RECONOCIMIENTO Y MANEJO DEL CROMATOGRAFO LACHROM ELITE.

ANALISIS DE UN PRODUCTO FARMACÉUTICO POR HPLC

LHEIDY OSORIO
TATIANA ARIAS
SARA FLÓREZ

INFORME DE LABORATORIO

CAMILO PERDOMO
DOCENTE

CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ

TECNOLOGÍA EN REGENCIA DE FARMACIA
ANÁLISIS INSTRUMENTAL
BOGOTÁ D.C
2015
RESUMEN
La práctica se realizó en dos sesiones. En la primera se llevó a cabo el
reconocimiento del cromatógrafo HPLC con el fin de conocer plenamente la
función de cada una de sus partes.
En la segunda sesión se realizó el análisis de un producto farmacéutico (ASA),
la cual se llevó a diferentes concentraciones a partir de una solución patrón.
Palabras clave: Cromatógrafo, solución patrón, ASA, concentraciones.
ABSTRACT
The practice was conducted in two sessions. The first was held recognition
HPLC chromatograph in order to fully understand the function of each of its
parts.
In the second session the analysis of a pharmaceutical (ASA) was held, which it
was different concentrations from a standard solution.
Key Words: Chromatograph, standard solution, ASA, concentrations.
1. INTRODUCCION
La cromatografía es una técnica de separación para la caracterización de los
componentes de una mezcla compleja, permitiendo la identificación de cada
uno de ellos y determinar su cantidad en la mezcla.
La cromatografía por HPLC se basa en la distribución de los componentes en
dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra móvil. La muestra se diluye en
una fase móvil (gas, líquido o fluido súper crítico) que se pasa a través de una
fase estacionaria no polar (columna). Los componentes de la muestra
interaccionan con los compuestas de la columna determinando la separación
de los componentes en la muestra [ CITATION Uni07 \l 9226 ]

2. MARCO TEÒRICO

2.1. Tipos de cromatografía: Dependiendo de la naturaleza de la fase estática

y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía.
2.1.1 Cromatografía sólido-líquido: La fase estacionaria es un sólido y la móvil
un líquido.
2.1.2 Cromatografía líquido-líquido: La fase estacionaria es un líquido anclado
a un soporte sólido.
2.1.3 Cromatografía líquido-gas: La fase estacionaria es un líquido no volátil
impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.
2.1.4 Cromatografía sólido-gas: La fase estacionaria es un sólido y la móvil un
gas.
2.1.5 Cromatografía preparativa: Se usa para purificar suficiente cantidad de
sustancia para un uso posterior, más que para análisis.
2.1.6 Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y
posiblemente también la concentración de un analíto en una muestra. [ CITATION
Uri13 \l 9226 ]

2.2 Tipo de interacción de fase estacionaria:

2.2.1 Adsorción: Sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la
mezcla mediantes interacciones de tipo polar.
2.2.2 Partición: Separación por diferentes solubilidad de los componentes de la
mezcla en las fases estacionaria líquida.
2.2.3 Intercambio iónico: Sólido con grupos funcionales ionizables cuya carga
se pueden intercambiar con los iones de la fase móvil.

2.3 Teoría de repulsión de pares de electrones de valencia (TREPEV):

Es un modelo utilizado en química para predecir la geometría molecular de las
moléculas basada en el grado de repulsión electrostática de los pares de
electrones alrededor del átomo.

La TREPEV está basada en que los pares de electrones de valencia alrededor

de un átomo se repelen mutuamente, y por lo tanto, adoptan una disposición
espacial que minimiza esta repulsión, determinando la geometría molecular. El
número de pares de electrones de valencia alrededor de un átomo, tanto
enlazantes como no enlazantes, se denomina número estérico. [ CITATION Iñisf \l
9226 ]

Los pares de electrones pueden ser de dos tipos dependiendo de sí forman

parte, o no, de un enlace, denominados pares libres o pares no enlazantes.
Existen tres tipos de interacciones repulsivas entre los pares de electrones de
una molécula, cada una con un determinado valor de intensidad. Ordenadas de
mayor a menor repulsión las interacciones posibles son:
La repulsión par no enlazante - par no enlazante  
La repulsión par no enlazante - par enlazante        
La repulsión par enlazante - par enlazante
2.4 Serie eluotrópica: es una lista en de varios compuestos ordenados según
su elución para un adsorbente determinado. Esta lista permite especificar los
solventes necesarios en la cromatografía de una mezcla.
El orden de la lista empieza con solvente no polares y finaliza con los más
polares. [ CITATION Unisf1 \l 9226 ]
2.5 Equipo HPLC

Figura 1: Equipo HPLC

Corporación Tecnológica de Bogotá (2012). Procedimiento operativo del equipo HPLC
Hitachi. Recuperado de: http://portal.ctb.edu.co/descargas/laboratorios/proc/DO-PR-
035%20Procedimiento%20Operativo%20del%20Equipo%20HPLC%20Hitachi..pdf

Partes del equipo:

2.5.1 Reservorio de solventes: son recipientes que suelen ser de vidrio y tubos
de teflón indispensables para eliminar gases disueltos y partículas que
puedan tener la fase móvil.
2.5.2 Bombas: Generan una regulación en la precisión y velocidad de la fase
móvil. Cuando la fase móvil es una mezcla de componentes, la bomba
es programada para tomar los componentes de manera determinada.
[ CITATION Mus \l 9226 ] Existen las bombas reciprocas que son aquellas
que producen un bombeo del fluido con un movimiento continuo hacia
adelante y hacia atrás de varios pistones.
2.5.3 Inyectores: Son válvulas que permiten la regulación de la muestra en
volúmenes. Existen los inyectores de jeringa y los inyectores de
válvulas, esta última consiste en 6 vías, dos están unidas entre sí por
medio de una espira que es un tubo que contiene la muestra antes de
realizar la inyección.[ CITATION Jor11 \l 9226 ]
2.5.4 Columna: En esta se realiza la separación. Las más utilizadas en este
tipo de cromatografía son las de relleno, que consisten en un tubo de
acero relleno de la fase estacionaria adecuada al tipo de separación que
se llevara a cabo.
2.5.5 Detector: Dispositivo que permite medir la composición de la fase móvil.
Existen diferentes tipos de detectores: de absorbancia, de fluorescencia,
de índice de reflexión, de dispersor de luz, electroquímico, y por
espectroscopia de masas [ CITATION Cor121 \l 9226 ]

3. MATERIALES Y METODOS

3.1. Materiales y reactivos

 Cromatografo líquido HPLC LACHROM ELITE
 Equipo de filtración de solventes
 Columnas para cromatografía HPLC Nucleosil 250 4,6
 Viales y septas para cromatografo
 Lámparas de emisión en desuso
 Balanza analítica
 Pipeta aforada 1, 2,3,5 y 10ml
 Vaso de precipitado de 100 y 250ml
 Balón aforado de 10,25 y 50ml
 Frasco lavador
 Jeringa desechable de 10ml
 Papel filtro
 Micro espátula
 Frasco lavador
 Agua HPLC
 Metanol HPLC
 Cafiaspirina
 Acetaminofén
 Aspirina
 Vitamina C
 Noraver-Fenol

3.2. MÉTODOS

3.2.1 Primera parte práctica

Se realizó el reconocimiento del equipo HPLC LACHROM ELITE reconociendo
las partes del equipo y su función dentro de la técnica analítica.
3.2.2 Segunda parte práctica
Se asignó el análisis de tres tipos de medicamentos de la siguiente manera:
1. Acetaminofén
2. Aspirina
 3. Vitamina C
Con cada uno de estos analitos se realizaron diluciones para obtener un rango
de concentración entre 0-100ppm.
Se usaron 5 viales y se hizo uso como fase móvil de agua: etanol (70:30).
Se tomó un vial y con una jeringa se purgo con la solución de la muestra
problema a analizar, luego con ayuda de un filtro colocado en la base de la
jeringa se extrajo la cantidad suficiente para llenar el vial, seguido a ello se
retiró el filtro y se adiciono en el vial.
Se introdujo cada vial en el automuestrador teniendo cuidado de su ubicación
esto para proceder al análisis indicando la posición del vial a analizar.

4. RESULTADOS

Al realizar la cuantificación de acido acetilsalicico (ASA) de una solución patrón

a diferentes concentraciones, se obtuvieron, a partir de los distintos
cromatogramas los siguientes datos:
Tabla 1: Datos aportados por el cromatograma de cada muestra

Tiempo de Tiempo muerto

Muestra retención Área
Muestra problema 6 1.7 2221189
10 ppm 5.17 1.7 261270
20 ppm 5.383 1.7 478427
40 ppm 5.65 1.7 1124821
60 ppm 5.807 1.7 1620100
80 ppm 5.903 1.7 1898933

A partir de los datos anteriores y teniendo en cuenta la longitud de la columna

(L) se obtuvo la constante de distribución de la muestra (K’), cálculo de W y
cantidad (N) y altura (H) de los platos teóricos para cada cromatograma.
Tabla 2: Valores de W, K’, N y H para cada cromatograma.
Muestra W k' N H
ASA MP 1.9 2.519411765 158.6539125 0.001575757
ASA 10 0.8 2.041176471 668.2225 0.000374127
ASA 20 1.2 2.166470588 321.9632111 0.000776486
ASA 40 1.4 2.323529412 260.5918367 0.000959355
ASA 60 1.6 2.415882353 210.7578063 0.001186196
ASA80 1.7 2.472352941 192.9157592 0.001295902

Al graficar la concentración de la muestra (solución patrón) de ácido

acetilsalicílico vs el área bajo la curva del pico del cromatograma
correspondiente a la sustancia a analizar, se obtuvo la siguiente gráfica:
 Área
2000000
f(x) = 25313.61 x
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000 Area
800000 Linear (Area)
600000
400000
200000
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Gráfica 1: Concentración vs área de ácido acetilsalicilico

Para hallar la resolución de cada una de las muestras, se tomó un pico

contiguo (A) al señalado para la cuantificación de acido acetilsalicilico (B), y
aplicando la siguiente ecuación:

R= trA – trB .
0.5 (WA+ WB)

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 3: Resolución para cada una de las muestras.

(A) (B)
Tiempo de W Tiempo de W RESOLUCION
retención retención
muestra problema 2.523 0.3 6 1.9 3.145454545
10 ppm 5.17 0.8 ----
20 ppm 2.587 0.3 5.383 1.2 3.728
40 ppm 2.513 0.3 5.65 1.4 3.690588235
60 ppm 2.52 0.3 5.807 1.6 3.46
80 ppm 2.547 0.2 5.903 1.7 3.532631579

Concentración de acido acetilsalicilico a partir de la preparación de la

solución:
Peso tableta: 597mg
Concentracion de ASA en la tableta: 500mg
Cantidad disuelta: 10mg
Volumen de aforo: 0.1 L
500mg ASA x 10 mg/tab = 8.37 mg ASA
597mg/tab

8.37 mg ASA = 83.75 ppm

0.1L

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

A partir del los cromatogramas se determinó un valor promedio del tiempo

muerto de 1.7 para todas la muestras, ya que en todos los casos, este fue el
mínimo tiempo necesario para que aparezca la primera señal analítica.

De la tabla 2, se infiere que la constante de distribución del analito aumenta

con la concentración del mismo, teniendo en cuenta, que K’ es la relación entre
la concentración de la especie en la fase estacionaria (C s), respecto a la
concentración de la especie en la fase móvil (C E).

K= Cs / CE

Cada vez que aumenta la cantidad del analito, tendrá más probabilidad de
quedarse en la fase estacionaria, por ello aumentará su tiempo de retención y
K’ tomará valores más altos ya que la concentración de analito en la fase móvil
estará disminuida

Teniendo en cuenta que los valores obtenidos de N (número de platos

teóricos), toman valores pequeños, en los cromatogramas obtenidos para cada
solución analizada, no se observan picos muy definidos.

Respecto a la gráfica 1, que relaciona la concentración de la solución

preparada con el área bajo la curva de cada uno de los picos, donde debería
obtenerse una línea recta, se obtiene una línea semicurva que puede deberse
a la alta concentración de las soluciones, esto podría evidenciarse en el
cromatograma por el ensanchamiento de los picos

Se realizó la tendencia lineal para la gráfica 1 con el fin de determinar la

concentración de ácido acetilsalicilico en la muestra problema, obteniendo la
ecuación de la recta y = mx + b donde:

Y = Área bajo la curva de la muestra problema

M= Pendiente de la recta
X = concentración de la muestra problema
B = Intercepto con el eje Y
Reemplazando los valores de la pendiente y el área bajo la curva en la
ecuación:

2221189 = (25314)X+ 0
(2221189) / (25314) = X
87.74547681 = X
88ppm = X

Teniendo en cuenta los valores de concentración de ASA reportados por el

fabricante y la cuantificación por HPLC, se reporta una diferencia no
significativa de 4.25ppm que puede presentarse por la faltade exactitud del
peso de la muestra problema para diluir.

Se observó en todos los cromatogramas, que el pico no es simetrico, sino que

presenta un ensanchamiento anormal al inicio de la señal, a esto se le
denomina efecto fronting e indica que las soluciones utilizadas en la
cromatografía, presentan concentraciones altas

6. CONCLUSIONES

A través de la práctica, se logró el reconocimiento y manejo del equipo HPLC

En los estudios con HPLC, deben usarse soluciones muy diluidas para obtener
resultados más confiables, ya que a concentraciones altas se producen
desviaciones en la tendencia lineal de los resultados obtenidos y
ensanchamiento de los picos en el cromatograma.

El análisis por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) es un método

muy preciso y exacto aunque en comparación con otros métodos, requiere de
más tiempo, siendo esta, una gran desventaja.

Es importante determinar si la cromatografía se realizará en fase normal o fase

reversa para garantizar la correcta elección de las fases móvil y estacionaria.
7. ANEXOS

7.1. Anexo 1: Cromatograma muestra problema de ASA

7.2. Anexo 2: Cromatograma ASA (10ppm)

7.3. Anexo 3: Cromatograma ASA (20ppm)

7.4. Anexo 4: Cromatograma ASA (40ppm)

7.5. Anexo 5: Cromatograma ASA (60 ppm)

7.6. Anexo 6: Cromatograma ASA (80ppm)

 Bibliografía

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