Ing. Hanz Flechas.

BIOFILLER MAKER Hs.

Principios y métodos de preparación del Plasma rico en Plaquetas.

Abstracto

Definición

Las plaquetas son fragmentos citoplasmáticos de megacariocitos, formados

en la médula y de aproximadamente 2 µm de diámetro. Contiene más de 30
proteínas bioactivas, muchas de las cuales tienen un papel fundamental en la
hemostasia o cicatrización tisular.

Siete factores de crecimiento proteico fundamentales, que son activamente

secretados por las plaquetas, inician todo el proceso de cicatrización de heridas
[Cuadro 1]. PRP también incluye tres proteínas en la sangre conocidas por
actuar como moléculas de adhesión celular: fibrina, fibronectina y vitronectina.

Cuadro 1

Factores de crecimiento plaquetario y sus características específicas

La activación hace que los gránulos presentes en las plaquetas se fusionen con
su membrana celular (también llamado desgranulación) donde las proteínas
secretoras (p.ej. PDGF, TGF-β, etc.) Son transformadas a un estado bioactivo
por la adición de histonas y cadenas laterales de carbohidratos. Las proteínas
activas son entonces secretadas, uniéndose a los receptores transmembrana
de las células diana, que incluyen células madre mesenquimales, osteoblastos,
fibroblastos, células endoteliales y células epidérmicas. Estos agonistas unidos
a los receptores transmembrana luego activan una señal proteica intracelular
que provoca la expresión de una secuencia de genes que dirige la proliferación
celular, la formación matricial, la producción osteoide, la síntesis de colágeno,
etc. Provocando así la reparación de tejido y regeneración tisular.

La secreción activa de estos factores de crecimiento por las plaquetas

comienza dentro de los 10 minutos después la activación, con más del 95% de
los factores de crecimiento Pre-sintetizados segregados en 1H.

Marx propuso que la cuenta de plaquetas en 10 lakh/ml en 5 ml de PRP, como

definición de trabajo del PRP, basado en la prueba científica de la mejora en la
curación de hueso y tejido Suave.

Hay una escasez de estudios que indiquen la concentración en la que ocurre la

estimulación óptima. Rughetti y otros estudiaron la relación entre la
concentración de plaquetas en gel plaquetario y cambios en la actividad
funcional de las células endoteliales humanas. La proliferación de células
endoteliales y su migración y la invasión de células endoteliales se produjo en
forma de campana. Los autores encontraron que el pico de la estimulación para
la proliferación de células endoteliales está en 1.25 × 10 6 y la angiogénesis en
1.5 × 106 plaquetas/ml, respectivamente. Esto significa el hecho de que un
conteo de plaquetas PRP de 1 Millón/ml se ha convertido en la definición de
trabajo para el PRP terapéutico y también la razón de la crítica de no obtener
los mejores resultados esperados de PRP, que podría ser debido a
concentraciones más bajas de plaquetas.

Clasificación
La literatura en PRP es considerable, pero los resultados publicados son
a menudo contradictorios. Es muy difícil ordenar e interpretar los datos
disponibles, debido a un gran número de técnicas de preparación, terminología,
formas de estos materiales, y la lista interminable de aplicaciones potenciales.
Según la clasificación propuesta por Ehrenfest y otros (2009), cuatro familias
principales de preparaciones pueden definirse, dependiendo de su contenido
celular y de la arquitectura de fibrina.
 1. El Plasma Rico en Plaquetas Puro (P-PRP) son los
productos de PRP pobres en leucocitos, son preparaciones
sin leucocitos y con una red de fibrina de baja densidad
después de la activación.

2. Leucocito y PRP (L-PRP) son preparaciones con leucocitos y

con una red de fibrina de baja densidad después de la
activación. Es en esta familia que existe el mayor número de
sistemas comerciales o experimentales. Particularmente,
muchos protocolos automatizados que han sido desarrollados
en los últimos años, requieren el uso específico de kits que
permiten un mínimo manejo de las muestras de sangre y una
máxima estandarización de la preparación.

3. Plasma Rico en fibrina (P-PRF), o de Plasma Rico en

Fibrina, Pobre en Leucocitos, son preparaciones sin leucocitos
y con una red de fibrina de alta densidad. Estos productos sólo
existen en un gel fuertemente activado forma, y no se puede
inyectar ni utilizar como la fibrina tradicional Colas.

4. leucocito-y plaqueta-rico fibrina (L-PRF) o los productos

de segunda generación de PRP son preparaciones con
leucocitos y con una red de fibrina de alta densidad.

Este sistema de clasificación fue ampliamente citado, defendido y validado

por una Conferencia de consenso multidisciplinario Publicada en 2012.

Preparación de PRP
El PRP se obtiene de una muestra de sangre de los pacientes, extraída
en el momento del tratamiento. El drenaje de 30 CC de sangre venosa producirá
3-5 cc de PRP dependiendo del conteo plaquetario basal de un individuo, el
dispositivo utilizado, y la técnica empleada. La extracción de sangre se realiza
con la adición de un anticoagulante o no, tal como el fosfato de dextrosa
citratado, para prevenir la activación plaquetaria antes de su uso.

Principios de la preparación del PRP

El PRP es preparado por un proceso conocido como centrifugación

diferencial. En centrifugación diferencial, fuerza de la aceleración se ajusta para
sedimentar ciertos componentes celulares basados en diversa gravedad
específica.
Hay muchas maneras de preparar el PRP. Puede ser preparado por el
método de PRP o por el método de la Buffy-capa (capa leucocitaria).
 En el método de PRP, una centrifugación inicial para separar los
glóbulos rojos (RBC) es seguida de una segunda centrifugación para
concentrar las plaquetas, que se suspenden en una pequeña porción al final
del volumen de plasma. En Figura 1, diagrama de flujo describe una
centrifugación doble de PRP. La WB (sangre compuesta) se recoge inicialmente
en los tubos que contienen Anticoagulantes. El paso de la primera centrifugación
se realiza con la aceleración constante, para separar RBCs (glóbulos rojos) del
volumen restante del WB. Después de la primera centrifugación, el WB se
separa en tres capas: una capa superior que contiene sobre todo las plaquetas
y WBC (Glóbulos Blancos), una capa intermedia, delgada, que se conoce como
capa leucocitaria y que es rico en glóbulos blancos y una final que consiste
mayormente en RBCs. Para la producción de PRP puro (P-PRP) la capa
superior y la capa leucocitaria superficial se transfieren a un nuevo tubo estéril.
Para la producción de PRP rico en leucocitos (L-PRP), toda la capa leucocitaria
y una pequeña porción de RBCs se transfieren a un nuevo tubo estéril. Ahora
se realiza la segunda centrifugación, la fuerza “g” en esta segunda
centrifugación debe ser ajustada para ayudar a la formación de “soft pellet”
(eritrocitos- plaquetas) en el fondo del tubo. La porción superior del volumen
que está compuesta mayormente PPP, (Plasma Pobre en Plaquetas) se
remueve. Los pellets son homogeneizados en el último tercio (5ml de plasma)
para crear PRP Plasma Rico en Plaquetas.
Figura 1
Diagrama de flujo que describe la preparación del PRP
En el método de la capa de leucocitaria, la sangre (WB) es centrifugada a "alta
velocidad" con la subsecuente extracción de la capa leucocitaria. La capa
leucocitaria contiene alta concentración de Leucocitos.
De un pequeño volumen de WB (10 ml), se puede producir una capa
leucocitaria muy delgada. La dificultad radica en separar esta fina capa,
contiene principalmente glóbulos blancos y plaquetas, de la capa subyacente
de RBC.

Procedimiento [1]

PRP método

1. Obtener WB por punción venosa en tubos con citrato de dextrosa ácido (ACD)
2. No enfríe la sangre en ningún momento antes o durante la
separación de las plaquetas.
3. Centrifugar la sangre usando un centrifugado ‘suave’.
4. Transferir el sobrenadante de plasma que contiene
plaquetas a otro tubo estéril (sin anticoagulante).
5. Centrifugar el tubo a una velocidad más alta para obtener un concentrado de
plaquetas.
6. El 1/3 más bajo es PRP y 2/3 superiores es el plasma pobre en
plaquetas (PPP). En la parte inferior del tubo, se forman pelotillas
(Pellets) de eritrocitos-plaqueta.
7. Retirar el PPP y suspender los pellets plaquetarios en una cantidad
mínima de plasma (2-4 mL) agitando suavemente el tubo.

Método de la Capa Leucocitaria

1. El WB se debe almacenar de 20 °C a 24 °C antes de la centrifugación.

2. Centrifugar la sangre WB a una velocidad ‘alta’.
3. Tres capas se forman debido a su densidad: la capa inferior
que consiste en
RBCs, la capa media que consiste en las plaquetas y
glóbulos blancos y la capa superior del PPP.
4. Retire el plasma flotante de la parte superior del recipiente.
5. Transfiera la capa leucocitaria a otro tubo estéril.
6. Centrifugar a baja velocidad para separar glóbulos blancos o usar filtro de
filtración de leucocitos.

No hay consenso sobre Si o no las plaquetas deben activarse previamente

antes de su aplicación y con qué agonista. Algunos autores activan las
plaquetas con trombina o calcio, mientras que otros aplican plaquetas sin ser
previamente activadas, argumentando que se obtienen mejores resultados.
 Comparación de estudios de preparación
El PRP es preparado por centrifugación, variando la fuerza centrífuga
relativa, la temperatura y el tiempo. Se ha visto que el procedimiento de dos
pasos de centrifugado ofrece los mejores resultados.
Los procedimientos de preparación también son relevantes, como lo
demuestran los estudios del potencial Condro-inductivo y Óseo-inductivo del
PRP.
Hay numerosos protocolos en la literatura actual que describen las
condiciones óptimas de centrifugación [Cuadro 2]. Sin embargo, estos diversos
protocolos han sido optimizados con respecto a diversas variables del proceso,
tales como volumen y muestreo del WB procesado, número de vueltas, período
de tiempo de centrifugación, y rango de aceleración centrífuga. Teniendo en
cuenta la complejidad de un producto autólogo como el PRP y la necesidad de
control de calidad en las aplicaciones clínicas, es crucial demostrar la
capacidad del procedimiento para reproducir resultados coherentes.
Tabla 2

Comparación de varios protocolos para el rendimiento plaquetario

A pesar de estas variaciones, todos los protocolos siguen una secuencia genérica que
consiste drenado de la sangre, una centrifugación inicial para separar RBCs,
centrifugaciones subsecuentes para concentrar las plaquetas y otros componentes y una
activación de la muestra mediante la adición de un agonista plaquetario.

Amable y otros estudiaron variaciones en la fuerza centrífuga relativa (FCR), temperatura

y tiempo para optimizar las condiciones de aislamiento plaquetario y
cuantificación de citoquinas y factores de crecimiento en PRP antes y después
de la activación plaquetaria.
Sangre periférica de 22 donantes voluntarios de sexo masculino y femenino
(entre 20- 54 años de edad) fue recolectada usando tubos de recolección de
sangre de 4,5 ml que contenían solución de citrato de 0,5 ml. Las muestras de
sangre se procesaron eligiendo FCR de 240 a 400 × g, en un tiempo de 8 a 19
min y una temperatura de 8° a 16 ° C. Todos los pasos se realizaron en una
centrifugadora refrigerada.
El mejor rendimiento se obtuvo con parámetros de 300 × g durante 5 min a 12° C y 240
× g durante 8 min a 16° C durante la primera centrifugación. La segunda
centrifugación de 700 × g durante 17 min fue escogida ya que permitió una
menor pérdida de plaquetas en la fracción PPP y produjo un pellet que fue
fácilmente Re-suspendido.
 Amanda y otros demostraron que el procesamiento de 3,5 ml de sangre a
100 × g durante 10 min (1 ra centrifugación), 400 × g durante 10 min (2 da
centrifugación) y retirar 2/3 del plasma remanente, promovió alta recuperación
plaquetaria (70%-80%) y concentración (5 ×) manteniendo la integridad y
viabilidad plaquetaria. Los autores creen que el tiempo y la aceleración son los
parámetros fundamentales que definen la composición de la muestra PRP
después del primer paso de centrifugado. Períodos de tiempo más largo
incrementan ligeramente la recuperación plaquetaria y disminuye las
concentraciones de WBCs en la capa superior. Por lo tanto, el tiempo podría
ser un parámetro de control cuando se requieran niveles bajos de WBC en la
muestra de PRP, como los granulocitos y los linfocitos.
Diversos factores contribuyen al gradiente de concentración plaquetaria
como el tamaño de las plaquetas, la diferencia biológica entre los individuos y la
variabilidad del hematocrito.
Sin embargo, este gradiente es más crítico después del segundo paso de
centrifugado porque algunos eritrocitos están inevitablemente presentes en el
volumen que se transfirió desde el primer
centrifugado. La presencia de estos RBCs restantes puede generar
un pellet en la parte inferior del tubo, que adsorben las plaquetas y glóbulos
blancos en su superficie. La mezcla manual durante un corto período de tiempo
es insuficiente para resuspender completamente las plaquetas, y se observa
una gran variabilidad en el conteo plaquetario. Aproximadamente el 20% de las
plaquetas permanecieron adsorbidos en el Pellet de RBC.

Kahn y otros determinaron que una aceleración centrífuga de 3731 × g

por un período de 4 min fue la condición óptima para obtener la mayor
concentración plaquetaria de 478 ml de WB.
La mayor eficiencia de recuperación plaquetaria obtenida por Slichter y
Harker fue del 80%, utilizando una muestra de 250-450 ml de WB centrifugado
a 1000 × g durante un período de 9 min. Se observó que un paso subsecuente
de la centrifugación de 3000
× g por un período de 20 minutos disminuyó la viabilidad de la plaqueta.
Landesberg y otros, obtuvieron muestras de PRP que tenían aproximadamente
3.2 veces la concentración de la línea basal del WB. El procedimiento de
centrifugación procesó 5 ml de WB DOS veces a 200 × g durante 10 min por
centrifugado.
Jo y otros examinaron el efecto del tiempo de centrifugación y la fuerza
gravitacional (g) en el cociente de la recuperación plaquetaria del PRP. El
procedimiento de doble centrifugado para la preparación del PRP se usó en 39
sujetos. El WB fue centrifugado a partir del 500 × g hasta 1900 × g con
incrementos de 200 × g por 5 minutos y de 100 × g hasta 1300 × g con
incrementos de 200 × g durante 10 min. En el paso 2, las plaquetas en el
plasma separado se concentraron a 1000 × g durante 15 min, 1500 × g durante
15 min,
2000 × g por 5 min y 3000 × g por 5 min. Lograron la mejor eficiencia (92%)
con la aplicación de una aceleración de 900 × g durante 5 min para el primer
paso de centrifugado. Un total de 9 ml de El WB fueron procesados, y la
concentración plaquetaria medida fue. 310,7 ± 78,5 × 10 3 /mm3. La mayor
eficacia en el segundo centrifugado (el 84%) se obtuvo aplicando 1500 × g
durante 15 min. La concentración plaquetaria fue, 633,2 ± 91,6 × 10 3 /mm3, que
fue 4,2 veces mayor que la concentración basal.

Bausset y otros encontraron que una centrifugación de 130 × g o 250 × g

durante un período de 15 min fue óptima, al realizar un procedimiento que
involucró dos centrifugaciones. Un factor de concentración plaquetaria de 3,47
fue obtenido de 8.5 ml de WB procesado, y 2.0 ml de plasma fueron
procesados en el segundo centrifugado.
Mazzocca y otros analizaron tres protocolos para preparar muestras de
PRP con diferentes composiciones: una baja en plaquetas (382 × 10 3 /mm3) y
bajo en WBC (0.6 × 103 /mm3) con procedimiento de un paso de centrifugado a,
1500 rpm durante 5 min (10 ml WB); una alto en plaquetas (940 × 103/mm 3) y
alto en WBC (17 × 103/mm3) con un procedimiento de paso de centrifugado a,
3200 RPM por 15 minutos (27 mL WB); y un proceso de dos centrifugaciones
(1500 rpm para 5 min y 6300 rpm durante 20 min) que produjo la concentración
más alta de plaquetas (472 × 103/mm3) y más baja en WBC (1.5 × 103/mm3).
Anitua y otros. Utilizaron sólo un paso de centrifugación y recogieron el
volumen inmediatamente por encima de la capa de eritrocitos. La sangre se
recogió en tubos estériles (4,5 ml) que contenían 3,8% (p/v) citrato trisódico,
luego centrifugaron a 460 × g durante 8 min (Instituto de biotecnología B.T.I.,
Vitoria-Gasteiz, España). Este protocolo obtuvo un factor de concentración
plaquetaria de 2,67 por encima del valor basal.

Dugrillon y otros, reportaron que el número de plaquetas no siempre es

proporcional a la cantidad de factores de crecimiento, así que debe darse más
atención a la calidad de PRP que a el número de concentración plaquetaria. Su
estudio demostró que el TGF-β1 y Concentración plaquetaria están
relacionados proporcionalmente a las fuerzas de centrifugación cuando las
fuerzas son menores de 800 × g. TGF-β1 se vuelve inversamente proporcional
con la fuerza centrífuga cuando las fuerzas están por encima de 800 × g.
Araki y otros, concluyeron que el protocolo optimizado para la preparación
del PRP fue la centrifugación del WB a 230-270 × g por 10 minutos, que
también obtuvo un número bajo de glóbulos (4.1%-5.8% del WB). Glóbulos
blancos parecen precipitarse cuando la fuerza de centrifugación es ≥ 840 × g.

En su Protocolo, lanWB (40-72 ml) fue drenada por punción venosa,

recolectado y dividido en alícuotas de 7,5 ml en tubos cónicos de 15 ml. Los
tubos se centrifugaron a 20 ° c en una centrifugadora refrigerada. Para el
segundo centrifugado, se aplicó una aceleración de 2300 × g para 10 minutos.
El factor de concentración plaquetaria fue
7,4 veces mayor que la basal, después quitando aproximadamente 1/10 del
PPP y agregando el ácido etilendiaminotetracético (EDTA) como
anticoagulante.
Muchos otros estudios, especifican la aceleración centrífuga en rotaciones
por minuto (RPM) en lugar de en × g, complicando la tarea de comparar y
reproducir sus resultados.
En un estudio reciente de Kececi y otros. El primer protocolo de centrifugado
(centrifugado suave) fue elegido como 250-270 × g durante 10 min. En la
segunda centrifugación, la fuerza de la misma fue variada a partir del 300 × g,
500 × g, 750 × g, 1000 × g, 1500 × g y 2000 × g por 10 min. El factor de
concentración plaquetaria aumentó a medida que la fuerza centrífuga del
segundo paso aumentó. 1,92-veces, 2.16-veces, 2,80 veces, 3,48 veces, 3,67
veces, y 3,76 veces después de una centrifugación de 10 minutos en
segundo lugar en 300 × g, 500 × g, 750 ×
g, 1000 × g, 1500 × g y 2000 × g, respectivamente. Los autores opinaron que la
obtención de una concentración de plaquetas definitivas podría ser posible
mediante el ajuste de la fuerza de centrifugación individualmente según el valor
de referencia personal.

Perspectiva de los autores

Hay varios protocolos descritos en la literatura para la preparación del
PRP. Aceleración centrífuga, número de centrifugaciones, tiempo y distancia
entre las partículas y el rotor al volumen del WB procesado es crítico para la
optimización del PRP. Cada laboratorio debe estandarizar su Protocolo. Un
PRP estándar hecho A mano se podía preparar fiable y rentable sin utilizar un
kit comercial. El factor de concentración plaquetaria se puede cambiar con la
fuerza de la centrifugación aplicada en la preparación del PRP.

Factores que influyen en el rendimiento PRP

Varios factores influyen en el rendimiento de PRP, como el drenaje de

sangre; velocidad, tiempo y temperatura de centrifugación y uso de
anticoagulantes.

Extracción de sangre
El proceso de coagulación está influenciado desde el momento del
drenado. Para evitar la activación (no intencional) de plaquetas, la mayoría de
los protocolos utilizan agujas de orificios grandes (> 22) para drenar la sangre.
En un estudio de Waters y Roberts. Usando dos dispositivos de la célula-
salvamento y dos dispositivos de centrifugado, en el curso de 260 casos
clínicos, encontraron que había una tendencia a la baja en el conteo de
plaquetas con un tiempo más largo de drenaje.
 Centrifugación

La fuerza gravitacional de la tierra es suficiente para separar muchos tipos

de partículas con el tiempo. Un tubo de sangre anti-coagulada dejada inmóvil
en una centrifuga eventualmente se separará en fracciones de plasma, RBC y
WBC. Sin embargo, el largo tiempo necesario para este tipo de separación la
hace inviable para la mayoría de las aplicaciones. Además, la degradación
potencial de los compuestos biológicos durante el almacenamiento prolongado
significa técnicas de separación más rápidas. Por lo tanto, para acelerar la
sedimentación, el efecto de la gravedad se amplifica con ' fuerza centrífuga '
proporcionada por una centrifugadora y puede ser muchos miles de veces la
fuerza de la gravedad.
La separación de los componentes celulares dentro de la sangre puede
ser alcanzada por un proceso conocido como centrifugación diferencial. En la
centrifugación diferencial, la fuerza de aceleración se ajusta para sedimentar
ciertos componentes celulares y dejar a otros en suspensión. En la
centrifugación, El FCR es la fuerza requerida para separar dos fases, esta
fuerza también llamada campo de centrifugado relativa.
Se expresa como múltiplos del campo gravitacional de la tierra (g). Acelerando
el g, la sedimentación puede ser alcanzada más rápido.
' g ' es la fuerza real ejercida sobre el contenido del rotor giratorio, que
separa las soluciones acuosas en la centrifugadora. Las revoluciones por
minuto (RPM) se calculan utilizando la siguiente ecuación.

Fórmula

g = (1,118 × 10-5) R S2
Donde ' g ' es el FCR, R es el radio del rotor (del Centro del rotor a la muestra)
en Centímetros y S es la velocidad de la centrifugadora en revoluciones por
minuto.

Es importante recordar que el cálculo del FCR depende del radio del rotor de
centrifugado utilizado. La misma máquina centrífuga con diferentes rotores
puede producir diferentes fuerzas de aceleración.

Temperatura

La temperatura durante el procesamiento es crucial para prevenir la activación

plaquetaria. Manual de AABB recomienda 21°C -24°C, para la centrifugación de
la sangre para la obtención de PRP.
 Macey y otros. También indicaron que el enfriamiento puede retardar la
activación plaquetaria y esto puede ser esencial en la obtención de PRP con
plaquetas viables.

Muchos autores han utilizado un nivel de temperatura de 12°C -16°C

durante la centrifugación para la mejor recuperación plaquetaria.
Esto es alemán para los que utilizan una centrifugadora ordinaria para
desarrollar PRP, Las que son desarrolladas principalmente para propósitos de
diagnóstico y no para procesar el PRP y por lo tanto puede no producir un
suficiente campo plaquetario.

Anticoagulantes
La importancia reside en la elección de un anticoagulante capaz de
preservar la mejor funcionalidad, integridad y morfología posible de las
plaquetas.
Con respecto al tipo de anticoagulante para el uso, la mayoría de los
autores convienen en no usar EDTA porque podría dañar la membrana de la
plaqueta. Por lo tanto, se recomiendan los anticoagulantes con citrato y
dextrosa de citrato sódico.
Los autores compararon los efectos del citrato de sodio y ACD-A en la
agregación plaquetaria, pH y extracelular Concentración iCa. El anticoagulante
ACD-A es la opción para colección de plaquetas por apheresis, mientras que el
citrato trisódico (3.2% o 3.8%) es el anticoagulante más comúnmente usado
para evaluaciones diagnósticas de plaquetas. El citrato trisódico y las
soluciones de ACD-A difieren notablemente en el pH, con ACD-A con un pH de
4,9 y 3.8% al citrato de sodio con un pH de 7.8. Además, la concentración de
iones de citrato en ACD-A es 15.6 mg/ml, mientras que el 3.8% citrato de sodio
contiene 24.4 mg de citrato ion/ml. Se ha reportado. En varias especies que las
alteraciones en el pH y la extracelular concentración iCa de PRP puede afectar
la agregación plaquetaria in vitro, la agregación se deteriora típicamente en pH
ácido y más baja extracelular Concentraciones iCa.

Alternativamente se puede utilizar el citrato de fosfato de dextrosa-

adenina. Qué es similar al ACD-A pero tiene menos ingredientes de apoyo y,
por lo tanto, es un 10% menos efectivo para mantener la viabilidad plaquetaria.

Activación del PRP

La activación de PRP antes de la inyección es otro parámetro que

requiere más discusión.
PRP puede ser activado exógeno por la trombina, el cloruro de calcio o el
trauma mecánico. El colágeno es un activador natural de PRP, así cuando el
PRP se utiliza en tejido blando, no necesita ser activado exógeno.
Una vez que el PRP se activa, (fibrinógeno-fibrina) comienza a formarse
una red de fibrina, solidificando el plasma y creando un coágulo o membrana
de fibrina.
 Según Weibrich y otros. Aquí no hay cambios significativos en la
concentración plaquetaria o concentración de factores de crecimiento en
relación con la edad y el género, aunque existen estudios que informan que el
hematocrito y el conteo plaquetario total influyen en la concentración
plaquetaria del PRP.

Consejos útiles para la estandarización del procedimiento PRP

El médico necesita determinar cuánto PRP necesitaría generar para el
procedimiento particular.
Como se indicó anteriormente, muchos factores influyen en el rendimiento de PRP.
Los puntos siguientes son provechosos en la obtención de un concentrado óptimo del
PRP.

1. Drenar la sangre en tubos con anticoagulante (vacutainer)

usando aguja para extracción de sangre BD Eclipse
preferiblemente. Aparte 1-2 ml para el conteo celular basal,
incluyendo RBC, Plaquetas, WBC y hematocritos. El porcentaje
de hematocrito del paciente (la proposición del volumen de RBC
en el volumen total de sangre) es relevante para la optimización
del campo plaquetario. La sangre con un bajo porcentaje de
hematocrito tiene mas plasma disponible por lo tanto diluye la
concentración de plaquetas en el plasma.

2. Las muestras de sangre que se recolectan en los tubos de

ACD deben invertirse 5-10 veces para mezcla adecuada del
anticoagulante y la sangre. Si el tubo no está mezclado,
pueden formarse pequeños coágulos de fibrina, causando un
falso descenso en el conteo plaquetario

3. después del 1er centrifugado, mida el conteo plaquetario en

RBCs y el sobrenadante para asegurar separación óptima de
las plaquetas del WB

4. Si esto no sucede, cambie los parámetros como rpm y tiempo.

5. Después del 1er centrifugado, si se obtiene el gran volumen de

plasma, entonces necesitaría un "g" más alto para concentrar
las plaquetas en fondo del tubo (Ley de la velocidad).

6. Después de la 2da centrifugación, mida el conteo de plaquetas

en PPP y PRP después de almacenar adecuadamente los
tubos.
 7. Si una mayor concentración de plaquetas en el plasma pobre
en plaquetas (capa superior) o menor concentración en PRP
(capa inferior) se observa, entonces los parámetros no son
óptimos.

8. El PRP debe separarse del PPP poco después de la

centrifugación porque las plaquetas concentradas se
difundirán lentamente en el PPP con el tiempo y reducirían el
conteo plaquetario de la preparación del PRP.

9. para el conteo de las plaquetas en el concentrado de PRP

final, debe ser re-suspendido por al menos 5-10 min para
permitir la distribución equitativa de las plaquetas antes de
contar.

Para obtener un rendimiento de plaquetas en PRP más de 10 lakhs/ml,

todas las variables como rpm, tiempo y la temperatura debe ser estandarizada
y también la consistencia del concentrado tiene que ser mantenida durante el
período después de varios intentos con varias permutaciones y combinaciones,
los autores encontraron que en 900g x 5 minutos para la
1ª centrifugación y 1000g x 10 minutos para la 2ª centrifugación a
16 ° C en una centrifugadora refrigerada, la producción de PRP fue encontrada
óptima. Los autores han registrado consistentemente conteos de plaquetas
superiores a 10 lakhs/ml usando estos parámetros.
 Conclusión

La utilidad del PRP está aumentando en el campo de la dermatología y la estética.

Aunque los sistemas de PRP comercializados ofrecen suspensiones ricas en plaquetas
listas para aplicarse de manera estéril, alto costo, volumen limitado de sangre extraída,
diferencias en las pautas de centrifugación, amplia variación en la concentración de
plaquetas, dificulta al médico para elegir entre los kits de PRP fácilmente disponibles.

Hay muchos protocolos para la preparación del PRP cada uno que tiene su
estandarizado propio parámetros y resultados reclamados, como se mencionó en la
revisión. Es recomendable estandarizar los protocolos de preparación individual, que
son rentables y fáciles de adaptar en entornos clínicos.
La comprensión de los principios básicos de la centrifugación es de importancia
primordial en preparación de PRP. Los ensayos de metodología repetidos por "enfoque
de ensayo y error", estricta vigilancia en el mantenimiento de la esterilidad y control
cruzado regular de los valores plaquetarios son una necesidad para obtener resultados
coherentes.

Para el proceso de Gelificación del concentrado plaquetario el

BIOFILLE MAKER Hs, ofrece protocolos estándar para el Gel de
4ta y 5ta generación, pero brinda al usuario la opción de introducir
sus propios protocolos
 Referencias
1. Conley CL. Hemostasis. In: Mountcastle VB, editor. Medical Physiology. St.
Louis: The C.V. Mosby Company; 2004. pp. 1137–46. [Google Scholar]
2. Harrison P, Cramer EM. Platelet alpha-granules. Blood Rev. 1993;7:52–62. [PubMed] [Google
Scholar]
3. Schliephake H. Bone growth factors in maxillofacial skeletal reconstruction. Int J Oral
Maxillofac Surg. 2002;31:469–84. [PubMed] [Google Scholar]
4. Sunitha Raja V, Munirathnam Naidu E. Platelet-rich fibrin: Evolution of a second-generation
platelet concentrate. Indian J Dent Res. 2008;19:42–6. [PubMed] [Google Scholar]
5. Cole BJ, Seroyer ST, Filardo G, Bajaj S, Fortier LA. Platelet-rich plasma: Where are we now
and where are we going? Sports Health. 2010;2:203–10. [PMC free article] [PubMed] [Google
Scholar]
6. Kevy SV, Jacobson MS. Comparison of methods for point of care preparation of autologous
platelet gel. J Extra Corpor Technol. 2004;36:28–35. [PubMed] [Google Scholar]
7. Marx RE. Platelet-rich plasma: Evidence to support its use. J Oral Maxillofac Surg.
2004;62:489–96. [PubMed] [Google Scholar]
8. Antoniades HN, Williams LT. Human platelet-derived growth factor: Structure and functions.
Fed Proc. 1983;42:2630–4. [PubMed] [Google Scholar]
9. Marx RE. Platelet-rich plasma (PRP): What Is PRP and What Is Not PRP? Implant Dent.
2001;10:225–8. [PubMed] [Google Scholar]
10. Rughetti A, Giusti I, D’Ascenzo S, Leocata P, Carta G, Pavan A, et al. Platelet gel-released
supernatant modulates the angiogenic capability of human endothelial cells. Blood Transfus.
2008;6:12–7. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
11. Dohan Ehrenfest DM, Rasmusson L, Albrektsson T. Classification of platelet concentrates:
From pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF) Trends
Biotechnol. 2009;27:158–67. [PubMed] [Google Scholar]
12. Dohan Ehrenfest DM, Bielecki T, Mishra A, Borzini P, Inchingolo F, Sammartino G, et al. In
search of a consensus terminology in the field of platelet concentrates for surgical use: Platelet-
rich plasma (PRP), platelet-rich fibrin (PRF), fibrin gel polymerization and leukocytes. Curr
Pharm Biotechnol. 2012;13:1131–7. [PubMed] [Google Scholar]
13. Sweeny J, Grossman BJ. Blood collection, storage and component preparation methods. In:
Brecher M, editor. Technical Manual. 14th ed. Bethesda MD: American Association of Blood
Banks (AABB); 2002. pp. 955–8. [Google Scholar]
14. Welsh WJ. Autologous platelet gel: Clinical function and usage in plastic surgery. Cosmetic
Derm. 2000;11:13–9. [Google Scholar]
15. Scherer SS, Tobalem M, Vigato E, Heit Y, Modarressi A, Hinz B, et al. Non-activated versus
thrombin-activated platelets on wound healing and fibroblast-to-myofibroblast differentiation
in vivo and in vitro. Plast Reconstr Surg. 2012;129:46e–54e. [PubMed] [Google Scholar]
16. Platelet Rich Plasma (PRP) Guidelines, © International Cellular Medicine Society - 2011.
[Last accessed 2014 Dec 5]. Available from: http://www.cellmedicinesociety.org .
17. Marlovits S, Mousavi M, Gabler C, Erdös J, Vécsei V, et al. A newsimplified technique for
producing platelet-rich plasma: A short technical note. Eur Spine J. 13:102–06. [PMC free
article] [PubMed] [Google Scholar]
18. Waters JH, Roberts KC. Database review of possible factors infuencing point-of-care platelet
gel manufacture. J Extra Corpor Technol. 2004;36:250–4. [PubMed] [Google Scholar]
19. Lozada JL, Caplanis N, Proussaefs P, Willardsen J, Kammeyer G. Platelet-rich plasma
application in sinus graft surgery: Part I--background and processing techniques. J Oral
Implantol. 2001;27:38–42. [PubMed] [Google Scholar]
20. Han B, Woodell-May J, Ponticiello M, Yang Z, Nimni M. The effect of thrombin activation of
platelet-rich plasma on demineralized bone matrix osteoinductivity. J Bone Joint Surg Am.
2009;91:1459–70. [PubMed] [Google Scholar]
21. Amable PR, Carias RB, Teixeira MV, da Cruz Pacheco I, Corrêa do Amaral RJ, Granjeiro JM, et
al. Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: Optimization and quantification
of cytokines and growth factors. Stem Cell Res Ther. 2013;4:67. [PMC free article] [PubMed]
[Google Scholar]
22. Perez AG, Lana JF, Rodrigues AA, Luzo AC, Belangero WD, Santana MH. Relevant aspects of
centrifugation step in the preparation of platelet-rich plasma. ISRN Hematol.
2014;2014:176060. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
23. Kahn RA, Cossette I, Friedman LI. Optimum centrifugation conditions for the preparation of
platelet and plasma products. Transfusion. 1976;16:162–5. [PubMed] [Google Scholar]
24. Slichter SJ, Harker LA. Preparation and storage of platelet concentrates. I. Factors
influencing the harvest of viable platelets from whole blood. Br J Haematol. 1976;34:395–402.
[PubMed] [Google Scholar]
25. Landesberg R, Roy M, Glickman RS. Quantification of growth factor levels using a simplified
method of platelet-rich plasma gel preparation. J Oral Maxillofac Surg. 2000;58:297–301.
[PubMed] [Google Scholar]
26. Jo CH, Roh YH, Kim JE, Shin S, Yoon KS. Optimizing platelet-rich plasma gel formation by
varying time and gravitational forces during centrifugation. J Oral Implantol. 2013;39:525–32.
[PubMed] [Google Scholar]
27. Bausset O, Giraudo L, Veran J, Magalon J, Coudreuse JM, Magalon G, et al. Formulation and
storage of platelet-rich plasma homemade product. Biores Open Access. 2012;1:115–23. [PMC
free article] [PubMed] [Google Scholar]
28. Montalvo S, Tresguerres I, Tamini FM, Blanco Jerez L. A comparative study of 2 methods for
obtaining platelet rich plasma. J Oral Maxillofac Surg. 2007;65:1084–93. [PubMed] [Google
Scholar]
29. Mazzocca AD, McCarthy MB, Chowaniec DM, Cote MP, Romeo AA, Bradley JP, et al.
Platelet-rich plasma differs according to preparation method and human variability. J Bone
Joint Surg Am. 2012;94:308–16. [PubMed] [Google Scholar]
30. Anitua E, Aguirre JJ, Algorta J, Ayerdi E, Cabezas AI, Orive G, et al. Effectiveness of
autologous preparation rich in growth factors for the treatment of chronic cutaneous ulcers. J
Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2008;84:415–21. [PubMed] [Google Scholar]
31. Dugrillon A, Eichler H, Kern S, Klüter H. Autologous concentrated platelet-rich plasma (cPRP)
for local application in bone regeneration. Int J Oral Maxillofac Surg. 2002;31:615–9. [PubMed]
[Google Scholar]
32. Araki J, Jona M, Eto H, Aoi N, Kato H, Suga H, et al. Optimized preparation method of
platelet-concentrated plasma and noncoagulating platelet-derived factor concentrates:
Maximization of platelet concentration and removal of fibrinogen. Tissue Eng Part C Methods.
2012;18:176–85. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
33. Fernández-Barbero JE, Galindo-Moreno P, Ávila-Ortiz G, Caba O, Sánchez-Fernández E,
Wang HL. Flow cytometric and morphological characterization of platelet-rich plasma gel. Clin
Oral Implants Res. 2006;17:687–93. [PubMed] [Google Scholar]
34. Su CY, Kuo YP, Nieh HL, Tseng YH, Burnouf T. Quantitative assessment of the kinetics of
growth factors release from platelet gel. Transfusion. 2008;48:2414–20. [PubMed] [Google
Scholar]
35. Kececi Y, Ozsu S, Bilgir O. A cost-effective method for obtaining standard platelet-rich
plasma. WOUNDS. 2014;26:232–8. [PubMed] [Google Scholar]
36. Chapter 17. 1st edition. 2014. Bentleys textbook of pharmaceutics -An update, Sanjay
Kumar Jain, Vandana Soni; pp. 556–65. [Google Scholar]
37. Macey M, Azam U, McCarthy D, Webb L, Chapman ES, Okrongly D, et al. Evaluation of the
anticoagulants EDTA and citrate, theophylline, adenosine, and dipyridamole (CTAD) for
assessing platelet activation on the ADVIA 120 hematology system. Clin Chem. 2002;48:891–9.
[PubMed] [Google Scholar]
38. Anitua E, Prado R, Sánchez M, Orive G. Platelet-rich-plasma: Preparation and formulation.
Oper Tech Orthop. 2012;22:25–32. [Google Scholar]
39. Callan MB, Shofer FS, Catalfamo JL. Effects of anticoagulant on pH, ionized calcium
concentration, and agonist-induced platelet aggregation in canine platelet-rich plasma.
American journal of veterinary research. 2009;70:472–7. doi:10.2460/ajvr.70.4.472. [PMC free
article] [PubMed] [Google Scholar]
40. Guder WG, Narayanan S, Wisser H, Zawta B. Special Aspects of Haematological Analysis:
Diagnostic Samples: From the Patient to the Laboratory: The Impact of Preanalytical Variables
on the Quality of Laboratory Results. 4th ed. Wiley - Blackwell Publications; 2009. pp. 36–7.
[Google Scholar]
41. Weibrich G, Hansen T, Kleis W, Buch R, Hitzler WE. Effect of platelet concentration in
platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration. Bone. 2004;34:665–71. [PubMed]
[Google Scholar]
42. Woodell-May JE, Ridderman DN, Swift MJ, Higgins J. Producing accurate platelet counts for
platelet rich plasma: Validation of a hematology analyzer and preparation techniques for
counting. J Craniofac Surg. 2005;16:749–59. [PubMed] [Google Scholar]