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Appel d’offre2009 du GDR Ecchis 2009

Culture des communautés microbiennes hydrothermales en bioréacteur, Mise au point


d’une technique d’identification en temps réel des micro-organismes cultivés.

Equipes impliquées

Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes (UMR6197) Ifremer


Anne Godfroy , Françoise Lesongeur , Post Doctorant Ifremer (recrutement Novembre 2009)

Laboratoire Universitaire de Biodiversité et Ecologie Microbienne (EA3882) ESMISAB


Georges Barbier, Franck Deniel

Contexte scientifique

Dans les écosystèmes hydrothermaux sous-marins profonds les micro-organismes sont


soumis à des conditions parmi les plus extrêmes et instables de la planète. Le gradient
thermique et géochimique qui résulte du mélange entre les fluides hydrothermaux
surchauffés et l’eau de mer ambiante génère une variété d’habitats pour les
microorganismes. Ainsi des micro-organismes psychrophiles, mésophiles thermophiles et
hyperthermophiles prospèrent en utilisant les abondantes sources organiques et
inorganiques d’énergie et de carbone disponibles. Ces micro-organismes libres, forment des
tapis ou des biofilms sur les sédiments, les surfaces ou les animaux. D’autres sont des
symbiotes obligatoires associés aux invertébrés. Au cours des 20 dernières années les
microbiologistes ont obtenus des données conséquentes sur la diversité et la physiologie
des micro-organismes associées à ces écosystèmes uniques. De façon traditionnelle la
diversité microbienne a été estimée par des approches culturales. Ces études, ciblées
initialement sur les microorganismes thermophiles hétérotrophes, ont été étendues par la
suite à d’autres groupes métaboliques et ont conduit à l’isolement d’une centaine d’espèces
appartenant aux règnes des Archaea et des Bacteria et impliquées dans la plupart des
cycles biogéochimiques. Cependant recréer les conditions physico –chimiques d’un
écosystème en culture est difficile et conduit inévitablement à une vision biaisée de la
diversité. Ceci est d’autant plus vrai en ce qui concerne l’écosystème hydrothermal car le
développement de milieu de cultures appropriés et la reconstitution des conditions
environnementales sont extrêmement difficiles. Plus récemment la diversité microbienne des
écosystèmes hydrothermaux sous-marins profonds a été étudiée en faisant appel aux
techniques moléculaires. Les études moléculaires (Corre et al., 2001, Nercessian et al.,
2003, Takai & Sako, 1999, Schrenk et al., 2004, Schrenk et al., 2003, Reysenbach et al.,
2000), principalement fondées sur l’analyse des séquences des gènes codant pour les ARNr
16S donnent une image des communautés microbiennes présentes dans l’écosystème mais
ne permettent pas d’inférer du rôle des microorganismes détectés, notamment si ceux ci
appartiennent à des phylums pour lesquels il n’existe aucun représentant cultivé; cette
approche assimilatrice ne rend pas compte de la diversité phénotypique qui existe au sein
d’un phylum. Il apparaît ainsi clairement qu’aucune des deux approches culturales et
moléculaire n’apportera seule les réponses aux questions que nous nous posons sur la
biodiversité et le fonctionnement des ces écosystèmes. Ainsi les méthodes culturales restent
cruciales pour accéder et comprendre la diversité physiologique des organismes de cet
écosystème.
Le développement de « nouveaux » systèmes de cultures en conditions naturelles simulées
apparaît comme une étape indispensable en vue de cultiver des communautés microbiennes
plutôt que des souches pures (Palleroni, 1997). La maîtrise au laboratoire des techniques de
fermentation des espèces hyperthermophiles (Godfroy et al., 2006, Godfroy et al., 2000)
nous a conduit à réaliser des cultures d’enrichissement en continu, à haute température sur
un milieu de culture riche en matière organique à partir d’échantillons de cheminées
hydrothermales (thèse d’Anne Postec 2005). Ce travail a permis d’obtenir des cultures de
populations microbiennes anaérobies thermophiles ou hyperthermophiles, sur plusieurs
semaines et à différentes températures. Le suivi des populations cultivées a été réalisé par
une approche moléculaire (amplification des gênes codant pour les ARN ribosomaux 16S,
séparation par DGGE ou clonage, puis séquençage) qui a révélé la dynamique des
populations cultivées et une diversité supérieure à celle obtenue par les techniques
d’enrichissements classiques en flacon (Postec et al., 2007, Postec et al., 2005b). Des
espèces détectées par l’analyse moléculaire ont pu être cultivées et isolées et décrites :
Marinitoga hydrogenitolerans (Postec et al., 2005a) et Thermodesulfatator atlanticus (Alain et
al, sous presse). Dans les édifices hydrothermaux actifs les communautés de micro-
organismes sont soumises à un gradient physico-chimique abrupt résultant du mélange
entre le fluide hydrothermal chaud et l’eau de mer froide. Ce mélange turbulent engendre le
passage de conditions anaérobies strictes à des conditions aérobies parallèlement à la
diminution de température. A ces variations de l'habitat sont associées des modifications de
nature des donneurs et des accepteurs d’électrons; l'ensemble de ces variations va
conditionner les métabolismes mis en oeuvre par ces communautés. La possibilité de
maintenir en culture sur une longue durée, une fraction des populations microbiennes
thermophiles et hyperthermophiles des édifices hydrothermaux, permet d’évaluer in vitro
l’influence des variations de certains paramètres de l'habitat sur les populations
microbiennes cultivables. Ainsi lors de la réalisation d’une culture d’enrichissement en
conditions oligotrophe, les variations de la température, la nature des donneurs ou
accepteurs d’électrons ont permis de mettre en évidence un effet sur les communautés
cultivés (Doctorat N.Byrne 2008),(Byrne et al., in press). Une diversité phylogénétique mais
également une diversité phénotypique inattendue ont ainsi été mises en évidence. Par
exemple, des souches du genre Thermococcus ont révélé des compétences métaboliques
jusqu’ici insoupçonnées suggérant que ces micro-organismes pourraient être parmi les
premiers colonisateurs des édifices hydrothermaux, voire même être issues d’une biosphère
de subsurface. Cependant il n’a pas toujours été possible d’obtenir en culture pure tous les
micro-organismes détectés lors des cultures de communautés. En effet les analyses
moléculaires qui ont permis d’identifier les micro-organismes présents dans les cultures
d’enrichissement en bioréacteur (amplification par PCR des gènes codant les ARNr 16S
clonage ou bien DGGE et SSCP puis séquençage), sont des techniques lourdes et
consommatrices de temps et ont jusqu’ici été réalisée a posteriori. Ainsi de nombreuses
tentatives d’isolement des micro-organismes identifiés n’ont pas pu aboutir à l’obtention de
souches pure et donc d’accéder à leurs caractéristiques phénotypiques. Une des raisons
pouvant expliquer les échecs de purifications constatées est que ces tentatives d’isolement
ont été réalisées plusieurs mois après la culture sur des échantillons dont la conservation a
pu ne pas être optimale.
D’autre part une étude récente (Doctorat N.Byrne, 2008, (Byrne et al., 2009)) a permis de
mettre en évidence, et ce pour la première fois, la présence de micro-organismes capables
de réaliser l’oxydation anaérobie de l’ammonium (micro-organismes Annamox) dans
l’écosystème hydrothermal. La présence et l’activité de ces micro-organismes ont été mise
en évidence d’une part grâce à la détection des signatures moléculaires spécifiques de ces
organismes (séquences d’ARN16S et présence de lipides ladderannes) dans différents
compartiments de l’écosystème hydrothermal, et d’autre part par la réalisation de mesure
15
d’activité par l’incorporation de l’isotope stable de l’azote ( N). La mise en évidence dans les
édifices hydrothermaux de micro-organismes Anammox actifs permet d’émettre l’hypothèse
que le cycle de l’azote peut fonctionner à haute température et que les micro-organismes
Anammox responsables appartiennent à un nouveau clade au sein des Planctomycètes
Anammox. L’existence au sein du Phylum des planctomycètes Anammox d’espèces
thermophiles présente non seulement un intérêt quand au fonctionnement du cycle de
l’azote dans les environnements extrêmes mais est également extrêmement intéressant d’un
point de vue évolutif. L’obtention en culture de ces micro-organismes viendrait confirmer
cette hypothèse.
Projet :

Le développement d’une technique permettant la détection rapide (en quelques jours si ce


n’est en temps réel) des micro-organismes présents dans une culture d’enrichissement
pourrait permettre non seulement de procéder plus rapidement à la réalisation des sous-
cultures à partir de la culture active d’enrichissement puis à la purification des espèces
nouvelles mais également d’évaluer rapidement tout changement dans la structure des
communautés microbienne cultivées si un des paramètre environnemental est modifiés
comme cela se produit dans l’écosystème. Parmi les méthodes moléculaires récentes la
technique de DHPLC (Nocker et al., 2007) permet d’accéder à la diversité des
microorganismes présents dans une communautés microbienne. Les fragments d’ADN
obtenu par amplification par PCR d’une portion des gènes codant pour les ARN ribosomaux
16S (ou de gènes de fonction) sont séparés par HPLC en conditions dénaturantes,
théoriquement à chaque pic d’élution obtenu correspond une espèce de Bacteria ou
d’Archaea. L’avantage de cette technique par rapport aux techniques habituellement utilisée
telles que la DGGE, la TGGE et la SSCP est sa facilité et sa rapidité de mise en oeuvre mais
surtout la possibilité de récupérer, grâce à un collecteur de fractions, les fragments d’ADN
correspondant aux différentes espèces. Les fragments d’ADN obtenus peuvent être
séquencés rapidement afin d’accéder à l’identité des espèces constituant la communauté.
Ainsi la mise en évidence d’une nouvelle espèce microbienne pourra être immédiatement
suivie de sa purification à partir de la culture d’enrichissement active.
Un équipement de DHPLC (Système Wave System Microbial), est en cours d’acquisition
dans le laboratoire dirigé par Georges Barbier à l’ESMISAB dans le cadre du programme
Souchotèque 2 financé dans le cadre du CPER.

Nous proposons donc dans le cadre d’un post doctorat sur financement Ifremer :

-D’une part de tester l’utilisation de la technique de DHPLC sur des échantillons d’ADN issus
de travaux de cultures de communautés précédents (Doctorat de N. Byrne) pour lesquels
nous possédons les données moléculaires de diversité (clonage et séquençage et suivi
temporel par SSCP). Ce travail pourra aboutir à la rédaction d’une publication
méthodologique.
-Et d’appliquer l’utilisation de cette technique à de nouvelles cultures de communautés en
bioréacteur, notamment en conditions d’autotrophie sous différentes conditions
physicochimiques.
-D’autre part de mettre en route une culture visant à l’enrichissement des micro-organismes
Anammox détectés dans des échantillons de cheminées hydrothermales, et d’estimer
l’enrichissement des micro-organismes Anammox par DHPLC et grâce à des mesures
d’activité1.

Demande financière :

La somme demandée concerne l’achat : d’une colonne haut débit pour la séparation
des acides nucléiques (3000€), des tampons d’élutions (1000€), d’une lampe de détection,
de pré-filtres et seringues d’injection (1000€) indispensables au fonctionnement de la
DHPLC, soit un total de 5000€

1
Ces travaux seront réalisée en étroite collaboration avec le laboratoire « Institute of Wetland and Water Ecology » à Nijmegen,
aux Pays-Bas, laboratoire qui dispose d’une compétence avérée dans ce domaine.
Références Bibliographiques :
Alain, K.,A. Postec, E. Grinsard, F. Lesongeur, D. Prieur and A. Godfroy . Thermodesulfatator atlanticus sp. nov., a novel
thermophilic, chemolithoautotrophic, sulfate-reducing bacterium isolated from a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology soumis
Byrne, N., F. Lesongeur, N. Bienvenu, C. Geslin, K. Alain, D. Prieur & A. Godfroy, (in press) Effect of variation of environmental
conditions on the microbial communities of deep-sea vent chimneys, cultured in a bioreactor. Extremophiles.
Byrne, N., M. Strous, V. Crépeau, B. Kartal, B. Jean-Louis, M. C. Schmid, F. Lesongeur, S. Schouten, A. Jaeschke, M. S. M.
Jetten, D. Prieur & A. Godfroy, (2009) Presence and activity of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria at deep-sea
hydrothermal vents. The ISME Journal 3: 117-113.
Corre, E., A.-L. Reysenbach & D. Prieur, (2001) e-Proteobacterial diversity from a deep-sea hydrothermal vent on the Mid-
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Godfroy, A., N. D. H. Raven & R. J. Sharp, (2000) Physiology and continuous culture of the hyperthermophilic deep-sea vent
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Nercessian, O., A.-L. Reysenbach, D. Prieur & C. Jeanthon, (2003) Archaeal diversity associated with in situ samplers deployed
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Postec, A., F. Lesongeur, P. Pignet, B. Ollivier, J. Quérellou & A. Godfroy, (2007) Continuous enrichment cultures: insights into
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Reysenbach, A. L., K. Longnecker & J. Kirshtein, (2000) Novel bacterial and archaeal lineages from an in situ growth chamber
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Schrenk, M. O., D. S. Kelley, S. A. Bolton & J. A. Baross, (2004) Low archaeal diversity linked to subseafloor geochemical
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Schrenk, M. O., D. S. Kelley, J. R. Delaney & J. A. Baross, (2003) Incidence and Diversity of Microorganisms within the Walls of
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