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La Stérilisation

I – Définition

La stérilisation est une opération pharmaceutique qui consiste à priver un


médicament ou un objet des microorganismes qui le souillent. Ces
microorganismes seront, selon les cas, détruits ou éliminés.

Les procédés utilisés et les précautions à prendre doivent être tels qu’en fin
d’opération, la probabilité de trouver une unité non stérile doit être inférieure
à 10-6.

II- Les produits stérilisés :

En pharmacie, on a recours à la stérilisation pour :

 des médicaments : préparations injectables, collyres, produits destinés à


être appliqués sur certaines blessures et brûlures ;
 du matériel utilisé lors d’opérations chirurgicales (instruments, lingerie
opératoire, fils à ligatures) ;
 du matériel à injection : seringues, aiguilles, cathéters, sondes ;
 les objets de pansement ;
 les tubes de recueil des prélèvements ;
 la nourriture des immunodéprimés (voie entérale) ;
 les prothèses et les drains ;
 ainsi que les locaux dans lesquels doivent être préparés aseptiquement
des médicaments.

III – Méthodes de stérilisation :

 La stérilisation par la vapeur d’eau.


 La stérilisation par la chaleur sèche.
 La stérilisation par irradiation.
 La stérilisation par les antiseptiques gazeux.
III – 1 – La stérilisation par la chaleur :

III – 1 – 1 – facteurs influençant :

La destruction des germes par la chaleur dépend d’un certain nombre de


facteurs liés aux conditions opératoires, à la nature des germes et à leur
nombre. La sensibilité des germes à la chaleur dépend :

● De l’espèce microbienne et pour une même espèce, de la nature


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végétative ou sporulée du germe : les spores sont plus résistantes que les
formes végétatives.

● De la durée du traitement et du nombre de germes :

La quantité de germes présents dans le


Nombre de
germes
milieu joue un rôle important. Il existe
survivants une relation logarithmique entre la durée
d’un traitement à la chaleur et le nombre
de germes survivants dans le milieu
traité, qui se traduit par une courbe
exponentielle qui tend vers 0 sans jamais
l’atteindre.

La stérilisation étant une probabilité mais non une certitude absolue, il est
indispensable, si l’on veut augmenter les chances de réalisation d’une bonne
stérilisation : d’avoir le moins de germes possible avant l’opération

● De la température : le temps nécessaire à la destruction des spores d’une


espèce microbienne en fonction de la température peut être représenté par
une courbe qui, avec des coordonnées semi logarithmiques, donne une
droite :

temps
100
30
Temps qui assure pour chaque température
9 une réduction de 1012 à 100 de spores de
3 Clostridium botulinum

1
°C
0 100 105 110 115 120
à
à
à

Valeur stérilisatrice F :

On appelle valeur stérilisatrice F, pour une température donnée, le temps


nécessaire pour réduire de 105 à 100 le nombre des spores par millilitre de
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préparation, par exemple :

 à 120°C, F = 3 mn
 à 100°C, F = 30 mn

Cycle de stérilisation :

Le cycle de stérilisation ou barème de stérilisation est dit de la courbe


d’évolution de la température à l’intérieur des récipients en fonction du
temps. Cette courbe comprend une partie ascendante (montée en
température), un plateau correspondant au maintien de la température
choisie, et une partie descendante correspondant à la période de
refroidissement.

Temp
● De la nature du milieu : en milieu s sec, les germes sont beaucoup plus
difficiles à détruire qu’en milieu humide; en chaleur sèche il s’agirait surtout
d’oxydation et en chaleur humide de coagulation des protéines.

La destruction des microorganismes est plus aisée en milieu acide ou alcalin ou


en présence d’une activité bactériostatique de certains principes actifs, se
manifestant à chaud.

III- 1- 2- La stérilisation par la chaleur sèche :

On utilise des fours ou étuves à air chaud (type four Pasteur ou stérilisateur
Poupinel), chauffés électriquement et équipés d’un système de ventilation
pour assurer une homogénéité de la température dans l’enceinte. On chauffe
habituellement à 180°C pendant 30 minutes ou 1 heure pour stériliser
essentiellement le matériel métallique et les récipients en verre. Pour un
meilleur rendement, ces derniers peuvent être stérilisés en continu dans des
fours tunnels.

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III- 1- 3- La stérilisation par la chaleur humide :

C’est la méthode recommandée chaque fois qu’elle est possible. Elle permet la
destruction des germes à une température de 120°C maintenue 20 minutes.
Elle se pratique dans un autoclave.

Autoclave :

C’est une enceinte cylindrique, en acier inoxydable munie d’un couvercle fixé
par des boulons. L’étanchéité est assurée par un joint en caoutchouc.
Différents systèmes de contrôle et de sécurité sont fixés sur le couvercle :

 un manomètre gradué en pression et en température ;


 une soupape de sécurité pour éviter les surpressions ;
 un robinet d’évacuation de l’air ou de la vapeur.

À l’intérieur se trouve un panier métallique perforé dans lequel seront placés les
objets et produits à stériliser, au dessus d’une petite quantité d’eau. Le
chauffage est assuré électriquement ou avec de la vapeur surchauffée.

En général, le manomètre est gradué en excès d’atmosphère sur la pression


normale. Au moment de la fermeture du robinet d’échappement, le
manomètre est au zéro ce qui correspond à 100°C. Ensuite, on a
approximativement les correspondances suivantes :

0,5 atmosphère + 110°C

1 atmosphère + 121°C

2 atmosphères + 134°C

3 atmosphères + 144°C

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Autoclave de laboratoire

Fonctionnement :

Après remplissage (eau et objets à stériliser) et fermeture de l’autoclave, le


chauffage est allumé robinet d’évacuation ouvert, ce qui permet de purger
tout l’air présent dans l’autoclave. Le robinet est fermé dès la sortie de
vapeur (l’air est éliminé car il est mauvais conducteur de chaleur et risque
d’être responsable des retards voire des défauts de stérilisation).

La température et la pression intérieures vont augmenter parallèlement (réglage


classique à 1 atmosphère soit 121°C). Lorsque la pression est atteinte, le
chauffage est réglé pour la maintenir ainsi pendant 20 minutes. Le chauffage
est ensuite arrêté et l’autoclave se refroidit lentement. Le robinet
d’échappement ne sera ouvert qu’après retour du manomètre au zéro
(100°C) sinon la dépression brutale provoquera l’ébullition des liquides et
l’éclatement des ampoules et des flacons qui les contiennent.

Les autoclaves industriels sont en général horizontaux et à ouverture latérale


pour permettre un chargement et un déchargement par chariots à plateaux.

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Les autoclaves industriels en continu :

Pour la stérilisation de produits préparés en grande quantité (exemple : flacons


pour perfusion de chlorure de sodium à 9 ‰ ou de glucose à 10 %), certains
appareils permettent de stériliser en continu. Dans ces stérilisateurs, deux
colonnes d’eau hautes de 10 mètres maintiennent sous pression de 2
atmosphères la partie inférieure de l’appareil où arrive la vapeur, à la
température de 120°C.

Les flacons à stériliser arrivent en continu et se réchauffent progressivement


dans la première colonne. Ils passent pendant un temps choisi de 25 à 30
minutes dans la vapeur à 120°C où ils sont stérilisés avant de remonter
dans la colonne d’eau froide.

III – 2 – La stérilisation par les rayonnements :

Le développement de l’utilisation des rayonnements notamment ionisants a


connu un essor industriel pour stériliser le matériel thermosensible (matériel
médicochirurgical ou non réutilisable dans la pratique hospitalière).

II – 2 – 1 – Rayons ultraviolets :

Le pouvoir microbicide de ce rayonnement est très élevé. Malheureusement, il


est surtout important pour les courtes longueurs d’onde qui présentent
l’inconvénient d’être absorbées par la matière.

- Au dessus de 3000 Ǻ :ils sont pénétrants mais ne sont pas


microbicides.

- Entre 2000 et 3000 Ǻ, ils sont microbicides mais ne traversent que


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l’eau pure.

- En dessous de 2000 Ǻ, leur action microbicide devient considérable


mais ils sont arrêtés par une mince couche d’eau.

En Pharmacie, ce mode de stérilisation ne peut être appliqué aux préparations


en ampoules ou en flacons car les rayons U.V. ne peuvent franchir les parois
de verre ; il n’est utilisé que pour la stérilisation de l’atmosphère des
enceintes stériles.

Pour la stérilisation de l’air, il est à noter que ces lampes à ultraviolet n’agissent
qu’en rayonnement direct : il ne doit y avoir aucun obstacle entre les lampes
et les germes à détruire.

Autre inconvénient, ils peuvent provoquer des accidents oculaires très graves ;
les opérateurs doivent porter des lunettes protectrices.

II – 2 – 2 – Les ionisants :

Le procédé fait appel soit à des rayonnements électromagnétiques de grande


énergie (rayons gamma) soit à des rayonnements corpusculaires
électroniques (rayons bêta).

Cette radiostérilisation est obtenue soit des radioéléments, type Cobalt 60, qui
émettent des photons gamma, très bactéricides et très pénétrants, soit par
des accélérateurs d’électrons qui émettent un rayonnement bêta. La
radiostérilisation est très utilisée pour le matériel médicochirurgical, du
textile opératoire et des compresses, en raison de la nature du procédé, elle
ne peut être réalisée que par un centre spécialisé.

II – 2 – La stérilisation par les antiseptiques gazeux :

Les gaz permettent de stériliser à des températures plus basses qu’avec la


stérilisation par la chaleur. Ils traitent le matériel thermosensible (matières
plastiques, par exemple). L’oxyde d’éthylène et le formaldéhyde représentent
les principaux gaz utilisés pour la stérilisation. D’autres gaz, cependant,
peuvent être utilisés pour des applications particulières : l’acide peracétique
(ne permet pas de stériliser le produit dans son emballage).

II – 2 – 1 – La stérilisation par l’oxyde d’éthylène :

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L’oxyde d’éthylène est un gaz bactéricide très réactif, ce qui constitue un
avantage pour son efficacité comme agent bactéricide, mais pose le problème
de sa sécurité d’emploi (explosif et toxique) et de sa lenteur et difficulté
d’élimination du matériel.

Instable, inflammable et explosif dans l’air ; il peut exploser lorsque sa


concentration est supérieure à 30 %. Ceci oblige à le stabiliser par des gaz
inertes diluants de deux types :

 le carboxyde : comprenant 10 % d’oxyde d’éthylène et 90 % de CO2,


 le cryoxyde : comprenant 12 % d’oxyde d’éthylène et 88 % de fréon.

À doses supérieures à 1 g/m3, il peut entrainer des troubles de type : nausées,


vomissements, vertiges ; on a observé chez des malades, lors d’une
utilisation par voie parentérale, des phénomènes hémolytiques, des sténoses
trachéales, des collapsus cardiovasculaires.

La toxicité par contact est fréquente chez le personnel de stérilisation : elle se


traduit par des phénomènes allergiques plus ou moins importants.

● Conduite d’une opération de stérilisation par l’oxyde d’éthylène :

Les procédés consistent à introduire l’oxyde d’éthylène (pur ou en mélange) dans


une enceinte hermétiquement close où le vide a été fait préalablement. Ce
vide a pour but d’extraire l’air de l’enceinte d’une part et des objets à
stériliser d’autre part. Après un contact de plusieurs heures, une succession
de plusieurs rinçages élimine l’oxyde d’éthylène de l’enceinte. Un rinçage
consiste dans un premier temps à éliminer par dépression de l’oxyde
d’éthylène puis dans un deuxième temps à l’introduction d’air stérile dans
l’enceinte.

Après la stérilisation, la désorption sera plus ou moins longue selon la nature


des polymères : certains permettront une désorption rapide, d’autres une
désorption lente.

II – 2 – 2 – La stérilisation par le formaldéhyde :

elle associe la vapeur d’eau à basse température au formaldéhyde. Celui-ci


existe sous trois états possibles : phase gazeuse, dilution aqueuse, phase

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solide.

L’effet bactéricide est identique à celui de l’oxyde d’éthylène :

● Alkylation des acides nucléiques.

● Dénaturation des protéines de la paroi des microorganismes.

Principe général de déroulement d’un cycle de stérilisation :

L’appareil utilisé est généralement un autoclave avec programmateur permettant


de réaliser :

- soit des cycles classiques vapeur d’eau sous pression 121°C ou


134°C ;
- soit des cycles sous vide avec vapeur d’eau et formaldéhyde à la
température de 55°C ou 80°C.
Un rinçage est nécessaire à la fin afin d’éliminer les résidus de formaldéhyde. Il
se fait à l’air stérile.

II – 2 – 3 – La stérilisation par l’acide péracétique :

C’est un liquide incolore à la température ordinaire, on ne le rencontre pas à


l’état pur mais sous forme d’un mélange en équilibre de quatre
constituants :

CH3 COOOH + H2O CH3COOH +


H2O2

L’efficacité de l’acide péracétique est due à la libération d’oxygène sous forme


atomique, oxydant très puissant qui agit sur la paroi cellulaire et les
constituants cytoplasmiques des microbes. Son utilisation est adaptée à la
stérilisation des bulles ou isolateurs en matière plastique utilisés pour les
fabrications stériles et pour les contrôles microbiologiques.

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III – 3 – Stérilisation par filtration :

Ce procédé s’applique aux produits qui ne supportent pas un traitement


stérilisant final par l’un des autres procédés en raison de leur sensibilité. Il
permet l’élimination de bactéries éventuellement présentes dans un liquide
ou un gaz par rétention

Il s’agit d’une technique de microfiltration. La porosité de 0,22 μm permet


d’arrêter toutes les bactéries pathogènes pour l’homme. Deux catégories de
filtre existent ::

● Les membranes filtrantes (filtres écrans) : composées d’une très mince


pellicule de film comportant des pores cylindriques, rectilignes,
perpendiculaires à la surface, de dimensions égales, chaque cm2 de surface
contient des millions de pores qui occupent environ 80% du volume total de
la membrane. Ils agissent par criblage à la façon d’un tamis. Les membranes
sont en esters de cellulose (acétate, nitrate), en nylon, en fluorure de
polyvinylidène, en teflon, …

● Les filtres en profondeur : composés d’agglomérats de fibres plus ou moins


compressées ou de matériaux frittés, ils possèdent une structure spongieuse
consistant en un labyrinthe de pores sinueux reliés les uns aux autres.

Il est fréquent d’associer ces deux types de filtres en une combinaison


préfiltration – filtration pour obtenir une meilleure efficacité.

L’intégrité de la membrane filtrante doit être vérifiée en routine pour s’assurer


de son efficacité, avant et après stérilisation.

Installation de filtration
stérilisante

Cuve de fabrication Cuve de stockage


Filtre
Solution non stérile stérilisant Solution stérile

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III – 4 – La préparation dans des conditions aseptiques :

Ce mode d’obtention de produits stériles est réservé aux produits qui ne peuvent
subir aucun traitement de stérilisation dans leur conditionnement définitif.
C’est le cas de certaines préparations pour usage parentéral, notamment les
poudres pour préparations injectables, de certains vaccins et de certains
réactifs de laboratoire.

Ces types de produits sont préparés dans des enceintes de dimensions diverses :
il peut s’agir d’une vitrine, de l’entourage d’une machine, ou d’une salle
entière de fabrication.

Etant donné la complexité des installations, les exigences dans le degré de


l’asepsie à réaliser selon les fabrications sont diverses.

III – 4 – 1 –filtration de l’air

L’élimination des microbes fait appel à l’emploi de filtres dits « absolus » ou


HEPA (Haute Efficacité pour les Particules de l’Air). Ce sont des filtres en
plaques pliées en accordéon pour augmenter leur surface de contact et. Ces
filtres doivent être rigoureusement contrôlés, par exemple par le test DOP
(Dioctylphtalate) : les particules de fumée de DOP obtenues dans des
conditions particulières ont un diamètre de 0,3 μm environ. Les filtres
doivent avoir une efficacité d’eau moins 99,97%.

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II – 4 – 2 – Enceintes stériles :

● Enceintes stériles classiques :

On distingue les vitrines et les salles stériles :

- Les vitrines stériles :

Elles sont de taille réduite, closes et l’opérateur se trouve à l’extérieur. Les


opérations y sont réalisées à l’aide de gants étanches fixés sur la paroi (boite
à gants) ou à l’aide d’un demi-scaphandre.

Gants Demi-scaphandre

Isolateurs ou bulles

- Les salles ou blocs stériles :

Dans ce cas, les manipulateurs se trouvent à l’intérieur et constituent une


source de contamination importante. Des lampes U.V. sont placées un peu
partout par précaution supplémentaire.Le gros matériel est stérilisé sur
place dans l’enceinte à l’aide de formol ou d’acide péracétique entre les
heures de travail du personnel.

Le personnel revêt des vêtements stériles : combinaison, masque, bottes, gants,


lunettes de protection contre les U.V.

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● Enceintes stériles à flux d’air laminaire :

Ces enceintes sont traversées par un flux d’air qui se déplace à une vitesse
uniforme le long de lignes parallèles verticales ou horizontales. Elles
comportent deux faces opposées poreuses dont l’une pour l’entrée de l’air est
équipée de filtres stérilisants juxtaposés de type HEPA. On les appelle aussi
salles blanches stériles.

À côté de ces enceintes stériles, il existe ce qu’on appelle des « hottesà flux
laminaire », de taille réduite, réservés à des opérations nécessitant des
appareils peu encombrants. Dans ce cas aussi, le flux d’air laminaire peut
être horizontal ou vertical. Ces postes de travail sont très utilisés en
microbiologie pour les ensemencements et dans les pharmacies hospitalières
pour la préparation aseptique des médicaments.

Hottes à flux d’air laminaire Tente à flux d’air laminaire

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Exemple d’une hotte à flux d’air laminaire

IV– Contrôle de stérilité

IV- 1- Contrôle microbiologique du produit :

Il se fait soit par :

- Ensemencement direct du produit

- Incubation de la membrane après filtration du produit.

● Limites de l’essai :

Un lot est stérile lorsqu’il contient moins d’une unité de conditionnement sur un
million qui ne soit pas stérile, c'est-à-dire contenant au moins un
microorganisme

Un résultat favorable signifie seulement qu’aucun microorganisme contaminant


n’a pu être décelé dans l’échantillon examiné dans les conditions de l’essai.
L’extension de ce résultat à tout un lot de produit nécessite la certitude que
toutes les unités qui le composent ont subi le procédé de manière identique.

IV- 2- Contrôle en cours ( les indicateurs de stérilité) :

En cours de stérilisation, un contrôle est réalisé pour être sûr que la


température a bien été atteinte à l’intérieur de l’autoclave. Dans la mesure
du possible, des sondes sont convenablement placées. À défaut, on introduit
avec les produits à stériliser des tubes témoins qui contiennent une
substance chimique pure ayant un point de fusion précis et une trace de
colorant (exemple : acide benzoïque qui fond à 120°C). Lorsque cette
température est atteinte, la substance fond et se colore par dissolution du
colorant.

Il existe aussi des peintures témoins qui changent de couleur en fonction de la


température et du temps de chauffage. Ces peintures sont étalées sur des
sparadraps ou des rubans adhésifs collés sur les objets à stériliser.

Les indicateurs les plus efficaces sont des préparations de microorganismes


sélectionnés en raison de leur forte résistance à la méthode de stérilisation
choisie. Cette souche doit être non pathogène et se développer facilement.
Des spores de Bacillus stearothermophilus sont recommandées comme
microorganismes témoins lors de la stérilisation par la vapeur.

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