Techniques d’analyses biologiques 02 (M212)

Méthodes de séparation :
Les techniques de sédimentation gravitaires ou centrifuges, séparent un
mélange en deux phases non miscibles grâce à la différence de masse volumique
entre ces phases.
Dans la décantation, seule intervient la gravité ou effet de la pesanteur. Dans la
centrifugation, la gravité est remplacée par la force centrifuge dont l’intensité
peut être beaucoup plus grande.

Dépôt d'une boue argileuse

Suivez la sédimentation photographies réalisées toutes
les dix minutes
Les techniques de sédimentation sont des procédés de séparation
de deux phases dont l’une ou l’autre ou les deux à la fois présentent
un intérêt :
- Si les deux phases obtenues sont récupérées, cette sédimentation
joue un rôle de séparation (écrémage du lait).
 Les techniques de sédimentation

- Lorsque la phase mineure est

rejetée et la phase majeure (milieu de
dispersion) est récupérée, la
sédimentation joue un rôle de
clarification (jus de fruits).

- Si la phase majeure est rejetée et la phase mineure récupérée, la

sédimentation joue un rôle de concentration (levurerie).
III.2 Décantation :
La décantation est une opération de séparation mécanique, sous
l’effet de la pesanteur, de plusieurs phases non-miscibles.il est ainsi
possible de séparer, soit plusieurs liquides non-miscibles de
densités différentes, soit des solides insolubles en suspension dans
un liquide. Dans le cas de deux liquides qui ne sont pas miscibles
(huile et l’eau par exemple) et après décantation, le liquide le plus
dense se place en dessous du liquide le moins dense.
Dans les laboratoires, ce procédé est utilisé lors des extractions
liquide-liquide impliquant une phase aqueuse et une phase
organique. Apres extraction, ces 2 phases sont séparées par
décantation.

Application de la décantation
•traitement des eaux usées
•Dessablage
•Déshuilage
Calcule de la vitesse de sédimentation

Lors de la sédimentation de particules solides de masse m, de

diamètre d et de masse volumique S (Rhô) dans un milieu
fluide de masse volumique  L et de viscosité η (éta), au repos,
les particules sont soumises à l’action de trois forces :

•le poids,
•la poussée d’Archimède,
•les forces de frottement exercées sur
la particule par le fluide, du fait de sa
viscosité.
 Calcule de la vitesse de sédimentation
Son déplacement dépend de la résultante de la poussée d’archimède,de la force de
frottement et de la force de la pesenteur ;la particule va flotter (résultantes des
forces > force de la pesanteur) ou au contraire, elle va décanter avec une vitesse
spécifique (résultantes des forces < force de la pesanteur).
En se déplacant dans un fluide, une particule subit des forces de frottment. Ces
forces sont définies par l loi de stocks.Si la particule est de forme sphérique avec un
rayon r , cette loi est fonction du r (en m), de la viscosité du fluide (η).sa formule
est:
 Calcule de la vitesse de sédimentation

N.B: la vitesse de sédimentation augmente avec la différence de

masse volumique particule-fluide p - f , l’accélération de la
pesanteur g, le diamètre de la particule.
La vitesse de sédimentation diminue lorsque la viscosité du milieu
augmente, ou le diamètre des particules diminue. Les particules de
plus gros diamètre sédimentent plus rapidement que les particules de
petit diamètre.
 :
La centrifugation est une sédimentation accélérée dans laquelle g
(=l’accélération de la pesanteur) est remplacée par l’accélération
centrifuge.
III.3 .1Principe de la centrifugation :
Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer
jusqu’à ce qu’elle rencontre une résistance capable de l’arrèter. ce
principe est couramment utilisé en biochimie pour séparer des
précipités, des cellules, des organites et des macromolécules (par
exemple, des lipoprotéines).
lorsque les particules en suspension dans leur solvant sont ainsi
placées dans le rotor d’une centrifugeuse; la mise en oeuvre de la
centrifugation génère une accélération qui pousse les particules
vers l’extérieur du rotor, donc vers le fond du tube de
centrifugation.
— vitesse de sédimentation dans le champ centrifuge (centrifugation
avec D diamètre de particule (la particule est supposée sphérique),
Δρ : différence de masses volumiques,

η : viscosité dynamique du liquide porteur,

g : accélération due à la pesanteur,
rω2 accélération centrifuge,
N : vitesse de rotation (en tr/min).
 Le taux ou coefficient de sédimentation lors de l'ultracentrifugation
d'une macromolécule. est calculé en divisant la vitesse constante de
la particule sédimente (en m/s) par l'accélération appliquée (en
m/s²).
La constante de Svedberg caractérise une particule dans un milieu
donné, elle est notée : S= (dr/dt) / ( w2.r)

L'unité de la constante de sédimentation est le Sveberg : 1S = 10-13 sec

F:forc centrifuge
W: vitesse angulaire de rotation
r: distance de l’axe de rotation
 La constante de sédimentation, qui peut être déterminée
expérimentalement, dépend de la masse moléculaire de la particule mais
aussi des conditions expérimentales

Autre expression de vs

N: représente la constante
d’Avogadro (N=6.02 X 10 23 mol-1 ).
•Le svedberg n'est pas additif
• Si on a un mélange de protéines avec des S différents, on
pourra séparer les protéines
unités Svedberg (S) unité de "taille" est particulièrement employée pour
caractériser les particules ribosomiques. C'est pourquoi on parle encore de
ribosomes 70 S chez les procaryotes et 90 S chez les eucariotes.
 La vitesse de rotation du rotor comportant les tubes de centrifugation est le
facteur limitant.la puissance du moteur faisant tourner le rotor est donc un facteur
important. selon le volume de matériel à centrifuger, l’accéléartion requise ou
encore la température de travail

Pour mesurer l’efficacité d’une centrifugeuse, on compare l’accélération centrifuge

(G) avec l’accélération de la gravité (g= 9.81m.s-2)
Nb G=G/ g = G /9.81
Exemple : une centrifugeuse dont le bol mesure 1 m de diamètre et tournant à la
vitesse de 4000 tours par minute (419 rad/s) a un nombre de G = 87780 ;
l’accélération centrifuge développée par la centrifugeuse est 87780 plus grande que
la pesanteur !
Dans une centrifugation, il faut connaître la force relative de centrifugation (force
de gravité relative, FGR, accélération) en "x g". Cependant pour une vitesse de
rotation donnée, chaque rotor a une FGR différente puisque que le rayon de
rotation est différent. Il faut donc être capable de convertir la vitesse de rotation
(RPM, rotations par minute) en FGR. Pour cela on peut se servir d'un
nomogramme ou de la formule mathématique de conversion. Celle-ci est:

g = 1.119 • 10-5 x r x N2
où g est la force relative de centrifugation, r est le rayon de rotation du rotor (en
cm) et N (rotations par minute, RPM) exprime la vitesse de rotation.
Inversement, et c'est ce qui est généralement le plus utile expérimentalement,
on peut calculer la vitesse de rotation (en RPM) pour atteindre une accélération
donnée:
 : Les modèles les plus simples, souvent
appellées centrifueuses cliniques, permettent d'atteindre de
faibles accélérations (1000 à 3000 xg) à des vitesses de rotation
relativement basses (moins de 3000 RPM). Certains modèles sont
réfrigérés, certains autres non.
Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles
permettent d'obtenir des vitesses de rotation de l'ordre de 30 000 RPM,
donnant pour les plus petits rotors des accélérations d'environ 20 000 xg. Tous
les modèles sont réfrigérés. Ces centrifugeuses permettent de centrifuger des
relativement gros volumes. Certains rotors peuvent même contenir quatre ou
six bouteilles de 250 mL.
 Ce sont des appareils complexes et coûteux qui
permettent d'atteindre des accélérations très élevées (jusqu'à 300 000 xg) en
faisant tourner des rotors très rapidement (50-85 000 RPM). De telles vitesses
de rotation ne peuvent s'obtenir que sous pression très réduite. Les faibles
pressions permettent aussi d'éviter la surchauffe du rotor et de l'échantillon.
Tous les modèles sont réfrigérés. Ces appareils doivent donc être munis de
pompe à vide et de systèmes de réfrigération. Les volumes sont quelques peu
limités, généralement on ne trouve pas de rotors pouvant contenir plus d'une
dizaine de tubes de 40 mL.
 On a aussi développé des centrifugeuses
spécialement conçues pour les micro-volumes très souvent employés en
biochimie moderne. Les microtubes à centrifuger sont des petits tubes
coniques généralement de 1.5 mL fait de polypropylène et assez peu
dispendieux. Les centrifugeuses de ce type peuvent être réfrigérées et
atteindre des accélérations de l'ordre de 12-15 000 x g. Les modèles les moins
couteux n'ont pas de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés.

Ce sont des appareils de moins en moins

utilisés. Ces centrifugeuses servent surtout à analyser la taille et la masse des
particules et des protéines. D'autres techniques beaucoup moins coûteuses
sont utilisées de nos jours: électrophorèse, filtration sur gel...
 Les rotors doivent supporter des accélérations importantes
mais ils doivent être suffisamment légers pours que le moteur
parvienne à les faire tourner. Ainsi, pour les centrifugations à faible
vitesse ,des rotors en acier peuvent être utilisés, mais pour les fortes
accélérations sont préférés des alliages à base de métaux à la fois
légers et résistances comme l’aluminium et le titane, et même des
rotors à base de fibres de carbone.
• chaque rotor a une vitesse maximale à laquelle on peut le faire
tourner .
• Les rotors sont munis d’un compte-tours(disque collé à la base du
rotor) permettant d’assurer le décompte des rotations effectuées par
le rotor et d’estimer ainsi son usure .
• Toutes centrifugation nécessite d’équilibrer parfaitement le rotors;
en particulier par la pesée des tubes contenant le liquide à
centrifuger, les tubes diamétralement opposés devant présenter une
masse identique.

• La précision de la pesée est d’autant plus critique que les

accélérations imposées sont plus implorantes ( cas des
ultracentrifugeuses).
• Ainsi, une différence de 1mg sous gravité normale devient 100 à
100 000g
• Au cours de l’opération d’équilibrage des tubes, il faut penser à
équilibrer l’intégralité du dispositif qu’on met dans le puits du rotors (
c’est-à-dire le tube,le bouchon, éventuellement l’adapteur).
Pour équilibrer deux tubes (ou bouteilles) à centrifuger on peut:
Manoeuvre
enlever du liquide dans le tube le plus
lourd
ajouter un solvant dans le plus léger
transférer le matériel du plus lourd au
plus léger
équilibrer chaque tube contre un tube
de solvant
Situation
si on peut se permettre de ne pas utiliser
toute la préparation et perdre du
matériel
si on peut se permettre de diluer la
préparation
si les deux tubes ont le même contenu et
peuvent être mélangés
si on a suffisamment de place dans le
rotor
 Il existe trois grands types de rotors

il sont faits de blocs de métal

(aluminium,titane ) dans lesquels sont creusés
des puits servant de logements aux tubes de
centrifugation,ces puits inclinés avec un certain
angle par rapport à l’horizontale (de 15 à 35°
selon les modèles).
 Le rayon de ces rotors étant relativement
court, il est assez facile de les faire tourner
rapidement.
 les particules sédimentent le long des parois
des tubes et s’accumulent sur les cotés du fond
des tubes de centrifugation
 Rotors d’ultracentrifugation analytique ( ASC Optima
ou ProteomeLab XL-A/L)
Dans ce système mobile, les godets disposés sur des crochets ou
sur un système mobile, les godets disposés sur des crochets ou sur un
système à bascule se réorientent quand débute la rotation du rotor et
passent en position horizontale sous l’effet de la force centrifuge.

Les particules peuvent ainsi sédimenter directement dans le fond

des tubes de centrifugation, sans heurter les parois des tubes (ce qui
peut être dommageable pour certaines particules).
Ce type de rotor est principalement utilisé pour des centrifugations
en gradient,discontinu ou continu;
Ils sont moins répandus et peuvent être utilisés des centrifugations
en gradient. Comme les rotors à angle fixe, les rotors verticaux sont
des blocs de métal résistants mais dont les puits destinés à contenir
les tubes sont verticaux . Donc, lors de l’accélération, le gradient
contenu dans le tube se réoriente horizontalement de façon
perpendiculaire à l’axe de rotation.
À l’arret de la centrifugation, le gradient revient en position verticale
dans le tube ,parallèlement à l’axe de rotation.
L’avantage des rotors verticaux est leur capacité à atteindre de
grandes vitesse de rotation ,ce qui réduit considérablement les
durées de centrifugation.
Ultracentrifugation permet d’obtenir des accélérations élevées
(>=100 000 g).les ultracentrifugeuses sont caractérisées par la
puissance de leur moteur et par l’établissement d’un vide très
poussé dans la chambre de rotation ,nécessaire à la réfrigération
et permettant d’éviter l’échauffement du rotor. Le but de
l’ultracentrifugation préparative est d’obtenir des préparations
purifiées de particules présents dans un milieu liquide, elle peut
être différentielle ou en gradient.
Dans cette méthode, le tube de centrifugation est initialement
rempli d’un mélange homogène de la solution à centrifuger .
Après centrifugation, on obtient habituellement deux fractions :
un culot contenant les particules sédimentées et un surnageant ou se
trouvent les particules.
Les deux fractions sont récupérées en décantant le surnageant .
cette méthode peut aussi être utilisée pour purifier des particules dont
la densité est plus légère que celle du solvant (par exemple,
les lipoprotéines);on parle alors d’ultracentrifugation de flottation.
 A 600g, pendant 10 minutes, on observe
la sédimentation du noyau et du
cytosquelette.
 A 15 000g, pendant 5 minutes, on
observe la sédimentation des
mitochondries, des lysosomes et des
peroxysomes.
 A 100 000g (ultracentrifugation),
pendant 60 minutes on observe la
sédimentation de la membrane plasmique,
des microsomes et des grands polysomes.
 A 300 000g, pendant 2heures on
observe la sédimentation des ribosomes et
des petits polysomes.
 Ce qui reste à la fin c’est la fraction
hydrosoluble du cytosol.
 Cette technique permet la séparation des particules selon leurs coefficients de
sédimentation.
 Dans ce type de centrifugation, la solution de macromolécules est déposée sous
forme de couche en haut d’un gradient de densité préparé auparavant
 Ce type de gradient minimise l’agitation par échauffement de la solution, ce qui
peut nuire à la résolution.
 On utilise le saccharose est souvent utilisé pour la séparation des fraction
cellulaires, qui est visqueux et biochimiquement inerte pour former le gradient .
(Figure ultracentrifugation zonale).
 Puisque la vitesse de sédimentation est une fonction plus sensible à la forme
d’une macromolécule qu’a sa densité, l’ultracentrifugation en zones sépare les
macromolécules de forme similaire selon leur masse
 Pendant la centrifugation, chaque espèce se déplace à travers le gradient à une
vitesse largement déterminée par leur coefficient de sédimentation et donc migre
comme une zone.
 À la fin de l’expérience, la récolte des fractions se fait par l’insertion d’une aiguille
au fond du tube de centrifugation et on collectionne le contenu du tube par un
collecteur de fraction .
 Cette méthode de centrifugation, aussi connue sous le nom de
centrifugation isopycnique, sépare les macromolécules selon leur
densité
 L’échantillon est dissout dans une solution concentrée d’une substance
dense qui diffuse relativement vite comme les sels CsCl et Cs 2SO4, et
qui est subie à des hautes vitesses de rotation
 Le fort champ centrifuge génère un gradient important de sel dans
lequel les composantes de l’échantillon se retrouvent en zone de
densités égales à celle de la solution de sel; autrement dit (1-
 ῡ.ρ)=0, donc aucune migration puisque v = 0
 la technique préférée pour séparer des macromolécules qui possèdent
une gamme de densités.
Par exemple:
 acides nucléiques (plasmide vs ADN génomique et ARN total) -
 ribosomes et polysomes
 -virus
 organites subcellulaires (microsome, mitochondries, …)
Le saccharose ("sucrose") est très souvent employé. Il permet d'atteindre des
densités assez élevées, de l'ordre de 1.3 g/mL avec du saccharose 2.5 M.
le chlorure de césium (CsCl) couramment utilisé, particulièrement dans la
séparation des acides nucléiques Ce sel peut atteindre une densité très élevée,
de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5 mol/L. D'autres sels de césium peuvent aussi être
employés comme le Cs2SO4.
Le tartrate de potassium KC4H5O6 :avec sa densité maximale de 1.48 g/cm, qui
peuvent servir pour la purification de virus labiles
Le Metrizamide™, de la compagnie Nyegard, est un dérivé iodobenzamido du
glucose. Il est très soluble et non chargé. Il permet d'atteindre des densités
assez fortes de l'ordre de 1.46 .
Le Ficoll™, un produit de la compagnie Pharmacia, est un polymère de glucose
l'épichlorohydrine, comme le Sephadex™ de la même compagnie. Son principal
avantage est qu'il peut produire des densités élevées sans générer de fortes
pressions osmotiques.
Le Percoll™, un autre produit de Pharmacia. Il s'agit ici de particules de gel de
silice recouvertes de polyvinylpyrolidone. Il permet de produire des densités de
l'ordre de 1.3 g/mL tout en maintenant de faibles pressions osmotiques et de
faibles viscosités.
 Le gradient est
préformé par des dépôts successifs de solution
de CsCl de densité croissante (Fig). Les
différents éléments s’accumulent aux interfaces
entre les solutions de densité différentes.

Ce sont des gradients

pour lesquels la variation de densité est continue.
Une solution de CsCl de densité donnée soumise
à une force de gravité intense forme
spontanément un gradient de densité continu
(Fig.). Les différents constituants vont alors
migrer jusqu’à atteindre le point précis où leur
densité est égale à celle du solvant formant des
bandes.
 : dessiccation des boues pour le traitement des eaux
usées ;
 : séparation de la crème du lait
(écrémage),extraction des huiles et des matières grasses (extraction de l'huile
d'olive), extraction du miel (apiculture) ;
: pour enrichir l’uranium avec l'isotope léger 235U;

: la séparation du plasma ou du sérum sur lesquels seront

pratiqués différents dosages, la clarification des urines pour dosages
spécifiques, etc.
 : la détermination de l’hématocrite, les dosages des
facteurs plasmatiques de la coagulation.
 détermination des anticorps irréguliers, des
groupes sanguins, lavage des hématies pour les débarrasser du plasma, etc.
 : pour la cytologie de liquides de différentes origines,etc.
 pour des épreuves de concentration des parasites,etc.
 .: la fréquence d’utilisation des
centrifugeuses est moindre dans ce domaine.
• Références bibliographiques
1. A ppareils et méthodes en biochimie et biologie moléculaire
;Bernard Hainque ,Bruno Baudin et philippe Lefebvre;edition
Médecine_sciences Flammarion ,2008,449 page .

2. Biochimie .Donald Voet,Judith G Voet , De Boeck superieur

2016,1784 pages.
3. Biologie cellulaire .Marc Maillet , Elsevier Masson 2006,618
pages.
4. Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation
Ultracentrifugation . Lucette BARDET . P 1 405
5. Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation
Décantation – Filtration.Par Jean HACHE. PE 1 415