Méthodes de Séparation 2010-2011 Nathalie Younan

Série 4: HPLC

Exercice 1 :

a) Vous essayez de séparer une mélange inconnu par chromatographie en phase

inverse avec un éluant 50% acetonitrile/ 50% H2O. Les pics obtenus sur le
chromatogramme se chevauchent et sont élués dans le domaine k’=2-6.
Pour améliorer la chromatographie de ce mélange, utiliseriez-vous une plus
forte ou plus faible concentration en acetonitrile ?

b) Vous essayez de séparer de nouveau un mélange inconnu sur phase normale

avec comme éluant : 50% hexane/ 50% methyl t-butyl ether. Les pics se
chevauchent avec un k’ compris entre 2 et 6.
Utiliseriez-vous une plus forte ou plus faible concentration d’hexane pour la
prochaine chromatographie de ce mélange ?

Exercice 2 :

a) Quels paramètres pourrait-on varier pour changer la résolution de deux pics

trop proches ?
b) Après optimisation d’une élution isocratique avec différents solvants, la
résolution de deux pics est de 1,2. Comment peut-on améliorer la résolution
sans changer les solvants d’élution ni le type de phase stationnaire ?

Exercice 3 :

a) Des composés aromatiques non polaires sont séparés par HPLC. La phase
stationnaire est une phase inverse C18 constituée de greffons de chaînes aliphatiques
à 18 carbones. L’éluant utilisé est un mélange 65% méthanol / 35% H2O.
Comment les temps de rétention seraient-ils modifiés en utilisant un mélange avec
90% de méthanol ?

b) Deux composés, octanoic acid et 1-aminooctane, sont chromatographiés sur la

même colonne HPLC décrite en (a) et en utilisant comme éluant un mélange 20%
méthanol / 80% tampon (pH 3.0).
Lequel des deux composés sera élué en premier ? Pourquoi ?

CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2COOH Octanoic acid

CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2 1-aminooctane
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Exercice 4 :

Quel est l’ordre d’élution des acides suivants en HPLC avec une colonne dont la
phase stationnaire est de type C18 et comme phase mobile un tampon formiate pH 9
(C = 200 mM) ?

1 acide linoléique CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO2H

2 acide arachidique CH3(CH2)18CO2H
3 acide oléique CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO2H

Exercice 5 :

Conditions expérimentales : la colonne a 4 mm de diamètre, 150 mm de long. Le

débit est de 1 mL/min. La phase stationnaire C18 est constituée de greffons de chaînes
aliphatiques à 18 carbones. L’élution est faite par un mélange isocratique de méthanol
(58%) et d’eau (42%) avec 1% d’acide acétique.

CO2CH3 CO2CH2CH3

CO2CH3 CO2CH2CH3

Diméthyl-phtalate Diéthyl-phtalate Acide benzoïque

A quels pics correspondent les composés représentés ci-dessus ? Expliquer l’ordre

d’élution.
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Exercice 6 :

Une phase stationnaire greffée pour la séparation d’isomères optiques a la structure

suivante :

Pour séparer les énantiomères d’amines, alcools ou thiols, les composés sont
préalablement dérivatisés avec un groupe nitro-aromatique qui augmente l’intéraction
des composés avec la phase greffée et les rend observables avec un détecteur
spectrophotométrique.

Quand le mélange est élué avec 20% 2-propanol / 80% hexane, l’énantiomère R est
élué avant l’énantiomère S, avec les paramètres chromatographiques suivants :

t R
R= = 7.7
= 4.53 t M = 1min
w

Pour l’isomère R, k’=1.35

a) Déterminer t1, t2 et w (unités en minutes)

b) Si les plateaux théoriques pour chaque pic sont les mêmes, déterminer w1/2
pour chaque pic.
c) L’aire d’un pic d’une gaussienne est : 1.064 x hauteur pic x w1/2 .
Admettons que les aires des deux pics soient égales, déterminer les hauteurs
relatives des pics (hR/hS).
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Exercice 7 : Taille des particules et efficacité de colonne

Un même échantillon est chomatographié en HPLC avec une colonne de 5 cm avec

phase inverse C18. Entre les chromatogrammes a et b, uniquement la taille des
particules remplissant la colonne diffère : 4
m (figure a) et 1.7
m (figure b).

a) Comment évolue l’efficacité de la colonne lorsque la taille des particules

diminue ? Justifier.

En général, les particules de silice occupent environ 40% du volume de la colonne et

le solvant environ 60%.
La colonne (figure a) a un diamètre interne de 4.6 mm et est utilisée à un débit, uv, de
3 mL/min. Le volume d’échantillon injecté dans la colonne est de 20
L.
La colonne (figure b) a un diamètre dc = 2.1mm.

b) Quel débit doit être utilisé dans la configuration de colonne b (figure b) afin
d’obtenir la même vitesse linéaire, ux, que la colonne a ?
Quel volume d’échantillon devra être injecté dans la colonne b ?