TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ACAPULCO

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA GENERAL
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM
NEGATIVAS

GRUPO B
ALUMNO: EDGAR JORDI CLAUDIO RAMIREZ
NO. CONTROL: 16320349
NO. EQUIPO: 1

DOCENTE: M.C. MIGUEL ÁNGEL DÍAZ ALDAY

ACAPULCO DE JUÁREZ, GRO., A 02 DE MARZO DEL 2019

Contenido
INTRODUCCIÓN......................................................................................................................... 3
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................................4
JUSTIFICACIÓN......................................................................................................................... 4
OBJETIVO GENERAL................................................................................................................5
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................................................................5
MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................................5
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO..............................................................................................5
METODOLOGÍA.............................................................................................................................6
Para identificación de cocos Gram negativos.................................................................6
Para identificación de bacilos Gram negativos...............................................................6
REFERENCIAS......................................................................................................................... 14
BIBLIOGRAFÍAS..........................................................................................................................14
LINKOGRAFÍAS...........................................................................................................................14
INTRODUCCIÓN

El aislamiento de los microorganismos, presentes en las muestras biológicas,

suele indicar que se trate del agente causal de la enfermedad infecciosa que se está
investigando y se lleva a cabo, utilizando medios de cultivo sólido contenido en una
placa de Petri, siguiendo la técnica de la siembra por estría en la superficie.
Los medios de cultivo que se van a usar dependen del tipo de muestra y de los
microorganismos presentes en ella. Des esta manera pueden emplearse medios
nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien medios
enriquecidos. Los medios más usados en el laboratorio, comprenden el agar sangre de
carnero 5%, agar MacConkey, agar nutritivo. Otro de los medios de cultivo
recomendados a utilizar con este fin es el agar CLED, se trata de un medio diferencial
que contiene lactosa y un indicador de pH, de color verde a amarillo. Su déficit en
electrolitos impide la invasión de la placa por microorganismos móviles, como son las
especies del género Proteus, facilitando así su aislamiento y posterior identificación.
Para la identificación de los distintos microorganismos aislados se realizarán
pruebas bioquímicas, fisiológicas y serológicas.
Estos procedimientos nos permiten aplicar técnicas de siembra por estría en el
medio, obtener cultivos puros del microorganismo y luego proceder a la identificación
de cada uno de las bacterias aisladas.
Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identificación,
es decir, a clasificarlo dentro de un grupo o taxón ya establecido, con el que tenga la
mayor semejanza. La complejidad de este proceso depende del nivel de precisión o
discriminación que se pretende conseguir.
Aunque en los últimos años se ha asistido a un crecimiento importante en la
oferta de métodos genotípicos aplicados al diagnóstico microbiológico, en la mayor
parte de los procesos de identificación se siguen utilizando métodos fenotípicos, puesto
que su realización, lectura y coste los hacen más asequibles.
En esta ocasión se aplicarán pruebas de identificación para bacterias Gram
negativas, ya que anteriormente se realizaron pruebas de identificación de bacterias
Gram positivas. Con ello se busca ver que técnicas existen para la identificación de
Gram negativas, cuál es el fundamento de la técnica, cuál es su procedimiento y que se
espera obtener como resultado. Para la identificación de cocos Gram negativos se
puede aplicar: se puede aplicar la prueba de la oxidasa. Para la identificación de
bacilos Gram negativos se pueden aplicar: prueba de fermentación de glucosa y
lactosa en medio Kligler, Prueba de reducción de nitratos, prueba de producción de

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indol/movilidad, producción de ureasa, prueba del rojo de metilo (modificación de
Barry), Prueba de Voges-Proskauer, prueba de la desaminación de la fenilalanina,
prueba de Descarboxilación de aminoácidos (lisina, ornitina y arginina) Para ello se
usarán reactivos como: agar TCI, caldo urea, citrato de Simmons, medio MIO, agar
fenilalanina, medio MR-VP (pruebas IMVIC) y agar LIA.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Se realizará las distintas pruebas bioquímicas para la identificación de las

bacterias Gram negativas con el propósito de conocer el género y la especie a la que
pertenece la bacteria. Para ello se tomará en consideración los conocimientos
obtenidos previo a la práctica. El propósito de estas pruebas, es para la identificación
de cocos gram negativos y bacilos gram negativos, entre los cuales los nosotros
tendremos que identificar el género y la especie de las bacterias.
La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando
diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de
similitudes. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas
bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía
metabólica (conjunto de reacciones bioquímicas) a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio
de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo
si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo, se debe suplir con factores de
crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares
cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de
la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación,
comerciales, etc.).

JUSTIFICACIÓN

Toda práctica tiene un fundamento claro, por lo tanto, en esta se debe aplicar
técnicas de identificación de bacilos y cocos gram negativos, en las cuales
determinaremos el género y la especie bacteriana que se aislará en el medio de cultivo.
Es necesario tomar todas las medidas de precaución para realizar estas técnicas
debido a cualquier fallo, puede tener un impacto negativo en las pruebas y, por lo tanto,
no se obtendrán los resultados que se esperan.

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 La identificación bioquímica de microorganismos ofrece una idea de lo que estos
microorganismos son capaces de hacer, siendo posible la discriminación de las
diferentes cepas de la misma especie por perfiles bioquímicos específicos. Las
diferencias en las actividades enzimáticas concretas informan sobre la ecología, la
fisiología o el hábitat natural del microorganismo, lo cual en algunos casos puede
considerarse información importante.
Cada especie bacteriana tiene un conjunto bien definido de actividades
metabólicas diferentes de todas las demás especies. Esta “huellas” bioquímicas son
propiedades controladas por las enzimas bacterianas. Así, las pruebas bioquímicas son
importantes porque ayudan al investigador a identificar correctamente los patógenos
presentes en una muestra y, de esta manera, poder recomendar el tratamiento
adecuado al paciente.

OBJETIVO GENERAL

 Desarrollar las distintas pruebas bioquímicas de identificación de bacterias Gram

negativas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Conocer las pruebas enzimáticas que sucederá durante las pruebas bioquímicas
de identificación de Gram negativas.
 Preparar los distintos agares como medio de cultivo para las distintas pruebas
bioquímicas de identificación de Gram negativas.
 Aplicar las buenas prácticas de laboratorio para prevenir errores durante la
realización de las pruebas bioquímicas de Gram negativas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales, reactivos y equipo

 Agar TCI
 Caldo urea
 Citrato de Simmons
 Medio MIO
 Agar fenilalanina
 Medio MR-VP (pruebas IMVIC)

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  Agar LIA.
 Asa bacteriológica
 Mechero de bunsen
 Tubos de ensayo de 13x100 mm
 Matraces de Erlen-Meyer
 Gradilla
 Agitador de vidrio
 Autoclave
 Hisopos estériles

Metodología

Para identificación de cocos Gram negativos

Si tenemos un cultivo que corresponda con cocos Gramnegativos se realizará la

prueba de la catalasa y oxidasa; ambas son positivas en el caso del género Neisseria
(Ver Guía para Neisseria) y Moraxella. La identificación se completaría entonces
mediante pruebas bioquímicas, principalmente de fermentación de azúcares.

Prueba de la oxidasa (citocromo oxidasa).

Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de

electrones en la respiración aeróbica, transfiriendo electrones al oxígeno, con la
formación final de agua.
Material
Tiras de papel de filtro, reactivo de oxidasa, aplicadores de madera y cultivo
microbiano.
Procedimiento
Con un aplicador de madera, se toca la cúpula de una colonia, se frota sobre una tira
de papel de filtro impregnada en solución acuosa al 1% de tetrametil-para-fenilen-
diamina (Reactivo de Kovacs).
Interpretación
En caso positivo el papel cambia de color, pasando de rosado a marrón y a negro
finalmente, en 10-20 segundos, como consecuencia de que el reactivo se oxida en
presencia de citocromo oxidasa. En caso negativo la tira de papel no cambia de color.

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Para identificación de bacilos Gram negativos

Los bacilos gramnegativos se aislan con mucha frecuencia en los laboratorios de

Microbiología Clínica. Los más comunes pertenecen a Enterobacterias, Pseudomonas,
Acinetobacter, Alcaligenes y Vibrios. La identificación de los bacilos Gram negativos
puede iniciarse con la prueba de la oxidasa (ya descrita). Cualquier organismo que
resulte positivo en esta prueba queda excluido de la familia Enterobacteriaceae, cuyos
miembros no poseen la enzima citocromo oxidasa.

Estudio de la familia Enterobacteriaceae. Estos microorganismos son oxidasa

negativa, y se van a identificar mediante las características de las colonias en los
medios de cultivo y de una serie de pruebas bioquímicas que comienzan con la
siembra en medio Kligler. Según los resultados obtenidos, se continuará con otras
pruebas de identificación como: Producción de indol, movilidad, crecimiento en citrato,
producción de ureasa, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer, descarboxilación de la lisina,
malonato, acetato y desaminación de la fenilalanina.

Prueba de fermentación de glucosa y lactosa en medio de Kligler.

Esta prueba se usa en la identificación inicial de bacilos Gramnegativos,

especialmente de enterobacterias. En este estudio se observa la fermentación de
glucosa y/o lactosa con producción de ácido y/o gas y la producción de SH2.
Material
Asa de siembra (aguja), tubos de Kligler y cultivo bacteriano.
Procedimiento
Los tubos de Kligler se inoculan con la aguja de siembra, con microorganismos
de la colonia que se va a identificar y se hacen picadura del mismo sin llegar hasta el
fondo del tubo, continuando la siembra por estría en la superficie. Incubar a 37ºC
durante 24 horas.
Interpretación
La interpretación de los resultados se hará de la forma siguiente:

 Fermentación de glucosa.

Se aprecia en el cambio a amarillo del indicador de pH (rojo de fenol)

únicamente en la parte inferior del tubo. Esto es debido a la pequeña proporción de
glucosa que existe en el medio (0,1%), que, al ser fermentada en el fondo del tubo,
donde existen condiciones de anaerobiosis, produce suficiente ácido para que cambie
el indicador, pero no a medida que nos aproximemos a la superficie, donde las
condiciones son más aeróbicas, allí la bacteria respira y la producción de ácido es
menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo sembrado no
fermenta la glucosa con producción de ácidos, todo el tubo toma una coloración roja.
Incluso, una vez que la glucosa ha sido degradada la bacteria comienza a utilizar los
aminoácidos, liberándose aminas, que elevan el pH, por lo que el color rojo puede ser
más intenso.

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  Fermentación de lactosa.

Se pone de manifiesto por el cambio a amarillo del indicador, tanto en el fondo

del tubo como en la superficie. La concentración de lactosa es diez veces mayor que la
de glucosa, con lo que la producción de ácido formado es tan elevada que hace
cambiar el indicador en todo el tubo. El hecho de que la fermentación de lactosa
enmascare la de la glucosa no tiene importancia, ya que para que una bacteria
fermente lactosa debe ser capaz de fermentar glucosa. Si la bacteria no es capaz de
fermentar la lactosa, una vez que la glucosa ha sido degradada, como ya se ha
comentado, la bacteria comienza a utilizar los aminoácidos, liberándose aminas, que
neutralizan la pequeña cantidad de ácidos presentes en la porción inclinada del medio
y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo aparecerá de color rojo intenso y
el fondo de color amarillo debido a la fermentación previa de la glucosa.

 Producción de gas.

La producción de gas en la fermentación se manifiesta por la aparición de

burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.

 Producción de SH2.

Para detectar la producción de SH2 a partir de tiosulfato sódico debe

incorporarse al medio de cultivo un indicador, dado que el SH2 es incoloro. Para tal fin
se utiliza una sal de hierro que reacciona con el SH2, para producir un precipitado
negro de sulfuro de hierro. La producción de SH2 tiene lugar en ambiente ácido, de ahí
que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a
partir de la glucosa. Así, un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo,
aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro.

Reducción de nitratos.

La reducción de nitratos a nitritos es una característica propia de varios

microorganismos que utilizan nitrato como aceptor final de electrones en la respiración
anaeróbica. Esta prueba es útil en la identificación de microorganismos pertenecientes
a las enterobacterias, aunque también sirve para identificar otros microorganismos.

Material

Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solución de α- naftilamina (A) y

solución de ácido sulfanílico (B).

Procedimiento

Inocular el medio líquido de nitrato con un asa de cultivo puro del

microorganismo, e incubar a 37ºC durante 18-24 horas. Pasado ese tiempo, añadir al

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cultivo 1 ml de solución de α-naftilamina (reactivo A) y un ml de ácido sulfanílico
(Reactivo B).

Interpretación

El desarrollo de una coloración roja en el medio de cultivo, tras la adición de los

reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la prueba de reducción
de nitratos se considera positiva. Si no se desarrolla color, la prueba puede
considerarse negativa (no se han reducido los nitratos) o bien se han reducido
originando otros compuestos (amoníaco, nitrógeno molecular, óxido nítrico u óxido
nitroso) por lo que la lectura se corresponde con un falso negativo. En este caso se
puede añadir al medio de cultivo una pequeña cantidad de polvo de zinc, que reduce
los nitratos del medio a nitritos. El desarrollo de un color rojo, indica la existencia de
nitratos en el medio y confirma que la reacción es negativa.

Producción de indol/movilidad

El indol es uno de los productos de degradación del metabolismo del aminoácido

triptófano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrólisis del
triptófano y su desaminación, produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco.

Material

Medio de cultivo para producción de indol/movilidad, cultivo bacteriano y reactivo

de Ehrlich.

Procedimiento

Inocular el medio con el microorganismo e incubar a 37ºC durante 24-48 horas.

Transcurrido ese tiempo, añadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlich (paradimetilamino
benzaldehido en etanol), por la pared del tubo sin agitar.

Interpretación

La aparición, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la

interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba
se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído del
reactivo originando un complejo de color rojo.

Movilidad

Es otra característica útil en la identificación de los microorganismos. Se puede

llevar a cabo observando el crecimiento en el medio semisólido.

Material

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 Aguja de siembra, medio semisólido (agar movilidad/indol), y cultivo bacteriano.

Procedimiento

Sembrar, por picadura, con la aguja de siembra en medio semisólido, incubando

a 37ºC durante 48 horas.

Interpretación

La baja concentración de agar de este medio permite que las bacterias se

desplacen, si son móviles. Por ello, observando si el crecimiento está sólo en la
picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es
inmóvil o móvil.

Citrato

Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de cultivo como

única fuente de carbono, esta característica es importante en la identificación de
microorganismos pertenecientes a las enterobacterias.

Material

Un tubo con medio de Citrato de Simmons y cultivo bacteriano.

Procedimiento

Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37ºC durante 24-48

horas.

Interpretación

En caso positivo, el medio de cultivo cambia de color verde a azul. Si el

microorganismo utiliza el citrato como fuente de carbono, también utiliza las sales de
amonio como fuente de nitrógeno, con producción de amoníaco, lo que da lugar a una
alcalinización del medio. Esto se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH
azul de bromotimol, de verde a azul intenso, a la vez que se observa crecimiento en la
superficie.

Producción de Ureasa.

La ureasa es una enzima presente en algunos microorganismos como

Klebsiella, Enterobacter y Proteus. Esta enzima es capaz dehidrolisar la urea, con
producción de dióxido de carbono y amonio, lo que causa una alcalinización del medio.

Material

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 Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo bacteriano.

Procedimiento

Inocular el medio de cultivo mediante estría en superficie e incubar a 37ºC

durante 24 horas.

Interpretación
Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome
color fucsia, debido a la alcalinización del mismo por producción de amonio a partir de
la urea, que se pone de manifiesto por un cambio del indicador de pH (rojo de fenol).

Prueba del rojo de metilo (Modificación de Barry).

Esta prueba consiste en comprobar si el microorganismo en estudio fermenta la

glucosa con producción de ácidos (succínico, láctico, acético, etc.) o vía ácido mixta.

Material

Un tubo de medio de caldo RM-VP, cultivo bacteriano y reactivo rojo de metilo.

Procedimiento

Inocular el medio líquido e incubar a 37ºC durante 18-24 horas. Transcurrido ese
tiempo añadir, 1 ó 2 gotas de la solución de rojo de metilo y agitar ligeramente.

Interpretación

En caso positivo aparece un color rojo estable, lo que indica una producción de
ácidos elevada que disminuye el pH del medio. Un color anaranjado no indica que la
prueba sea positiva, ya que otros microorganismos pueden producir pequeñas
cantidades de ácidos.

Prueba de Voges-Proskauer.

Consiste en comprobar si el microorganismo estudiado fermenta la glucosa

siguiendo la vía butilénglicólica, detectando un producto intermedio en la reacción que
es el acetil-metil-carbinol o acetoína.

Material

Un tubo de medio de caldo de RM-VP, cultivo bacteriano, solución de α-naftol e

Hidróxido de Potasio (o Hidróxido de sodio al 40%).

Procedimiento

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 Inocular el medio líquido con el cultivo puro del microorganismo e incubar a 37ºC
durante 24-48 horas. Después de la incubación, transferir 1 ml del cultivo a un tubo
estéril y se añade 0,6 ml de α-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Es necesario
adicionar los reactivos en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el
medio al oxigeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.

Interpretación

El desarrollo de un color rosa en el tubo, transcurridos 10 a15 minutos desde la

adición de los reactivos, indica que la prueba es positiva, es decir, que la acetoína se
ha oxidado pasando a diacetilo. No debe leerse después de 1 hora, ya que los cultivos
negativos pueden mostrar un color cobrizo y dar un falso positivo.

Desaminación de la fenilalanina.

Esta prueba es útil para la diferenciación inicial de las especies de Proteus y

Providencia de otros bacilos Gram negativos (Enterobacterias). Sólo los miembros de
estos géneros poseen la enzima responsable de la desaminación oxidativa de la
fenilalanina. La fenilalanina es un aminoácido cuya desaminación por medio de una
desaminasa, da lugar a la formación de amoníaco y de ácido fenilpirúvico, el cual
puede detectarse por la adición de un reactivo.

Material

Un tubo de medio agar fenilalanina, cultivo bacteriano y solución de cloruro

férrico al 10%.

Procedimiento

Sembrar el microorganismo en la superficie del medio agar fenilalanina inclinado

e incubar a 37ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo añadir 4 ó 5 gotas de la
solución de cloruro férrico directamente sobre la superficie del agar, rotar el tubo para
desprender el cultivo de la superficie.

Interpretación

La prueba se considera positiva cuando aparece una coloración verde intensa.

Esto se debe a que las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa, transforman el
aminoácido en ácido fenilpirúvico, que da reacción coloreada con el cloruro férrico.

Descarboxilación de los aminoácidos (Lisina, Ornitina y Arginina).

Las descarboxilasas son un grupo de enzimas, específicas para un aminoácido,

que actúan sobre el grupo carboxilo de los aminoácidos con la formación de aminas de
reacción alcalina, conocida como descarboxilación. Se usan para determinar la

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descarboxilación de los aminoácidos (lisina, ornitina y arginina) en la identificación de
enterobacterias.
Aminas específicas:
Lisina ……Cadaverina
Ornitina …Putrescina
Arginina…Citrulina

Material

Tubo de cultivo con el medio base para aminoácidos, con el aminoácido a

ensayar, un tubo de control del medio base sin aminoácido, cultivo bacteriano y aceite
mineral.

Procedimiento

Inocular con material de una colonia dos tubos con caldo descarboxilasa de
Moeller, uno con el aminoácido a ensayar y el otro sin aminoácido (control). Cubrir
ambos tubos con aceite mineral estéril (1cm de espesor) e incubar a 35 °C por 18 a 24
horas.

Interpretación

El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el organismo es

viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente como para activar las
descarboxilasas. El retorno al color azul púrpura del tubo que contiene el aminoácido
indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas por descarboxilación.

Descarboxilación de la Lisina (LIA).

Material

Un tubo con Agar Hierro Lisina (LIA), cultivo bacteriano.

Interpretación

1. Descarboxilación de la lisina:
 descarboxila la lisina --- fondo y tendido púrpura (K/K)
 no descarboxila la lisina --- fondo amarillo (A) y tendido púrpura (K/K)

2. Desaminación de la lisina:
 Desamina la lisina - fondo amarillo (A) y tendido rojo (R)
 No desamina la lisina- fondo amarillo (A) y tendido púrpura (K)

3. Producción de H2S
 Produce H2S ---- Ennegrecimiento del medio
 No produce H2S- sin cambios.

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 4. Producción de gas
 Produce gas - Ruptura o desplazamiento del agar
 No produce gas - sin cambios

Los bacilos oxidasa positiva pueden clasificarse en fermentadores de glucosa

y no fermentadores; por ello, estos dos grupos de microorganismos se identifican
mediante la prueba de utilización de la glucosa (oxidativa o fermentativa).

Utilización de la glucosa

 Oxidativa: (Pseudomonas utiliza la glucosa por vía oxidativa) (ver Guía para
BNF).
 Fermentativa: (Vibrio por vía fermentativa (ver Guía para Vibrionáceas).
 Incapacidad de utilizar glucosa por las dos vías: es una característica
importante de Alcaligenes, alcaliniza el medio (ver Guía para BNF).
Interpretación de las pruebas de identificación de bacilos Gram negativos
fermentadores o no de la glucosa.

REFERENCIAS
Bibliografías

Gutiérrez Romero, Ana Lilia et al. (2017). Manual de Laboratorio de Microbiología General I.
Universidad Autónoma Nacional de México, Facultad de estudios superiores Zaragoza.

J. Perilla, Mindy et al. (2004). Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de

Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la
Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Atlanta, Georgia, U.S.A.
Linkografías

In SlideShare – Guía para la identificación de bacterias. Recuperado de:

https://es.slideshare.net/Biohazardoa/215-guia-para-la-identificacion-de-las-bacteria?
from_action=save
J. L. López-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert. (2009). Técnicas de identificación de
bacterias. Recuperado de: http://media.axon.es/pdf/65248.pdf

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