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UNIVERSITÉ

D’ORAN -1-
FACULTÉ DE MÉDECINE
DÉPRARTEMENT DE PHARMACIE
MODULE DE TOXICOLOGIE



TOXICOLOGIE GÉNÉRALE
ð
MÉTHODES DE PRÉLÈVEMENT,
D’EXTRACTION ET D’ANALYSE
EN TOXICOLOGIE


Dr BENDJAMAA A.
Maitre Assistante Hospitalo-Universitaire Spécialiste en Toxicologie

ANNÉE UNIVERSITAIRE
2018 - 2019




Toxicologie Générale Méthodes de prélèvement, d’extraction et d’analyse en toxicologie





Plan du cours


ð


I- Introduction

II- Prélèvements analysables en Toxicologie

III- Méthodes d’extraction des toxiques
III.1. Minéralisation
III.2. Méthodes d’extraction des toxiques organiques non volatils
III.3. Méthodes d’extraction des gaz et des toxiques organiques volatils

IV- Méthodes d’analyse toxicologique
IV.1. Réactions chimiques
IV.2. Méthodes chromatographiques
IV.3. Méthodes spectrales
IV.4. Méthodes immunologiques

V- Conclusion

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I. INTRODUCTION

La toxicologie analytique est la discipline scientifique qui s’occupe de la recherche, de l’identification


et du dosage des différents toxiques dans les différents milieux qu’ils soient biologiques,
environnementaux ou des denrées alimentaires.

Domaines de l’implication de la toxicologie analytique
Le laboratoire de toxicologie peut être sollicité par différents services :
-Service des urgences médico-chirurgicales et les services cliniques : toxicologie clinique
-Service de médecine de travail : toxicologie professionnelle
-Service de médecine légale : toxicologie médicolégale
-Service d’hygiène alimentaire : toxicologie alimentaire
-Services de surveillance environnementale : toxicologie environnementale.

L’analyse toxicologique est basée sur :


• Des échantillons de qualité
• Un personnel suffisant et compétant
• Des équipements analytiques performants
• Une interprétation rigoureuse des résultats.

II. PRÉLÈVMENTS ANALYSABLES EN TOXICOLOGIE

La réalisation d’un prélèvement de qualité est une étape cruciale en analyse toxicologique. Différents
milieux biologiques peuvent être utilisés pour le screening toxicologique :

II.1. Prélèvements réalisés chez le vivant :


L’intérêt de chaque prélèvement dépend du contexte de la demande de l’analyse toxicologique
(toxicologie d’urgence, toxicologie médicolégale, toxicologie professionnelle, …)
a. Le sang : prélèvement sur tube sec, hépariné ou EDTA (NaF pour le dosage de l’alcool), ou sur
papier buvard (Dried Blood Spot), le sang est le prélèvement le plus facile à obtenir, il permet surtout
d’apprécier les concentrations sériques souvent corrélées à un facteur de gravité.
b. Les urines : (quantité suffisante sur tube ECBU ou flacon en plastique propre sans conservateur)
étant le principal milieu d’élimination pour beaucoup de xénobiotiques et leurs métabolites, il est
très avantageux pour établir une chronologie d’exposition au toxique.
c. Le liquide de lavage gastrique (quantité suffisante sur flacon en plastique propre sans
conservateur) : le premier liquide de lavage gastrique peut être très utile pour des ingestions
récentes en raison de la présence de grandes quantités de toxiques non métabolisés.
d. Les cheveux : (50 à 100 cheveux sont coupés et conservés dans un tube sec ou une enveloppe).
Les cheveux présentent l’avantage de pouvoir accéder à une information à posteriori ce qui est utile
dans certaines circonstances comme la soumission chimique.
e. La salive : (quantité suffisante sur contenant en plastique approprié sans conservateur)
f. L’air expiré : prélever sur des tubes spéciaux qui se ferment hermétiquement.

II.2. Prélèvements réalisés sur cadavre au moment de l’autopsie


a. Prélèvements obligatoires :
Sang cardiaque, Sang périphérique, Urines, Humeur vitrée, Cheveux, Contenu gastrique, Poumon.
b. Prélèvements facultatifs : à prélever en cas d’absence d’un ou deux des prélèvements
obligatoires, il s’agit de : Bile, Organes, Liquide de putréfaction, …

D’autres types de prélèvement tel que le sol, l’eau, l’air, les aliments, produits de saisie ; sont utilisés
dans différentes applications de l’analyse toxicologique (expertise alimentaire, toxicologie
environnementale...).

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III. MÉTHODES D’ISOLEMENT DES TOXIQUES


Le traitement des échantillons dépend de la nature de l’échantillon et de la molécule considérée.


Selon les propriétés physico-chimiques on distingue :
- Les toxiques fixes :
*Minéraux : Pb, Cd, Hg, As, Cr, F…
*Organiques : médicaments, pesticides organiques, alcaloïdes…
- Les toxiques volatils :
*Hydrosolubles : alcools, phénols, HCN, …
*Liposolubles : benzène, toluène, solvants halogénés, CS2
III.1. Minéralisation
La minéralisation consiste à l’extraction des toxiques minéraux.
Le but de la minéralisation est de :
- Eliminer l’action perturbatrice des matières protéiques.
- Ioniser les métaux.
- Concentrer le toxique.
Méthodes :
*Minéralisation par voie sèche (incinération).
* Action lytique du chlore.
* Carbonisation sulfurique, parfaite ultérieurement par l’action d’acide oxydant (+++ utilisée).
Critères de choix :
* Simple, rapide, pratique.
* Ne pas entraîner des pertes.
* Ne pas apporter des nouveaux éléments (contamination).
* Ne pas transformer le toxique.

III.1.1. Minéralisation par voie sèche :
L’exemple de la minéralisation d’un échantillon de sang pour la recherche du fluor illustre le
principe de cette méthode :
- 2ml de sang sont mises dans une capsule en porcelaine.
- L’échantillon subit d’abord une dessiccation ensuite il est alcalinisé par du NaOH.
- L’ensemble est minéralisé pendant 6h à 600°C dans un four à moufle.
Résultat : Cendre blanches de NaF.

III.1.2. Méthodes utilisant le chlore : ex : méthode d’Ogier
Cl2+ H2O à 2HCl + ½ O2 (oxydation de la matière protéique).

III.1.3. Méthodes nitro-sulfurique (voie humide) :


il s’agit d’une action conjuguée de deux acides : Acide sulfurique et Acide nitrique.
Þ Acide sulfurique :

A température d’ébullition, l’acide sulfurique a des :


- Propriété déshydratante : H2SO4 à SO3 + H2O (vapeur)
SO3+ H2O à H2SO4 (l’eau de la matière organique).
- Propriété fixatrice d’azote : H2SO4 + N (matière organique) à NH4+
- Propriété oxydante : H2SO4 à SO2+ ½ O2+ H2O
C (matière organique) + O2 à CO2
Þ Acide nitrique :
Son action consiste à terminer et parfaire la minéralisation (Propriété oxydante).
2HNO3 à 2NO2 + ½ O2 + H2O
2HNO3 à N2O3 + O2+ H2O
2HNO3 à 2NO + 3/2 O2+ H2O
Cette technique peut être effectuée soit dans un système ouvert (Technique de Deniges) ou de
préférence semi fermé (Technique de Pien) pour éviter les pertes.

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Il existe des systèmes de minéralisation automatiques permettant la minéralisation de plusieurs


échantillons au même temps, tout en assurant un chauffage homogène.
III.1.4. Minéralisation assistée par micro-ondes :
L’échantillon est placé dans un réacteur transparent aux micro-ondes avec un liquide polaire ou une
solution ionique (généralement un acide). Les micro-ondes provoquent une agitation des molécules
ce qui entraîne un chauffage rapide de la solution permettant un gain important de temps par
rapport au chauffage classique.

III.2. Méthodes d’extraction des toxiques organiques non volatils


III.2.1. Extraction liquide-liquide


L’extraction repose sur 3 propriétés :
- Différence de solubilité des corps dans un solvant en fonction de leur poids moléculaire.
- Influence du pH sur leur solubilité.
- Coefficient de partage entre 2liquides non miscibles.

III.2.1.1. Extraction générale : méthode STAS-OTTO-OGIER
La méthode repose sur la première propriété. La procédure comporte les étapes suivantes :
- Une précipitation des protéines de l’échantillon par un mélange d’acide tartrique et d’alcool 95°C
en portant l’ensemble à une température de 50 à 60°C pendant 12h, et les éliminer par filtration.
- Une distillation sous vide du filtrat élimine l’alcool utilisé (le liquide sirupeux obtenu peut subir la
même opération jusqu’à l’obtention d’un filtrat aqueux acide).
- Une extraction du filtrat acide par un solvant organique à éther acide
- Une alcalinisation du liquide aqueux puis extraction par solvant organique à éther alcalin
- une extraction de la phase aqueuse basique par du chloroforme à chloroforme alcalin.

III.2.1.2. Extraction sélective liquide-liquide :
Extraction par un solvant organique en milieu acide ou milieu alcalin selon la nature de la molécule à
extraire
Exp : - Extraction acide : Acide salicylique, barbituriques.
- Extraction alcaline : phénothiazines, amitriptyline.
Purification des extractions :
• Déshydratation par du sulfate de sodium anhydre Na2SO4
• Réextraction avec de l’eau distillée.
• Purification par du charbon.

III.2.2. Extraction liquide-solide


L’extraction se fait à l’aide de cartouches remplies de matières appropriées pour chaque famille de
toxiques.
Son principe repose sur la distribution des composés entre l'échantillon et l'adsorbant. L'extraction
se déroule généralement en quatre étapes : conditionnement de la cartouche, percolation de
l’échantillon, lavage qui sert à éliminer les impuretés, et élution des analytes. 


III.3. Méthodes d’extraction des gaz et des toxiques organiques volatils


III.3.1. Extraction des toxiques gazeux à partir du sang
III.3.1.1. Extraction du CO par la technique de NICLOUX :
Principe : Action conjuguée :
* D'un acide fort et fixe qui décompose les combinaisons gazeuses de l'Hémoglobine,
* de la chaleur,
* D'un entraînement à la vapeur d'eau sous vide qui parfait l'extraction totale des gaz.

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III.3.1.2. Techniques par diffusion gazeuse : MÉTHODE DE CONWAY :


Principe : basé sur le pouvoir réducteur du toxique (CO).
CO + PdCl2 + H2O è CO2 + Pd + 2 HCl

III.3.2. Distillation
Principe : le chauffage de l’échantillon dans un dispositif à distillation favorise l’entrainement à la
vapeur d’eau des toxiques volatils.
Application : Toxiques volatils hydrosolubles.
Exemple : phénol, aniline, acide cyanhydrique, nitrobenzène, alcools, …

III.3.3. Entraînement à l’air chaud :
Principe : un courant d’air chaud (80°C) traverse l’extracteur contenant l’échantillon à analyser et le
toxique libéré est capté ensuite par barbotage dans un réactif approprié : réactif de captage.
Application : Toxiques volatils liposolubles.
Exemple : Benzène dont le réactif de captage est le butanone.

IV. MÉTHODES D’ANALYSE TOXICOLOGIQUE

IV.1. Réactions chimiques


A. Réactions de précipitation :
Il s’agit généralement de réactions d’interaction avec des métaux et des métalloïdes en milieu
aqueux légèrement acide.
Exp : recherche des alcaloïdes par les Réactifs de : Mayer ; de Dragendorff et de Bouchardât.

B. Réactions colorées :
Certaines substances qui mises au contact de réactif produisent une réaction colorée. On distingue :
*Les réactions colorées directes :
On fait réagir un volume d’échantillon (urines, liquide de lavage gastrique) avec un volume du réactif
approprié. Le développement d’une coloration caractéristique indique la présence éventuelle de la
substance recherchée. Exemple :
-Réactif de FORREST pour les phénothiazines ---> rose, bleu, violet (selon la molécule détectée)
-Réactif de TRINDER pour les salicylés ---> violet

*Les réactions colorées après extraction :
On fait réagir l’extractum avec le réactif de coloration.
-Réaction au FURFURAL pour les carbamates ---> violet
-Réaction de Fujiwara –Ross pour les composés chlorés ---> rose
-Réaction de PARRI pour les barbituriques ---> violet.

IV.2. Méthodes chromatographiques


La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un mélange même très
complexe. La séparation est fondée sur la réalisation d’une suite continue d’équilibre entre deux
phases :
- Une phase stationnaire (fixe).
- Une phase mobile.

IV.2.1. Chromatographie sur couche mince : CCM


La CCM repose sur la différence de vitesse de migration sur une couche fine d'un produit absorbant
(phase stationnaire) sous l'action d'un mélange de solvant (éluant : phase mobile) dans une cuve
étanche.
La révélation se fait après séchage de la plaque.
Sous lampe UV à 254 nm on localise les molécules migrantes pour :
- le calcul du rapport frontal : RF
- la révélation par des réactions de coloration.

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NB. La nouvelle version de la CCM : HPTLC consiste à mesurer la densité optique sur la plaque, elle
permet d’augmenter les performances de la CCM.

IV.2.2. Chromatographie liquide à haute performance : HPLC


La technique correspond à une séparation des substances dans une colonne contenant une phase
stationnaire suite à un parcourt d’une phase mobile liquide.

Appareillage : une station HPLC est composée de :


- Un réservoir de solvant.
- Un système de pompage.
- Un système d'injection de l'échantillon à analyser.
- Une colonne chromatographique.
- Un détecteur : plusieurs types de détecteur peuvent être utilisés :
Spectrophotomètre d'absorption : UV.
Détecteur a barrette de diodes : DAD.
Détecteur électronique.
Spectrophotomètre de masse : SM.

Avantage :
Technique très sensible et spécifique
Dosage de composés polaires, apolaires, composés thermosensibles.

IV.2.3. Chromatographie en phase gazeuse CPG


Méthode de séparation sur colonne de substances volatiles véhiculées par un gaz inerte appelé gaz
vecteur dans une colonne remplie d’une phase stationnaire.
Les échantillons analysés peuvent être liquides ou solides injectés directement ou selon la technique
« Head space ».
Appareillage :
-Une source de gaz vecteur.
-Un système d'injection de l'échantillon à analyser.
-Un four
-Une colonne chromatographique.
-Un détecteur : plusieurs types de détecteur peuvent être utilisés :
FID : détecteur à ionisation de flamme
ECD : détecteur à capture d’électron
SM : spectromètre de masse.
Avantage :
Technique très sensible et spécifique
Dosage de composés volatils et des gaz.

IV.3. Méthodes spectrales


Les techniques spectrophotométriques sont basées sur les interactions entre la matière et les
radiations électromagnétiques. Il peut s’agir de photométrie dans le visible, l’ultra-violet ou l’infra-
rouge, voire dans le domaine des rayons X.

IV.3.1. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans l’UV- visible :


Lorsqu’un faisceau monochromatique pénètre dans un milieu, les molécules constituant ce milieu
peuvent absorber une partie du rayonnement.
La SAM dans l’UV-visible fait intervenir l’énergie électronique et couvre le domaine compris entre
200 et 400 nm pour l’UV et entre 400 et 800 nm pour le visible.
En spectrophotométrie, la relation entre l'intensité lumineuse à l'entrée et à la sortie de la cuve est
régie par la loi de Beer-Lambert :
A = log10 I0 / I = k c l

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La loi de Beer-Lamber est valable pour :


• Lumière monochromatique.
• Concentrations faibles (linéarité de la loi de B-L entre 0 et 1).
• Solutions limpides.
• Molécules stables en solution.
• Molécules stables sous l’irradiation.
• Solvant transparent aux UV-visible.

Application : analyse qualitative et quantitative.
Avantages : simplicité, coût peu élevé, sensibilité, efficacité en analyse quantitative.
Inconvénients : très sensible aux interférences. Nécessite un traitement purificateur de l’échantillon.

IV.3.2. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans l’IR :


L’IR analytique recouvre plusieurs méthodes d’identification, non destructives basées sur
l’absorption, par l’échantillon, des radiations électromagnétiques comprises entre 1 et 1000 µm. On
détermine les raies d’absorption en mesurant la transmittance du faisceau électromagnétique par la
substance étudiée.
Application :
• Analyse qualitative :
Les spectres IR constituent l’empreinte digitale de la molécule.
• Analyse quantitative :
L’IR permet de doser ; CO, hydrocarbures dans l’eau, ...
Avantages : simple, rapide, très spécifique et fidèle.
Inconvénients : coût élevé.

IV.3.3. Spectrophotométrie d’absorption atomique SAA


Consiste à mesurer la lumière absorbée à une certaine longueur d'onde par des atomes non excités
de l'élément à doser. L'atomisation se fait dans la flamme ou dans le four.
Appareillage :
-Une source lumineuse émettant la raie requise par le dosage
-Un dispositif d'atomisation= four ou flamme
-Un système monochromateur afin d'isoler la raie de mesure
-Un détecteur.
Application : Dosage de plusieurs éléments (As, Se..) et métaux lourds (plomb, mercure..)
Avantages: Très sensible et spécifique.
Inconvénients : Analyse quantitative seulement.

IV.3.4. Spectrophotométrie d’émission atomique


La SEA basé sur l’atomisation et excitation thermique des atomes de l'élément à doser par de hautes
tensions générées le plus souvent par des sources à plasma. Les atomes excités se désintègrent pour
retrouver les niveaux bas en émettant leur spectre de raies dont l’étude permet de déterminer la
nature des éléments constituent l’échantillon et leur concentration.
Appareillage :
Un spectromètre d’émission atomique type ICP (Plasma par couplage inductif) comporte :
-Un dispositif pour introduire et dissocier l’échantillon à l’état d’atomes ou d’ions puis les exciter ;
-Un système optique pour séparer les différentes émissions optiques ;
-Un système de détection et d’analyse du rayonnement émis (SM+++) ;
-Un système d’enregistrement.

Applications : Dosage des minéraux, des métaux et des métalloïdes.



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Avantages :
Technique multiélément : contrairement aux appareils d’absorption atomique qui ne permettent
d’étudier qu’un seul élément à la fois, les spectromètres d’émission atomique peuvent en doser
plusieurs au sein d’un même échantillon, soit simultanément soit séquentiellement.
Inconvénients : interférences spectrales nombreuses.

IV.4. Méthodes immunologiques


Toutes les techniques immunologiques de dosage constituent des applications originales d’un seul et
même principe : un marqueur peut être couplé à un anticorps ou un antigène constituant un traceur.
Le marqueur possède des propriétés spéciales qu’il conserve une fois fixé et qui permettent de
révéler la présence de l’antigène ou de l’anticorps ou du complexe qu’ils auront formé, en émettant
un signal qui peut être mesuré.

Le signal peut consister :
- En une émission de fluorescence.
- En une émission de radioactivité.
- En une manifestation d’une activité enzymatique.

Elles sont classées selon le mode de détection du marqueur fixé sur l’antigène ou l’anticorps.
Traceur Dosage avec compétition Dosage sans compétition
(Anticorps limitant) (Anticorps en excès)
Radiomarqué Radioimmunoassay (RIA) Immunoradiometric assay (IRMA)
Enzyme Enzymoimmunoassay (EIA) Enzyme-labeled immunosorbent assay
(ELISA)
Fluorescent Fluoroimmunoassay (FIA) Immunofluorometric assay (IFMA)

V. CONCLUSION

L’analyse toxicologique est partie intégrante de la démarche globale de gestion des risques sanitaires

La nature des échantillons et leur qualité ainsi que les méthodes d’analyse utilisées conditionnent la
qualité du résultat de l’analyse toxicologique demandée sur le prélèvement considéré.

Etant donné qu’il n’existe aucune méthode simple, rapide qui permet de tout détecter, un
laboratoire de Toxicologie doit disposer de nombreuses techniques.

Pour assurer une utilisation optimale de ces techniques, un dialogue permanent avec le clinicien à
chaque avancée médicale ou analytique a pour objectif de cibler les examens toxicologiques les plus
utiles.

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