Méthodes d’étude de la cellule

Dr ZAOUI C.
MAA en Biologie cellulaire
 MORPHOLOGIQUE

I-MICROSCOPIE
STRUCTURALE

II- Méthodes de
ETUDE DES CELLULES ULTRASTUCTURALE séparation des
composants
cellulaires

FONCTIONELLE

II- Techniques de
ciblage moléculaire
IDENTIFICATION
MOLECULAIRE
 Méthodes d’études cellulaires

• I) Les méthodes d’observation

– 1) Méthodes et techniques d’observations des cellules
• a) Microscopes optiques
• b) Microscopes électroniques
– 2) Techniques de préparation des échantillons
• a) Etudes des structures
• b) Mise en culture
• II) Les méthodes de fractionnement subcellulaire
– 1) Homogénéisation
– 2) Purification
• a) Centrifugation différentielle
• b) Centrifugation par gradient préformé
III. Techniques de ciblage moléculaire
Technique??
 INTRODUCTION

structurelle, fonctionnelle

Très petite de taille, incolore,

translucide

Microscope photonique , colorants,

microscope électronique

structure de la cellule, organites, complexité

 Microscopes

Microscope Photonique Microscope électronique

Lumière
fond clair
ultraviolette
Balayage Transmission
(MEB). (MET)
contraste de
À fond noire
phase
 1-Microscopie optique à lumière transmise
(à fond claire )

-trajet lumineux dans un - Aspect d’un microscope

microscope optique à à lumière transmise
lumière transmise.
 Microscopes photoniques

• le microscope courant (à Fond clair)

• Utilise la déviation d’un flux de Photons (Lumière)
• 2 systèmes convergents de lentilles: l’objectif &l’oculaire
image agrandie de l’objet à étudier

• La qualité de l’image dépend du pouvoir séparateur ou Limites de résolution = 0,2

µm (500 fois + l’œil humain).
• L’étude des tissus , bactéries, cellules sanguines & organites cellulaires
(mitochondrie s, chloroplastes …. )dont la taille avoisine 0,5µm.
• l’épaisseur ne doit pas dépasser 10µm?
 Microscopes photoniques

• à Lumière ultraviolette : pouvoir séparateur= 0,1µm

• à contraste de phase: lorsque la lumière traverse une partie

dense ,elle est retardée par rapport à celle qui traverse une
région claire , on obtient des images contrastées des cellules
sans coloration préalable.

• à fond noir : les rayons lumineux arrivent latéralement sur la

préparation alors que le fond de l’observation apparaît noir ,
toute particule capable de diffuser de la lumière devient très
brillante.
 2-Microscopie optique à contraste de
phase

• Permet d’observer:
• des objets non préalablement colorés, exp
des cellules vivantes.
• (A) Quand des ondes lumineuses traversent
• Permet d’observer: des objets colorés, leur amplitude est
• des objets non diminuée, c’est ce qui crée l’image.
préalablement • (B) Quand les ondes lumineuses traversent
colorés, exp des un objet non coloré, leur amplitude est très
cellules vivantes. peu changée, mais leur phase est modifiée,
. ce qui crée des interférences. Ce sont les
effets de ces interférences qui sont exploités
pour créer une image dans les microscopes à
contraste de phase.
3- Microscopie optique à fluorescence
• permet d’observer des éléments
fluorescents
• dans une cellule. Ces éléments
fluorescents peuvent être naturels,
mais le plus souvent ce sera une
molécule spécifique,
• Un ARNm ou une protéine par
exemple, que l’on aura marqué à l’aide
d’une sonde spécifique couplée à un
fluorochrome.
• Ce type de microscope permet donc
de localiser précisément dans la
cellule tel ou tel type de molécule.
• L’objet est excité par une lumière de
longueur d’onde définie par un filtre.
La fluorescence émise est observée.
 Microscopes électroniques

• Les è ayant une longueur d’ondes ‹ à celle des photons

• la limite de résolution : 0,1ὴm.

• La source lumineuse est un filament de tungstène .

• porté à haute température émission sous vide des è dans une
colonne.

• accélérés sous vide forment un faisceau qui est canalisé

par des condensateurs e par une forte ≠ de potentiel , ces
forment un faisceau qui est canalisé par des
condensateurs, la formation de l’image résulte
-Microscopie électronique à balayage
• L’objectif est d’observer le relief des
structures.
• contrairement à la plupart des
autres techniques de microscopie,
l’objet n’est pas coupé mais sa
surface est recouverte d’un film
métallique d’épaisseur différentielle
en fonction du relief.
• Le matériel biologique est ensuite
dissout à l’acide; le film métallique
est récupéré et analysé au
microscope électronique.
-Microscopie électronique à transmission
• Le principal intérêt du microscope électronique
par rapport au microscope optique est
d’augmenter le grandissement.
• La microscopie électronique (résolution de
quelques angströms) révèle l'ultrastructure de
celles-ci et permet une observation plus poussée
de la structure des cellules procaryotes comme
eucaryotes.

• Au lieu d’être éclairé, l’objet est bombardé par un

faisceau d’électrons.
• L’image mettra en évidence les structures plus ou
moins opaques aux électrons.

• L’objet doit être coupé en tranches ultrafines puis

imprégné de sels de métaux lourds qui vont se
fixer différentiellement sur les différentes
structures intracellulaires et les rendre plus ou
moins opaques aux électrons.
- Comparaison entre les microscopes
les plus courants
II- METHODES DE PREPARATION DES
ECHANTILLONS POUR MICR0SCOPIE

Structure :
 CYTOLOGIE .
 HISTOLOGIE.

Ultrastructure
 MET .
 MEB.
 PREPARATION DES ECHANTILLONS

• 1. observation de cellule vivantes : Ce type

d’observation ne concerne qu’une faible
catégorie de cellules ( sanguine, organisme
unicellulaires)
 Observation de cellules vivantes
• Mettre les cellules en suspension dans leur
milieu d’origine ou synthétique.
• Déposer une goutte de la suspension sur une
lame
• Colorer avec des colorant peu ou pas toxique :
Colorants vitaux (Rouge neutre : Vacuoles,
Vert Janus: mitochondries)
• Observer au microscope.
 Structure : CYTOLOGIE

1/ Principe : étudie les cellules sur des frottis (Hould, 1984).

Le colorant polychrome
de la Compagnie Paragan

ACÉTONE

Fixation

Observation
microscopique
 Structure: HISTOLOGIE

Les échantillons

Formol 10% Microtome

tamponné

Déshydratation Bloc de
Clarification paraffine

Inclusion

Coloration

Observation
L’hémalun-éosine
microscopique
Déparaffinage
 Préparation de frottis

• Des cellules isolées en suspension

• étalement sur lame en verre
• Fixées par dessiccation (chaleur) ou à l’aide
d’une laque
• Colorées
 2
Cytoponction

Prélèvement Etalement Traitement

• Technique largement utilisée , peu coûteuse , simple , rapide , bien

tolérée par les patientes.
 Traitement du materiel prélevé

Cytoponction Réactions

Fixation
Produits

Méthanol /Acétone
Durée

24 Heures

Hydratation Ethanol 96° 2minutes

Ethanol 80° 2minutes

Ethanol 70° 2minutes

Ethanol 50° 2minutes

Eau courante 15 secondes

Eau courante 15 secondes

Coloration I Hemalun de HARIS 3 minutes

Eau courante 15 secondes

Eau courante 15 secondes

Déshydratation I Ethanol 50° 2minutes

Prélèvement
Ethanol 70° 2minutes

Ethanol 80° 2minutes

Ethanol 96° 2minutes

Coloration II Orange G 3 minutes

B C Ethanol 96° 1 minute

EA 50 3 minutes

Déshydratation II Ethanol 96° 1 minute

Ethanol 96° 1 minute

Ethanol 96° 1 minute

Eclaircissement Acétone 1 minute

Toluène I 2 minutes
Toluène II 2 minutes

Dépôt et étalement du prélèvement MONTAGE Lamelle montée sur lame avec de l’Eukitt
 Observation et résultats

Perte de la polarité Augmentation du rapport

Chevauchement nucléoplasmatique
nucléaire

Cytoplasme éosinophile
vacuolisé
 Préparation de coupes

• les tissus sont trop mous pour être débités en coupes

 Fixation

étape primordiale , préserve la structure du

tissu de l’autolyse ,immobilise les
constituants cellulaires , l’échantillon est
immergé dans un fixateur (Formol pour le
MO , Osmium pour le ME)
Prélèvement du centre nodulaire et du mamelon et mise en cassettes
 Inclusion

• les tissus sont inclus dans la paraffine pour la MO

• La résine plastique pour ME
 Inclusion MO

Réactions Produits Durée

POST FIXATION Formol 45 mn

1/10eme

Acétone I 45 mn
Acétone II 45 mn
Acétone III 45 mn

CIRCULATION Toluène I 45 mn
Toluène II 45 mn
Toluène III 45 mn
Paraffine I 24 H
Paraffine II 1H

INCLUSION Paraffine à l’aide de moules

métalliques.
MET
 membrane plasmique

paroi
cytoplasme avec nombreux
ribosomes

chromosome bactérien
Cellule de Bacillus subtilis (x 32 000)
Eubactérie de type Gram+

paroi

membrane plasmique

cytoplasme

Organisation de la paroi et de la membrane limitante

de Bacillus subtilis
OMBRAGE METALLIQUE

Charpente cellulosique de la paroi végétale

COLORATION NEGATIVE

Virus de la mosaïque du tabac (VMT)

 Une portion de cellule
observée au MET après
cryofracture
 Microtomie
• débiter le boc contenant l’échantillon en
tranche très fines grâce à la lame du
microtome
• MO : 3 à 10 µm d’épaisseur
• ME: 50 à 500ὴm
ultamicrotome (couteau en diamant)
• ME: 50 à 500ὴm
ultamicrotome (couteau en diamant)
 Coloration

• Permet de visualiser les structures grâce aux

colorants
Coloration
Réactions Produits Durée

Déparaffinage Toluène I 10 minutes

Toluène II 10 minutes

Réhydratation Ethanol 96 ° 30 secondes

Ethanol 70 ° 30 secondes

Ethanol 50 ° 30 secondes

Eau courante 1 minute

Coloration Hémalun de HARIS 5 minutes

Eau courante 1 minute

Eau acide 1 minute

Bicarbonate de Lithium 1 minute

Ethanol 50 ° 30 secondes

Eosine alcoolique 1 minute

Déshydratation Ethanol 96 ° 30 secondes

Ethanol 96 ° 30 secondes

Ethanol 96 ° 30 secondes

Acétone 5 minutes

Eclaircissement Toluène III 10minutes

Toluène IV 10 minutes

Montage Lamelle montée sur lame avec de l’Eukitt

 Remarques
• la congélation est une méthode qui permet
d’éviter la fixation qui souvent altère les
structures .
• le tissu congelé est découpé directement avec
cryostat .’