Extraction de plasmide | BioEduc

le janvier 12, 2019

Extraction et Isolement des plasmides

Définition de plasmides

Le plasmide est généralement un morceau circulaire ou parfois linéaire d’ADNdb

présent dans les bactéries. Dans de nombreux cas, il porte des gènes non essentiels,
qui sont responsables de la survie d'une bactérie particulière dans des conditions
défavorables.

Généralités sur les plasmides

En raison de leur petite taille et de leur polyvalence, les plasmides bactériens sont
devenus un élément central de la recherche en biotechnologie dans de nombreuses
expériences allant de l'expression des gènes humains dans des cellules bactériennes
au séquençage de l'ADN.

Le terme «plasmide» a été introduit par le biologiste moléculaire américain Joshua

Lederberg en 1952. Dans une seule cellule bactérienne, le nombre de plasmides
identiques varie de 1 à 1000 dans différentes circonstances et varie entre 1 et plus de
1000 kb. Les scientifiques ont profité des plasmides pour les utiliser comme outils de
clonage, de transfert et de manipulation de gènes.

Les plasmides utilisés en génie génétique sont appelés vecteurs, qui sont couramment
utilisés pour multiplier ou exprimer un gène particulier.

Les plasmides peuvent être introduits dans les cellules bactériennes par
transformation. En se divisant rapidement, les bactéries peuvent être utilisées comme
usines pour générer des fragments d'ADN en grand nombre.

Il existe de nombreuses façons de classer les plasmides bactériens. D'après leurs

fonctions, ils sont:

1. les plasmides R de résistance

2. les plasmides F de fertilité
3. les plasmides de col
4. les plasmides de dégradation

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 5. les plasmides de virulence.

Les plasmides peuvent appartenir à un ou plusieurs de ces groupes fonctionnels.

L'ADN plasmidique apparaît généralement dans l'une des cinq confirmations, c'est-à-
dire un ADN dénommé circulaire ouvert, circulaire détendu, linéaire, super enroulé ou
fermé de manière covalente et dénaturée comme un ADN super enroulé.

Les plasmides sont des molécules d'ADN distinctes du chromosome de la cellule

bactérienne et capables de transmettre de manière stable sans se lier au chromosome
bactérien. Il peut être transféré horizontalement entre les cellules et est responsable
du transport et de la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques parmi les
souches environnementales et cliniques. En outre, les plasmides portent également
de nombreux gènes qui codent pour une large gamme d’activités métaboliques,
permettant ainsi à la bactérie hôte de dégrader les polluants, à la production de
composés antibactériens, démontrant la virulence et le pouvoir pathogène des
bactéries.

Principe d'extraction des plasmides

Les plasmides (Voir protocol d'extraction) doivent être isolés des bactéries pour purifier
une séquence spécifique à utiliser comme vecteurs dans le clonage moléculaire.

Il existe divers procédés et kits commerciaux disponibles aujourd'hui pour l'isolation de

la conformation pure et souhaitée de l'ADN plasmidique, quel que soit le nombre de
copies, élevé ou faible.

Dans cette section, nous discuterons de la procédure qui peut être appliquée à cette
fin sans l'utilisation de kits ou de colonnes disponibles dans le commerce.

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La plupart des procédures d'isolation de plasmides disponibles reposent sur le fait que
les plasmides se présentent généralement sous une configuration circulaire fermée de
manière covalente chez les bactéries. Ainsi, après la lyse cellulaire, la plus grande
partie du contenu intracellulaire sort de la cellule et ensuite, le plasmide est enrichi et
purifié. Étant donné que l'ADN plasmidique est très sensible aux contraintes
mécaniques, il convient d'éviter les forces de cisaillement, telles que le mélange
vigoureux ou le vortexage, après la lyse cellulaire. Dans ce contexte, toutes les étapes
de mélange doivent être effectuées par une inversion minutieuse des tubes à plusieurs
reprises plutôt que par vortexage. Les extrémités peuvent être coupées pour minimiser
la force de cisaillement.

Le stade le plus délicat de l'isolement des plasmides est la lyse des bactéries, car une
lyse incomplète et une dissolution totale de la cellule peuvent réduire le rendement en
ADN plasmidique.

Comme la simple lyse de la cellule génère une énorme quantité d’ADN génomique à
partir de bactéries de poids moléculaire élevé, elles peuvent être séparées de l’ADN
plasmidique par centrifugation à grande vitesse et d’autres débris cellulaires.

La méthode la plus populaire d'isolement de l'ADN plasmidique est l'utilisation de

Birnboim et Doly (1979). Cette technique tire parti de la plage étroite de différence de
pH (12,0 à 12,5), qui dénature l’ADN linéaire mais non l’ADN circulaire fermé de
manière covalente. Ainsi, lors de la digestion par le lysozyme, la paroi cellulaire de

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bactéries s’affaiblit et les macromolécules cellulaires sortent de la cellule en raison du
traitement au SDS et à l’hydroxyde de sodium.

L'ADN chromosomique reste sous forme de poids moléculaire élevé mais devient
dénaturé. Lorsqu'il est neutralisé avec un milieu acide, l'ADN chromosomique se
renature et s'agrège pour former un réseau insoluble. En outre, une concentration
élevée d'acétate de sodium précipite les complexes protéine-SDS et l'ARN de haut
poids moléculaire.

Comme le pH de la dénaturation alcaline est soigneusement contrôlé, la forme

circulaire fermée des molécules d’ADN plasmidique reste toujours dans leur forme
native dans la solution, tandis que les autres macromolécules contaminants
coprécipitent. Ainsi, le précipité peut être éliminé par centrifugation pour concentrer le
plasmide par précipitation à l'éthanol. Si nécessaire, les plasmides peuvent être encore
purifiés par filtration sur gel.