Purificación y caracterización de un compuesto antimicrobiano producido por Lactobacillus

plantarum que mostró actividades tanto antifúngicas como antibacterianas

*Como vemos este artículo fue realizado en Korea, en la Universidad de Chosun

*Para esquematizar la exposición la dividimos en 4 partes: primero un contexto general, luego

materiales y métodos, seguimos con Resultados y discusión y finalmente con las conclusiones.

¿Qué es?

Lactobacillus plantarum pertenece al dominio “Bacterya” y a la familia “Lactobacillaceae”. Son un

grupo de microorganismos Gram positivos que se utilizan ampliamente en la preservación de alimentos
debido a sus propiedades probióticas y su capacidad para producir bacteriocinas (pero de esto
hablaremos a continuación).

Ensayo de actividad antimicrobiana

La actividad antimicrobiana se determinó utilizando el ensayo spot-on-the-lawn.

Como observamos en la imagen de la izquierda, en este método se hace uso de un medio selectivo o
diferencial en este caso utilizamos uno selectivo, el cual es caldo MRS (el cual se mencionó
anteriormente). Se utiliza una distribución similar a la que observamos en la imagen de la derecha.

Para garantizas mejores resultados, las alicuotas de la muestra antimicrobiana, fueron concentradas 5
veces y las placas se prepararon esparciendo la bacteria sobre el medio.

La actividad antimicrobiana se definió como la actividad recíproca de la dilución más elevada a la que
se inhibía el crecimiento microbiano. Y se calculó como (1000/d)*D, donde D es el factor de dilución y
d es igual a el volumen original de la muestra antes de realizar la concentración de 5 veces, es decir, 50
μL.

Análisis de ácidos orgánicos

Los ácidos orgánicos producidos por estos microorganismos se determinaron usando un sistema de
cromatografía iónica.

El equipo utilizado es como el que vemos en esta imagen, a grandes rasgos, esta técnica utiliza algo
llamado resinas de intercambio iónico, los cuales son polímeros capaces de intercambiar iones que se
encuentran presentes en él con iones en una solución que se pasa a través de ellos. Entonces, cuando la
muestra atraviesa las columnas que tienen estas resinas, los iones se separan y una vez separada, la
muestra pasa a través de un detector donde se registra la señal.

(Por si acaso) Nota: El resultado son unos cromatográmas donde la posición de los máximos nos indica
el ión presente (carácter cualitativo) y su área nos indica que cantidad existente de dicho ión (carácter
cuantitativo).
Y es así como se logra analizar los ácidos orgánicos presentes, cabe resaltar que para el desarrollo
experimental, fue necesario el uso de diferentes columnas para cada ácido (acético, cítrico, fórmico,
láctico…)

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Como ya se explicó anteriormente, la muestra que contiene el principio activo fue preparada por PSE, y
adicionalmente se separó utilizando cromatografía líquida de alta resolución o HPLC.

Básicamente, en esta técnica los analitos se separan al pasar a través de una fase estacionaria,
transportados por una fase móvil.

Aquí podemos observar un esquema del cromatógrafo con el que se realiza esta técnica, en primer
lugar tenemos un contenedor de la fase móvil (que es basicamente el diluyente que transporta la
muestra a través del equipo), tenemos una bomba que nos genera esa presión necesaria para que la fase
movil viaje a través del equipo, hasta que llega a la válvula de inyección que es donde se inyecta la
muestra, entra a la columna (fase estacionaria) y ahí es donde se va generando la señal que se registra
en el detector y se interpreta en el software de datos.

Espectro antimicrobiano de L. plantarum EM

Para determinar si las actividades antifúngicas y antibacterianas se dieron por la producción orgánicos,
se investigó el análisis de ácidos orgánicos en el filtrado de cultivo y en el SPE-AS.

Entonces, se detectaron 4 ácidos orgánicos en el filtrado de cultivo (los observamos en la tabla).

Por el lado del SPE-AS sólo observamos el ácido acético y el feniláctico debido a que los demás se
desecharon a través del proceso PSE.

Luego, estos ácidos fueron analizados a través de Cromatografía iónica y los resultados arrojaron que el
ácido feniláctico y el ácido cítrico no presentaron actividad antimicrobiana y si bien el ácido cítrico
poseía propiedades antibacterianas, estas no eran tan altas como las que presentaba el ácido láctico, por
lo que se llegó a que propablemente la actividad antibacteriana de L. plantarum EM contra diversas
bacterias patógenas transmitidas por los alimentos podría originarse principalmente en este ácido.

3.3. Purificación e identificación del compuesto antimicrobiano.

El compuesto antimicrobiano contenido en SPE-AS se purificó por HPLC. La finalidad con que se
realizó esto fue para determinar cuál componente producía un pico más puro, y con ello determinar
cuál era el que albergaba las actividades antifúngicas y antibacterianas.

Lo que observamos en estas imágenes, son los cromatogramas, esto es lo que arroja el equipo con que
se lleva a cabo el HPLC. También observamos la utilización del método spot-on-the-lawn para analizar
la actividad en A. fumigatus y B. cereus. Lo que se hizo a través del HPLC fue separar la muestra en
diferentes fracciones y esas fracciones se analizaron con el ensayo de spot-on-the-lawn.
Básicamente lo que se hizo fue un proceso de descarte: Se realizó una primera ronda de HPLC, con 16
fracciones (como observamos en la imagen), se analizaron las actividades antrimicrobianas y se
tomaron aquellas fracciones que mostraran actividades más altas, que en este caso fue de la 7 a la 12.

Estas fracciones activas fueron sometidas a una segunda HPLC con las mismas condiciones, esta vez
obteniendo 13 fracciones y determinando que las fracciones 9 a 10 fueron las que mostraron las
actividades más altas.

Estas se sometieron a una tercera HPLC, se obtuvo que la fracción 5 era la fracción activa.

Y finalmente, al someter a una cuarta HPLC se obtuvo que la fracción 4 fue la de mayor actividad. Este
resultado se confirmó al realizarle otro HPLC, donde esta vez se obtuvo un pico puro.