Microscopia y técnicas histológicas

I: Microscopia

Microscopia óptica
Un microscopio, ya sea simple (una sola lente) o compuesto (lentes múltiples), es un
instrumento que aumenta el tamaño de una imagen y permite ver más detalles de lo
que sería posible a simple vista.
El poder de resolución del ojo humano (o sea, la distancia que debe haber entre dos
objetos para que se ven separados y que no parezcan uno solo, 0,2 mm) está
determinado por el
espacio que hay entre dos
células fotoreceptoras
contiguas de la retina.
La función de un
microscopio es la de
ampliar una imagen hasta
el grado en el cual la
retina pueda resolver la
información, que, de otro
modo, estaría por debajo
de su límite de resolución.
Poder de resolución (d)
Es la capacidad de un sistema óptico para mostrar como separados a dos puntos
ubicados a muy pequeña distancia entre sí. La calidad de una imagen, es decir, la
claridad y la riqueza de detalles dependen del poder de resolución del objetivo.

 Límite de resolución: Es la mínima distancia que debe haber entre dos puntos
para mostrarlos separados e individuales. Este límite es la inversa del poder de
resolución de manera que cuanto menor sea el límite de resolución, mayor
será el poder de resolución.
1
LR =
PR
El límite de resolución depende de la longitud de onda de luz utilizada y de la apertura
numérica (AN) del lente objetivo (el lente ocular solo aumenta la imagen del objetivo,
no contribuye al poder de resolución)
El límite de resolución se obtiene a través de la siguiente fórmula:
𝑘𝑥𝜆
LR =
AN
De este modo se obtiene un límite de resolución, de aproximadamente 0,2 µm.
Microscopio óptico o de campo claro
Es el microscopio más utilizado. Sus componentes son:

 Fuente luminosa, para la iluminación de la muestra

 Lente condensador, para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra; es

decir que su función es la de concentrar la luz. Suele llevar incorporado el
diafragma, con el cual se regula la anchura del haz de luz que llega al objetivo.

 Platina, sobre la que se coloca el portaobjetos.

 Lente objetivo, para recoger la luz que ha atravesado la muestra. Se

encuentran situados en el revólver porta-objetos. Existen dos tipos de objetivos

A) Objetivos secos (4X, 10X, 40X), en donde la preparación y el objetivo están

separados por el aire, ya que no se necesita interponer ninguna sustancia entre
ellos.
B) Objetivos de inmersión (100X), en donde entre la preparación y el objetivo se
interpone el aceite de inmersión.

 Lente ocular, a través del cual se puede examinar directamente la imagen

formada por la lente objetivo.
Aumento total
Se define como la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto
observado. Dicha relación viene determinada por el objetivo y el ocular existentes en
el microscopio óptico.
El aumento total se calcula multiplicando el número de aumento del objetivo por el
número de aumento del ocular.

Ocular Objetivo Aumento total

10X 4X 40X
10X 10X 100X
10X 40X 400X
100X
10X (Objetivo de inmersión) 1000X

Microscopia electrónica

Hay dos tipos de microscopios electrónicos que proporcionan datos morfológicos y

analíticos de células y tejidos: el microscopio electrónico de transmisión (MET) y el
microscopio electrónico de barrido (MEB).
Con el microscopio electrónico se logra un muy notable incremento del aumento y el
poder de resolución. En principio, se debe a que se reemplaza la luz visible, de longitud
de onda de alrededor de 500 nm, por un haz de electrones de longitud de onda de
0,005 nm. Esto implica que el límite de resolución de los microscopios electrónicos no
puede ser superior a 0,2 nm, es decir, unas mil veces mejor que el microscopio óptico.
Además la apertura numérica del microscopio electrónico es mucho menor que la del
microscopio óptico.

El MET utiliza la interacción de un haz de electrones con la muestra para producir

una imagen (la palabra transmisión se refiere a que electrones atraviesan el objeto)
La “óptica” del MET es, en principio similar a la del microscopio óptico, excepto que el
MET utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz.
El principio del microscopio es el siguiente:
  Una fuente (cátodo, cañón de electrones) como es un filamento de tungsteno
calentado que emite electrones

 Los electrones son atraídos hacia un ánodo

 Una diferencia eléctrica entre el cátodo y el ánodo imparte a los electrones un

voltaje de aceleración de entre 20.000 y 200.000 voltios, con lo que se genera
un haz de electrones.

 Este haz de electrones atraviesa luego una serie de lentes electromagnéticas

que cumple la misma función que los lentes de cristal de un microscopio óptico.
La lente condensador da forma al haz de electrones que alcanza el plano de muestra y
cambia su diámetro. Entonces, el haz que ha atravesado la muestra es enfocado y
aumentado por una lente objetivo para después volver a ser aumentado por una lente
proyector.
Las partes de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen claros;
las partes que han absorbido y
dispersado los electrones a causa de su
densidad inherente o de la adición de
metales pesados durante la
preparación, aparecen oscuras.
El valor del microscopio óptico radica en
el gran poder de resolución que es
posible obtener. Sin embargo, es
importante diferenciar entre el poder
de resolución teórico, de unos 0,2 nm,
que puede lograrse al analizar polvo
metálico (por ej.) y el poder de
resolución en la práctica, que puede
lograrse en la investigación de
preparados biológicos, de 2 nm.
El uso de microscopio electrónico está
limitado por el escaso poder de
penetración del haz de electrones por lo
que es necesario utilizar cortes de tejido
muy delgados (20 – 100 nm)
Dibujo esquemático de la conformación de un
microscopio electrónico.

En la microscopio electrónica de barrido el haz de electrones no atraviesa la muestra,

sino que explora (barre) la superficie.
 En el microscopio de barrido, los electrones no atraviesan el objeto; la imagen se
forma indirectamente por captación puntual de detalles en la superficie del preparado.
El MEB forma la imagen de la superficie y no es necesario utilizar cortes ultrafinos,
dado que el haz de electrones no atraviesa el preparado.

Diagramas comparativos de la formación de la imagen en diferentes tipos de microscopios. El

microscopio óptico (izquierda) se presenta como si estuviera invertido; el microscopio óptico de
transmisión (MET) aparece en el medio y el microscopio electrónico de barrido (MEB) se ilustra a la
derecha. Tanto en el MET como en el MEB las muestras deben mantenerse en un medio de gran
vacío.
II: Histología

La palabra histología significa estudio del tejido, y se refiere al análisis de la

composición microscópica y las respectivas funciones de los organismos pluricelulares.
Marcello Malpighi fue el fundador de la histología.
Solo existen cuatro tejidos animales fundamentales, los cuales son, tejido epitelial,
tejido conectivo, tejido muscular y tejido nervioso.
Se forman tejidos cuando las células, por lo general de distinto tipo (especialización) se
agrupan para llevar a cabo determinadas funciones. Además de las células, el tejido se
compone de una matriz extracelular, producida por las propias células, en la que estas
se encuentran inmersas para conformar una organización estructural característica de
cada tejido.
Los órganos son unidades funcionales mayores, compuestas por distintos tipos de
tejidos (ej. Hígado) Los sistemas orgánicos comprenden varios órganos con funciones
relacionadas (ej. Sistema respiratorio). Por último los sistemas difusos se definen
como grupos celulares con funciones relacionadas pero de localización difusa en varios
órganos distintos.
Más allá de que por su etimología la palabra histología significa estudio de los tejidos,
la asignatura histología incluye, además, la estructura de las células de los tejidos y la
conformación de los órganos; es decir, el estudio de las células o citología, el estudio
de los tejidos o histología propiamente dicha y el estudio de la estructura de los
órganos o histología especializada (también anatomía microscópica)
El objetivo de la histología es comprender la microanatomia de las células, la
estructura y la ultraestructura de los tejidos, y los órganos y a correlacionar la
estructura y ultraestructura con la función: histofisiología.

III: Técnicas de histología y embriología

Preparación e investigación de tejidos

muertos

El estudio directo de células y tejidos solo puede efectuarse en forma limitada, ya que
es difícil diferenciar los distintos componentes entre sí con la microscopia óptica, dado
que tienen igual grado de refracción de la luz. Además, por lo general el tejido
presenta un espesor tal que la penetración de la luz y el poder de resolución son
insuficientes.
Debido a esto se utiliza con mucha mayor frecuencia el tejido muerto, que se
mantiene mediante acciones químicas inmediatamente después de extraído y se corta
en secciones muy delgadas, denominadas cortes histológicos (una delgada rebanada
de tejido, cuyo grosor varía entre 0,5 y 10 o más µ)
Después de la tinción con distintos colorantes, se observan los cortes con el
microscopio óptico, dado que el contraste creado por la tinción permite diferenciar os
componentes.
Preparación de cortes histológicos
Pasos en la obtención de un preparado histológico por el método de inclusión en
parafina.
1°. Extracción de la muestra: La extracción del tejido se realiza mediante pinzas y una
chuchilla/ hoja de afeitar, con daño mínimo del trozo de tejido- Puede efectuarse por
biopsia, que es la muestra de tejido extraída del organismo vivo, o por necropsia.

2°. Corte del órgano o tejido: El tejido u órgano obtenido de un animal (muestra de
tejido) es cortado inicialmente en piezas menores.
3°. Preparación del especimen para la obtención de cortes histologicos

A) El primer paso en la preparación de una muestra de tejido u órgano es la

fijación para conservar la estructura.
La fijación, lograda por la acción de distintos agentes químicos denominados
fijadores, conserva la estructura del tejido de forma permanente para permitir el
tratamiento ulterior.
Las muestras tienen que sumergirse en el fijador inmediatamente después de
extraerse del organismo (fijación por inmersión)
La fijación se utiliza para:

 abolir el metabolismo celular,

 impedir la degradación enzimática de las células y de los tejidos por
autolisis (autodigestión) que lleva a la degeneración post-mortem.
 destruir los microorganismos patógenos, como las bacterias, los hongos o
virus que podrían destruir el tejido, y
 endurecer el tejido como consecuencia de la formación de enlaces cruzados
o de la desnaturalización de las moléculas proteicas.
Se diferencian los fijadores coagulantes, que modifican la conformación de las
proteínas hasta el punto de impedir sus funciones (ej. la actividad enzimática) y los
fijadores gelantes, que promueven la formación de enlaces cruzados entre las
moléculas proteicas, por lo que se mantiene su ubicación relativa igual que en la célula
viva.
El fijador de uso más común es el formaldehido, el cual preserva la estructura general
de la célula y de los componentes extracelulares al reaccionar con los grupos aminos
de las proteínas.
[Sin embargo, el formaldehido no reacciona con los lípidos y, por consiguiente, es un
mal fijador de las membranas; para conservar estructuras de a membrana hay que
usar fijadores especiales con metales pesados, como permanganato y osmio, que se
unan a los fosfolípidos. El empleo de rutina de tetróxido de osmio como fijador en la
ME es la razón principal del excelente estado de conservación de las membranas en las
microfotografías electrónicas]
B) Deshidratación
Luego de la fijación, la muestra se lava y se deshidrata sumergiéndolo sucesivamente
en alcoholes de graduación creciente (50 – 70 – 96 – 100) hasta llegar al alcohol
absoluto (100%). Esto se lleva a cabo ya que los medios de inclusión son insolubles en
agua, por lo que antes es necesario deshidratar el tejido.
A continuación, se lo sumerge en un líquido como el xileno o tolueno (o un sustituto
del xilol), que es miscible tanto en alcohol 100% como en parafina. Este paso
intermedio, llamado aclaración, es esencial antes de impregnar el tejido deshidratado
con parafina ya que el alcohol y la parafina son inmiscibles.
C) Inclusión en parafina

Durante la impregnación la parafina reemplaza por completo al xileno; este

procedimiento se realiza en una estufa a una temperatura ligeramente superior a la
del punto de fusión de la parafina.
Cuando se completa la impregnación la muestra es transferida a un molde y se
remueve el exceso de parafina alrededor de la muestra. Al enfriar, se solidifica la
parafina y, junto con el tejido incluido, forma un bloque solido o taco, que se secciona.
4°. Corte con micrótomo: El tejido fijado se corta en secciones delgadas que permite el
paso de la luz. La mayoría de los preparados para microscopia óptica tienen un espesor
de alrededor de 1-10 µmm, para lo que se requiere un micrótomo, que los corta en
rebanas finas (0,5 µm) con una cuchilla de acero.

5°. Extensión y estiramientos de los cortes en un baño de agua: Posteriormente se

separan con cuidado uno o dos cortes y se depositan sobre la superficie del agua de un
baño de agua caliente. Esto ablanda la parafina y estira el corte eliminando las arrugas.
6°. Montaje
Los cortes luego son transferidos a un portaobjetos de vidrio, al que antes se le ha
añadido una pequeña cantidad de medio de montaje (albumina, pineno o resinas
acrílicas) para que sirva de adhesivo.
7° Desecado en un calentador: El portaobjetos se coloca sobre una plancha caliente de
37°- 40°; a medida que el preparado se seca, el corte se adhiere a la superficie del
portaobjetos.

7° Tinción, donde el corte se tiñe para permitir su examen

Los cortes de tejido se montan sobre portaobjetos y se tiñen.
La mayoría de los colorantes histológicos se utilizan en solución acuosa, por lo que los
cortes incluidos en parafina deber ser “desparafinados” mediante un tratamiento con
xileno u otro solvente apropiado y rehidratados por pasajes por concentraciones
decrecientes de alcohol en agua antes de ser teñidos (100 – 96 – 70 – 50)
La mayor parte de los métodos de tinción histológicos se eligen según su capacidad
para teñir selectivamente los componentes tisulares.
La tinción más usada es una combinación que emplea hematoxilina y eosina (H&E),
que tiñe los componentes nucleares de azul violáceo, mientras que las estructuras
citoplasmáticas adquieren una tonalidad rosácea.
El tejido sobre el portaobjetos se tiñe con hematoxilina en agua (10 min). Como el
colorante en contraste, la eosina, es más soluble en alcohol que en agua, se vuelve a
deshidratar la muestra en soluciones alcohólicas de concentración creciente y después
se tiñe con eosina en alcohol.
Después de la tinción, se deshidrata nuevamente la muestra de tejido hasta llegar al
xileno o tolueno y se monta, es decir, se cubre con una gota de medio de montaje
transparente no acuoso y después se coloca un cubreobjeto para proteger el
preparado.
IV: Histoquímica y citoquímica

Métodos histoquímicos

Los métodos histoquímicos aprovechan las acciones físicas y químicas sobre los
preparados histológicos para determinar la localización de sustancias químicas en las
células y los tejidos.
Antes de la reacción histoquímica en sí, es necesario efectuar una fijación y una
preparación adecuadas, que conserven la sustancia química estudiada y las estructuras
celular y tisular (ej. los solventes orgánicos como el xileno disuelven los lípidos y deben
evitarse al estudiarlos)

Fundamentos químicos de la coloración

Colorantes ácidos y básicos

- La hematoxilina y la eosina son los colorantes de uso frecuente en la
histología.
Un colorante ácido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte
coloreada, y se describe con la fórmula general [Na+ anilina-]
Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas
en el citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular
Un colorante básico, tiene una carga neta positiva en su parte coloreada, y se describe
con la fórmula general [anilina+ Na-] (La hematoxilina no es estructuralmente un
colorante básico, pero tiene propiedades tintoriales muy semejantes a las de las
anilinas básicas)
Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes
de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos. Así, ponen de manifiesto el
núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy
abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes ácidos.
- Los colorantes básicos reaccionan con los componentes aniónicos de las
células y tejidos (componentes con una carga neta negativa)
Entre los componentes aniónicos se encuentran los grupos fosfato de los ácidos
nucleicos, los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de
las proteínas. La capacidad de estos grupos aniónicos de reaccionar con un
colorante básico se denomina basofilia.
 - Los colorantes ácidos reaccionan con los grupos catiónicos de las células y de
los tejidos; en particular con los grupos aminoionizados de las proteínas.
Los colorantes ácidos (o aniónicos) llevan una carga negativa y tiñen los componentes
celulares o tisulares que portan cargas positivas. La reacción de los grupos catiónicos
con un colorante ácido recibe el nombre de acidofilia.

Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y

teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hematoxilina) y el citoplasma
de color rosado (eosina).

Secciones de parafina de 8 µm de grosor teñidas con hematoxilina y eosina. A) Vellosidades del

intestino delgado. B) Detalle del epitelio del digestivo. C) Hepatocitos. D) Papila fungiforme de la
lengua.

ÍNDICE de TÉCNICAS

1. Introducción

Proceso histológico
 Una cantidad limitada de sustancias dentro de las células y en la matriz extracelular
presenta basofilia.
Entre estas sustancias se incluyen:

 heterocromatina y nucléolos del núcleo (principalmente por los grupos

fosfato ionizados en los ácidos nucleicos)
 componentes citoplasmáticos como el ergastoplasma (también por los
grupos fosfato ionizados en el ARN ribosómico)
 material extracelular como los hidratos de carbono complejos de la matriz
cartilaginosa (por los grupos sulfato ionizados)
La tinción de los colorantes ácidos es menos específica, pero más sustancias dentro
de las células y en la matriz extracelular presentan acidofilia.
Estas sustancias comprenden:

 la mayor parte de los filamentos citoplasmáticos, en especial los de las células

musculares,
 la mayoría de los componentes membranosos intracelulares y una gran parte
del citoplasma no especializado de otro modo y
 la mayor parte de las fibras extracelulares (principalmente por los agrupo
amino ionizados)

Otros métodos de tinción

Métodos basados en la reacción de Schiff para

grupos aldehído
El reactivo de Schiff es la leucofucsina formada
por el tratamiento del colorante rojo fucsina con
bisulfito. La leucofucsina es incolora, pero forma
un producto rojo de adición estable con los
grupos aldehído.
La reacción de PAS (ácido periódico- reactivo de
Schiff) tiñe hidratos de carbono y
macromoléculas con abundancia de hidratos de
carbonos, que se tiñen de color magenta. Se usa
para detectar moco en varios tipos de células y
tejidos, la membrana basal subyacente a los
epitelios y las fibras reticulares del tejido
conjuntivo.

Microfotografía de una tinción con PAS de un

preparado de la mucosa del intestino delgado. En el
epitelio se distinguen células caliciformes de color
rojo intenso, que contienen secreción (una
glucoproteína) que se tiñe con la reacción de PAS.
Varios componentes tisulares reaccionan con el método de PAS; se dice que son "PAS-
positivos”

Tinción con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la

derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente.

Se pueden apreciar las células caliciformes teñidas de rosado con la técnica de PAS por su alto
contenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tinción general aparecen transparentes, sin
teñir.

Determinación histoquímica de lípidos

Después de la fijación de los lípidos con formol, se cortan secciones congeladas para
evitar la extracción de los
lípidos mediante solventes
orgánicos.
Para la demostración
histoquímica, a menudo se
utilizan los colorantes
denominados Sudán. Son casi
insolubles en agua pero
solubles en lípidos, por lo que
se utilizan disueltos en alcohol
diluido, que no disuelve las
grasas.
Los colorantes Sudán tiñen con
intensidad los triacilgliceroles,
por ejemplo, por tinción de los
adipocitos con rojo Sudán.
Microfotografía de un corte por congelación de
tejido adiposo teñido con rojo Sudán para los lípidos
de los adipocitos.
Metacromasia
Ciertos colorantes básicos reaccionan con componentes hísticos que hacen cambiar su
color normal del azul al rojo o al púrpura; esta modificación de la absorbancia se
denomina metacromasia.
Las estructuras de las células y de los tejidos con una alta concentración de grupos
sulfato y fosfato ionizados, como la sustancia fundamental del cartílago (matriz
cartilaginosa), los gránulos de heparina de los mastocitos y el retículo endoplasmático
rugoso de los plasmocitos exhiben metacromasia.
Los colorantes capaces de sufrir esta transformación se denominan colorantes
metacromáticos; pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantes básicos, de los
cuales los más importantes son azul de toluidina y tionina.
Inmunocitoquímica
El organismo está en condiciones de reaccionar ante sustancias extrañas, los
antígenos, y formar anticuerpos específicos que se unen con estos. Actúan como
antígenos las macromoléculas proteicas o las polisacáridas. Los anticuerpos son
proteínas producidas por las células plasmáticas y circulan por la linfa y la sangre.
La reacción entre un antígeno y su anticuerpo es muy específica.
Los anticuerpos pueden purificarse de la sangre y conjugarse (asociarse) con un
colorante fluorescente. En general los colorantes fluorescentes (fluorocromos) son
sustancias químicas que absorben luz de longitudes de onda diferentes (ej. luz
ultravioleta) y luego emiten luz visible de una longitud de onda especifica (ej. verde,
amarillo, rojo)
La fluoresceína (el colorante de uso más frecuente, junto con rodamina y proteína
verde) absorbe luz ultravioleta y emite luz verde. Los anticuerpos conjugados con
fluoresceína pueden aplicarse a cortes de tejidos sobre portaobjetos de vidrio para
localizar un antígeno en las células y tejidos.
La reacción del anticuerpo con el antígeno luego puede examinarse y fotografiarse con
un microscopio de fluorescencia o con un microscopio confocal que produce una
reconstrucción tridimensional del tejido examinado.

V: Interpretación de cortes

Antes de poder comprender un corte histológico se debe conocer la estructura

anatómica del órgano. También es útil saber en qué sentido se lo cortó: si fue un corte
transversal, longitudinal u oblicuo, y si el corte se realizó a través de todo el órgano o
solo abarco parte de él.
Con frecuencia se marcan los preparados indicando el sentido del corte. No es un caso
importan si el órgano es asimétrico (ej. bazo o hígado) ya que su apariencia en el
microscopio será la misma cualquiera sea el sentido del corte.
Es importante considerar la estructura tridimensional de los órganos y sus
componentes cuando se examina un preparado histológico.

Las células son objetos tridimensionales que varían en tamaño y forma. Por otro lado,
las células pueden tener una distribución al azar o muy específica en el órgano. La
manera en que luce una célula en un preparado histológico depende tanto de su forma
real como de la manera en que se la cortó.
Los números primos ilustran cortes transversales (4), oblicuos (1) y, longitudinales (2, 3, 5,6)
efectuados sobre una estructura multicelular que consiste en una monocapa con proyecciones
huecas (por arriba de la monocapa) e invaginaciones (por debajo de la monocapa).