UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER Versión:

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL MEDIO Fecha de

AMBIENTE Aprobación
ASIGNATURA MICROBIOLOGÍA GENERAL PARA Página:
INGENIERÍAS

GUÍA: TECNICAS DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS

DOCENTE: ZAIDA ROCIO CONTRERAS VELASQUEZ

1. INTRODUCCIÓN

En una pequeña porción de muestra de agua, suelo, alimento, etc; se puede encontrar una significativa cantidad
de microorganismos, es importante para el microbiólogo tener una idea clara de cada una de las técnicas que
debe desarrollar para conocer el número de microorganismos presentes sea por métodos directos o indirectos.

2. OBJETIVOS

 Conocer las técnicas de recuento de microorganismos directo e indirecto.

 Desarrollar los procedimientos de manera adecuada para usar en el futuro de su práctica profesional.

3. FUNDAMENTOS

Para la determinación del Número de microorganismos se pueden utilizar métodos directos e indirectos:

3.1 METODOS DIRECTOS

 Recuento total en cámara de New Bauer

Es el método para contar microorganismos diluyendo la muestra en un volumen final conocido. Se

cuenta las células en varios cuadrados de la cámara y se realiza el promedio.

Figura 1. Camara de Neubauer

Tomado de: Betancurt et al. https://spanish.alibaba.com/product-detail/factory-direct-sale-keep-in-stock-blood-counting-chamber-for-lab-and-hosptical-
1918837329.html

Figura 2. Camara de Neubauer de perfil

Tomado de: https://spanish.alibaba.com/product-detail/factory-direct-sale-keep-in-stock-blood-counting-chamber-for-lab-and-hosptical-
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La cámara consta de 4 cuadrantes (ubicados en las esquinas) y un cuadrante central de un mm de lado

(el que se utilizará). Este cuadrante central se encuentra dividido en 25 cuadrados, cada uno de ellos a
su vez divididos en 16 cuadraditos.

El cálculo para hallar el número de células x mm3 en la muestra, se obtiene aplicando la siguiente
fórmula:
KxNxD
Donde:
K es la constante de la Cámara =10 (para llevar 0,1 mm3 a 1 mm3)
D es la inversa de la dilución (es decir, si la dilución es 1/100, se debe multiplicar por 100)
N es el número de células en los cuadrantes señalados en el cuadrante del centro

Materiales y Métodos:

 Levadura comercial
 Caldo Sabouroud
 4 tubos de agua peptona de 9 ml cada uno
 Micropipeta 100 – 1000 ul
 Micropipeta 10-50 ul
 Capilares
 Camaras de New Bauer
 Microscopio
 Incubadora a 27ºC

Procedimiento:

1. Agregar un gramo de levadura comercial en 5 ml de caldo Sabouroud y dejar incubar por 24 horas a
27 ºC.
2. Realizar las diluciones que sean necesarias.

3. Agregar en cada pozo de la cámara de New Bauer, 10 ul de la dilución preparada.

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3,0 mm
Área= 1,0 mm2 o 0,1 mm3

1,0 mm

4. Preparación de la cámara
 Lavar la Cámar a y el cubre con agua destilada y alcohol al 96%
 Secar bien con papel suave
 Poner el cubreobjeto encima de la cámara
 Homogeneizar removiendo bien el cultivo donde residen las levaduras
 Tomar con una pipeta la muestra
 Poner la punta de la pipeta en una de las dos ranuras de la cámara y por capilaridad las
levaduras se distribuirán en la cámara.
 Si se crea una cámara de aire repetir la operación desde el principio.
 Esperar unos minutos antes de contar para que las levaduras se depositen en la cámara

5. Preparativos del Microscopio

 El enfoque del microscopio se empieza con el objetivo de menor aumento (10x), ubicándose en
el centro de la cámara, posteriormente, sin desenfocar se pasa al objetivo de 40X.

 Se hace el recuento en el cuadrante central, éste tiene 25 cuadros, de éstos se seleccionan 5,
los cuatro de las esquinas y el del centro.

6. Tener en cuenta las siguientes fórmulas para los resultados del número de células por ml
Cálculos:
Si se cuentan 25 cuadriculas del centro de la cámara:
No de células x inversa de la dilución x 10 x 1= No de células x mm3
Si se cuentan 5 cuadrículas del centro de la cámara
No de células x inversa de la dilución x 10 x 5= No de células x mm3
Si se cuenta 1 cuadrícula del centro de la cámara
No de células x inversa de la dilución x 10 x 25= No de células x mm3
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Se promedia el valor de los tres resultados lo cual corresponde al No de células x mm3 de la muestra.
Teniendo en cuenta que el reporte se lleva a cabo en ml, se multiplica el valor obtenido por 1000
obteniendo el valor de 1 cm3, equivalente a 1 ml.

3.2 METODOS INDIRECTOS

 Recuento en placa

Se basan en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada

una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente a una colonia de
forma que el número de éstas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra
plaqueada (sembrada). El sistema es fácil de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve para
hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un
volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen
dado de muestra con el medio de cultivo antes que se solidifique). Esta última opción permite realizar
el recuento de microorganismos microaerófilos (que no crecen bien en la superficie de las placas de
cultivo). Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contra
entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida.

Materiales y Métodos:

1 Tubo de ensayo con crecimiento de levaduras Sacharomyces

4 Tubos de ensayo c/u con 9 ml de agua de dilución esteril
1 Gradilla
1 micropipeta 100 – 1000 ul
4 medios de cultivo de agar sabouroud
1 Mechero de Bunsen
1 Incubadora

Procedimiento:

 Técnica de recuento en placa en superficie

En condiciones asépticas:
a) Agitar vigorosamente el tubo de ensayo con el crecimiento de E. coli, para homogeneizar.
b) Pipetear 1 ml de la muestra y verterlo en el primer tubo con 9 ml de agua de dilución esteril, quedando
entonces una dilución de 10 -1.
c) Agitar la dilución anterior y con pipeta estéril, tomar 1 ml de ésta dilución y agregarla en el segundo tubo,
quedando una dilución 10-2.
d) Agitar la dilución anterior y con pipeta estéril tomar 1 ml de ésta dilución y agregarla en el tercer tubo,
quedando en éste tubo una dilución 10 -3.
e) Agitar la dilución anterior y con pipeta estéril tomar 1 ml de ésta dilución y agregarla en el cuarto tubo,
quedando en éste tubo una dilución 10 -4.
f) Marcar 4 cajas de petri 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4, verter en cada caja de petri 0,1 ml de su respectiva dilución.
g) Hacer una siembra masiva con ayuda de un hisopo de algodón.
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 Técnica del Recuento en Placa profunda

Se desarrollan los pasos como están en la siembra para placa en superficie seguido de:
h) Antes de que pasen 10 minutos, agregar a cada caja de Petri el medio de cultivo contenido en un tubo, a
temperatura máxima de 47°C (todavía líquido). Una temperatura mayor puede causar la muerte total o
parcial de los microorganismos.
i) Antes de que el medio de cultivo solidifique homogeneizar cada caja mediante movimientos de traslación
y rotación en una superficie plana, durante aproximadamente 1 minuto, evitando que se mojen la tapa y
los costados de la caja. De ésta manera la muestra y el agar son mezclados íntimamente.
j) Dejar reposar las cajas el tiempo necesario para que se solidifique el agar.
k) Una vez solidificado el agar en las cajas, incubar en posición invertida con el objeto de que el agua de
condensación del agar no caiga sobre la superficie del cultivo.
l) Incubar a 37 °C durante 24 horas.
m) Transcurrido el tiempo de incubación contar las colonias que se han desarrollado en cada una de las
placas.
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Al hacer el recuento, tener en cuenta las siguientes consideraciones:

 Seleccionar las cajas que contengan entre 20 y 250 colonias y descartar otras.
 Si son varias las que entran en éste intervalo, contar todas y como resultado, tomar el promedio de 2
cajas.
 Si no hay ninguna caja con un recuento dentro del intervalo mencionado, se hará de aquella que tenga el
valor más próximo a cualquiera de los dos extremos. En estos casos los resultados se tomarán cómo
aproximados.
 Si el recuento no se hace en el mismo momento de sacarlas de la incubadora, se pueden conservar las
cajas dentro del refrigerador entre 5 y 10 °C, durante un periodo máximo de 24 horas.

Cálculo y presentación de Resultados:

Una vez el recuento de las cajas correspondientes, los resultados obtenidos se elaboran de la siguiente manera:
 Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 1 ml, la expresión por resultado es directa.
 Si la cantidad de aguasembrada ha sido de 1 ml, el número de colonias contadas habrá de dividirse por
el volumen de muestra sembrada, es decirpor 0,1 ml para obtener el número de colonias por mililitro.
 En general se tiene que la ecuación es:

UFC/ml= Numero de colonias * inverso de la dilución*10(si se siembra 0,1 ml)

 UFC/ml = Número de colonias en volumen de muestra sembrada en ml.

 Si no se observan colonias en ninguna de las cajas sembradas, el resultado no será de 0 UFC/ml, sino
que será referido al menor grado de dilución sembrado.

4. CUESTIONARIO
 Realizar una comparación de las ventajas y desventajas de los métodos usados.
 Que otro90as sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los recuentos.
 ¿Cuál es la composición del medio de cultivo usado en la caja de petri?
 Explicar con un ejemplo la investigación de otro tipo de microorganismos utilizando éstas mismas
técnicas.
 ¿Teniendo en cuenta el campo de acción profesional, que tipo de muestra se utilizaría usted para estudio
y como se prepararía ésta para hacer la dilución?

5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

https://spanish.alibaba.com/product-detail/factory-direct-sale-keep-in-stock-blood-counting-chamber-for-
lab-and-hosptical-1918837329.html