1.

Resumen

Se obtuvo el modelo cinético de la hidrólisis de la lactosa, en enzima soluble e inmovilizada (tipo

CLEAS), por medio de la β-galactosidasa producida por Aspergillus oryzae. Esto se logró analizando
los efectos del pH, temperatura y de diferentes concentraciones tanto de las enzimas como de la
lactosa, además se obtuvieron los parámetros cinéticos de las enzimas. La hidrólisis de la lactosa,
se realizó en soluciones tamponadas de 0,1 M. Para obtener los efectos de pH y temperatura se
evaluaron 4 niveles de pH (3,5 a 6,5) y 5 temperaturas distintas (30°C a 70 °C), en cambio para la
determinación de parámetros cinéticos se utilizaron 9 concentraciones de sustrato de 2g/L a 140
g/L. Se determinó que el pH óptimo, para ambas enzimas (soluble y cleas), fue de 4.5 y que
temperaturas superiores a 60° C causan una disminución significativa de la actividad, por lo que la
temperatura óptima es 40°C para CLEAS y para soluble. De acuerdo a los resultados cinéticos, se
evidencio que la enzima presenta una inhibición competitiva por galactosa.

Los parámetros cinéticos para la enzima soluble fueron: una actividad específica de 120.524 y
100.532 (UI/gramos enzima) para las masas de 0,00025 y 0,000125 g respectivamente, un Km de
69 mM, un Ki de 21,56 mM y un Vmax de 119,96 (UI/mg enzima). Por otro lado los resultados
obtenidos en la enzima inmovilizada por CLEAS fueron: 18.999,3 y 6.813,07 (UI/gramos enzima)
para las masas de enzima de 0,0015 y 0,00075 g respectivamente, un Km de 74,48 mM, un Ki de
7,53 mM y un Vmax de 12,98 (UI/mg enzima).

2. Resultados y Discusión

2.1. Determinación de actividad enzimática insoluble e inmovilizada

Se determinó la actividad enzimática específica de la enzima β-galactosidasa procedente de
Aspergillus oryzae tanto en forma soluble como en agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAS) a
ph 4,5 y temperatura de 40°C. La concentración enzimática de la muestra de enzima soluble
utilizadas fueron de 500 ppm (Figura 2.1.1) y 250 (Figura 2.1.2), mientras que la cantidad de
enzima inmovilizada provenía de una solución 15 mg/ml con una dilución de 1/5 (Figura 2.1.3) y
1/10 (Figura 2.1.4). Los datos obtenidos en laboratorio para realizar estos gráficos para enzima
soluble 500 ppm y 250 ppm aparecen detallados en el anexo A, Tablas A.1 y A.2 y para enzima
inmovilizada a dilución 1/5 y 1/10 en el Anexo A, Tabla A.3.

Figura 2.1 Rango lineal de la enzima soluble 0,00025 g

De este gráfico es posible obtener la pendiente del rango lineal, 29,67 umol/min la cual entrega la
actividad de la enzima. Considerando la cantidad enzimática utilizada, un total de 0,00025 g, se
tiene una actividad específica de 120524 UI/g de preparado enzimático.
Figura 2.2 Rango lineal de la enzima soluble 0,000125 g

Análogamente a lo anterior, es posible calcular desde los datos obtenidos en la Figura 2.1.2, una
actividad específica de 100352 UI/g de preparado enzimático considerando una cantidad de
preparado enzimático de 0,000125 g en la solución.

Figura 2.3 Rango lineal de la enzima inmovilizada (CLEAS) 0,0015 g

De la misma forma, con una masa de 0,0015 g de preparado enzimático se tiene una actividad
específica de 18999,3333 UI/g de preparado enzimático.

Figura 2.4 Rango lineal de la enzima inmovilizada (CLEAS) 0,00075 g

Considerando la masa de 0,00075 g enzima en las muestras, se tiene una actividad específica de
6813,06667 UI/g de preparado enzimático para la muestra de CLEAS con dilución de 1/6. En la
tabla 2.1 se resumen las actividades específicas obtenidas en esta práctica.

Tabla 2.1 Actividades catalíticas de la enzima soluble e inmovilizada.

Actividad específica
Masa de enzima (g) (UI/gramos enzima)

Enzima soluble 0,00025 120524

0,000125 100532

Enzima inmovilizada 0,0015 18999,333

0,00075 6813,0677

Se puede observar que en ambos casos la masa de la enzima inmovilizada es mayor que la soluble,
no obstante la actividad específica es menor. Entre las posibles causas se encuentran que al
realizar la precipitación de CLEAS se afectó directamente a la enzima, de tal forma que se pudo
presentar desnaturalización o cambio conformacional ya que los aminoácidos que están
especialmente en el sitio activo de la enzima se ven afectados por las fuerzas intermoleculares que
genera el solvente. Además al entrecruzar la enzima se generan restricciones difusionales
provocando que el sustrato no puede acceder de la misma forma al sitio activo (Molina, Peña, &
Torres, 2009).

2.2. Determinación de los efectos de pH y temperatura para enzima soluble e inmovilizada

Se determinó la actividad enzimática de la enzima soluble e inmovilizada a distintos pH y

temperaturas. Para una temperatura de 40°C se obtuvo el perfil de actividad versus pH de la
enzima soluble mostrado en la Figura 2.2.1 utilizándose 0,00025 gramos de enzima, a la misma
temperatura se tiene el perfil de actividad versus pH de la enzima inmovilizada en la Figura 2.2.2
en el que se utilizó 0,004167 gramos de proteína.

Figura 2.5 Perfil de actividad específica de enzima soluble versus pH

Figura 2.6 Perfil de actividad específica de enzima inmovilizada (CLEAS) versus pH.

Para la misma cantidad de enzima anterior, con un pH de 4,5 se determinó el perfil de actividad
para la enzima soluble (Figura 2.2.3) e inmovilizada (Figura 2.2.4). Estos datos se encuentran
resumidos en el Anexo A. Tablas A.4, A.5, A,6 y A.7.

Figura 2.7 Perfil de actividad específica de enzima soluble versus temperatura.

Figura 2.8 Perfil de actividad específica de enzima inmovilizada (CLEAS) versus temperatura.

Las enzimas son moléculas de proteínas lábiles, por lo que la temperatura tiene un fuerte efecto
en su configuración, que afecta tanto a la actividad como a la estabilidad. Los efectos de la
temperatura corren en direcciones opuestas: la actividad tiende a aumentar con la temperatura
como consecuencia del aumento de la velocidad de reacción, mientras que la estabilidad tiende a
disminuir, ya que la temperatura aumenta la tasa de inactivación de la enzima. El valor óptimo
observado en el proceso es de 60º C y se observa la actividad máxima, este valor no es un óptimo
real ya que la enzima puede sufrir una drástica pérdida de la estabilidad al aumentar un poco su
temperatura, es por ello que la temperatura de trabajo debe ser menor a 60º C teniendo valores
cercanos a 40º C.

El efecto del pH se deriva del hecho de que las enzimas son polímeros poli iónicos, esto significa
que cambios en el pH producen cambios en la etapa de ionización del sitio activo y en la
distribución de las cargas en la superficie de la proteína, de acuerdo con los valores pK de los
residuos de aminoácidos ionizables. En este caso el pH es bastante relevante porque el proceso
enzimático se lleva a cabo en un medio acuoso, entonces se determinó que el pH óptimo de
trabajo, donde se alcanza la máxima actividad, es de 4,5 (Illanes, Vera, & Wilson, 2014).

2.3. Determinación de los parámetros cinéticos para enzima soluble e inmovilizada

Con el fin de determinar los parámetros cinéticos tanto de la enzima soluble como de la enzima
inmovilizada, se determinó la velocidad de reacción a distintas concentraciones de lactosa en el
medio desde 2 g/L hasta 140 g/L (Datos en anexo A, Tabla A.8). Se utilizaron las mismas cantidades
de enzima soluble e inmovilizada que en la determinación de perfiles de pH y temperatura.
Obteniendo una curva Michaeliana tanto para la enzima soluble (Figura 2. 3.1) como para la
enzima inmovilizada (Figura 2.3.2).
Figura 2.9 Representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten para la enzima soluble.

Figura 2.10 Representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten para la enzima

inmovilizada

El método utilizado para la determinación de los parámetros cinéticos fue la linealización de

Lineweaver-Burk. Obteniendo para la enzima soluble un Km y Velocidad máxima (Vmax) de 69 mM
y 119,96 UI/mg enzima respectivamente. Respecto a la enzima inmovilizada se determinó un Km
de 74,48 mM y una Vmáx de 12,988 UI/mg enzima. La linealización de los datos obtenidos a partir
de la enzima soluble se tiene graficada en la Figura 2.3.3 y para la enzima inmovilizada en la Figura
2.3.4
Figura 2.11 Gráfico de inversos (Lineweaver-Burk) para enzima soluble

Figura 2.12 Gráfico de inversos (Lineweaver-Burk) para enzima inmovilizada

Según bibliografía, la enzima β-galactosidasa sufre de inhibición competitiva por galactosa (PARK,
SANTI, & PASTORE, 1979). Para determinar la constante de inhibición (Ki) se midió la velocidad de
reacción enzimática a tres concentraciones distintas de inhibidor: 1,8 g/L, 3,6 g/L y 5,4 g/L (Datos
en Anexo A, Tabla A.9, A.10 y A.11). Con el mismo método de linealización de L-B se determinaron
las velocidades máximas y km aparentes para cada concentración de inhibidor (Tabla 2.3.1).

Tabla 2.2 Parámetros cinéticos aparentes a distintas concentraciones de inhibidor (galactosa).

  Enzima soluble Enzima inmovilizada

Vap
Concentración inhibidor Vap (UI/mg (UI/mg
(g/L) enzima) Kap (mM) enzima ) Kap (mM)
5,4 g/L 109,46 166,03 14,66 364
3,6 g/L 97,033 142,439 12,475 305,99
1,8 g/L 102,2 100,47 16,45 162,524
Se observa que no existe mayor fluctuación en los valores de velocidad máxima respecto de la
enzima sin inhibición soluble e inmovilizada. Sin embargo, los valores de Kap aumentan junto con
la concentración de inhibidor, lo que comprueba el carácter competitivo de la inhibición.
Conociendo la cinética, se puede determinar el parámetro Ki cuyo valor junto con el resto de los
parámetros cinéticos determinados se resume en la tabla 2.3.2

Se utilizó la siguiente ecuación lineal para calcular el parámetro Ki, correspondiente al parámetro
de km aparente para la ecuación de inhibición competitiva. Donde Kap (Km aparente) e i
(concentración de inhibidor):

Km
Ecuación 2.1 Kap=km+ ∗i
Ki
De esta manera a través de una regresión lineal es posible obtener Ki.

Tabla 2.2 Valores de Km, Vmáx y Ki para enzima soluble e inmovilizada.

Vmax (UI/mg
  enzima) Km (mM) Ki (mM)
Enzima soluble 119,96 69 21,56
Enzima inmovilizada 12,98 74,48 7,53

Referencias
PARK, Y. K., SANTI, M. S. S., & PASTORE, G. M. (1979). PRODUCTION AND CHARACTERIZATION
OF ?-GALACTOSIDASE FROM ASPERGILLUS ORYZAE. Journal of Food Science, 44(1), 100–103.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1979.tb10016.x
Illanes, A., Vera, C., & Wilson, L. (2014). Problem Solving in Enzyme Biocatalysis. Chile: John Wiley
& Sons, Ltd.
Molina, D., Peña, A., & Torres, R. (2009). Hidrólisis de almidón de Yuca mediante la utilización de
preparaciones solubles e insolubilizadas de alfa-amilasa. Ciudad Universitaria, Colombia.