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Informe de Bioensayos
Estudios de Inmunoestimulación
en Camarones Litopenaeus vannamei
Biodinámica S.A. (Chile)
Y
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CibNor)
Unidad Hermosillo (México)
INDICE
1.- Objetivo………………………………………………...................2
4.- Resultados.................................................................9-12
Bioensayo Nº1
5.- Resultados.................................................................12-17
Bioensayo Nº2
1.- Objetivo
Determinar el efecto de dos productos inmunoestimulantes de distintas formulaciones
(suspensión y solución) inyectables sobre parámetros inmunológicos de camarón blanco L.
vannamei.
2.- Introducción:
En los últimos años, los estudios en el campo de la inmunología de crustáceos, han generado
expectativas de controlar las enfermedades a través de la activación del sistema inmune. Sin
embargo, en los inicios, la falta de metodologías para medir el estado de defensa de los
crustáceos era un problema serio (Sritunyalucksana y cols., 1999). Durante , la última década,
se han desarrollado e implementado técnicas bioquímicas, que permiten medir los parámetros
celulares y humorales de crustáceos sirviendo como indicador de la condición inmune de los
camarones. , con la intención de desarrollar criterios para la selección de organismos
resistentes a patógenos, inmunomodulación y mejoramiento sanitario de los organismos en
cultivo (Rodríguez y Le Moullac, 2000).
En camarón, como en todos los crustáceos, no un sistema de defensa especifico con memoria,
no existen las inmunoglobulinas como en los vertebrados, sin embargo, pero poseen
mecanismos de defensa que evitan el establecimiento y proliferación de patógenos. La
respuesta celular de camarón se manifiesta a través de fagocitosis, encapsulación, formación de
nódulos y citotoxicidad (Itami y cols., 1998; Chang y cols., 2000; Rengpipat y cols., 2000;
Vargas-Albores y Yepiz-Plascencia., 1998), mientras que la respuesta humoral es llevada a cabo
por aglutininas, enzimas, citoquininas y factores líticos (Vargas-Albores y cols., 1992; Vargas-
Albores y cols., 1993; Hernández-López y cols., 1996; Marques y Barracco, 2000). Algunos
componentes y/o actividades se encuentran integrados en sistemas o cascadas de reacciones,
como es el caso del sistema de la coagulación y el sistema de activación de la profenoloxidasa
(proFO).
Antecedentes previos, indican que los productos de Biodinámica S.A. tienen un fuerte actividad
inmunostimulante en peces, por lo que el presente trabajo tiene como objetivo evaluar dicho
efecto en los parámetros inmunológicos del camarón.
3
PRIMERA PARTE:
Ø Bioensayo Nº1: efecto de ADITIVO A (2x) EN SUSPENSIÓN
Tiempo de Bioensayo y muestreos: El ensayo duró 24 horas desde la aplicación del aditivo
inyectable, tomándose 10 camarones por tratamientos en intervalos de tiempo desde 0,3,6,12 y
24 horas.
SEGUNDA PARTE
Ø Bioensayo Nº2: efecto de ADITIVO B EN SOLUCION
Tiempo de Bioensayo y muestreos: El ensayo duró 48 horas desde la aplicación del aditivo
inyectable, tomándose 10 camarones por tratamientos en intervalos de tiempo desde 0,3,6,12,
24, 36 y 48 horas.
Inyección inmunoestimulante
Extracción hemolinfa
50 Inyección en región toráxica (10 camarones por
camarones periodo, se eliminan)
CONTROL
INYECCIÓN,
SOLUCIÓN. SALINA 1h
3h
SISTEMA INMUNE 6h
HUMORAL 12h
50 EVALUACIÓN 24h
camarones
ENSAYO SISTEMA INMUNE
INYECCIÓN CELULAR
C/PRODUCTO
Sistema Sistema
Inmune Inmune
Humoral celular
q Muestreo de Hemolinfa
La hemolinfa es extraída desde el camarón vivo por punción desde la región ventral del
camarón entre el último par de pereiópodos y el primer par de pleópodos, en la siguiente
relación: 1 volumen de hemolinfa en 2 volúmenes de anticoagulante SIC-EDTA, previamente
enfriado. Se utiliza una jeringa estéril 29G x13 mm, 1 ml. Se toma muestra de hemolinfa
1,3,6,12,y 24 hrs post inyección del producto.
q Proteínas Totales
El nivel de proteínas Totales se determina en muestras de plasmas, obtenidas por
centrifugación de la hemolinfa extraída. Se toma un volumen y se agrega a una microplaca. Se
hace reaccionar con el reactivo de Biuret formándose un complejo coloreado al cabo de tiempo
de reacción, el cual es medido en lector de Elisa a 546 nm. (Kit Proteinas totales, Mét. Biuret,
RANDOX).
A partir de una curva de calibrado con una solución stock de BSA estándar (1mg/mL) se
extrapola la concentración de proteínas totales en el plasma de la muestra.
Los resultados se expresan como actividad específica ( (Abs 490 nm/min)/(mg proteínas /mL)).
6
La actividad (FO) Total corresponde a la suma de las actividades FO libre y Pro FO , esta última
es activada en presencia de tripsina transformándose a FO. Por lo tanto, la actividad FO Total
se mide utilizando el mismo protocolo para FO libre pero la hemolinfa es previamente incubada
en microplacas conteniendo tripsina (1 mg/mL) en cada pocillo. Una vez transformada toda la
ProFO a FO se determina esta última en presencia de L-Dopa y medido a 490 nm según
protocolo anterior. Para calcular la Profenoloxidasa: ProFO= (FO Total-FO libre)
Una unidad de SOD es la que causa un 50% de inhibición de la velocidad de reducción de INT
bajo las mismas condiciones del ensayo.
Con la ayuda de una curva de calibrado confeccionada con estandares de SOD del kit se grafica
% de inhibición v/s unidades SOD /mL.
q Ensayo de Fagocitosis.
Este kit se basa en la internalización de la bacteria E. coli (K-12 strain) marcada con
fluoresceína. Una vez englobada por los hemocitos, la fluorescencia es medida en un lector de
Florescencia a 480 excitación y 520 nm de emisión.
Luego, se resta la florescencia del control negativo a las florescencia de las muestras
estimuladas con el efector. LECTURAS EXPERIMENTAL NETA , es el resultado de la fagocitosis
en respuesta a un efector.
proFenoloxidasa (proFO)
Control proFO
1.4
Tratamiento proFO
* 1.2
Absorbancia (nm)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyección (h)
Gráfica 4.1: Variación de niveles de proFO en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo
A suspensión (2X) comparados con control . Los asteriscos rojos indican diferencias
significativas.
10
Fenoloxidasa (FO)
0.045
0.04
0.035
Absorbancia (nm)
0.03
0.025
Control FO 0.02
0.015
Tratamiento FO
0.01
0.005
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyección
El recuento de Hemocitos disminuyó significativamente por efecto del aditivo, desde las 3 horas
(Gráfica 4.3), comparados con el grupo control.
* 25
20
15
10
5
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyeción (h)
Gráfica 4.3: Recuento total de hemocitos en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo 1
(2X) suspensión comparados con control. Asteriscos rojos indican diferencias significativas.
11
Reducción de NBT
0.2
0.18
* Control 0.16
Absorbancia (nm)
Tratamiento 0.14
*
0.12
* 0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyección (h)
Gráfica 4.4: Reducción de NBT de hemocitos de camarones inoculados con aditivo 1(2x)
Suspension (2X) comparados con tratamiento control . Asteriscos rojos indican diferencias
significativas.
Consideraciones
FOtotal
0.16 Control
1x
0.14 3x
3x50
Actividad (Abs/min)
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (horas)
0.16
FO
0.14
0.12
Actividad (Abs/min)
Control
0.1 1x
3x
0.08 3x50
0.06
0.04
0.02
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (horas)
En la gráfica Nº5.2 se puede observar que el nº de Hemocitos Totales disminuye en los grupos
de camarones tratados con dosis altas (3x), especialmente entre las 6 y 12 horas comparados
con el grupo control, restableciéndose cercano a las 24 horas. Este efecto se mantiene hasta las
48 hras. Comparado a los valores de los controles , todos los grupos tratados tuvieron menor
conteo de hemocitos durante el ensayo, quizá debido a una migración a los tejidos o al sitio de
inyección en los individuos inyectados con el producto.
20000000
* 3x
3x50
No de Hemocitos/ml
15000000
10000000
5000000
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempopost-inoculación (h)
Gráfica 5.2: Cuenta total de hemocitos en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo
B (1X, 30 µl; 3X 30 µl; 3X 50 µl.) o con solución salina estéril (controles). El tiempo cero
corresponde a los valores obtenidos en camarones sin inocular. Los asteriscos rojos indican
diferencias significativas.
15
1
Reducción de NBT
0.9
0.8
0.7
Absorbancia
0.6
0.5
0.4
Control
0.3 1x
3x
0.2
3x50
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo post-inyección (h)
Gráfica 5.3: Reducción de NBT en hemocitos de camarones tratados con aditivo B (1X, 30 µl;
3X 30 µl; 3X 50 µl.) o con solución salina estéril (control). El tiempo cero corresponde a los
valores obtenidos en camarones sin inocular.
SOD
0,350
0,300
Absorbancia
0,250
0,200
Control
0,150 1x
0,100 3x
3x50
0,050
0,000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo post-inoculación
Proteína Total
180
160
Concentracion de proteína total
140
120
(mg/ml)
100
80 CTR
60 1x
40 3x
20 3x 50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo post-inoculación (h)
5.g)Actividad Fagocítica:
100 Fagocitosis
ctr
90
1x
80
3x
Fagocitosis (%)
70 3x50
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo post-inoculación (h)
Gráfica Nº5.6: % fagocitosis en grupos tratados con aditivo B en distintas dosis comparadas
con grupo control (solución salina estéril).
soluble.
18
6. Conclusión Generales
ü Existe una variación importante de los parámetros bioquímicos entre cada ensayo, no
pudiéndose comparar resultados en ensayos realizados en forma separada. Por lo que
cada resultados es comparado sólo con su control (inyección solución salina estéril).
7.Bibliografía citada