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Hématologie

Cellules normales du sang


et de la moelle rouge des os
Livret 1 d'activités technologiques

Chantal Muller (Professeur - Lycée La Martinière Duchère - LYON )


Remerciements

Mes remerciements vont à tous ceux qui ont permis la réalisation de cet ouvrage, en particulier mes
collègues, professeurs au lycée La Martinière Duchère de Lyon avec qui j'ai travaillé avec beaucoup
de plaisir en hématologie :

Marie Claude Peyrot, qui m'a énormément aidé à débuter cet enseignement,

Caroline Platroz et Stéphanie Darmochod, qui


m'ont aidé efficacement à améliorer ces fiches techniques
et qui ont relu l'ensemble des livrets.

Un remerciement particulier à Christiane Robin,


technicienne de laboratoire au lycée La Martinière Duchère de Lyon,
qui a contribué avec compétence et gentillesse à la mise au point de techniques.

Un remerciement aussi aux biologistes du laboratoire d'hématologie du Centre de Biologie Nord de


Lyon, ainsi qu'à Madame Bizeul, technicienne cytologiste.

Des remerciements également pour Gilles et Sangeetha Muller qui m'ont aidé pour la mise en page.

La majorité des photographies des cellules sanguines et médullaires présentes dans les livrets 1 et 2
ont été reproduites avec l'aimable autorisation des responsables du site http://med2.univ-angers.fr .

2 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Avant-propos

Ce livret 1 d'activités technologiques s'adresse aux étudiants de première année de section de


technicien supérieur d'analyses de biologie médicale (B1ABM).

Il correspond au module 1 des activités technologiques d'hématologie du référentiel 2008 du brevet de


technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.

Ce livret 1 fait partie de quatre livrets relatifs aux enseignements technologiques d'hématologie de la
section technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.

Livret 1 – Cellules normales du sang et de la moelle rouge des os


Livret 2 – Hémopathies
Livret 3 – Hémostase
Livret 4 – Immuno-hématologie

AOÛT 2015

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Sommaire
Préambules

Risques biologiques et prévention au laboratoire d'hématologie et immunologie .................................. 5


Utilisation du microscope.............................................................................................................................. 12

Chapitre 1 – Hémogramme

Introduction................................................................................................................................................... 19
Hémogramme méthodes manuelles
Fiche technique 1 – Hématocrite........................................................................................... 23
Fiche technique 2 – Matériel pour numération manuelle des cellules.................................. 27
Fiche technique 3 – Numération des hématies..................................................................... 33
Fiche technique 4 – Dosage de l'hémoglobine..................................................................... 37
Fiche technique 5 – Indices érythrocytaires......................................................................... 39
Fiche technique 6 – Numération des leucocytes.................................................................. 43
Fiche technique 7 – Frottis sanguin et coloration................................................................. 47
Fiche technique 8 – Étude du frottis sanguin coloré............................................................ 55
Fiche technique 9 – Morphologie des leucocytes................................................................. 61
Fiche technique 10 – Interprétation de la formule leucocytaire........................................... 65
Fiche technique 11 – Numération des plaquettes................................................................. 67
Fiche technique 12 – Anomalies érythrocytaires.................................................................. 71
Fiche technique 13 – Interprétation d'hémogrammes........................................................... 83
Examens complémentaires à l'hémogramme
Fiche technique 1 – Vitesse de sédimentation...................................................................... 85
Fiche technique 2 – Numération des réticulocytes............................................................... 91
Hémogramme automatisé
Fiche technique 1 – Principes et résultats............................................................................. 97
Fiche technique 2 – Pièges d'interprétation.......................................................................... 110
Fiche technique 3 – Analyses de résultats d'automates cellulaires....................................... 113

Chapitre 2 – Myélogramme

Introduction – Généralités....................................................................................................................... 121


Fiche technique 1 – Étude cytologique d'un frottis médullaire............................................. 125
Fiche technique 2 – Lignée érythoblastique - les précurseurs.............................................. 127
Fiche technique 3 – Lignée granuleuse neutrophile - les précurseurs.................................. 131
Fiche technique 4 – Lignée granuleuse éosinophiles et basophiles - les précurseurs........... 135
Fiche technique 5 – Lignée mégacaryocytaire – les précurseurs.......................................... 139
Fiche technique 6 – Myélogramme et compte rendu............................................................ 143
Annexe : Schéma de l'hématopoïèse............................................................................................... 146

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

- Préambules -

R isques biologiques et prévention au laboratoire


d'hématologie et d'immunologie

RISQUES BIOLOGIQUES

Le risque zéro n'existe pas, par conséquent tout le personnel de laboratoire doit savoir:
 repérer un risque
 l'évaluer
 le prévenir
 intervenir et réparer en cas d'accident.

1 - Identification du risque infectieux

1.1 - Agents infectieux transmissibles à l'homme par le sang ou les dérivés


sanguins provenant de personnes contaminées.

 Les agents infectieux majeurs sont des virus:


virus des hépatites, principalement B (VHB) et C (VHC)
virus de l'immunodéficience humaine (VIH)
VIH VHB VHC
Prévention vaccinale non oui non
Prévalence de l'infection en France
(2005)= nombre de personnes 110 000 300 000 700 à 800 000
contaminées
Concentration virale (virions /mL) de
101 à103 106 à1010 ?
sang chez une personne contaminée
Taux de transmission
- par voie transcutanée 0,3 % 6 à 40 % 2 à 4%
- par projection cutanéomuqueuse 0,04 %
Sources : INRS / GERES

B1ABM CM © 5
Risques biologiques et prévention

 D'autres agents biologiques peuvent aussi être dangereux :


-bactéries,
-parasites sanguins,
-champignons,
-Agents à Transmission Non Conventionnelle (ATNC) ou prions. Ce sont des protéines
infectieuses très résistantes aux procédés d'inactivation habituels (chaleur sèche, formol…). En
l'état actuel de nos connaissances, ils ne semblent pas se transmettre par le sang mais peuvent se transmettre par contact de
tissus contaminés (cf. sécurité au laboratoire de cytologie et d'histologie).

Retenir que ces virus sont détruits par : . l'eau de Javel à 12 ° Cl diluée au 1/10
. l'alcool à 70° Temps de contact
. le glutaraldéhyde à 2 % 5 à 10 min
. le formol
. la chaleur (30 min à 56 °C pour VIH)

. les rayons U.V. , les rayons gamma


Mais ils ne sont pas détruits par: . la congélation

Virus de l’hépatite B qui resiste à de nombreux traitements, d’où la


Exception :
nécessité d’être vacciné

1.2 - Modes de transmission de ces agents infectieux

Il existe 4 modes de transmission des agents infectieux à l'homme:


 par voie transcutanée et cutanéomuqueuse
La plupart des agents infectieux ne traversent pas une peau saine, mais toute coupure ou
micro-coupure est une porte d'entrée pour ces agents.
Exemple de risque infectieux : piqûre par du matériel souillé (aiguille, pipette Pasteur
en verre, bris de verre…)
N.B. C'est le risque le plus grave de contamination.
 par inhalation d'aérosols
C'est le mode de transmission le plus fréquent. Le risque est insidieux, car les aérosols
ne sont pas visibles.
Exemple de risques infectieux : inhalation d'aérosols lors de l'ouverture de tube de sang
ou de plasma contaminé.
 par voie orale
Étant donné l'interdiction absolue de pipeter à la bouche, la contamination est souvent
due au fait de porter à la bouche des objets souillés (stylo …) ou des mains souillées.
 par projection vers la peau , les yeux ...
Exemples de risques infectieux : projection de sang contaminé lors de la casse d'un
tube, ou frottement de l'œil avec la main souillée.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

1.3 - Procédures à risques

Qui est concerné ? Quels risques majeurs ?


L'acheminement du prélèvement

Patient

Infirmières Piqûre avec une aiguille souillée


Médecins Prélèvement
Techniciens

Agents Transport
Coupure, contact

Secrétaires Réception au laboratoire

Coupure, piqûre, contamination


Techniciens Analyse
orale, par projection

Ramassage
Agents d'entretien Élimination des déchets Piqûres, coupures, contamination
orofécale..
Services extérieurs

Le risque existe à chaque étape

2 - Démarche de prévention
Cette démarche doit être collective pour une protection de tous.

2.1 - Vaccinations obligatoires pour les professionnels de la santé


Loi 91-73 du 18 janvier 1991
Toute personne qui dans un établissement ou organisme public ou privé de prévention ou de soins,
exerce une activité professionnelle l'exposant à des risques de contamination, doit être immunisée
contre:
- BGC
- l'hépatite B (rappel en fonction du taux d'Anticorps)
- la diphtérie, le tétanos, la poliomyélite (vaccin à 2-4 mois, 11 mois, 6 ans, 11-13 ans puis
rappel à 25 ans, 45 ans, 65 ans puis tous les 10 ans)
- la fièvre typhoïde (rappel tous les 3 ans pour les personnels de laboratoire).
De même pour tout étudiant d'un établissement préparant à l'exercice des professions de santé.
Décret du 5 septembre 1996:
Obligation vaccinale avec le BCG des élèves, personnels de laboratoire d'analyses médicales.
Il n'existe pas de vaccin contre le VIH et le VHC

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Risques biologiques et prévention

2.2 - Origine des produits sanguins utilisés au lycée

Une convention cadre sur le sang a été élaborée entre le ministère de l'éducation nationale et l'agence
française du sang (14-4-1994).
Les échantillons de sang sont fournis par le centre de transfusions.
– Ils proviennent de donneurs prélevés dans des conditions conformes aux bonnes pratiques de
prélèvement.
– Ils ont été soumis aux tests de dépistages suivants :
• recherche des anticorps anti-VIH
• recherche des anticorps anti-VHC
• recherche des antigènes HBs et des anticorps anti-HBc correspondant au VHB
• recherche des anticorps anti-HTLV I et II (virus des leucémies humaines à lymphocytes T)
• recherche des anticorps anti-syphilitiques
• dosage des transaminases (enzymes indiquant une lésion des cellules hépatiques)
– Les recherches d'anticorps et d'antigènes doivent être négatives, et l'activité des transaminases dans
le sang doit être normale.

2.3 - Respect des bonnes pratiques du laboratoire


 Tenue de travail
– Les vêtements de ville et les sacs sont déposés dans un vestiaire extérieur au laboratoire.
– Le port d'une blouse propre, en coton (mélange polyester-coton 65%-25% - non inflammable) est
impératif. La blouse doit recouvrir les vêtements personnels. Elle est à retirer à chaque sortie du
laboratoire.
• Transport dans le cartable : repliée endroit contre endroit dans un sac plastique
• Lavage à 60°C, avec des produits lessiviels adaptés (types produits du CHU) puis repassage.

– Les cheveux longs doivent être attachés et les ongles doivent être courts.
– Le port de bagues et de bracelets est à éviter.

 Comportement : avoir une attitude réfléchie


– Le poste de travail doit être organisé de façon rationnelle, un soin extrême doit être apporté aux
manipulations afin de réduire au maximum les risques d'éclaboussures et de contamination par des
aérosols.
– Il faut veiller à ne pas déranger la personne qui manipule.
– Rien ne doit être porté à la bouche
• Ne pas manger, ne pas boire, ne pas fumer, ne pas se maquiller dans le laboratoire
• Éviter les gestes machinaux:
Ne pas se ronger les ongles
Ne pas sucer ses doigts ou un crayon
Ne pas se frotter les yeux, porter la main au visage, passer la main dans les cheveux…

– Le matériel utilisé doit être adapté et conforme : de préférence du matériel plastique à usage unique
– Le port de gants (aux deux mains) en latex à usage unique est obligatoire mais limité aux gestes à
risque. Ils doivent être utilisés avec discernement. cf. fiche n°2
– Il faut se laver les mains après la manipulation ou en cas d'incident. cf. fiche n°1

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

– La prise de note pendant la manipulation


Utiliser un cahier de laboratoire recouvert d'un protège-cahier en plastique et un stylo bille qui
resteront au laboratoire
Protéger le protocole de la manipulation par une pochette plastique transparente
Rédiger le compte rendu de la manipulation à partir du cahier de laboratoire, après décontamination de
la paillasse.

– Décontamination, élimination des déchets


- En cas de renversement de sang au cours de la manipulation, verser immédiatement de
l'eau de Javel à 1,2° chlorométrique (ou surfanios), poser une feuille de papier filtre; laisser
agir 10 min.
-
- Après utilisation
Trier et traiter le matériel selon le tableau suivant :

Matériel à usage unique Matériel réutilisable


*
Potentiellement Potentiellement
Non contaminé Non contaminé
contaminé= DASRI* contaminé

DASRI
DASRI piquant- En bac avec
mou coupant désinfectant

Poubelle
Sac imperforable Décontamination
plastique inviolable par immersion dans
un désinfectant (eau
de Javel à 1.2°Cl ou
Destruction
par immersion dans
obligatoire par un
l’alcool 70 % pendant
organisme spécialisé
10 min minimum
et sur site autorisé

Déchets Nettoyage

*DASRI : Déchets d'Activités de Soins à Risques Infectieux

ATTENTION : Les déchets coupants et tranchants doivent être éliminer à part dans
des récipients non perforables et inviolable.

- Après la manipulation :
. Désinfecter le plan de travail avec de l'eau de Javel à 3° chlorométrique ou surfanios.
. Se laver soigneusement les mains
. Laver les sols tous les jours : balayage humide à l'eau de Javel à 3° chlorométrique.

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Risques biologiques et prévention

3 - Règles à appliquer en cas d'Accident d'Exposition au Sang


Définition : Un accident d'exposition au sang (AES) est une exposition accidentelle avec du sang
(ou un liquide biologique) lors :
− d'une effraction cutanée due à une piqûre avec une aiguille ou une coupure avec un objet tranchant
− d'un contact avec du sang ou du liquide contaminé sur une plaie, une peau non intacte ou une
muqueuse, permettant la pénétration de l'agent infectieux.

Les consignes à appliquer d'urgence en cas d'accident doivent être affichées.

 Immédiatement : réaliser les soins locaux :


Si piqûre ou blessure ou contact sur peau lésée : Si projection (muqueuses, yeux)
- Nettoyer : eau + savon antiseptique (betadineR
scrub) - Rincer abondamment à l'eau courante
- Rincer ou à l'eau physiologique pendant au
- Désinfecter par contact ou immersion pendant au moins 5 min
moins 5 min avec
. une solution pure de Dakin Si projection oculaire, contacter ensuite
. ou de l'alcool à 70° un ophtalmologiste
. ou de la Bétadine dermique (jaune)

 Dans la première heure :

Contacter le service d'infectiologie ou le médecin référent AES


pour évaluer le risque de contamination (au lycée, ce contact se fait par l'intermédiaire de l'infirmerie)

Cette évaluation du risque dépend de nombreux facteurs :


Exemples
 piqûre ou coupure profonde : risque maximum
 aiguille creuse : risque maximum
 sang : risque maximum, plasma ou sérum: risque moindre
 absence ou présence de moyens de protection : gants ou lunettes
 état clinique et sérologique du patient source

Recherche du statut sérologique du patient potentiellement contaminant :


- retrouver son bilan sérologique dans son dossier
- ou réaliser en urgence le bilan sérologique du patient source (avec son accord, sur
prescription médical): Ac anti-HVC, Ac anti-HIV, Ag Hbs

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

 Dans les 24 heures :


Faire établir un certificat médical initial mentionnant le risque biologique par le médecin du travail
ou médecin du service ou du service d'accueil des urgences,
Consulter son médecin du travail pour organiser le suivi sérologique et clinique et analyser les
circonstances de l'AES.

 Dans les 24 h pour un établissement privé ou dans les 48 h pour un établissement public:
Déclarer l'accident du travail à l'employeur
afin de bénéficier de l'accès aux soins et aux droits de protection sociale.

Suivi sérologique :
– Recherche des Ac anti-VIH avant le 8ème jour qui a suivi l'accident. Si la sérologie VIH se
révèle négative, un suivi sérologique sera réalisé, au 3ème mois et avant la fin du 6ème mois
après l'accident.

– Recherche des anticorps anti-VHC et la recherche de l'Ag HBS seront réalisées dès
l'accident. Le suivi biologique sera engagé comme indiqué précédemment ; de plus une
surveillance des ALAT et une recherche du génome du VHC (par PCR) seront effectuées en
fonction du risque de contamination.

Références
Décret n°94-352 du 4 mai 1994 - Circulaire n°98/228 du 9 avril 1998- Circulaire n°98/249 du 20 avril 1998
Circulaire DGS/DH/DRT N° 99/680 du 8 décembre 1999

Liens
Guide de gestion des risques biologiques :
Le document comprend un plan d'action, une description des dangers, une démarche
préventive, un outil pour se donner des moyens d'éliminer ou de contrôler les risques ainsi
que des exemples d'utilisation de la fiche de prévention à partir de la grille d'évaluation
Ce guide (format pdf) est à télécharger sur le lien suivant :
http://www.csst.qc.ca/portail/fr/publications/DC_200_16086.htm

Guide des risques biologiques au laboratoire


Ce document comprend trois parties :
− L'analyse du risque biologique
− La prévention du risque biologique
− La prévention spécifique à certaines activités
http://www.ubordeaux2.fr/servlet/com.univ.utils.LectureFichierJoint?
CODE=1206438264697&LANGUE=0

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Utilisation du microscope optique

Utilisation du microscope optique


De la bonne utilisation du microscope
dépend la qualité des résultats d’analyses médicales.
But :
–Connaître les principales parties du microscope optique (ou photonique)
–Être capable de choisir le bon objectif et les bons oculaires.
–Être capable de régler le microscope.
–Être capable d’entretenir le microscope.

1 - Description

oculaires tube statif


oculaire

vis fixant le tube


révolver oculaire
porte-objectif

objectif

platine

vis de centrage
du condensateur régulateur
de luminosité
condensateur
interrupteur
marche/arrêt
manette du
diaphragme du
condensateur
porte-
condensateur vis micrométrique
vis macrométrique

diaphragme de
champ molette de déplacement
de la platine

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Les principaux éléments constitutifs sont :


– une partie mécanique avec son statif, sa platine porte objet, son tube porte oculaire et son revolver
porte-objectifs;
– une partie optique avec une optique d'éclairage (source lumineuse, condensateur et diaphragmes
de champ et d'ouverture) surmontée d'une optique de formation de l'image (objectifs, tube et
oculaires). Les rayons lumineux issus de la source (lampe) traversent le condensateur, l'objet,
l'objectif, le tube, les oculaires pour arriver aux yeux de l'observateur.

2 - Rôles des éléments de la partie optique

2.1 - Objectif

Les objectifs sont constitués de lentilles convergentes dont le nombre est d'autant plus important que
l'objectif est puissant.
L'oeil observe l'image finale (c)
Ils donnent dans le tube une image Oeil
virtuelle, grossie et inversée de
intermédiaire (b) réelle, agrandie et inversée l'objet
de l'objet (a).
Oculaire

T1
G=
Grandissement (G) de l'objectif T2 (b) Image intermédiaire réelle,
agrandie et inversée de taille T2
Le grandissement est gravé sur l'objectif.

En général le microscope dispose de 3 objectifs


de grandissement différent : Objectif
– deux objectifs à sec 10x, 40x (ou 50x),
– un objectif à immersion 100x. Une goutte
(a) Objet posé sur la platine
d'huile à immersion est intercalée entre la de taille T1
préparation et l'objectif pour augmenter la
luminosité et la netteté de l'image. (Cette
huile a le même indice de réfraction que le verre).
(c) Image finale virtuelle,
grossie et toujours inversée
La distance entre l’objectif et la préparation Axe optique
varie suivant le grandissement. Plus l’objectif Principe du microscope :
L’image intermédiaire formée par l’objectif est grossie par l’oculaire
a un fort grossissement, plus la distance de
l'objectif à la préparation est faible.
2.2 - 0culaires
Ils jouent le rôle de loupes grossissant l'image intermédiaire donnée par l'objectif; ils donnent une
image (c) virtuelle grossie mais toujours inversée.
dm
Le grossissement (G') de l'oculaire : G '= dm : distance minimale de vision distincte
f
f : distance focale
Le grossissement est gravé sur l'oculaire.

B1ABM CM © 13
Utilisation du microscope optique

2.3 - Condensateur
Le condensateur permet de concentrer la lumière sur l’objet. Le champ éclairé par le condensateur doit
être uniforme.

2.3.1 - Position du condensateur:


La position normale du condensateur est presque complètement en haut avec la lentille frontale du
condensateur très près de la lame. Le réglage de Köhler permet d'optimiser cette position.
Certains condensateurs possèdent une lentille frontale escamotable. Cette particularité est utile pour
l’examen à faible grossissement. Basculer la lentille frontale, permet un éclairage plus uniforme aux
2,5x et 10x.

2.3.2 - Diaphragme du condensateur


Le rôle de ce diaphragme est de sélectionner les rayons lumineux parfaitement verticaux à l'objet.
 La fermeture du diaphragme augmente la profondeur de champ et le contraste mais diminue
la résolution et la luminosité. Le diaphragme du condensateur ne sert pas pour ajuster la luminosité,
on se sert du régulateur de luminosité (5) de la lampe pour cet ajustement.

2.4 - Diaphragme de champ


Ce diaphragme (11) permet de régler le diamètre du faisceau lumineux qui arrive sur la préparation.
Ainsi seul le champ objet est éclairé.
On limite alors, l'entrée de faisceaux lumineux parasites provenant de la diffraction de la lumière.

14 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3 - Principales caractéristiques optiques

3.1 - Grossissement du microscope

Grossissement de l'image = grandissement de l'objectif x grossissement de l'oculaire

Exemple:
Numération des hématies/leucocytes/plaquettes :
• objectif 40x
Grossissement = 40 x10 = 400
• oculaire 10x

Observation de frottis sanguins colorés


– observation générale du frottis
• objectif 10x
Grossissement = 10 x10 = 100
• oculaire 10x

– étude des cellules


• objectif 100x
Grossissement = 100 x10 =1000
• oculaire 10x
3.2 - Pouvoir séparateur du microscope

Le pouvoir séparateur correspond à la plus petite distance au-delà de laquelle il n'est plus possible de
percevoir l'écartement de deux points.
Le pouvoir séparateur du microscope photonique est de 200 nm soit 0,2 µm.

1 mm

100 µm Pouvoir séparateur


de l'oeil humain

Cellules végétales
10 µm
Hématies humaines

1 µm Bactéries

Pouvoir séparateur du
100 nm microscope photonique
Virus

10 nm
Protéines
Acides aminés Pouvoir séparateur
1 nm
Atomes
du microscope
0,1 nm ou 1 Å électronique

Échelle logarithmique des grandeurs microscopiques

B1ABM CM © 15
Utilisation du microscope optique

4 - Mise au point et réglage de l'éclairage selon les règles de


Köhler
– Poser et centrer la préparation sur la platine

– Allumer la source lumineuse (6) et choisir un niveau de


luminosité moyen (5)

– Placer l'objectif 10x (faible grossissement) dans l'axe du


trajet lumineux.
Toujours choisir en 1ère intention l'objectif x10 pour avoir
une vue d'ensemble de la préparation.

– Mettre au point l'image en respectant les consignes


suivantes pour éviter d'endommager le microscope ou la
préparation:
• Rapprocher sous contrôle de la vue la préparation de
l'objectif 10x à une distance légèrement inférieure à la
distance frontale (soit quelques millimètres pour
l'objectif 10x) en remontant la platine à l'aide de la vis
macrométrique

Attention : Le technicien regarde sur le coté du


microscope, ses yeux ne sont pas sur les oculaires.

• Placer l'œil à l'oculaire fixe et descendre doucement la


platine à l'aide de la vis macrométrique jusqu'à ce que
l'image apparaisse; améliorer la netteté à l'aide de la vis
micrométrique.

Si la mise au point n'est pas trouvée, il est préférable de


remonter la platine en regardant sur le coté du
microscope et reprendre à l'étape précédente.

– Régler l'écartement des oculaires pour obtenir une parfaite


superposition des deux images vues par chaque œil. On
observe alors une seule image circulaire.

– Affiner la mise au point en ne regardant qu'avec l'œil ne


disposant pas d'oculaire réglable (l'autre œil étant fermé).
Sans toucher à la mise au point (vis macro et micrométrique)
jouer sur l'oculaire à réglage dioptrique pour obtenir une
image nette avec l'œil précédemment fermé (l'œil ayant
initialement servi à affiner la mise au point étant alors
fermé).

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

– Régler la position du condensateur


Fermer progressivement le diaphragme de champ. Un cercle
lumineux flou apparaît dans le champ d'observation.
Abaisser légèrement le condensateur jusqu'à obtenir un hexagone
lumineux aux bords nets à l'aide de la molette du condensateur
Si cet hexagone est centré (B), réouvrir le diaphragme de champ
pour éclairer juste les limites du champ d'observation (C).

Si cet hexagone est excentré (A), il faut centrer cette image (B) en
agissant sur les 2 vis (15) de centrage du condensateur. Puis réouvrir le diaphragme comme
précédemment (C)

A B C
Réglage du fond clair selon Köhler

– Régler le diaphragme du condensateur


Pour les objets très contrastés (= colorés) le meilleur pouvoir séparateur est obtenu lorsque le
diaphragme du condensateur est " plutôt " ouvert.
Pour les objets peu contrastés, il faut fermer le diaphragme du condensateur jusqu'à environ 2/3 de la
pleine ouverture d'éclairage. Cela permet d'augmenter le contraste et la profondeur de champ
(malheureusement le pouvoir séparateur est alors moins bon).
– Régler la clarté
Elle se règle sur le régulateur (5) de l'intensité lumineuse.

Jouer sur le diaphragme du condensateur pour ajuster la clarté est une erreur car on touche alors
systématiquement la qualité de l'image (contraste et pouvoir séparateur).
– Pour observer à l'objectif 40x, tourner délicatement le révolver porte objectif et placer l'objectif
choisi sur le trajet du rayon lumineux. La mise au point est presque correcte, l'affiner en agissant
sur la vis micrométrique ; régler aussi le diaphragme du condensateur.

– Pour passer en immersion, l'objectif x40 est dégagé de l'axe


optique en tournant doucement le revolver porte objectif.
Lorsque les objectifs x40 et x100 sont de part et d'autre de la
préparation, on dépose une fine goutte d'huile à immersion puis
l'objectif x100 est positionné au-dessus de la préparation.

B1ABM CM © 17
Utilisation du microscope optique

Causes d'insuccès dans la mise au point:


– absence d'images
• l'objectif a été déplacé trop vite et trop loin. Recommencer l'opération
• la préparation a été placée du mauvais côté (face sans frottis) : cette faute grossière n'est pas
rare
– absence de lumière
• l'éclairage est détérioré (usure de la lampe) ou mal branché
• l'objectif n'est pas dans le cran du révolver
• un diaphragme est fermé (diaphragme du condensateur ou de champ)
• l'écartement des oculaires est mal réglé
– absence de netteté de l'image
• Optique sale:
Les lentilles des oculaires sont grasses ou poussiéreuses : la présence de tâches gênantes
suivent les mouvements de rotation de l'oculaire dans le tube. Nettoyer les oculaires.
De l'huile à immersion est restée sur l'objectif et a séché. Nettoyer alors délicatement les
objectifs avec un papier Joseph légèrement imbibé d'alcool.
• Lame ou lamelle sale. Nettoyer avec un papier filtre imbibé d'alcool.
• Vis micrométrique bloquée en fin de course. Ne pas forcer et agir sur la vis macrométrique.

5 - Après utilisation du microscope

– diminuer l'intensité lumineuse au maximum (potentiomètre) puis éteindre le microscope


(interrupteur)
– éliminer toute trace d'huile à immersion sur la tête de l'objectif à immersion et sur la platine
– essuyer les lentilles externes des oculaires, des objectifs à sec et la tête du condensateur
– placer le microscope sous sa housse protectrice.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

- Chapitre 1 -
L'hémogramme
Généralités

L'hémogramme est un examen de base en hématologie : il correspond à l'étude qualitative et


quantitative des cellules sanguines.

Le prélèvement du sang et sa conservation

 Prélèvement et conservation doivent respecter la taille et la forme des cellules.


Deux types de prélèvements possibles:
- prélèvement de sang veineux recueilli sur un anticoagulant adapté permettant la meilleure
conservation des cellules, l'EDTA ou Ethylen Diamine TetraAcetic acid, dont le nom déposé est le
Complexon.
Le prélèvement peut être conservé quelques heures à température ambiante pour la technique de
numération. Par contre, les étalements sur lame doivent être faits le plus rapidement possible après le
prélèvement.

- prélèvement de sang capillaire , en général au bout du doigt, ou au talon des très jeunes enfants.

✎ L'hémogramme peut être réalisé manuellement , mais actuellement vu la fréquence de sa


prescription, il est automatisé dans tous les laboratoires.

1 - Étude de la population érythrocytaire


Cette étude comprend:
➢ la numération des hématies
➢ la détermination de la concentration d'hémoglobine dans le sang
➢ la détermination de l'hématocrite.
Ces trois résultats permettent le calcul des trois indices érythrocytaires :
➔ volume globulaire moyen (VGM)
➔ teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH)
➔ concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)

B1ABM CM © 19
Chapitre 1 – Hémogramme – Généralités

Données complémentaires éventuelles :


➢ l'observation de la morphologie (taille, forme, couleur, inclusions) des hématies sur frottis sanguin
coloré à la coloration de May Grünwald Giemsa
➢ l'étude de la capacité érythrocytaire à former des rouleaux.
➢ l'étude de précurseurs érythrocytaires (érythroblastes) anormalement présents.
Actuellement les automates cellulaires indiquent aussi :
➢ l'indice de distribution des volumes des érythrocytes (IDE ou IDR)
➢ l'histogramme des volumes érythrocytaires.
Ces deux résultats détectent une éventuelle anisocytose.

2 - Étude de la population leucocytaire


Cette étude comprend :
➢ la numération des leucocytes
➢ la formule leucocytaire exprimée en pourcentage (%) et en Giga par litre de sang (G/L)
➢ l'aspect des leucocytes.

3 - Étude des thrombocytes


Cette étude comprend :
➢ la numération des thrombocytes
➢ l'étude des thrombocytes sur frottis de sang coloré
➔ taille et aspect
➔ répartition (isolées ou en amas)
– sur sang veineux recueilli sur EDTA, elles doivent être isolées
– sur sang capillaire, les plaquettes sont en amas
➔ estimation du nombre en accord avec la numération.

Actuellement les automates indiquent aussi le thrombocrite (volume occupé par les plaquettes dans un
litre de sang), l'indice de distribution des volumes plaquettaires, l'histogramme des volumes
plaquettaires qui montre la présence éventuelle de plaquettes géantes.

Pour exploiter correctement les résultats d'un hémogramme,


il faut donc :
– connaître les intervalles de référence
– savoir reconnaître et définir les anomalies.

Deux examens complémentaires à l'hémogramme sont parfois


demandés:
–Vitesse de sédimentation
–Numération des réticulocytes

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

4 - Intervalles de référence

4.1 - Numérations globulaires et constantes érythrocytaires


Enfants Adulte
Nouveau- né 3 mois 1 an 3-6 ans 10-12 ans Homme Femme
Hématies (T/L) 5,0 ± 1,0 4,0 ± 0,8 4,4 ± 0,8 4,8 ± 0,7 4,7 ± 0,7 5,2 ± 0,7 4,7 ± 0,7
4,0 à 6,0 3,2 à 4,8 3,6 à 5,2 4,1 à 5,5 4 à 5,4 4,5 à 5,9 4,0 à 5,4
Leucocytes (G/L) 18 ± 8 12 ± 6 11,5 ± 4,5 10 ± 5 9 ± 4,5 4 ,0à 10,0

Plaquettes (G/L) 150 à 500 150 à 500

Hémoglobine 165 ± 30 110 ± 20 120 ± 15 130 ± 10 130 ± 15 160 ± 20 140 ± 20


(g/L) 140 à 180 120 à 160
Hématocrite 0,54 ± 0,10 0,38 ± 0,06 0,44 ± 0,04 0,40 ± 0,04 0,41 ± 0,04 0,47± 0,07 0,42 ± 0,05
(L/L) 0,4 à 0,54 0.37 à 0.47
VGM (fL) 106 95 78 ± 8 81 ± 8 84 ± 7 80 à 100

TCMH (pg) 34 29 ± 5 27 ± 4 27 ± 3 27 ± 3 27 à 33

CCMH (g/L) 310 à 370 310 à 370

4.2 - Formule leucocytaire


Enfants Adulte
Nouveau-né 1 an 4 ans 10 ans
(G/L) (G/L) (G/L) (G/L) (G/L)
Polynucléaires
neutrophiles 6,0 à 26,0 1,5 à 8,5 1,5 à 8,5 1,8 à 8,0 1,8 à 7,0
Polynucléaires
éosinophiles 0,02 à 0,085 0, 05 à 0,07 0,02 à 0,65 0 à 0,6 0,04 à 0,5
Polynucléaires
basophiles 0 à 0,64 0 à 0,2 0 à 0,2 0 à 0,2 0 à 0,20

Lymphocytes 2 à 11 4 à 10,5 2,0 à 8,0 1,5 à 6,5 1,0 à 4,0

Monocytes 0,4 à 3,1 0,05 à 0,11 0 à 0,8 0 à 0,8 0,1 à 1,0

Nombre de
leucocytes 15 à 30 6 à 15 5 à 15 4,5 à 13,5 4,0 à 10,0

4.3 - Examens complémentaires à l'hémogramme


Réticulocytes 150 G/L 10 à 100 G/L (si >120 G/L :  régénération médullaire)
VS (mm/h) ≤ 15 chez l'homme et ≤ 20 chez la femme
D'après « Aide mémoire d'hématologie – C Sultan (Auteur), M Gouault-Heilmann (Auteur), M Imbert (Auteur) »

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Chapitre 1 – Hémogramme – Généralités

Fiches techniques

Hémogramme - Méthode manuelle

Fiche 1 : Hématocrite
Fiche 2 : Matériels nécessaires aux numérations cellulaires
Fiche 3 : Numération des hématies
Fiche 4 : Dosage de l’hémoglobine du sang
Fiche 5 : Indices érythrocytaires
Fiche 6 : Numération des leucocytes
Fiche 7 : Réalisation et coloration de frottis sanguins
Fiche 8 : Ėtude de frottis sanguins
Fiche 9 : Morphologie des leucocytes colorés par MGG
Fiche 10 : Exercices - Interprétation de formules leucocytaires
Fiche 11 : Numération des plaquettes
Fiche 12 : Anomalies érythrocytaires
Fiche 13 : Exercices - Interprétation d’hémogrammes

Examens complémentaires à l'hémogramme


Fiche 1 : Vitesse de sédimentation
Fiche 2 : Numération des réticulocytes

Hémogramme – Méthode automatisée


Fiche 1 : Principes et résultats de méthodes automatisées
Fiche 2 : Exercices : Interprétation d'hémogrammes automatisés
Fiche 3 : Quelques pièges d'interprétation

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme méthode manuelle – Fiche 1

Hématocrite (Ht)
1 - Définition

L’hématocrite (Ht) est le volume occupé par les hématies dans un litre de sang total.
Il s’exprime en L/L ou L.L-1 , parfois en %.

La détermination s’effectue:
- par microméthode directe avec des tubes capillaires : microhématocrite.
- par méthode indirecte grâce aux compteurs automatiques de cellules.

2 - Détermination de l’hématocrite

2.1 - Principe plasma

b
Le sang total est centrifugé dans des tubes calibrés, dans des
conditions standardisées de vitesse et de durée.

Après centrifugation, on mesure:


- la hauteur de la colonne d’hématies : a a a hématies
Ht =
- la hauteur totale de la colonne de sang : b b

L’utilisation d’un abaque facilite cette lecture bouchon de


pâte à sceller

fig. 1: Capillaire après


2.2 - Technique centrifugation du sang

2.2.1 - Matériel
✔ des microtubes (tubes capillaires) calibrés (longueur 75 mm; diamètre intérieur1mm) ouverts
aux deux extrémités.
• les microtubes héparinés (repère rouge) sont utilisés lors d’un prélèvement de sang
capillaire.
• les microtubes secs sont utilisés pour le sang veineux recueilli sur anticoagulant.

✔ une plaque de pâte à sceller.

✔ une centrifugeuse à microhématocrite dont la couronne horizontale peut tourner à 12 000


tours/min.

✔ un abaque.

✔ une paire de gants à usage unique en latex.

B1ABM CM © 23
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 1 – Hématocrite

2.2.2 - Prélèvement du sang


L’hématocrite peut être réalisé à partir de:
✔ sang veineux recueilli sur anticoagulant sec (EDTA) pour éviter sa dilution.
Avant utilisation, le sang veineux doit être soigneusement homogénéisé (20 min sur l’agitateur
rotatif).
✔ sang capillaire

2.2.3 - Manipulation
Préparer le matériel nécessaire à la manipulation puis mettre les gants

✔ Ouvrir avec précaution le tube de sang veineux soigneusement homogénéisé (entourer le


bouchon d’un papier filtre pour limiter les risques d’éclaboussures et d’aérosols, éliminer ce
bouchon dans de l’eau de Javel, le papier dans le récipient risques biologiques).

✔ Incliner le tube de sang et plonger (pas trop profondément) une extrémité du tube capillaire,
maintenu presque à l’horizontale, dans le sang veineux. Le sang monte par capillarité.
Remplir le tube sur une hauteur de 5 à 6,5 cm (< 6,5 cm)

✔ Essuyer soigneusement l’extérieur du tube capillaire souillé


par le sang avec un papier filtre sec puis avec du papier
Joseph imprégné d’alcool.

✔ En maintenant toujours le tube capillaire horizontal, boucher


l’extrémité qui n’a pas été en contact avec le sang avec de la
pâte à sceller, plaque tenue verticalement.

fig. 2: Occlusion du capillaire


avec la pâte à sceller

✔ Placer le tube sur le rotor de la microcentrifugeuse,


extrémité obturée vers l’extérieur, contre le bord
du plateau.
Choisir une répartition symétrique pour les
différents tubes et repérer le numéro de la rainure
correspondante, l’inscrire sur le cahier de paillasse.
pâte à
sceller

fig. 3: Capillaire contenant le sang, posé


sur le plateau de la centrifugeuse à
hématocrite

✔ Mettre en place le couvercle du rotor. Refermer le couvercle de la centrifugeuse puis afficher le


temps de la centrifugation (10 min) ce qui entraîne simultanément le démarrage.

24 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2.2.4 - Lecture de l’hématocrite

• Manipuler toujours la centrifugeuse avec des gants;


• Prélever le capillaire avec les gants et désinfecter à nouveau le tube avec un papier
imbibé d'alcool.

Remarque : Le tube capillaire ne doit pas rester longtemps en position horizontale; en cas de lecture
différée, le placer dans un tube à hémolyse pour le conserver en position verticale.
Avant la lecture :
– observer le plasma; il doit être de couleur jaune ambré. Si le plasma est rosé, des hématies ont été
hémolysées et l'hématocrite sera inexact (erreur par défaut). Un tel plasma est appelé « plasma
hémolysé ».
– observer la hauteur de la couche de leucocytes; si cette hauteur est anormalement élevée, penser à
le noter.

Lecture :
Elle s'effectue à l'aide d'un abaque permettant de ramener la hauteur de sang total à 100%
✔ placer le tube capillaire sur l'abaque, bas de la colonne de sang au repère zéro.
✔ rouler doucement le tube pour amener le haut de la colonne de sang face au repère 100.
✔ repérer la ligne médiane coïncidant avec l'interface hématie/leucocytes-plasma.
✔ la graduation correspondant à cette ligne indique la valeur de l’hématocrite.
%exemple : la graduation 44 correspond à un hématocrite de 0,44 L/L
100

90

80

70 %
100
60
90
50 80
70
40 60
50
30 40
20 30
20
10 10
0
0

fig 3: Abaque de lecture de l'hématocrite (Ht). Ici, Ht=42% ou 0,42L/L


La précision de la manipulation est de l’ordre de 3 %
Cette lecture peut être vérifiée par mesure des 2 valeurs a et b au double décimètre et du calcul du
rapport a/b.

B1ABM CM © 25
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 1 – Hématocrite

Après lecture : jeter le tube capillaire dans la poubelle DASRI« déchets coupants contaminés ».
L’abaque et la centrifugeuse doivent être régulièrement désinfectées.

Causes d'erreur:
– sang mal homogénéisé
– capillaire resté trop longtemps en position horizontale après centrifugation
– toute manipulation provoquant une hémolyse

3 - Détermination indirecte au compteur cellulaire


cf. techniques automatisées
Le compteur mesure:
- le volume moyen des hématies
- le nombre d’hématies par litre de sang.
Il calcule à partir de ces mesures l’hématocrite, volume occupé par les hématies dans un litre de sang.

Le résultat obtenu est souvent légèrement inférieur au microhématocrite mesuré directement car le
volume de plasma retenu entre les hématies du culot globulaire n’entre pas en jeu dans la méthode
indirecte.

4 - Résultats et interprétation

Intervalles de référence (ou valeurs normales ou valeurs physiologiques)

- Elles varient avec l’âge et le sexe

Adulte

Homme 0,47 ± 0,07 L/L soit 0,40 à 0,54 L/L


Femme 0,42 ± 0,05 L/L soit 0,37 à 0,47 L/L

Nouveau- né 0,54 ± 0,10 L/L soit 0,44 à 0,64 L/L

Enfant 1 an 0,40 ± 0,04 L/L soit 0,36 à 0,44 L/L

- L’hématocrite peut être modifié au cours de certaines pathologies (modification du nombre ou du


volume des hématies), mais il ne permet pas à lui seul d’effectuer un diagnostic.

- Il est surtout utile au calcul de certains paramètres érythrocytaires :


− volume globulaire moyen (VGM)
− concentration globulaire moyenne en hémoglobine (TCMH).

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme méthode manuelle – Fiche 2

M atériel pour numération manuelle


des cellules sanguines

1 - Matériel de dilution
Le sang doit être dilué pour permettre un numération des cellules.
– Utilisation des pipettes automatiques classiques :
Le sang ou le plasma sont des liquides visqueux, il est donc indispensable de prémouiller le cône
avant utilisation. Pour cela, avec la pipette muni de son cône, aspirer et refouler 3 fois le liquide
visqueux.
– Utilisation des pipettes à déplacement positif et à piston :
Ces pipettes sont spécialement adaptées à la mesure de liquide visqueux et le liquide prélevé est
ainsi isolé du corps de la pipette éliminant tout risque de contamination par aérosols.
Description de la pipette:
A
T A – Bouton-poussoir
B – Corps
C-P – Capillaire -piston
H – Support de capillaire - Pince
S – Embout
T – Molette pour régler le volume
V V – Volumètre

B
P

C
H

Mise en place du capillaire-piston


– Appuyer sur le bouton-poussoir jusqu'à la deuxième butée. La pince s'ouvre et dépasse l'embout.
– Prendre le capillaire-piston et faire glisser l'extrémité supérieur du piston dans la pince de fixation.
– Relâcher doucement le bouton-poussoir.
– Pour contrôler le bon montage du capillaire-piston, appuyer et relâcher le bouton-poussoir tout en
vérifiant le déplacement du piston dans le capillaire.

B1ABM CM © 27
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 2 – Numération manuelle des cellules sanguines

Aspiration
– Appuyer sur le bouton- poussoir jusqu’à la première butée,
– Immerger le capillaire dans le liquide (ex: sang) (2 mm),
– Relâcher le bouton- poussoir lentement pour aspirer le liquide (position haute),
– Essuyer tout excès de liquide à l’extérieur du capillaire, à l'aide d'un papier filtre et veiller à ne pas
toucher l’orifice.
Distribution
– Positionner l'extrémité du capillaire à la surface du diluant,
– Appuyer lentement sur le bouton-poussoir jusqu'à la première butée,
– Immerger le capillaire dans le diluant (2mm), puis aspirer (relâcher le bouton-pressoir) et refouler,
– recommencer 3 fois l'aspiration-refoulement.
Éjection du capillaire-piston
Appuyer sur le bouton-poussoir jusqu’à la première butée , puis continuez à appuyer jusqu’à la
deuxième butée (le piston et le capillaire sont alors éjectés simultanément).

2 - Hématimètres
Ils permettent de compter les cellules dans un volume connu appelé chambre ou cellule de
comptage.
2.1 - Description
Un hématimètre est une épaisse lame de verre au
centre de laquelle se trouve une ou deux plate-
formes gravées d'un quadrillage différent selon les
hématimètres.
Deux rigoles encadrent cette plate-forme et la
séparent de deux plateaux légèrement plus élevés
sur lesquelles on fait adhérer une lamelle planée
épaisse.
Celle lamelle délimite avec la plate-forme la
profondeur (h) de la chambre de comptage.

Les hématimètres les plus utilisés en hématologie


sont:
fig 1: Hématimètre
✔ hématimètre de Malassez
✔ hématimètre de Thoma
✔ hématimètre de Neubauer
Voir les caractéristiques des 3 types d'hématimères : figures 2, 4 et 6.

2.2 - Préparation de l'hématimètre : pose de la lamelle


 S'effectue sans gants
Pour faire adhérer la lamelle aux plateaux :
– humecter les plateaux de l'hématimètre avec une goutte d'eau
– poser une lamelle planée sur les 2 plateaux
– placer les 2 pouces le long des plateaux et exercer un mouvement de va et vient en appuyant sur la
lamelle jusqu'à perception d'une résistance
– contrôler la bonne adhérence par l'observation de franges irisées à la surface de contact ou par
retournement de l'hématimètre.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2.3 - Remplissage de l'hématimètre

 S'effectue avec des gants. Tenir l'hématimètre avec un papier filtre, ne pas le
toucher avec les gants.

– Homogénéiser le sang dilué


– A l'aide une psipette en plastique à pointe effilée, aspirer un peu de sang dilué
– Appliquer l'extrémité de la pointe de la psipette au contact de la lamelle, presser légèrement la
poire : la chambre de l'hématimètre doit se remplir par capillarité en 1 seule fois, il ne doit pas y
avoir de bulles d'air. Un peu de liquide doit déborder dans les rigoles, mais sans les remplir.
– Laisser l'hématimètre sur un plan horizontal pour que les cellules sédimentent, le temps varie selon
le type de cellules à dénombrer.
– Après sédimentation, les cellules seront comptées au microscope.

 Après manipulation, l'hématimètre et sa lamelle sont immergés dans l'eau de Javel


au moins 5 min, puis rincer abondamment à l'eau puis à l'alcool; ils sont séchés avec
un papier.

fig 2: Remplissage de l'hématimètre

fig 3: Photographie d'un hématimètre de


Malassez avec deux lamelles planées

B1ABM CM © 29
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 2 – Numération manuelle des cellules sanguines

Caractéristiques de l'hématimètre de Malassez

h = 0,2 mm

0,25 mm

Volume total de la chambre de


0,20 mm

comptage :
Vtotal =

Nombre (A) total d'unités de comptage


:
2 mm
A =

2,5 mm

fig 4: Caractéristiques de l'hématimètre de Mallassez

Description du quadrillage:
– un grand rectangle (2,5 x 2 mm) subdivisé en 10 bandes horizontales (0,25 x 2,5 mm) ou verticales
(0,2 x 2 mm)
– chaque bande est subdivisée en 10 petits rectangle appelés « unités de comptage ».
Il y a 4 catégories d'unités de comptage :
• unités quadrillées en 20 petits carrés égaux
• unités subdivisées en bandes horizontales ou verticales
• unités « vide »
2,5 mm
La chambre de comptage correspond à un parallélépipède, dont la
base est la surface du grand rectangle et la hauteur (0,2 mm) est 2 mm
délimitée par la lamelle planée.

UTILISATIONS 0,2 mm
Numération des hématies (fd = ) fig 5: Dimensions de la
– nombre d'unités de comptage : chambre de comptage
– volume utilisé pour le dénombrement :
Numération des leucocytes (fd = )
– nombre d'unités de comptage :
– volume utilisé pour le dénombrement :
Numération des plaquettes (fd = )
– nombre d'unités de comptage :
– volume utilisé pour le dénombrement :

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Caractéristiques de l'hématimètre de Thoma

h = 0,1 mm

0,20 mm
- Volume total de la chambre de
comptage :
Vtotal =
0,20 mm

- 16 unités de comptage de 16
petits carrés

- Nombre total de petits carrés :


n=
1 mm

1 mm

fig 6: Caractéristiques de l'hématimètre de Thoma

Description du quadrillage:
– un grand carré de 1 mm de côté et subdivisé en 400 petits carrés.
– certains petits carrés sont regroupés par 16 formant une
« unité de comptage » 1 mm
1 mm
La chambre de comptage correspond à un parallélépipède,
dont la base est la surface du grand carré et la hauteur (0,1 0,1 mm
mm) est délimitée par la lamelle planée.

UTILISATIONS fig 7: dimensions de la chambre de


Numération des hématies (fd = ) comptage
– nombre d'unités de comptage :
– volume utilisé pour le dénombrement :

Numération des plaquettes (fd = )


– nombre d'unités de comptage :
– volume utilisé pour le dénombrement :

B1ABM CM © 31
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 2 – Numération manuelle des cellules sanguines

Caractéristiques de l'hématimètre de Neubauer

Cet hématimètre est aussi très utilisé.

- Volume total de la chambre de


comptage :
Vtotal =

- Volume du carré « L »


VL=

mm
Volume des petits carrés « E »
VE=

fig 8: Caractéristiques du quadrillage de l'hématimètre de


Neubauer

Description du quadrillage:
9 grands carrés :
– 4 grands carrés d'angle « L »
– 1 carré central, lui même divisé en 25 carrés « E » groupés. Chaque carré « E »est encore
divisé en 16 plus petits carrés.
La chambre de comptage correspond à un
3 mm
parallélépipède, dont la base est la surface du grand
carré et la hauteur (0,1 mm) est délimitée par la lamelle 3 mm
planée.
0,1 mm
UTILISATIONS :
Numération des hématies (fd = )
– 5 carrés « E » appartenant au carré central fig 9: dimensions de la chambre de
– volume utilisé pour le dénombrement : comptage

Numération des leucocytes (fd = )


– 4 grands carrés d'angle « L »
– volume utilisé pour le dénombrement :

Numération des plaquettes (fd = )


– carré central (25 petits carrés « E »)
– volume utilisé pour le dénombrement :

32 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 3

Numération des hématies


Dénombrement direct au microscope

1 - Principe

Le sang est dilué de façon précise dans un liquide isotonique (NaCl : 8,5 g/L ou eau physiologique)
pour éviter la lyse des hématies.
Les hématies sont comptées au microscope dans un volume connu de sang dilué, grâce à un
hématimètre.
Le résultat est exprimé en nombre d’hématies par litre de sang.

2 - Réactifs et matériel

2.1 - Sang à analyser


Le sang est prélevé chez un sujet à jeun et au repos.
On peut utiliser:
– du sang veineux, prélevé à la veine du pli du coude et recueilli sur EDTA. Cet anticoagulant
sec ne dilue pas le sang et respecte l’aspect des cellules.
– du sang capillaire prélevé au bout du doigt chez l’adulte ou au talon chez le nouveau-né.

2.2 - Matériel
ο Pipette automatique P1000 et pipette à déplacement positif et à piston de 20 µL

ο Hématimètre de Thoma ou de Malassez et lamelle planée

ο Microscope avec objectif ( x 40) à sec

3 - Manipulation

3.1 - Préparation de l’hématimètre


Faire adhérer la lamelle aux plateaux (voir document « matériel »)
3.2 - Dilution du sang au 1/200
Le sang doit être soigneusement homogénéisé (20 min sur l’agitateur rotatif ou nombreux
retournements lents du tube).
Réaliser 2 dilutions successives : 1/10 puis 1/20

Préparer 2 tubes Eppendorf A et B, à l'aide d'une pipette automatique P 1000, verser dans le:
• tube A (dilution au 1/10) : 180 µL d'eau physiologique
• tube B (dilution au 1/20) : 380 µL d'eau physiologique

B1ABM CM © 33
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 3 – Numération des hématies

Enfiler les gants,

Dilution au 1/10 dans le tube A


Prélever 20 µL de sang bien homogénéisé, puis essuyer l'extérieur du capillaire à l'aide d'un
papier filtre, sans toucher l'orifice,
Rejeter les 20 µL de sang à la surface de l'eau physiologique, puis aspirer et refouler 3 fois.
Agiter le tube Eppendorf pour homogénéiser.

Dilution au 1/20 dans le tube B. Refaire la même manipulation.


Volume de sang dilué au 1/20 à prélever : 20 µL
3.3 - Remplissage de l’hématimètre
- Lors de la numération des globules rouges, la mise en hématimètre peut être réalisée
immédiatement après la dilution.

- Laisser l’hématimètre 3 à 5 min sur un plan horizontal pour que les hématies sédimentent.
3.4 - Comptage au microscope
Manipuler le microscope sans gant.

* Utiliser l’objectif à sec x 10 puis x 40


* Régler l’éclairage sur une faible intensité: - lentille du condenseur basculée
- diaphragme plus ou moins fermé.

- Vérifier à l’objectif x 10 qu’il n’y a pas de bulle d’air et que la répartition des hématies est
homogène dans la chambre de comptage, sinon recommencer le remplissage.

- Utiliser l’objectif x 40 pour compter les hématies


ο pour l’hématimètre de Malassez: dénombrer les hématies dans 4 unités de comptage, c’est à
dire dans 4 rectangles quadrillés choisis aux quatre coins du quadrillage.
ο pour l’hématimètre de Thoma: dénombrer les hématies dans 5 unités de comptage, soit 5
grands carrés dont 4 seront situés aux angles et un au centre du quadrillage.

Pour compter toutes les hématies et les compter une fois seulement, il faut opérer
méthodiquement.
* Dans chaque unité de comptage, compter les hématies carré après carré selon le schéma
suivant :
dans le cas de l’hématimètre de Malassez: dans le cas de l’hématimètre de Thoma

* Les hématies à cheval sur les limites de chaque petit carré ne sont comptées que si elles sont
sur la ligne horizontale supérieure ou sur la ligne verticale droite.

34 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Exemple : Quel est le nombre d’hématies comptées dans ces 4 carrés successifs ?

Résultats du comptage:

Attention: Le nombre de globules rouges comptés dans chaque unité de comptage ne doit pas
trop varier.

3.5 - Calcul
Soit: (N) le nombre d’hématies par litre de sang
* (fd) la dilution de sang
* (v) le volume de sang dilué dans lequel Établir les équations aux grandeurs : N = f (fd,v,n)
le comptage a été effectué
(n) le nombre total d’hématies comptées Etablir les équations aux unités :

Calcul du facteur de dilution appliqué : fd =

Numération avec l’hématimètre de Malassez: Numération avec l’hématimètre de Thoma:


Déterminer les équations aux valeurs numériques Déterminer les équations aux valeurs
simplifiées numériques simplifiées
v= v=

N= N=

Le résultat est exprimé en Téra /L ou 1012/L Rappel : T ou Téra = 1012

Écart type de répétabilité Sr = 0,15 T/L


Incertitude composée Uc = 0,35 T/L
Incertitude élargie U = k.Uc (facteur d'élargissement k=2 pour un niveau de confiance de 95%)
Exprimer le résultat correctement arrondi et accompagné de l'incertitude élargie

3.6 - Causes d’erreur

− Mauvaise homogénéisation du prélèvement.


− Mauvaise dilution ou mauvaise homogénéisation du sang dilué.
− Mauvaise répartition dans l’hématimètre.
− Mauvaise numération.
− Comptage simultané des hématies et des leucocytes.
− Les leucocytes sont différenciables des hématies par leur réfringence.
En fait l’erreur commise étant en général inférieure à 0,2 %, elle est négligeable, sauf en cas
d’hyperleucocytose importante.

B1ABM CM © 35
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 3 – Numération des hématies

4 - Interprétation des résultats

4.1 - Intervalles de référence (ou valeurs physiologiques)

Nombre d’hématies (T/L) Nombre d’hématies (T/L)


Homme 5,2 ± 0,7 4,5 à 5,9
Femme 4,7 ± 0,7 4,0 à 5,4
Nouveau-né 5,0 ± 1,0 4,0 à 6,0
Enfant 1 an 4,4 ± 0,8 3,6 à 5,2

Ces valeurs peuvent varier avec l’altitude, la grossesse.

4.2 - Résultats pathologiques

* Si le nombre des globules rouges est nettement inférieur aux valeurs normales, il y a
érythropénie.
* Un nombre de globules rouges supérieur aux valeurs normales, est appelé érythrocytémie.
Une érythrocytémie accompagnée d’une augmentation de l’hématocrite et du taux
d’hémoglobine, permet de diagnostiquer une polyglobulie.(cf. fiche 4 - page 38)

36 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 4

Dosage de l'hémoglobine
Méthode photocolorimétrique de DRABKIN

Méthode internationale de référence : méthode à la cyanméthémoglobine

1 - Principe

Le dosage de l’hémoglobine d’un échantillon de sang se déroule en trois étapes:

1ère étape : Lyse des hématies pour faire passer l’hémoglobine en solution.

2ème étape : Transformation de l’hémoglobine en cyanméthémoglobine, dérivé coloré et stable


qui présente un pic d’absorption à 540 nm.

Hémoglobine (Fe 2+ )
Ferricyanure de potassium (Fe 3+ ) [Fe (CN )6 ] 3-

Ferrocyanure de potassium (Fe 2+ ) [Fe (CN )6 ] 4-

Méthémoglobine (Fe 3+ )

Cyanure de potassium (KCN)

Cyanméthémoglobine

Le réactif de DRABKIN permet de lyser les hématies et de transformer l’hémoglobine en


cyanméthémoglobine.

3ème étape : Dosage de la cyanméthémoglobine par colorimétrie à 540 nm.


On compare l’absorbance de la solution de cyanméthémoglobine obtenue à partir du sang à
l’absorbance d’une solution étalon de cyanméthémoglobine.
On en déduit la concentration en hémoglobine du sang.
On l’exprime en g/L (unités usuelles) ou en mmol/L (système international).

Remarque:
Par cette méthode, on dose l’hémoglobine présente sous toutes ses formes, oxyhémoglobine, carbhémoglobine, methémoglobine. Seule
la sulfhémoglobine n’est pas dosée mais elle n’existe qu’à l’état de traces dans le sang.

B1ABM CM © 37
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 4 – Dosage de l'hémoglobine

2 - Intervalles de référence

Concentration en Unités usuelles Unités internationales


hémoglobine: g/L mmol/L
Homme ( 160 ± 20 )
140 à 180 8,7 à 11,2
Femme ( 140 ± 20 )
120 à 160 7,5 à 9,9
Nouveau - né ( 165 ± 30 )
135 à 195 8,4 à 12,1
Enfant 1 an ( 120 ± 15 )
105 à 135 6,5 à 8,4

3 - Interprétation du résultat

– Outre les variations du taux d’hémoglobine et du nombre de GR en fonction du sexe, on observe


des variations physiologiques en fonction de l’âge.

– Une diminution de la concentration de l'hémoglobine sanguin indique une anémie.


Chez l'adulte, on diagnostiquera une anémie si :

* Homme Hb < 130 g/L


* Femme Hb < 115 g/L

– Une augmentation de la concentration en hémoglobine associée à l’augmentation du nombre


d’hématies et de l’hématocrite définit une polyglobulie.
Chez l'adulte, on diagnostiquera une polyglobulie si :

Hb > 180 g/L


Nombre de GR/L > 6 T /L
Ht > 0,55 L/L

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 5

Indices érythrocytaires
Ils sont au nombre de 3 ;
– le volume globulaire moyen (VGM),
– la teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH),
– la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)
Ces indices sont indispensables pour orienter le diagnostic d'une anémie.
En cas de valeurs non physiologiques, l'étude morphologique des hématies sur frottis coloré doit être
réalisée.

1 - Volume globulaire moyen – VGM

Signification: Le VGM représente le volume (en fL) moyen d’une hématie.

Données utiles pour le Signification


calcul

Hématocrite: Ht L/L Ht (L) d’hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

Nombre N/L d’hématies N hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

 Ht (L) d’hématies contiennent N hématies.

 Ht (L)
N
est le volume moyen d’1 hématie.

 Ht Rappel: 1 L ⇔ 1015 fL
VGM = x 10 15 fL
N

microcytose normocytose macrocytose


Interprétation:
VGM
80 100 (fL)
Aspect des hématies sur frottis coloré au MGG

B1ABM CM © 39
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 5 – Indices érythrocytaires

2 - Teneur corpusculaire (ou globulaire) moyenne en


hémoglobine – TCMH (ou TGMH)
Le TCMH peut s’exprimer de deux manières:
• masse (en pg) moyenne en) hémoglobine d’une hématie (unité usuelle)
• nombre (en fmol) moyen de sous unités de l’hémoglobine dans une hématie (unité
internationale).

➊ Calcul du TCMH en pg (unité usuelle)


Données utiles Signification

Concentration en
hémoglobine: [Hb] g/L [Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans 1 L de sang total.

Nombre N/L d’hématies N hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

 [Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans N hématies.

 [Hb] g est la masse moyenne en hémoglobine d’1 hématie.


N
Si [Hb] g/L  [ Hb]
TCMH =
12
x 10 pg Rappel: 1 g ⇔ 1012 pg
N

➋ Calcul du TCMH en fmol de sous unités d’hémoglobine


Si [Hb] mmol/L  [ Hb]
TCMH = x 1012 fmol
N
un taux >33 pg est lié à la
Interprétation: la quantité d’Hb est
macrocytose.
insuffisante:
normochromie (Le G.R. normal étant saturé en Hb)
hypochromie
normochromie TCMH
27 33 pg
1,7 2 fmol
Aspect des hématies
sur frottis coloré
au MGG

40 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3 - Concentration corpusculaire (ou globulaire) moyenne en


hémoglobine – CCMH (ou CGMH)
Le CCMH peut s’exprimer de deux manières:
• masse (en g) moyenne en hémoglobine dans 1 L d’hématies (unité usuelle): g/L
• nombre (en mmol) moyen de sous unités de l’hémoglobine dans 1 L d’hématies (unité
internationale): mmol/L.

➊ Calcul de la CCMH en g/L (unité usuelle)

Données utiles Signification

Concentration en
hémoglobine: [Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans 1 L de sang total.
[Hb] g/L

Hématocrite: Ht L/L Ht (L) d’hématies sont contenues dans 1 L de sang total.

 [Hb] g d’hémoglobine sont contenus dans Ht (L) d’hématies.

 [Hb] g est la masse moyenne en Hb dans 1 L d’hématies.

 [Hb ]
Si [Hb] g/L (de sang) CCMH = g/ L d ' hématies
Ht

➋ Calcul de la CCMH en mmol/L de sous unités d’hémoglobine

Si [Hb] mmol/L (de sang)  [Hb ]


CCMH = mmol/ L d ' hématies
Ht
Les hématies ne Les hématies
sont pas saturées sont saturées en Impossible
Interprétation: en hémoglobine hémoglobine (problème technique)

CCMH
310 370 g/L
20 23,5 mmol/L

La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans
les anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d'anémie.

Toute anomalie révélée par les calculs doit être confirmée par l’observation des hématies
sur frottis colorée.

B1ABM CM © 41
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 5 – Indices érythrocytaires

4 - Exercices d'application

Compléter les résultats concernant le "système rouge" de l'hémogramme et interpréter ces


résultats.

   
Homme de 56 ans Femme de 45 ans Enfant de 12 mois Nouveau-né

Hb : 140 g/L Hb : 133 g/L Ht : 0,40 L/L Érythrocytes : 5,6.1012/L


VGM: 89 fL Érythrocytes : 4,1.1012/L Hb : 126 g/L Ht : 0,57 L/L
TGMH: 30 pg VGM: 89 µm3 Érythrocytes : 4,9.1012/L Hb : 193 g/L

   
Femme de 52 ans Homme de 62 ans Femme de 37 ans Homme de 56 ans

Érythrocytes: 3,4.1012/L Hb : 97 g/L Hb : 87 g/L Hb : 18,7 g/dL


Ht : 0,26 L/L Érythrocytes : 2,85.1012/L Érythrocytes : 3,1.1012/L Érythrocytes : 6,2.1012/L
Hb : 89 g/L Ht : 30 % Ht : 0,27 L/L Ht : 56 %

Présenter les résultats sous forme d'un tableau de résultats :


N° Valeurs trouvées Intervalle de référence Conclusion
pour ……………………….
Hémoglobine
en g/L

Hématies
en T/L

Hématocrite
en L/L

VGM
en fL

TGMH
en pg

CCMH
en g/L

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 6

Numération des leucocytes


Dénombrement direct au microscope

1 - Principe

Le sang recueilli sur anticoagulant sec, est dilué de façon précise dans un liquide qui lyse les
hématies (trop nombreuses, elles gêneraient la numération).
Les leucocytes sont comptés au microscope dans un volume connu de sang dilué, sur un
hématimètre.
Le résultat est exprimé en nombre de leucocytes par litre de sang.

Remarque: Lors de cette numération, on dénombre toutes les cellules nucléées du sang.
Aussi, si le frottis sanguin révèle la présence d’érythroblastes (précurseurs des érythrocytes
possédant un noyau), il faut corriger le résultat pour obtenir le nombre réel de leucocytes.
(voir fiche 10: exercices - formules leucocytaires).

2 - Réactifs et matériel

2.1 - Sang à analyser


Le sang est prélevé chez un sujet à jeun et au repos.
On peut utiliser:
• du sang veineux recueilli sur EDTA. Cet anticoagulant sec ne dilue pas le sang et respecte
l’aspect des cellules.
• du sang capillaire prélevé au bout du doigt chez l’adulte ou au talon chez le nouveau-né.

2.2 - Matériel
• Pipette automatique P 200 et pipette à déplacement positif et à piston de 20 µL

• Hématimètre et lamelle planée.


L’hématimètre de Malassez est utilisé habituellement.
L’hématimètre de Thoma ayant un volume trop faible (0,1 mm3) ne doit pas être utilisé.

• Microscope avec objectif à sec (x 10 et x 40)

2.3 - Diluant : liquide de Hayem


• Acide acétique ..................1 mL
• Bleu de méthylène (1%) ...5 mL
• Eau distillée QSP .......,..200 mL
2.4 - Manipulation
2.4.1 - Préparation de l’hématimètre (cf. fiche 2)
- Faire adhérer la lamelle aux plateaux.

B1ABM CM © 43
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 6 – Numération des leucocytes

2.4.2 - Dilution du sang au 1/20


Le sang doit être soigneusement homogénéisé (20 min sur l’agitateur rotatif ou nombreux
retournements lents du tube)
Préparer le matériel nécessaire à la manipulation avant d’enfiler les gants.
- Réaliser la dilution: prélever 20 µL de sang et les diluer dans 380 µL de diluant.
- Homogénéiser le mélange sang-diluant.
- Laisser en attente 10 min pour permettre la lyse des hématies.
- Homogénéiser à nouveau avant utilisation.
2.4.3 - Remplissage de l’hématimètre
- Laisser l’hématimètre 5 min sur un plan horizontal pour que les cellules sédimentent.
2.4.4 - Comptage au microscope
Manipuler le microscope sans gant.

* Utiliser l’objectif à sec x 10 pour la * Régler l’éclairage sur une faible intensité:
mise au point, puis x 40 pour le - lentille du condenseur basculée
comptage - diaphragme plus ou moins fermé.

- Vérifier à l’objectif x 10 l’absence de bulles d’air et l’homogénéité de la répartition des


leucocytes, dans la chambre de comptage, sinon recommencer le remplissage.

- Utiliser l’objectif x 40 pour compter les cellules


Dénombrer les cellules dans la totalité de la chambre de l’hématimètre de Malassez (10
bandes), en procédant par bande (1 bande = 10 rectangles).
2.4.5 - Calcul
Soit: Établir les equations aux grandeurs:
* (fd) le facteur de dilution de sang N = f ( fd,v, n )
* (v) le volume de comptage en L
* (n) le nombre total de leucocytes N = n *fd/v
comptés
(N) le nombre de leucocytes par litre Établir les equations aux unités :
de sang

Calcul du volume utilisé : Hématimètre de Malassez v =

Numération après dilution , déterminer les équations aux grandeurs simplifiées


fd = 20 N = f(n) N = n*20*106

Écart type de répétabilité Sr = 0,15 G/L Rappel : G ou Giga = 109


Incertitude composée Uc = 0,30 G/L
Incertitude élargie U = k.Uc (facteur d'élargissement k=2 pour un niveau de confiance de 95%)
Exprimer le résultat correctement arrondi et accompagné de l'incertitude élargie

✎ Attention : si le nombre de leucocytes est très important, il est alors nécessaire de diluer le

44 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

sang au 1/100.
Dans le cas ou fd =100, établir les equations aux grandeurs simplifiée N = f(n).
N= n *100 *106
2.4.6 - Causes d’erreurs
- Mauvaise homogénéisation du sang
- Mauvaise dilution ou mauvaise homogénéisation du sang dilué.
- Mauvaise répartition dans l’hématimètre
- Mauvais dénombrement.

2.5 - Interprétation des résultats


2.5.1 - Intervalles de référence (sujets à jeun et au repos)

Nombre de leucocytes (G/L)


Adulte 4,0 à 10,0
Nouveau-né 15,0 à 30,0
Enfant 1 an 6,0 à 15,0

Il existe des variations liées à :


l’état physiologique du sujet : état de veille ou de sommeil, activité physique, digestion, grossesse
l’âge du sujet (voir tableau ci-dessus) ; il n’y a pas de différence liée au sexe.
C’est entre 5 et 12 ans que les valeurs deviennent celles de l’adulte.

Remarque :
La numération des leucocytes ne concerne que les leucocytes circulants. 50 % des leucocytes totaux
du sang sont marginés, c’est à dire accolés à la paroi des vaisseaux sanguins.
En cas de stress (décharge d’adrénaline), ils passent dans la circulation, ce qui augmente le nombre
de leucocytes circulants.

2.5.2 - Résultats pathologiques

* Il y a leucopénie si le nombre de leucocytes est inférieur aux intervalles de référence.


* Il y a hyperleucocytose si le nombre de leucocytes est supérieur aux intervalles de
référence.

Il est important dans la discussion de préciser l’intensité de l’anomalie (faible, modérée, forte…).

B1ABM CM © 45
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 6 – Numération des leucocytes

fig 10: Numération des cellules au microscope


optique

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 7

C onfection d'un frottis sanguin


oloration de May-Grünwald Giemsa

1 - Généralités

1.1 - Principe
Le frottis sanguin consiste en la réalisation d'un étalement monocellulaire des cellules sanguines sur
une lame de verre à partir d’une goutte de sang.
Les cellules ainsi déposées sur la lame sont fixées, colorées (méthode de May-Grünwald Giemsa-
MGG) puis observées au microscope optique.

1.2 - Intérêts
L’observation d’un tel frottis au microscope photonique permet :
 L’identification et le comptage des différents types de leucocytes. Le calcul du pourcentage des
différents leucocytes et le calcul de leur nombre par litre de sang permettent l’établissement de
la formule leucocytaire.
 L’étude de la morphologie des érythrocytes (taille, forme, couleur et éventuelles inclusions).
 L’étude de la morphologie des plaquettes, de leur mode de groupement et l’estimation de leur
nombre approximatif
 L’observation éventuelle de cellules anormales, de parasites sanguins…

2 - Confection des frottis

2.1 - Prélèvement
 sang veineux recueilli sur anticoagulant (EDTA) depuis moins de 3 heures
 sang capillaire
2.2 - Matériel
 lames de verre :
Elles doivent être très propres, parfaitement dégraissées (à l’éthanol) et sèches. L’utilisation de
lames munies d’un bord dépoli permettant le marquage du frottis non plus sur le sang (problème de
sécurité) mais sur la lame est préférable.

 lamelles d’étirement.
Ce sont des lamelles (en plastique ou en verre) dont la largeur est plus petite que celle de la lame.

B1ABM CM © 47
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 7 – Frottis sanguin et coloration May Grünwald Giemsa

2.3 - Technique
Préparer le matériel (champ opératoire, lames dégraissées et référencées, pipette plastique à pointe
effilée à usage unique, lamelles d’étirement, récipient de Javel).
Si la lame possède un bord dépoli, inscrire les références du sang au crayon de papier sur la partie
dépoli.
Mettre les gants

 Poser la lame de verre horizontalement sur le


champ opératoire.

 Déposer une goutte de sang (de 2 mm environ de


diamètre) à l’aide d’une pipette à pointe effilée à
1 cm du bord de la lame de verre (A).

 Placer le bord biseautée (et à coin coupés) de la


lamelle à étirement, en contact avec la lame, en
avant de la goutte de sang.
Faire glisser la lamelle inclinée à 45° vers la
goutte de sang, jusqu’à la toucher. (A) et (B).

 Laisser le sang s’étendre par capillarité le long de


l’arête de la lamelle (B).

 Pousser la lamelle d’un mouvement continu et


régulier vers l’autre extrémité de la lame, sans
trop appuyer. Tout le sang doit être étalé avant
qu’on atteigne l’extrémité de la lame (C)

 Sécher immédiatement le frottis par agitation à l’air

Si la lame ne possède par de bord dépoli, marquer le frottis avec un crayon de papier (réservé à cet
effet) en tête du frottis.

En fin de manipulation :
- Désinfecter à la Javel :
• l’extrémité du crayon (éventuellement utilisé) à la Javel
• les frottis non-conformes
• la lamelle (ou la jeter dans la poubelle contenant le sac autoclavable)

- Dans la poubelle contenant le sac autoclavable, jeter la pipette plastique, le champ opératoire….

- Désinfecter la paillasse à la Javel.

48 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2.4 - Résultats

Critères d’un bon frottis :

 de bonne taille (1/2 ou 3/4 de la lame)


 de bonne densité (ni trop mince, ni trop épais)
 goutte étalée en entier
 distant des bords de la lame donc accessible en tout point à l’observation microscopique
 se termine si possible par une extrémité arrondie.

Causes d’erreurs :

 trous .lames mal dégraissées  stries .irrégularité du mouvement


 traînées  lames sales, poussiéreuses stries et franges importantes appui sur la
spatule

 frottis trop fin et/ou trop long avec franges   frottis trop épais et/ou trop court  lamelle
lamelle avec angle trop aigu ou mouvement avec angle trop obtus ou mouvement d’étirement
d’étirement trop lent. trop rapide.

 goutte non étalée en entier (frottis non


représentatif du sang)  bien attendre  barre épaisse en bout de frottis  arrêt du
l’étalement du sang contre l’arête de la lamelle. mouvement avant épuisement du sang.

Frottis Conséquences
trop épais cellules rétractées, les unes sur les autres, non identifiables
trop mince cellules trop dispersées, pas assez nombreuses
irrégulier, troué... mauvaise distribution des cellules
mal séché hématies altérées, lymphocytes à noyau rétractés

B1ABM CM © 49
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 7 – Frottis sanguin et coloration May Grünwald Giemsa

3 - Fixation et coloration de May-Grünwald Giemsa

3.1 - Principe
3.1.1 - Fixation du frottis ♥
Elle s’effectue au contact du méthanol dans lequel est dissout le colorant de May-Grünwald (MGG)

3.1.2 - Principe de la coloration ♥♥♥


Il repose sur l’action complémentaire de deux colorants neutres (colorant de May-Grünwald et
colorant de Giemsa) et sur l’affinité des éléments cellulaires pour les colorants acides (éléments
acidophiles) et pour les colorants basiques (éléments basophiles).

➢ Composition qualitative des colorants :


• Colorant de May-Grünwald : éosinate de bleu de méthylène en solution dans du méthanol
- Colorant acide : éosine
- Colorant basique : bleu de méthylène
• Colorant de Giemsa : éosinate d’azur de méthylène en solution dans du méthanol
- Colorant acide : éosine
- Colorant basique : azurs de méthylène

 Acquisition du pouvoir colorant :


Ces deux colorants en solution dans le méthanol n’ont aucun pouvoir colorant, c’est l’addition d’eau
qui leur donne leur pouvoir colorant en dissociant (ionisant) les sels en colorant acide (éosine) et
colorant basique (bleu de méthylène ou azurs de méthylène).

 Importance du pH :
– Des variations trop importantes de pH modifient l'aspect des cellules et en particulier celle des
hématies.
– Les colorants changent plus ou moins de couleur en fonction du pH
Par conséquent, le pH choisi est neutre (pH = 7).

 Les colorants ne colorent que les éléments cellulaires « complémentaires » avec lesquels ils
ont une affinité.
Si en se fixant sur l’élément cellulaire complémentaire,
 le colorant (éosine et bleu de méthylène) ne change pas de conformation, la coloration est dite
orthochromatique.
 le colorant (azurs de éthylène) change de conformation et donc de couleur, la coloration est
dite métachromatique.

L’éosine, colorant acide rouge rosé, se fixe sur :


• les éléments cellulaires basiques (ou acidophiles ou éosinophiles) et les colorent en rose-
orangé.
Exemples : les cytoplasmes des hématies chargées en hémoglobine, les granulations des
polynucléaires éosinophiles, et les histones basiques du noyau.
• les éléments cellulaires neutrophiles.

50 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Le bleu de méthylène, colorant basique bleu, se fixe sur :


• les éléments cellulaires acides (ou basophiles) et les colorent en bleu.
Exemples : les noyaux contenant de l’ADN, les cytoplasmes chargés en ARN (traduction).
• les éléments cellulaires neutrophiles.

L’action combinée des 2 colorants, éosine et bleu de méthylène, sur les éléments neutrophiles donne
une coloration violacée (lilas). Exemples : les granulations des polynucléaires neutrophiles.
Ces colorations sont orthochromatiques.

Les azurs de méthylène, colorant basique bleu, colorent les éléments cellulaires acides (ou
basophiles) en rouge.
Exemples :
. les noyaux (déjà colorés en bleu par le bleu de méthylène) sont surcolorés en violet,
. les granulations azurophiles des monocytes, des lymphocytes granuleux et des plaquettes sont
colorées en rouge.
Il s’agit d’une coloration métachromatique.
3.2 - Réactifs
3.2.1 - Colorant de May-Grünwald
- Colorant de May Grünwald (poudre) : 5 g
- Méthanol (CH3OH) ……………… : qsp 1000 mL
3.2.2 - Colorant de Giemsa
- Colorant de Giemsa (poudre) : 0,75 g
- Méthanol (CH3OH) .....……..: 65 mL
- Glycérol …………………….. : 65 mL
Dans certains pays, surtout anglophones, la poudre de Giemsa est remplacée par le colorant de
Wright.
Indication sur la prévention de risques chimiques

3.2.3 - Eau neutre (pH = 7)


- Hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4)….. : 5 g
- Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) : 1 g
- Eau distillée …………………………………… : qsp 1 L
Vérifier le pH au pH-mètre et ajuster si nécessaire.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 7 – Frottis sanguin et coloration May Grünwald Giemsa

3.3 - Technique
3.3.1 - Fixation
Avec les gants

 Placer la lame du frottis sur un support horizontal au-dessus d’un bac de


coloration
 Verser sur la lame 15 à 18 gouttes de colorant de May-Grünwald pur de façon
à recouvrir complètement le frottis
 Laisser agir 3 min.

3.3.2 - Coloration au May-Grünwald


Sans les gants :
 Ajouter autant de gouttes d’eau neutre que de gouttes de colorant, le mélange est quasi
spontané. (Éventuellement, terminer le mélange en inclinant légèrement la lame.)
 Laisser agir 2 min
 Rincer le frottis par un jet d’eau neutre projeté délicatement sur la lame au-dessus du frottis.

3.3.3 - Coloration au Giemsa


 Préparation extemporanée de la solution de Giemsa pendant les 2
min précédentes :
 dans une boite de Laveran, verser 30 mL d’eau neutre (mesurée
à l’aide d’une éprouvette graduée) et 40 gouttes de colorant de
telle manière que celui-ci reste à la surface de l’eau neutre et dans
un angle de la boite.
 Dès que la lame est prête, poser le couvercle sur la boite et
mélanger en agitant doucement (le pouvoir colorant est maximun fig. 4: Boite de Laveran
au moment du mélange).
 Déposer la lame (frottis en dessous pour éviter les dépôts de précipité de colorant) dans la boite
et laisser agir 10 min (Giemsa rapide)
 Rincer délicatement sous un jet d’eau neutre.

3.3.4 - Séchage
 Essuyer la face inférieure (opposée au frottis) avec du papier filtre
 Laisser sécher la lame à l’air en position inclinée
 Attendre au moins 5 min avant l’observation microscopique du frottis.

52 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3.4 - Résultats

Le frottis est observé à l’objectif x 100 à l’immersion.


La préparation est réussie si les cellules sont séparées, ne comporte ni dépôts de précipité, ni
artéfacts (hématies toutes crénelées…) et :
• les noyaux sont rouge-violet (basichromatine) ou rouges (oxychromatine)
• les cytoplasmes acidophiles sont rose-orangés (hématies)
• les cytoplasmes basophiles sont bleus (lymphocytes…)
• les cytoplasmes polychromatophiles sont gris-bleuté (monocytes….)
• les granulations neutrophiles sont violet lilas
• les granulations éosinophiles sont orangées
• les granulations basophiles sont violet foncé
• les granulations azurophiles sont rouges (monocytes, lymphocytes granuleux, plaquettes).

Si la préparation est
– mal séchée avant coloration  les hématies sont crénelées et sont alors appelées échinocytes
– mal fixée  les leucocytes sont rétractés, sans contraste, non identifiables
– mal colorée  les temps de coloration ne sont pas respectés, le pH de l’eau n’est pas neutre.

Si le pH de l’eau est légèrement acide, les hématies présentent une teinte rose vif.
Si le pH de l’eau est légèrement basique, les hématies présentent une teinte gris verdâtre.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 7 – Frottis sanguin et coloration May Grünwald Giemsa

En savoir plus

Laveran est le nom du médecin militaire, prix Nobel 1907,


pour avoir découvert l’agent du paludisme dans les
hématies en 1880.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 8

Étude cytologique du frottis sanguin coloré

1 - Examen global du frottis sanguin

Dans un premier temps : Examen de l’ensemble du frottis à faible grossissement (Obj.x10)

Cet examen permet de juger :


►de la qualité de l’étalement et de la coloration
►de la densité et de la répartition des cellules
►de la présence éventuelle de cellules anormales de grande taille (ex : certains parasites)

 Si le frottis est trop épais, les leucocytes et les érythrocytes sont rétractés  les détails
morphologiques sont peu visibles, ce qui entraîne des erreurs d’identification.
 Si le frottis est trop mince, les érythrocytes sont étirés, ils apparaissent plus grands et sans
dépression centrale.
Dans un deuxième temps : Examen du frottis à fort grossissement (Obj.x 100 ; à immersion).

Choisir une zone où les érythrocytes sont voisins sans se toucher (corps du frottis).

L’étude cytologique du frottis comprend l’étude des :


− leucocytes : formule leucocytaire, anomalies éventuelles
− hématies : aspect morphologique, groupement
− plaquettes : aspect morphologique, estimation du nombre moyen par champ microscopique,
mode de groupement.

2 - Formule leucocytaire (FL)

2.1 - Définition

La formule leucocytaire (FL) représente la proportion des différents leucocytes dans le sang :
 établie au microscope en pourcentage (%) pour 100 leucocytes
 exprimée en nombre par litre de sang (G/L), à l’aide de la leucocytose.

 Seules la FL exprimée en nombre par litre de sang doit être prise en compte pour l’interprétation
des résultats.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 8 – Étude cytologique du frottis sanguin coloré

2.2 - Établissement de la formule leucocytaire au microscope


 Établir la FL sur 200 leucocytes en général.

 Parcourir le frottis dans différentes zones réparties au centre et vers les bords
La répartition des leucocytes sur le frottis n’est pas homogène :
- les cellules les plus petites (petits lymphocytes) se trouvent surtout au centre
- les cellules les plus grosses (monocytes ou polynucléaires neutrophiles) se trouvent plutôt sur
les bords.
Pour que le résultat obtenu soit bien représentatif des populations leucocytaires étudiées, il faut
parcourir le frottis d’une manière égale au bord et au centre.
Plusieurs méthodes sont acceptées.
- Une méthode consiste à parcourir le frottis sur 4 lignes d’égales longueurs, en évitant la tête et la
queue du frottis.

2 bandes près des bords du frottis


2 bandes au centre du frottis

Identifier environ 50 leucocytes par bande.

- Une autre méthode consiste à parcourir le frottis comme suit :

 Identifier et compter chaque cellule nucléée rencontrée.

♦ les leucocytes matures :


– polynucléaires neutrophiles
– polynucléaires éosinophiles
– polynucléaires basophiles
– lymphocytes (sans distinguer les petits et grands lymphocytes)
– monocytes
Noter les anomalies éventuelles (PN hypersegmenté, lymphocyte à cytoplasme hyperbasophile….).

♦ les précurseurs des leucocytes présents dans le sang lors de certaines pathologies.
Ce sont des leucocytes immatures, précurseurs surtout granuleux, ils font partie de la FL.

Identifier précisément chaque stade


Les compter dans les 100% de la FL

La présence dans le sang de précurseurs granuleux, définit la myélémie.

56 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

♦ les précurseurs des érythrocytes (érythroblastes) présents dans le sang lors de certaines
pathologies.

Ils ne font pas partie de la formule leucocytaire.


La présence dans le sang d'érythroblastes, définit l'érythroblastose.
Problème :
Les érythroblastes sont des cellules nucléées, elles ont donc été comptées comme des leucocytes
lors de la numération de ces derniers.
Par conséquent, si le nombre N de leucocytes comptées est faux (erreur par excès), il faudra donc
corriger ce nombre.

– Identifier précisément chaque stade des érythroblastes rencontrés lors de la réalisation de


la FL.
– Les compter EN DEHORS des 100 % de la FL en indiquant leur pourcentage (%) pour 100
leucocytes.
– CORRIGER la numération des leucocytes :  le nombre N de leucocytes comptées est
faux (erreur par excès).
N = ensembles des cellules nucléées = leucocytes + érythroblastes

Lors de la réalisation de la FL, pour 100 leucocytes (matures ou non) comptées, X


érythroblastes ont été rencontrés.
Correction de la leucocytose : soit N’ la leucocytose réelle :
Pour (100+ X) cellules nucléées, il y a 100 leucocytes
donc pour N cellules nucléées, il y a N’ = pppppp leucocytes
100 + X
Calculer ensuite le nombre de chaque catégorie de leucocytes par litre de sang à partir
de la leucocytose réelle (corrigée).

Voir exercices n° 4 et 5 fiche 10


N.B. : Il existe des claviers qui facilitent le comptage de chaque catégorie de cellules.
2.3 - Incertitude
Plus le nombre de cellules comptées est grand, plus l’incertitude due au hasard de la répartition des
cellules sur le frottis diminue.
L’incertitude est estimée à 10 % pour 100 cellules comptées
à 7 % pour 200 cellules comptées.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 8 – Étude cytologique du frottis sanguin coloré

2.4 - Interprétation des résultats


2.4.1 - Chez l’adulte
Rappel : intervalles de référence du nombre de leucocytes dans le sang : 4,0 à 10,0 G/L

Intervalles de référence Variations pathologiques
% G. L-1 G. L-1
Polynucléaires 1,8 à 7 < 1,5  neutropénie
neutrophiles (PN) < 0,5  agranulocytose
45 à 70 > 8,0  neutrophilie ou
polynucléose neutrophile

Polynucléaires 0,04 à 0,5


1à5 > 0,7  hyperéosinophilie
éosinophiles (PE)
Polynucléaires 0 à 0,2
0à2 > 0,2  basophilie
basophiles (PB)
Lymphocytes (L) 0,8 à 4 < 1,0  lymphopénie
20 à 40 > 4,0  lymphocytose

Monocytes (M) 0,12 à 1 > 1,0  monocytose


3 à 10
Précurseurs des 0
0 Présence  myélémie
granuleux

✍ A noter qu’on n’objective pas de baisse des éosinophiles, ni des basophiles, ni des
monocytes, qui sont tous à l’état normal en faible proportion.
2.4.2 - Chez l’enfant
Cf. tableau page 21
Retenir que :
La FL est très variable selon l’âge de l’enfant :
 A la naissance et dans les premiers jours de la vie :  Polynucléose neutrophile et monocytose
physiologique
 Puis jusqu’à au moins 4 ans, parfois jusqu’à 10-12 ans :  Lymphocytose physiologique. Cette
lymphocytose physiologique est responsable de l’inversion de la fL :
% polynucléaires < % lymphocytes + % monocytes.
Elle est liée aux nombreuses viroses entrainant l’activité intense des mécanismes immunologiques à
cette période de la vie.
L’interprétation précise des résultats nécessite l’utilisation du tableau page 21.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3 - Étude des hématies


Observer la taille, la forme, la couleur des hématies ainsi que la présence éventuelle
d’inclusion anormale.

La population érythrocytaire normale est assez homogène :


− hématies de 7 à 8 µm
− avec une petite zone centrale plus claire due à la forme biconcave
− une teinte beige rosée

Les anomalies de taille, de forme, de couleur, la présence d’inclusions intra-érythrocytaires doivent


être identifiées et plus ou moins quantifiées car elles jouent un rôle important dans le diagnostic des
anémies.

 Toujours bien vérifier que les anomalies de taille et de couleur soient bien cohérentes avec les
indices érythrocytaires (VGM, TCMH et IDR).

fig. 5: Hématies de taille, de forme et de couleur anormales

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 8 – Étude cytologique du frottis sanguin coloré

4 - Étude des thrombocytes


Apprécier le nombre de plaquettes de façon approximative :
nombre moyen par champs = environ 10 plaquettes.

✎ Toujours bien vérifier que ce nombre estimé est bien cohérent avec la numération plaquettaire.

Apprécier la morphologie (taille, forme) et le groupement des plaquettes.


Si le sang a été recueilli sans anticoagulant
• noter la taille des plaquettes : normalement 3 à 5 µm
• noter leur aspect : normalement présence de granules azurophiles
• noter leur groupement : isolé ou en amas (aptitude à s’agréger)
Si le sang a été recueilli sans anticoagulant, il est normal d’observer des amas
plaquettaires.

Si le sang a été recueilli sur EDTA


• noter la taille des plaquettes : normalement 3 à 5 µm.
(parfois la présence d’EDTA provoque une augmentation de leur taille)
• noter leur aspect : normalement présence de granules azurophiles
• noter leur groupement : isolé ou en amas
L’EDTA inhibe l’agrégation des plaquettes, par conséquent les plaquettes doivent être
isolées.
Si les plaquettes sont en amas, cela signifie que la numération des plaquettes réalisée avec
le sang recueilli sur EDTA est sous estimée. Il faut absolument signaler que la numération
des plaquettes doit être refaite sur du sang recueilli sur du citrate de sodium (0,108 mol/L –
9V sang /1 V de citrate).

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 9

M orphologie des leucocytes sanguins


- Coloration MGG -

1 - Granulocytes ou polynucléaires

1.1 - Polynucléaires neutrophiles (PN)

Variante

Pourcentage : 45 à 70% - Nombre par litre de sang : 1,8 à 7 G


Aspect général de la Étude du noyau Étude du cytoplasme
cellule
– Taille 12 à 16 µm – Rapport N/C = 0,5 – Couleur : incolore
– Forme arrondie. – Forme : lobée (souvent 3 – Granulations : nombreuses, fines
lobes); parfois ( 0,2 à 0,9 µm), violettes.
hyposegmenté (PN jeune)

– Chromatine condensée, en
motte ; violet foncé.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 9 – Morphologie des leucocytes

1.2 - Polynucléaires éosinophiles (PE)

Variante

Pourcentage : 1 à 5% - Nombre par litre de sang : 0,04 à 0,5 G


Aspect général de la Étude du noyau Étude du cytoplasme
cellule
– Taille 12 à 16 µm – Rapport N/C = 0,5 – Couleur : incolore ou légèrement
– Forme arrondie. – Forme : lobée (souvent 2 bleuté
lobes) – Granulations : assez nombreuses,
– Chromatine assez plus grosses, régulières, aspect de
condensée : violet . billes ( 0,5 à 1,5 µm), beige rosé à
orangé

1.3 - Polynucléaires basophiles

Variante

Pourcentage : 0 à 2% - Nombre par litre de sang : 0 à 0,2 G


Aspect général de la Étude du noyau Étude du cytoplasme
cellule
– Taille 12 à 14 µm – Rapport N/C = 0,7 – Couleur : incolore
– Forme arrondie. – Forme : difficile à observer, – Granulations : assez nombreuses,
souvent en trèfle grosses, irrégulières, aspect de billes (
– Chromatine plus lâche; 0,2 à 2 µm), violet noir; recouvrant
rougeâtre. parfois le noyau.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2 - Agranulocytes ou mononucléaires

2.1 - Lymphocytes

Grand lymphocyte à grains


Petit lymphocyte Grand lymphocyte ou granuleux

Pourcentage : 20 à 40 % - Nombre par litre de sang : 1 à 4 G

2.1.1 - Petit lymphocyte


Aspect général de la Étude du noyau Étude du cytoplasme
cellule
– Taille 7 à 10 µm – Rapport N/C = 0,9 – Couleur : basophile (bleu vif)
– Forme arrondie. – Forme : volumineux, bien – Aspect : croissant ou mince couronne
rond, quelquefois encoché – Granulations : aucune en général
– Chromatine très
condensée, pâteuse; violet
noir.

2.1.2 - Grand lymphocyte


Aspect général de la Étude du noyau Étude du cytoplasme
cellule
– Taille 10 à 15 µm – Rapport N/C = 0,7 – Couleur : bleu pâle ,
– Forme arrondie mais – Forme : rond, ovalaire ou – Aspect : quantitativement plus
déformable. en « drapeau » important que chez le P.L.
– Chromatine moins – Granulations : pas de granulation
condensée que celle du P.L.; ou quelques granulations azurophiles,
violet. (rouge vif), assez grosses, souvent
regroupées dans une vacuole
incolore.

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 9 – Morphologie des leucocytes

2.2 - Monocytes

Pourcentage : 3 à 10 % - Nombre par litre de sang : 0,12 à 1 G


Aspect général de la Étude du noyau Étude du cytoplasme
cellule
– Taille 16 à 30 µm – Rapport N/C = 0,7 – Couleur : gris bleu « ciel d'orage »
– Forme arrondie mais – Forme : forme irrégulière, – Aspect : présence de zones incolores;
très déformable en S, en E, en U en fer à contours flous, irréguliers
cheval, en nuage ... – Granulations : pas de granulation ou
– Chromatine peu dense, le plus souvent nombreuses
d’aspect spongieux, non granulations azurophiles (rouges);
condensée, rougeâtre assez très fines, poussiéreuses, à la limite
claire. de la visibilité.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 10

Exercices : Interprétation de formules leucocytaires


Interpréter les 5 formules leucocytaires (FL) suivantes.
Exercice 1 : Exercice 2 :
Homme adulte – M. Moreno Enfant de 4 ans – Éric Blanc

Numération des leucocytes : 7,1 G/L Numération des leucocytes : 12 G/L


Formule leucocytaire (%) Formule leucocytaire (%)
PN 62 PN 37
PE 1 PE 1
PB 0 PB 1
L 31 L 57
M 6 M 4

Exercice 3 : Exercice 4 :
Homme adulte – M. Brun Femme adulte – Mme Green

Numération des leucocytes : 19,6 G/L Numération des leucocytes : 10,9 G/L
Formule leucocytaire (%) Formule leucocytaire (%)
PN 72 PN 55
PE 2 PE 1
PB 0 PB 1
L 20 L 34
M 3 M 9
Métamyélocytes neutrophiles 1 Érythroblastes 1 pour (en plus des) 100 GB
Myélocytes neutrophiles 2 polychromatophiles
Érythroblastes 8 pour (en plus des) 100 GB
acidophiles

Exercice 5 : Femme adulte – Mme Purple

Numération des leucocytes : 10,9 G/L


Formule leucocytaire (%)
PN 75 Métamyélocytes neutrophiles 4
PE 3 Myélocytes neutrophiles 3
PB 1 Promyélocytes neutrophiles 1
L 11 Érythroblastes acidophiles 9 pour (en plus des)100 GB
M 2

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Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 10 – Interprétation de formules leucocytaires

Rédiger selon le modèle suivant :


FL Pourcentage Intervalles de Nombre de Intervalles de Conclusion
(%) trouvé références (%) leucocytes (G/L) références (G/L)
PN
PE
PB
L
M

Total

Conclusion générale:

Quelques conseils :

1 – Vérifier si la somme des pourcentages des différentes catégories de leucocytes est de 100 %.
On tolère 99%, 101% mais pas au-delà.

2 – Vérifier si la somme des nombres/L des différentes catégories de leucocytes correspond au nombre
total (éventuellement corrigé) par litre de sang de leucocytes.

3 – Les métamyélocytes et myélocytes (s’ils sont présents), sont des précurseurs des granuleux, ils
entrent dans la formule leucocytaire. Il faut conclure à une myélémie.

4 – Les érythroblastes sont les précurseurs des rouges, ils n’entrent pas dans la formule leucocytaire.
Si des érythroblastes sont observés sur le frottis sanguin, cela signifie qu'ils ont été comptés en tant
que leucocytes lors de la numération des leucocytes.
« X érythroblastes pour 100 GB » signifie qu’il y a X érythroblastes en plus des 100 GB.
Il est donc important de corriger la numération des globules blancs. (cf. fiche 8) : exercice 4 et 5.

5 – Expression des résultats:


Ajuster les pourcentages à 0,5 près. Calculer la somme des pourcentages des blancs et vérifier qu’il y a
bien 100 %

6 – Pour interpréter la FL, il faut utiliser les nombres de GB/L et non les pourcentages.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 11

Numération des thrombocytes


Dénombrement direct au microscope

1 - Principe
Le sang est dilué de façon précise dans un liquide hypotonique qui lyse les hématies et respecte les
thrombocytes (ou plaquettes); ce liquide évite également l'agrégation des plaquettes au verre et entre
elles.
Les plaquettes sont comptées au microscope dans un volume connu de sang dilué, grâce à un
hématimètre.
Le résultat est exprimé en nombre de plaquettes par litre de sang.

2 - Réactifs et matériel

2.1 - Sang à analyser


Le sang est prélevé chez un sujet à jeun et au repos.
On peut utiliser :
• du sang veineux recueilli
– sur EDTA : cet anticoagulant sec ne dilue pas le sang et inhibe l’agrégation plaquettaire.
– sur citrate trisodique (0,11 mol/L) : cet anticoagulant liquide dilue le sang (1V de
citrate/9Vde sang) n'est utilisé qu'en deuxième intention, uniquement si les plaquettes du
patient s'agrègent sous EDTA.
– en tube à paroi non mouillable (plastique ou verre siliconé) pour empêcher l’adhésion des
plaquettes aux parois.

• du sang capillaire, prélevé au bout du doigt chez l’adulte ou au talon chez le nouveau-né.
Il est impératif de prélever la 1ère goutte de sang pour réaliser la numération des plaquettes, car
celles-ci adhèrent très vite à la plaie.
2.2 - Matériel
• Pipette automatique P 200 et pipette à déplacement positif et à piston de 10 µL ou de 20 µL

• Hématimètre et lamelle planée.


On peut utiliser l’hématimètre de Thoma ou celui de Malassez.

• Microscope avec objectif ( x 40) à sec. parfaitement nettoyé.


2.3 - Diluant : liquide de Piette
• Solution A
Mélanger extemporanément :
Chlorhydrate de procaïne .. 24,3 g
Eau distillée QSP ...............100 mL solution A ...........1 mL
• Solution B solution B .......... 9 mL
NaCl ....................................0,22 g Filtrer.
Eau distillée QSP ...............100 mL
Les solutions A et B sont conservées à +4°C.

B1ABM CM © 67
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 11 – Numération des plaquettes

3 - Manipulation

3.1 - Préparation de l’hématimètre (voir matériel numération)


– Faire adhérer la lamelle aux plateaux.
3.2 - Dilution du sang au 1/100
– Réaliser deux dilutions successives au 1/10
– Homogénéiser le mélange sang-diluant.(Le liquide perd son opacité)
– Laisser en attente 10 min pour permettre la lyse des hématies
– Agiter énergiquement avant utilisation.
3.3 - Remplissage de l’hématimètre
Les plaquettes, peu volumineuses, sédimentent lentement. Il est donc préférable de placer
l’hématimètre dans une atmosphère humide pour éviter la déshydratation de la préparation.
– Remplir l’hématimètre, le placer dans une boite de Pétri fermée et contenant un papier
filtre imbibé d’eau.
– Laisser sédimenter 30 minutes.

3.4 - Numération au microscope


Manipuler le microscope sans gant.
* Vérifier à l’objectif x 10 la netteté de la préparation.
* Utiliser l’objectif x 40 pour compter les cellules.

Les plaquettes sont de petites cellules réfringentes de 1 à 3 µm de diamètre, pour les observer et
les compter il faut:
FAIRE VARIER CONSTAMMENT LA MISE AU POINT LORS DU COMPTAGE

☑Avec l’hématimètre de Thoma :  compter les plaquettes dans la totalité du quadrillage


( la sédimentation est plus rapide car la chambre est moins profonde)

☑Avec l’hématimètre de Malassez :  compter les plaquettes dans 20 rectangles quadrillés pris
au hasard.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3.5 - Calcul

Soit: (N) le nombre de plaquettes par litre de


* (fd) le facteur de dilution de sang sang
* (v) le volume de sang dilué dans lequel on a Établir les equations aux grandeurs :
effectué le comptage N = f ( fd,v,n )
* (n) le nombre total de plaquettes comptées

Établir les equations aux unités :

Applications: fd = 100

Numération avec l’hématimètre de Malassez: Numération avec l’hématimètre de Thoma:


v = 0,20 µL v = 0,1 µL

Etablir les équations aux grandeurs simplifiées Etablir les équations aux grandeurs simplifiées
N = n *100/0,2.10-6 N = n *100/0,1.10-6

N = ½ * n * 109 /L N = n * 109 /L

Écart type de répétabilité Sr = 15 G/L Rappel : G ou Giga = 109


Incertitude composée Uc = 30 G/L
Incertitude élargie U = k.Uc (facteur d'élargissement k=2 pour un niveau de confiance de 95%)

3.6 - Causes d’erreurs

– Mauvaise homogénéisation du prélèvement


– Mauvaise dilution ou mauvaise homogénéisation du sang dilué
– Mauvaise répartition dans l’hématimètre
– Mauvaise numération
– La présence d’agrégats plaquettaires qui rend la numération difficile.

B1ABM CM © 69
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 11 – Numération des plaquettes

4 - Interprétation des résultats

4.1 - Intervalle de référence

Les intervalles de référence sont les mêmes quel que soit l’âge et le sexe.

Thrombocytes : 150 à 500 G/L

4.2 - Résultats pathologiques


* Si le nombre de thrombocytes est inférieur aux intervalles de référence, il y a
thrombocytopénie ou thrombopénie.

* Si le nombre de thrombocytes est supérieur aux intervalles de référence, il y a


hyperthrombocytose.

L’observation des plaquettes sur frottis sanguin coloré par la méthode de MGG (May
Grünwald Giemsa) complète la numération de plaquettes.
Ce frottis doit être réalisé si possible, à partir de sang capillaire ( la présence de
l’anticoagulant fait gonfler les plaquettes, et empêche d’observer leur agrégation).

L’observation des plaquettes doit concerner:


− leur taille : au cours de certaines pathologies, on peut observer des plaquettes géantes ou
macrothrombocytes (jusqu’à 10-12 µm de diamètre).
− leur aspect : présence de granulations azurophiles
− leur groupement :
✗ sur sang capillaire, le frottis doit montrer des d’agrégats plaquettaires. Ils sont
nombreux surtout en fin de frottis, ce qui témoigne du bon fonctionnement
plaquettaire.
✗ sur du sang prélevé sous EDTA, le frottis sanguin montre généralement des plaquettes
isolés. S'il est observé des agrégats plaquettaires, une nouvelle numération de
plaquettes doit être réalisé sous citrate trisodique.

Avant de conclure à une thrombopénie, toujours vérifier:


− l'absence de microcaillot dans le tube de sang
− l'absence d'agrégat plaquettaire sur frottis sanguin.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 12

Anomalies érythrocytaires
Dans certains états pathologiques (anémies), l'observation des hématies sur frottis sanguin coloré au
MGG montre :
– des variations de la taille, de la forme, de la couleur
– et même parfois la présence anormale d’inclusions intracytoplasmiques.
Parfois les hématies qui normalement sont généralement isolées sur un frottis sanguin, peuvent
s’associer et pour former des rouleaux ou des amas : groupement anormal.
Ces anomalies doivent être signalées lors de l’étude du frottis sanguin coloré au MGG.

L’observation des anomalies érythrocytaires s’effectue sur la zone sub-distale du frottis. Les
hématies sont en monocouche et bien séparées les unes des autres. La queue du frottis est à éviter, car
les hématies sont à cet endroit souvent écrasées et déformées.

Attention : Comme les anomalies érythrocytaires touchent une population cellulaire, elles sont
toujours retrouvées dans plusieurs champs microscopiques.

Rappel de la morphologie normale sur frottis sanguin coloré au MGG :

Normocyte, Cellule anucléée


normochrome Forme : discocyte, biconcave
Diamètre : 7 à 8 µm (VGM = 80 à 100 fL)
Couleur : Sur frottis coloré au MGG : forme ronde, beige rosé avec
une zone centrale plus claire.

Cependant une légère différence de taille existe et certaines hématies


peuvent être étirées ou écrasées par le frottis.

B1ABM CM © 71
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 12 – Anomalies érythrocytaires

1 - Anomalie de taille = Anisocytose

Anisocytose : définie par une grande variabilité des diamètres des hématies sur un même frottis.

L’anisocytose peut être due à la présence de :


Microcytes Forme : biconcave, normale,
Diamètre : < 6 µm (VGM < 80 fL)
Couleur : beige rosé avec une zone plus claire au centre

Pathologie : microcytose
 rencontrés au cours des anémies dues a un trouble de synthèse de Hb.
(ex : anémie ferriprive, inflammatoires, thalassémie).

Macrocytes Forme : biconcave, normale ou parfois ovalaire


Diamètre : > 9 µm (VGM > 100 fL)
Couleur : beige rosé avec une zone plus claire au centre plus ou moins
visible

Pathologie : macrocytose
Ils peuvent correspondre à des réticulocytes qui seront mis en évidence
après coloration au bleu de Crésyl brillant.

 Ils s'observent au cours de différentes dysérythropoïèses (anomalie


de synthèse des hématies au niveau de la moelle, avec érythropoïèse
inefficace) : carences en folates et/ou vitamine B12, alcoolisme, traitement
par AZT. Si leur diamètre est supérieur à 12 µm, ils sont alors parfois
appelés « mégalocytes ».

72 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2 - Anomalie de forme = Poïkilocytose

Poïklocyte : définie par la présence dans le sang d’hématies de forme anormale, abérrante.

Attention : il ne faut pas les confondre avec des artéfacts dus à l’étalement ou au séchage

La poïkilocytose peut être due à la présence de :

Drépanocytes Forme : allongée, classiquement en forme de faucille ou de croissant,


avec deux extrémités pointues, plus ou moins effilées ; ( hématies
falciformes)
Couleur : beige rosé

Pathologie : drépanocytose (maladie due à la présence dans les hématies


d’une hémoglobine anormale : HbS qui se polymérise si la pression
partielle en O est faible).
2
Codocytes Forme : « chapeau mexicain » vu de profil, aspect de cible ou de
ou cocarde vu de dessus
Couleur : beige rosé
cellules cibles
Leur présence est souvent associée à une anomalie de synthèse de
l’hémoglobine.
Ex : thalassémie, parfois au cours des anémies ferriprives.

Dacryocytes Forme : de larme, de poire


Couleur : beige rosé

Cet aspect, évocateur de fibrose médullaire, est rencontré au cours de


la splénomégalie myéloïde, des dysérythropoïèses acquises, et de
pathologies tumorales s'accompagnant de fibrose médullaire.

Échinocytes Forme : crénelées, en oursin  disque ou de sphère, hérissée de


spicules fins, régulièrement répartis sur toute la surface de la cellule.
Couleur : beige rosé
Attention : il faut s’assurer qu’il ne s’agit pas d’artéfacts dus à un frottis
mal séché ou du sang trop longtemps conservé.

s’observe au cours de
- Dyslipidémies, sujets non " à jeun "
- Déficit en pyruvate kinase
- Insuffisance rénale aiguë.

B1ABM CM © 73
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 12 – Anomalies érythrocytaires

Acanthocytes Forme : possèdent en surface quelques spicules épais de longueur


variables disposés irrégulièrement.
Couleur : beige rosé

s’observe au cours de cirrhoses éthyliques sévères.

Ovalocytes Forme : ovalaire ou en bâtonnet, les extrémités sont toujours


arrondies, sans spicules, ce qui les différencie des drépanocytes;
Couleur : beige rosé

présents en petite quantité dans certaines anémies acquises,


présents en grande quantité dans l’elliptocytose héréditaire, pathologie
congénitale de la membrane du globule rouge.

Stomatocytes Forme : uniconcave


 Zone centrale en forme de fente (évoquant une bouche)
Couleur : beige rosé

 Peu spécifique (anémies hémolytiques acquises, sphérocytose


héréditaire).

Schizocytes Forme : diverses (coquilles d’œufs) fragments d’hématies.


Couleur : beige rosé
VGM < 80 fL - cf. fig. 7

Cet aspect est observé au cours :


* d'anémies hémolytiques d'origine mécanique (ex : dues à des
prothèses valvulaires cardiaques...)
* des brûlures sévères.

Sphérocytes Forme : sphérique


Couleur : plus foncé (avec disparition du centre clair)
Diamètre : < 6 µm mais VGM compris entre 80 et 100 fL

Pathologie : sphérocytose
s’observe observe au cours de la maladie de Minkowski Chauffard ou
sphérocytose héréditaire (anomalies congénitale de la membrane des
hématies),
mais également au cours d'autres anémies hémolytiques

74 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3 - Anomalie de couleur = Anisochromie

Anisochromie : définie par la variabilité de l'intensité de coloration des hématies sur un même
frottis.

Annulocytes ou Seul un mince anneau périphérique est coloré.


leptocytes Il y a hypochromie

Cause : teneur faible en hémoglobine dans l’hématie (TCMH<27 pg)

Ils caractérisent une hypochromie

retrouvés dans les anémies hypochromes correspondant à des


anomalies de synthèse de l’Hb (Ex : anémies ferriprives sévères).

Hématies Couleur plus grise ou plus violacée


polychromatophiles
Cause : immaturité du cytoplasme : Hb incomplètement synthétisée et
persistance de ribosomes (ces hématies correspondent à des
réticulocytes)

témoignent d’une régénération médullaire importante.

B1ABM CM © 75
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 12 – Anomalies érythrocytaires

4 - Anomalies d'inclusions intra-érythrocytaires

Attention : ne pas confondre précipité de colorant et inclusion intra érythrocytaire.

Hématies Très fines granulations bleu violacé réparties sur toute la surface de la
ponctuées ou cellule. Ce sont les témoins d'une anomalie de synthèse de
l'hémoglobine.
à granulations
Cause : Elles proviennent de l’agrégation anormale de ribosomes.
basophiles
observées au cours des anémies hémolytiques, mais le plus souvent,
elles témoignent d'une dysérythropoïèse: hémoglobinopathie, anémie
mégaloblastique, intoxication par le plomb (saturnisme)…
(La recherche d'hématies ponctuées reste un examen fiable et peu onéreux
dans la surveillance du saturnisme).

Sidérocytes avec Fins granules en grappes d'hémosidérine (riches en fer)- 1 à 3 par


corps de hématie.
Pappenheimer
rencontrés au cours de toutes dysérythropoïèses avec sidéroblastose
(nombre augmenté si splénectomie ou asplénie fonctionnelle).

Anneau de Cabot Fin filament rouge violacé, en anneau ou en 8.


Cause : Il correspond à un reste de fuseau mitotique. cf. fig. 5

s'observe au cours des dysérythropoïèses.

Corps de Jolly Granule violacé souvent unique et excentre (diamètre 1 µm)


Cause : Il correspond à un reliquat nucléaire (ADN) cf. fig. 5

s'observe de façon constante après splénectomie ou lors d’asplénie.


Ils sont aussi présents au cours des dysérythropoïèses.

Attention : Une plaquette de petite taille peut parfois se superposer sur une hématie et ne doit pas
être confondue avec une inclusion intra-érythrocytaire.

Remarque : Les parasites inta-érythrocytaires ne sont pas évoqués dans ce cours. (cf. cours de
parasitologie B2ABM)

N.B. La présence d’érythroblastes (précurseurs nucléés d’hématies) est à signaler.

76 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Attention : certaines anomalies ne sont pas visibles sur frottis coloré par la méthode
de May-Grünwald Giemsa (MGG), elles nécessitent des colorations particulières :

Corps de Heinz Ils sont mis en évidence après la coloration post-vitale au bleu de crésyl
brillant.
Ils apparaissent sous formes d’une ou plusieurs grosses granulations
bleu foncé. situées à la périphérie de l'hématie contre sa membrane.

Cause : Ils proviennent de la dénaturation de l’hémoglobine en


méthémoglobine.
Ils sont dus à des précipités d'hémoglobine dénaturée (methémoglobine…),
toxiques pour la cellule.

caractéristiques de certaines anémies hémolytiques, soit congénitales


par hémoglobinopathies (hémoglobines instables) ou enzymopathies
(surtout déficit en G6PD).

Sidérocytes Après coloration de Perls, les corps de Papenheimer forment de petites


granulations bleutées, irrégulièrement réparties dans une hématie le
plus souvent hypochrome et macrocytaire.

Les sidérocytes sont des hématies contenant des grains d’hémosidérine une
forme de stockage du fer.

caractéristiques d'un défaut de synthèse de l'hémoglobine et d'une


mauvaise incorporation du fer dans celle-ci, les sidérocytes s'observent
dans les thalassémies, et autres dysérythropoïèses.
Ils vont généralement de pair avec un excès de sidéroblastes dans la
moelle osseuse.
N.B. Ces grains bleutés peuvent aussi s’observer dans les macrophages.

B1ABM CM © 77
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 12 – Anomalies érythrocytaires

5 - Anomalie de groupement

Hématies en Les hématies s'empilent l'une sur l'autre par modification de leur
rouleaux potentiel membranaire (qui normalement les repousse) : en général lié
à une ou des protéines adsorbées modifiant la charge électrique de
surface

 s'observent souvent en cas gammapathie monoclonale et


d'hyperfibrinogénémie (liée à un syndrome inflammatoire).

Les nombreux rouleaux présents dans le sang vont entraîner une


augmentation de la VS.
Il peut y avoir alors une sous estimation du nombre d'hématies.

Agglutinats Les hématies sont regroupées en paquets


d'hématies
Dans ce cas, la numération des hématies est entachée d'une
erreur par défaut.

Principalement associés à des agglutinines froides ; l'anomalie est


visible à température ordinaire; elle disparaît après incubation 1h à 37°C

1h - 37°C

Conséquence : il faut refaire la numération des hématies après une


incubation du sang 1h à 37°C

78 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Formation d’un corps de Jolly à partir d’un chromosome aberrant

anormale des microtubules du fuseau


Formation d’un anneau de Cabot à partir d’une persistance
fig. 6: Formation des corps de Jolly et de Cabot

fig. 7: Formation d'un schizocyte par coupure sur un filament de


fibrine

B1ABM CM © 79
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 12 – Anomalies érythrocytaires

ANOMALIES ÉRYTHROCYTAIRES
(Frottis sanguins colorés au MGG)

Hématies normales

Anisocytose : présence de Poïkilocytose : hématies de forme Anisochromie : hématies


microcytes et de macrocytes très différente normochromes et hypochromes

Hypochromie : présence Polychromatophilie et


d’annulocytes hypochromie

Sphérocytes Codocytes Dacryocytes

80 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Echinocytes Acanthocytes Stomatocytes

Schizocytes Drépanocytes Ovalocytes

Corps de Jolly Anneau de Cabot

Ponctuations basophiles Sidérocytes avec corps de


Pappenheimer

B1ABM CM © 81
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 12 – Anomalies érythrocytaires

Exercice : Pour chaque photographie, rédigez un commentaire sur l’aspect des hématies.

82 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes manuelles – Fiche 13

Exercices : Interprétation d'hémogrammes


Interpréter les trois hémogrammes.

Premier exemple
Patient : M. TERIEUR Alex Age : 68 ans (sang prélevé sur EDTA)

Unités Valeurs du Intervalles de Conclusion


patient référence
Hb g.L-1 195
Erythrocytes T. L-1 6.3
Ht L. L-1 0.59
VGM fL
TCMH pg
CCMH g. L-1
IDR % 12
Thrombocytes G. L-1 490
Leucocytes G. L-1 16
PN G. L-1
PE G. L-1
PB G. L-1
L G. L-1
M G. L-1
Autres cellules G. L-1

Total

PN % 69
PE % 2
PB % 1
L % 22
M % 6
Autres cellules % -

Total
Éryhtroblastes
- Acidophiles -
- Polychromatophiles

Observations des hématies sur frottis sanguin coloré au MGG : pas d’anomalie de taille, de forme,
de couleur, d'inclusion

Observations des plaquettes sur frottis sanguin coloré au MGG : le nombre de plaquettes par
champs est en moyenne de 20. Quelques plaquettes géantes. Leur aspect semble normal. Elles sont
isolées.

B1ABM CM © 83
Chapitre 1 – Hémogramme manuel – fiche 13 - Exercices

Deuxième exemple
Réaliser le tableau de l'exemple 1 et interpréter.

Patiente : Mme ATASTROPHE Monique Age : 47 ans (sang prélevé sur EDTA)
Unités Valeurs du Formule leucocytaire
patient
Hb g.L-1 75 PN 53 %
Erythrocytes T. L-1 3.3 PE 3%
Ht L. L-1 0.36 PB 1%
VGM fL L 34 %
TCMH pg M 9%
CCMH g. L-1
IDR % 17

Thrombocytes G. L-1 203 Eryhtroblastes


- Acidophiles 6 pour 100 GB
Leucocytes G. L-1 8 - Polychromatophiles 2 2 pour 100 G
Observations des hématies sur frottis sanguin coloré au MGG
- anomalie de taille : anisocytose nette – de nombreux macrocytes
- pas d’anomalie de forme :
- anomalie de couleur : anisochromie assez importante – hypochromie (nombreux annulocytes)
- pas d’anomalie d’inclusion
Observations des plaquettes sur frottis sanguin coloré au MGG
Nombre de plaquettes par champs : en moyenne de 11 . Taille et aspect normaux, isolées.

Troisième exemple
Patiente : Mme VERSAIRE Annie Age : 29 ans (sang prélevé sur EDTA)
Unités Valeurs du Formule leucocytaire
patient
Hb g.L-1 75 PN 63 %
Erythrocytes T. L-1 3.0 PE 2%
Ht L. L-1 PB 0%
VGM fL 73 L 27 %
TCMH pg M 8%
CCMH g. L-1
IDR % 16

Thrombocytes G. L-1 120

Leucocytes G. L-1 5.5


Observations des hématies sur frottis sanguin coloré au MGG
anomalie de taille : anisocytose nette – de nombreux microcytes
pas d’anomalie de forme
pas d’anomalie de couleur
pas d’anomalie d’inclusion
Observations des plaquettes sur frottis sanguin coloré au MGG
Nombre de plaquettes par champs difficile à apprécier car elles sont souvent en amas.
Taille et aspect normaux.

84 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Examens complémentaires à l'hémogramme – Fiche 1

V itesse de sédimentation
(Méthode de Westergren)

1 - Définition
La méthode standart de Westergren est définie par le Comité International de Normalisation en
hématologie.
C’est la vitesse à laquelle sédimentent les hématies d’un sang :
- recueilli sur citrate, à raison d’un volume de citrate pour 4 volumes de sang.
- déposé dans des tubes calibrés et verticaux, maintenus à température ambiante
(20 à 27°C).

On mesure la hauteur de plasma surnageant 1 h après le dépôt, grâce aux graduations du tube.
Le résultat s’exprime en mm de plasma surnageant après 1h de sédimentation.

2 - Facteurs influençant la VS

2.1 - Composition du plasma en protéines


Les protéines plasmatiques, chargées pour la plupart
positivement, neutralisent les forces de répulsion des GR
chargés négativement (acide sialique). Elles favorisent la
formation des rouleaux de GR.
La vitesse de sédimentation est d’autant plus rapide que
la formation de rouleaux d’hématies est importante.
Ainsi l’accélération de la VS est le plus souvent causée par
l’augmentation du taux de protéines plasmatiques telles que :
- le fibrinogène (migre au niveau des β
globulines)
- l’haptoglobine (migre au niveau des α2
globulines)
- la CPR= protéine C réactive : « protéine
d’origine hépatique qui précipite en présence de
la protéine C du pneumocoque » (migre au
niveau des γ globulines) fig 11: Rouleaux d'hématies (MEB)
- les anticorps (γ globulines).

B1ABM CM © 85
Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche1 – Vitesse de sédimentation

2.2 - Certaines pathologies érythrocytaires

- Variation du nombre de GR
Une augmentation du nombre de GR ralentit la VS
Une diminution du nombre de GR accélère la VS

- Taille des GR
les macrocytes sédimentent plus vite
les microcytes sédimentent moins vite

- Formes anormales gênant la mise en rouleaux


Sphérocytes (forme sphérique)
Drépanocytes (forme de croissant)…

3 - Matériel et réactifs

- Tubes de Westergreen
Tubes en matière plastique, à usage unique, calibrés, gradués en mm, le “zéro” étant la
graduation supérieure.

- Un support
Permettant de maintenir les tubes rigoureusement verticaux.

- Citrate trisodique à 0,11mol/L


Solution anticoagulante liquide servant à diluer le sang.

- Sang
Le sang est prélevé sur un sujet à jeun et au repos (les lipides modifient la VS). En pratique
courante le prélèvement se fait sur EDTA, le même échantillon servant à l’hémogramme et à la
VS. Parfois le sang est prélevé directement sur citrate 0,11 mol/L à raison d’un volume de
citrate pour 4 volumes de sang.

Remarque :
Des techniques récentes permettent de mesurer directement la VS dans le tube qui a servi au prélèvement
(tube spécial), ce qui évite des manipulations de sang pouvant être source de contamination.

86 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

4 - Mode opératoire
Les conditions expérimentales doivent être rigoureusement respectées, car elles influencent la VS
(verticalité du tube, calibre du tube…).

- Mettre la VS le plus tôt possible après le prélèvement :


Avant 2h si le sang est conservé à température ambiante.
Avant 6h si le sang est conservé à 4°C.
4.1 - Dilution du sang prélevé sur EDTA dans un tube à hémolyse

- Dans un tube à hémolyse sec, mettre un volume de citrate : 0,3 mL.


- Préparer le matériel nécessaire à la réalisation du test.
Mettre les gants.
- Homogénéiser le sang manuellement par retournements lents, puis retirer le
bouchon en évitant les aérosols
- Ajouter 4 volumes de sang : 4 x 0,3 = 1,2 mL
(pipette automatique à désinfecter en fin de manipulation).
- Mettre un parafilm.
- Homogénéiser le mélange par 2 à 3 retournements.
4.2 - Montage de la VS
- Placer, en le maintenant bien, le tube à
hémolyse contenant le sang dilué dans le godet.
- Introduire le tube de Westergren jusqu’au fond
du tube de sang dilué.
- Tirer la tige intérieure jusqu’à ce que le sang
atteigne exactement la graduation « zéro » en
évitant les bulles d’air.
- Casser la tige qui dépasse du tube.
- Noter le temps « zéro »
Jeter les gants puis ranger le matériel non contaminé
- Laisser sédimenter 1h, en évitant tout choc au
portoir.
- Lire la hauteur de plasma surnageant après 1h
de sédimentation.

Si la lecture après 2h est difficile, une nouvelle lecture après 2h de


sédimentation peut être effectuée. fig 12: Système pour VS

Mettre les gants pour éliminer le tube à VS dans le sac plastique en vue de l’autoclavage et le tube à
hémolyse dans l’eau de Javel.

B1ABM CM © 87
Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche1 – Vitesse de sédimentation

5 - Résultats et interprétation

5.1 - Intervalles de référence

Homme : 15 mm après 1h de sédimentation


Femme : 20 mm après 1h de sédimentation
Enfant : 10 mm après 1h de sédimentation

Causes d’erreur favorisant un augmentation de la VS :


Température de la pièce > 23°C
Tube incliné
Vibrations, chocs
Quantité d’anticoagulants non respectée

5.2 - Variations physiologiques

- VS accélérée chez la femme enceinte


Ceci est dû à l’hémodilution et au taux élevé de fibrinogène.

- VS souvent accélérée chez les sujets de plus de 50 ans


Après 1h jusqu’à 20 mm chez l’homme
jusqu’à 30 mm chez la femme
et même jusqu’à 50 mm chez le vieillard
5.3 - Variations pathologiques
5.3.1 - Ralentissement de la VS
Il est difficile à apprécier. Il se rencontre lors :
- d’une diminution du taux de fibrinogène.
- de certaines pathologies des érythrocytes :
§anomalies érythrocytaires : drépanocytose, sphérocytose….
§polyglobulie
- d'une hyperleucocytose >50 G/L.

5.3.2 - Accélération de la VS

5.3.2.1 - Lors d’une diminution du nombre d’érythrocytes


Érythropénie provoquant une anémie profonde  VS = 30 à 40mm/h
En particulier : les anémies hémolytiques (accompagnées généralement d’une baisse de
l’haptoglobine).

88 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

5.3.2.2 - Essentiellement lors de l’augmentation du taux de protéines plasmatiques

 Syndrome inflammatoire, caractérisé par un taux augmenté en fibrinogène


(β globulines), en haptoglobine (α2 globuline) et protéine C réactive (CPR).
Exemple : Rhumatisme inflammatoire, Cancers avec métastases …

 Hyperstimulation du système immunitaire, caractérisé par un taux de fibrinogène normal et


une augmentation du taux d’anticorps sériques (γ globulines) de spécificités variées (anticorps
polyclonaux).

 Maladies entraînant la production d’anticorps monoclonaux.


Maladie de Waldenström et myélome de Kahler, deux maladies caractérisées par un taux de
fibrinogène normal et une augmentation du taux d’anticorps sériques d’une seule spécificité
(anticorps monoclonal). Dans ce cas là, la VS est considérablement augmentée (supérieure à
100 mm après 1h) et sur le frottis sanguin, on peut même observer la présence de rouleaux.

6 - Automatisation de la VS
Des techniques automatisées de mesure de la VS ont été mises au point.
Le principe permettant la lecture est fondé sur la propriété des globules rouges à bloquer les rayons
infrarouges, alors que le plasma laisse passer les rayons.
Chaque canal de l'appareil est équipé d'une diode émettrice de rayons d'infrarouges et d'un capteur.
Lorsque la pipette est mise en place entre l'émetteur et le capteur dans l'appareil, la section contenant
des globules rouges bloque les rayons infrarouges qui ne sont plus détectés par le capteur.
En fin de test, l'appareil recherche le niveau pour lequel les rayons infrarouges ne sont plus détectés, il
indique la vitesse de sédimentation.

B1ABM CM © 89
Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche1 – Vitesse de sédimentation

Conduite à tenir devant une VS accéléré


La VS est un test non spécifique à interpréter avec prudence, en fonction du contexte clinique.
 En l’absence d'anémie sévère et d’un contexte clinique évocateur

VS accélérée

Dosage du fibrinogène plasmatique


et protéine C réactive (CRP)
Normal Augmenté

Électrophorèse des protéines plasmatiques

 des γ globulines α2 globulines


Pic monoclonal de γ globulines
polyclonales
 maladie de Kahler,
 hyperstimulation du
maladie de Waldenström
système immunitaire  syndrome
inflammatoire

Normal
Pathologique

Gammapathie Gammapathie Syndrome


polyclonale monoclonale inflammatoire

 Au cours d’une pathologie connue, la VS constitue un élément de surveillance d’un état


infectieux, inflammatoire ou cancéreux, par une méthode simple et efficace.
o Accélération de la VS laisse supposer une poussée évolutive.
o Ralentissement de la VS laisse supposer une évolution favorable.

90 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Examens complémentaires à l'hémogramme – Fiche 2

Numération des réticulocytes

1 - Caractéristiques des réticulocytes

Les réticulocytes (ou proérythrocytes) appartiennent à la lignée érythrocytaire. Ils sont issus des
érythoblastes acidophiles ayant éjecté leur noyau.
Ce sont les hématies les plus jeunes :
- ils sont anucléés comme les hématies matures
mais : -
- ils possèdent encore des organites cellulaires (mitochondries et ribosomes, RER) et
de la protoporphyrine leur permettant d’achever la synthèse d’hémoglobine, alors
que les hématies matures en sont dépourvues. Ces organites diminuent au fur et à
mesure que le réticulocyte mûrit.
- ils sont déformables et de forme plus ou moins sphérique
- ils sont mobiles.

Sidérosome

Mitochondrie
Polysome
Le réticulocyte observé
au microscope
électronique à
transmission présente des Mitochondrie altérée
contours irréguliers dus à Sidérosome
ses mouvements.
Agrégats de ribosomes

Mitochondrie altérée

Après coloration post-vitale, le


réticulocyte mort devient
sphérique.
fig. 8: Ultrastructure du réticulocyte

B1ABM CM © 91
Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche 2 – Numération des réticulocytes

Sur un frottis sanguin coloré par la méthode de May-Grünwald Giemsa, il se différencie d’une hématie
mature par un diamètre légèrement plus grand (aspect de macrocyte), un cytoplasme pouvant
apparaître polychromatophile (car non saturé en hémoglobine et contenant de l’ARN).

Pour le distinguer parfaitement d’une hématie mature, et pour pouvoir le compter, on utilise des
techniques permettant de colorer ou de marquer l’ARN contenu dans les réticulocytes:
➔ colorant utilisé pour la numération manuelle des réticulocytes :le bleu de crésyl brillant
➔ marqueur fluorescent ou colorant (bleu de méthylène) utilisé pour la numération
automatique des réticulocytes.

2 - Numération manuelle des réticulocytes

2.1 - Principe
2.1.1 - Coloration post-vitale au bleu de crésyl brillant (BCB)
Le bleu de crésyl brillant, colorant vitale basique, va fixer, précipiter et colorer l’ARN contenu
dans les réticulocytes  les ribosomes se regroupent sous forme de petite granulations.
Le colorant ne pénètre que dans des cellules vivantes, mais la concentration utilisée entraîne la mort
cellulaire : on parle de coloration post-vitale. Cette coloration est donc réalisée sans fixation
préalable.

2.1.2 - Numération des réticulocytes


C’est une numération indirecte :
 Sur frottis sanguin coloré au bleu de crésyl brillant, on dénombre réticulocytes et hématies et
on calcul le pourcentage de réticulocytes par rapport aux hématies.
 Connaissant le nombre d’hématies par litre de sang, on déduit le nombre de réticulocytes par
litre de sang.

Attention : Nombre d’hématies totales= nombre d’hématies matures + nombre de réticulocytes.

2.1.3 - Intérêt
Le nombre de réticulocytes dans 1L de sang est un excellent témoin de l’activité érythropoïétique de
la moelle osseuse.

2.2 - Matériel et réactifs


2.2.1 - Matériel
Bain marie thermostaté à 37°C
Lames de verre
Lamelles à étalement
Pipettes Pasteur en plastique à usage unique
Gants en latex à usage unique

92 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2.2.2 - Réactifs
Sang capillaire ou sang veineux recueilli sur EDTA
Solution de bleu de crésyl brillant filtrée
.Bleu de crésyl brillant (10g) : colorant de l’ARN
.Citrate de sodium (4g) : anticoagulant (nécessaire pour le sang capillaire)
.Chlorure de sodium à 8,5g/L (qsp. 1L) : solution isotonique pour ne lyser les hématies.

2.3 - Manipulation
2.3.1 - Coloration

2.3.1.1 - Technique
Dans un tube à hémolyse, introduire sans grande précision :
- 5 à 10 gouttes de colorant (pipette pasteur en plastique)
- une quantité égale de sang homogénéisé

Boucher le tube avec du parafilm.


Homogénéiser soigneusement le mélange en le faisant rouler entre les doigts.
Placer le tube à 37°C pendant environ 20 minutes.
Homogénéiser à nouveau pour bien remettre les cellules en suspension. Réaliser quelques frottis
réguliers et minces qui seront séchés au fur et à mesure.

2.3.1.2 - Observation au microscope optique


La coloration est observée à immersion, grossissement X 1000.

Les hématies matures sont colorées en bleu-verdâtre.

Les réticulocytes sont également colorés en bleu-verdâtre mais ils se


distinguent des hématies matures par la présence d’un fin réseau de
granulations bleu violacées (ARN) : ce réseau est d’autant plus
abondant que le réticulocyte est jeune.
Les réticulocytes n’ont pas de dépression centrale et sont parfois un
peu plus gros que les hématies matures.

Les réticulocytes plus âgés possèdent très peu de granulations bleu-


violacées. Seule une parfaite mise au point permet de les repérer.

B1ABM CM © 93
Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche 2 – Numération des réticulocytes

Ne pas confondre les réticulocytes


avec des artefacts (scissures dans l'hématie)
fig. 9: Hématies matures
comportant des scissures

REMARQUE : les corps de Heinz (précipités anormaux d’hémoglobine instable) sont également
colorés par le bleu de crésyl brillant sous forme d’un gros grain périphérique en général.

Corps de Heinz

Réticulocyte âgé

Réticulocyte jeune

Hématie mature

fig. 10: Frottis sanguin coloré au bleu de


crésyl brillant

94 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2.3.2 - Numération

2.3.2.1 - Technique
Repérer à l’objectif x 40 un champ où les hématies sont bien isolées et réparties de façon régulière.
Compter à immersion les hématies (n) en distinguant les réticulocytes (R) et les hématies matures
(Hm)
1ère méthode :
• Compter les réticulocytes dans 9 champs disposés comme ci-dessous : soit R1, R2… R9
• Compter les hématies matures, dans le champ central, soit Hm cette valeur.
• Si le nombre total de réticulocytes est inférieur à 50, recommencer la même opération dans
d’autres zones du frottis
R1, R2, R3 …R9 : nombre de réticulocytes
comptés dans chaque champ.

R1 R2 R3 H : nombre d’hématies totales (hématies


Champ
matures et réticulocytes) comptées dans le
microscopique
champ n°5
R5
R6 R4 Si le frottis est régulier, on considère que le
H
nombre d’hématies est le même dans les
champs voisins :

R7 R8 R9  nombre total d’hématies matures dans les 9


champs  n= 9 H

2ème méthode :
• Compter n = 1000 hématies (hématies matures et réticulocytes) sur différents champs et noter
le nombre (r) de réticulocytes rencontrés dans ces champs.

2.3.2.2 - Calcul du pourcentage de réticulocytes


ère
1 méthode :
Calcul pour une numération réalisée sur 9 champs microscopiques :

- Calcul du nombre (R) total de réticulocytes R = R1+R2+R3 + ……+ R9


- Calcul du nombre (n) d’hématies totales n = 9Hm + R
- Calcul du pourcentage (P) de réticulocytes P = R x100/n

2ème méthode :
- Calcul du pourcentage (P) de réticulocytes : P = R x 100/n
Les résultats normaux sont compris entre 0,5 et 2%.

2.3.2.3 - Expression par litre de sang


Connaissant le nombre (Nery) d’hématies par litre de sang, on déduit le nombre (Nret) de réticulocytes
par litre de sang
Nret = P x N/100
Ce résultat est exprimé en G/L (109/L)

B1ABM CM © 95
Chapitre 1 – Examen complémentaire à l'hémogramme – fiche 2 – Numération des réticulocytes

2.4 - Interprétation
Seules les valeurs exprimées en nombre de réticulocytes par litre de sang doivent être
interprétées.
Du fait de la technique de comptage, le nombre de réticulocytes n’est connu que de façon
approximative (à 20 % près).

Intervalle de référence chez l’adulte et chez l’enfant : 20 à 100 G/L

Ce taux est plus élevé chez le nouveau-né (100 à 300 G/L)

En pratique cette numération n’est réalisée qu’en cas d’anémie normocytaire ou macrocytaire.
(Les anémies microcytaires sont généralement arégénératives : cf. module 2 - Hémopathies)

Réticulocytes > 120 G/L : la moelle a une intense activité érythropoiétique qui tend à compenser
l’anémie : l’anémie est régénérative (anémie d’origine périphérique).

Réticulocytes < 120 G/L : la moelle ne peut pas augmenter son activité érythropoiétique pour
compenser l’anémie : l’anémie est arégénérative (anémie d’origine centrale).

3 - Numération automatique des réticulocytes


Actuellement il est possible de compter automatiquement ces cellules en cytométrie de flux, après les
avoir marquées sélectivement, grâce à leur ARN. Cf. cours « automatisation de l’hémogramme ».
Exemple : sur automate Pentra 120Rétic Horiba ABX
Les ARN résiduels des réticulocytes sont marqués par un fluorochrome, le thiazole orange.

L'automate mesure la fluorescence (350 nm) déclenchée par une excitation transitoire et les volumes
réticulocytaires par variation d'impédance.

Réticulocytes à forte concentration en


ARN
Fluorescence

Réticulocytes à concentration
moyenne en ARN

Réticulocytes à faible concentration en


ARN
Hématies matures
Volume
fig. 11: Scattergramme réticulocytaire

96 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme automatisé - Fiche 1

Automatisation de l'hémogramme
Actuellement, l’hémogramme est entièrement automatisé, ce qui permet un comptage fiable est rapide
des cellules sanguines.

1 - Principes des systèmes d’analyse des cellules

Les différents systèmes d’analyse des cellules étudient de nombreux paramètres


cellulaires.
Exemples :
− la taille et le volume des cellules
− la taille et l’aspect du noyau (segmentation, densité chromatinienne)
− le contenu granulaire intracytoplasmique
− l’activité peroxydasique du cytoplasme.
− la concentration en hémoglobine

2 principes sont utilisés :

− détection électrique

− détection optique

A ces deux méthodes de détection, un système de traitement du signal et d’analyse des données permet
l’analyse des cellules.

B1ABM CM © 97
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 1 - Principes

1.1 - Principe de la détection électrique


1.1.1 - Détection volumétrique par différence de conductivité (variation d’impédance)
◊ Principe « Coulter » du nom de son inventeur. Méthode de référence.

Ce principe est basé sur la différence de conductivité entre les cellules mauvaises conductrices et
le milieu salin, électroconducteur dans lequel baignent les cellules.

 : Un volume constant de suspension cellulaire est aspiré à travers un micro orifice de part et d’autre
duquel sont situées des électrodes. Entre ces électrodes passe un courant d’intensité constante.

Chaque fois qu’une cellule passe dans le micro orifice, la résistance augmente ainsi que la différence
de potentiel (ddp) entre ces électrodes : il y a impulsion de tension.

: L’amplitude de cette impulsion (amplifiée) de tension est proportionnelle au volume de la cellule


qui a traversé le micro orifice : ce volume cellulaire est appelé « volume Coulter ».

et: Un dispositif de seuil permet d’éliminer du comptage toutes les cellules ou particules de
volume inférieur aux cellules à compter.
Vers la pompe robinet
tension
tension seuil

temp temps
001256
s

Manomètre 
Amplification de  Discrimination des Comptage
l’impulsion impulsions
électrique

0,5 mL

électrodes
Tube à micro orifice

Cellules (GR…) dans


une solution saline

Aspiration des particules dans la sonde

Remarque: le diamètre du micro orifice (ou opercule) utilisé pour la numération des cellules sanguines
est de 100 µm, plusieurs cellules peuvent passer en même temps et donner naissance à une seule
impulsion.
C’est le passage de coïncidence. La fréquence de la coïncidence obéit à une loi statistique qui est
fonction de la concentration cellulaire. Une correction est automatiquement effectuée par l’analyseur,
ce qui permet d’obtenir des numérations fiables.

98 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

1.1.2 - Mesure de la conductivité à l'aide d'un courant à haute fréquence


Cette technique est généralement associé à une cytométrie de flux.(cf. § 1.2)
Un courant haute fréquence traverse le leucocyte ; ce dernier va modifier le courant en fonction
de la structure de son noyau (forme, densité chromatinienne, nucléoles) et de la composition
chimique de son cytoplasme ; plus le noyau est lobé et le cytoplasme riche, plus le passage du
courant est freiné. Cette mesure permet de différencier des leucocytes de même volume mais de
contenus différents par leur rapport nucléo-cytoplasmique.
1.2 - Principe des détections généralement optique après focalisation
hydrodynamique
Ce principe associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977):
• Focalisation hydrodynamique: les cellules passent en file indienne devant un système de
détection ou chambre de mesure.
• Détection des signaux optiques ou physiques émis par les cellules natives ou ayant subi un
traitement préalable et coupant le faisceaux d'un laser ou d'une lampe à mercure
Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs :
- aux propriétés optique par étude de la diffusion lumineuse liés à la taille de la cellule, à sa
structure interne (estimation de la granulométrie du cytoplasme, de la forme du noyau ...)
- aux propriétés des enzymes cytoplasmique (ex: recherche d'activité peroxydasique)
- aux propriétés du noyau (densité) par mesure de la conductivité à l'aide d'un courant haute
fréquence.
• Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés,
numérisés, traités et stockés par un ordinateur.

1.2.1 - Focalisation hydrodynamique


Les cellules sont soumises à une accélération considérable et défilent dans la chambre de mesure à
raison de plusieurs milliers par seconde.

La suspension cellulaire exposée à une surpression Flux


est injectée au centre d'une veine liquide échantillon
d'entraînement (liquide de gainage de densité > à
la densité de la suspension cellulaire) circulant à Flux de gainage
de densité > densité de la suspension
une vitesse différente.
Flux de gainage

Flux échantillon
Cette suspension cellulaire passe dans la
chambre de mesure par un Flux de gainage
rétrécissement d'un micro-orifice 50 µm à
300 µm puis est éliminé dans la Javel. Chambre de mesure

B1ABM CM © 99
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 1 - Principes

1.2.2 - Détection optique

1.2.2.1 - Étude de la diffusion de la lumière


La diffusion de la lumière est la résultante de plusieurs phénomènes : diffraction, réflexion, réfraction
et absorption.
Lorsqu’une cellule traverse un faisceau lumineux (laser ou lampe) excitateur, le faisceau
lumineux incident va subir une diffusion dépendant des propriétés physiques de la cellule
(diamètre, forme du noyau, contenu cytoplasmique).
La lumière laser (monochromatique, unidirectionnelle) diffusée par une cellule est détectable par un
photodétecteur sous des angles différents.
La lumière diffusée aux grands angles (40 à 90°) résulte de
deux phénomènes physiques : la réflexion et la réfraction. Cette
mesure donne une information qui dépend de la forme, du
contenu granulaire cytoplasmique et du noyau.

La lumière diffusée aux petits angles(1 à 12°) est


proportionnelle à la taille (et non au volume) de la cellule.

Cellule La lumière absorbée permet l'estimation du


LASER volume de la cellule (supposée sphérique)

La lumière diffusée est recueillie par des détecteurs (= photodiodes) qui transforment les signaux
optiques en signaux électriques, ces derniers sont ensuite amplifiés.

Remarque : Ces mesures appliquées :


 à la numération des hématies ou des plaquettes nécessitent une sphérisation préalable des
cellules pour que la taille mesurée soit bien proportionnelle au volume cellulaire.
 à l’étude des leucocytes, permettent de séparer 3 sous populations : lymphocytes, monocytes,
granulocytes.

100 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

1.2.2.2 - Étude de la fluorescence

Les cellules peuvent émettre une fluorescence spontanée, mais le plus souvent, la fluorescence est
apportée aux cellules par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER et réemet
l’énergie absorbée par vibration et dissipation de chaleur, émission de photons d’une longueur d’onde
plus élevée

1.2.3 - Éventuels traitements préalables des cellules


La détection optique s'effectue parfois après un traitement préalable des cellules:
 Sphérisation
 Cytolyse ménagée des cellules
La membrane devient semi-perméable. Le contenu cytoplasmique est libéré. La membrane
cytoplasmique se rétracte autour du noyau et des granulations
Le volume final dépend de la taille du noyau, de sa lobularité et des granulations.
 Réaction cytochimique
Après addition d’un substrat, on peut révéler une activité enzymatique (ex : peroxydase)
cellulaire par colorimétrie. On étudie alors les cellules ayant une activité peroxydasique.
 Coloration spécifique
Une coloration des granulations éosinophiles permet la détection des PE
Une coloration au noir de chlorazol permet la coloration des noyaux, granulations et
membrane des GB
 Marquage par une molécule fluorescente (numération des réticulocytes, des lymphocytes
CD4, CD8 ...).

1.3 - Traitement du signal


Les signaux optiques émis sont séparés par des filtres, collectés par des photomultiplicateurs capables
de détectés des longueurs d'onde d'émission différentes. Ces signaux sont ensuite amplifiés, convertit
en signaux électriques, numérisés, traités et stockés.
Des analyses multiparamétriques sont alors possibles.

Le système informatique après avoir enregistré les données produites par le cytomètre affiche les
résultats sous forme d’histogramme monodimentionnel ou bidimentionnel.
Exemple d’histogramme monodimentionnel
Après lyse des cytoplasmes cellulaires, les noyaux des lymphocytes apparaissent plus petits que les monocytes,
eux-mêmes plus petits que les granulocytes.
L’application du principe du « Volume Coulter » aux leucocytes ainsi traités permet d’obtenir des
histogrammes : nombre de leucocytes en fonction du volume nucléaire.

B1ABM CM © 101
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 1 - Principes

(fL)

fig 13: Exemple d'histogramme monodimentionnel

Exemple d'histogramme bidimentionnel


L’automate utilise dans ce cas les propriétés de diffusion de la lumière (cf.§1-2-2-a).
Chaque point des nuages représente une cellule, l’ordinateur réalise le comptage de chaque cellule à
l’intérieur de chaque nuage. On obtient ainsi l’histogramme de la figure 2.

Fig.1

fig 14: Exemple d'histogramme bidimentionnel transformé en histogramme monodimentionnel

1.4 - Analyse des données

A partir des histogrammes, l’automate :


- indique le nombre de cellules analysées
- calcule différents paramètres (ex: les paramètres caractérisant la dispersion d’une distribution).

Remarque: Des « alarmes » sont générées par l’automate après comparaison de la distribution
cellulaire étudiée avec une distribution théorique considérée comme physiologique.
En fonction des pathologies rencontrées, le biologiste valide ou non ces alarmes après étude au
microscope des échantillons cellulaires analysés.

102 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

1.5 - Contrôle de la qualité des résultats

Ce contrôle s’effectue dans les conditions définies par le GBEA (Guide de bonne exécution des
analyses).Le biologiste doit vérifier quotidiennement la bonne calibration des automates pour
détecter d’éventuelles dérives des résultats. Des cartes de contrôle sont établies.
Résumé: la cytométrie de flux
Principe : Dénombrement et identification de chaque cellule au sein d'une population de cellules en
suspension, en fonction de leur taille, de son rapport nucléocytoplasmique, de sa granulométrie
cytoplasmique (éventuellement en fonction des enzymes ou de marqueurs cellulaires).

Suspension cytoplasmique
( cellules monodispersées par un flux laminaire à vitesse constante)

Système de défilement cellule par cellule(1)

Système d'illumination (2) faisceau laser + filtes


+ Système de détection (3-4-5)
Tri des cellules – optique : diffusion, absorption, émission de fluorescence
– électrique : mesure de la conductivité à l'aide d'un courant de haute
fréquence
Système d'analyse des données (informatique)

B1ABM CM © 103
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 1 - Principes

2 - Application à l’automatisation de l’hémogramme

A partir de sang total recueilli sur EDTA potassique (conservation 2 à 4h à température du laboratoire),
les automates effectuent tous :
- le dosage de l’hémoglobine
- la reconnaissance et la numération des différentes cellules sanguines.
Certains automates effectuent même la numération des réticulocytes.

Dans l’appareil, le prélévement est séparé en plusieurs fractions (au moins 2) qui sont diluées :
 l’une hémolysée : détermination des leucocytes et de l’hémoglobine
 l’autre non hémolysée : comptage des hématies et des plaquettes.

2.1 - Analyse des érythrocytes, des plaquettes et des leucocytes


2.1.1 - Numération des erythrocytes et des plaquettes
Tous les automates effectuent cette numération sur un même canal, distinct du canal de numération des
leucocytes.
Ils comptent les cellules et mesure leur volume
 soit par détection électrique (volume « Coulter »). Les hématies ou les plaquettes ne subissent
aucun traitement préalable.
 soit par détection optique (diffraction aux petits angles)
Dans ce cas, les hématies et les plaquettes doivent être rendues sphériques pour que la taille
mesurée soit proportionnelle au volume cellulaire.

Les étapes essentielles :

GR en Traitement Focalisation Système de Représentation


suspension chimique éventuel hydrodynamique mesure : graphique
-volume Coulter
-diffusion lumineuse
.....

Résultat : on obtient un histogramme monoparamétrique (ou monodimentionnel) des hématies et


des plaquettes.

104 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Exemples :

Nombre d’érythrocytes Nombre de plaquettes

Seuils de mesure : 36 à 360 fL (en général) Seuils de mesure : 2 à 20 fL

Analyse des résultats

➔ Pour les érythrocytes :


Après analyse des histogrammes, le système informatique de l’automate calcule :
– le nombre d’érythrocytes/L de sang : Erc, GB, RBC
– le volume globulaire moyen : VGM, VMC, MCV. La distribution des volumes des hématies obéit
à une courbe de Gauss, dont le pic correspond au VGM.
– l’indice de distribution des « rouges » : IDR, IDE, IDC ou CV GR. Il correspond au coefficient de
variation des globules rouges autour de la moyenne.
Cet indice apprécie l’étalement autour de la valeur moyenne : c’est un bon indice du degré
d’anisocytose.

Si IDE < 15 %, la population érythrocytaire est homogène


Si IDE > 15 %, il y a anisocytose

➔ Pour les plaquettes

Après analyse des histogrammes, le système informatique de l’automate calcule :


– le nombre de plaquettes/L de sang : Plt
– le volume plaquettaire moyen : VPM (la courbe de distribution des volumes plaquettaires doit être
log-normale).
– l’indice de distribution des plaquettes : IDP

B1ABM CM © 105
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 1 - Principes

2.1.2 - Dosage de l'hémoglobine

 Tous les automates dosent l’hémoglobine plasmatique après lyse des hématies (utilisation du
canal des leucocytes) selon la méthode de Drabkin.

 Certains automates peuvent déterminer la concentration en hémoglobine en fonction du volume


de chaque globule rouge pris individuellement.
Une nouvelle constante érythrocytaire peut être alors calculée : l’indice de Distribution de la
Concentration en Hémoglobine HDW, E.T.Hgb (en %)  information sur le degré d’anisochromie.
2.1.3 - Indices érythrocytaires ou plaquettaires calculés à partir des valeurs
expérimentales
A partir des 3 valeurs expérimentales mesurées par l’automate telles :
- Nombre d’érythrocytes/ L de sang (GR)
- Volume globulaire moyen (VGM)
- Concentration en hémoglobine du sang [Hb]
- Nombre de plaquettes/ L de sang (Plq)
- Volume plaquettaire moyen (VPM),

Le système informatique calcule :


- Teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH)
- Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)
- Hématocrite (Ht)
- Thrombocrite (THT)

Remarque: la CCMH n’est plus utilisée pour détecter une hypochromie:


- c’est un indice du bon fonctionnement de l’automate car la CCMH est calculée à partir des 3
paramètres expérimentaux mesurés par l’automate:

15
[ Hb ] g/L  x 10
CCMH  g / L= Cet indice doit être compris entre 310 et 360 g/L
GR  ery/L  x VGM  fL 

Si CCMH > 360 g/L, et si le résultat de la numération des érythrocytes est inférieure aux
valeurs de référence; il faut alors penser à la présence d'agglutinines froides.
Ces agglutinines provoquent l'agglutination des érythrocytes à température du laboratoire, la
numération des érythrocytes est alors faussée (erreur par défaut).

L'observation d'amas érythrocytaires sur frottis doit confirmer cette hypothèse.


Dans ce cas, il faut refaire la numération après incubation du sang 1h à 37°C.

106 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2.1.4 - Numération de leucocytes et établissement de la formule leucocytaire


Les étapes essentielles :
Ces analyses concernant les leucocytes nécessitent la lyse des globules rouges.

Système de Représentation
GB en Traitement Focalisation
graphique
suspension chimique éventuel hydrodynamique mesure :
-volume Coulter Histogramme mono
-diffusion lumineuse et biparamétrique
-courant haute fréquence
-absorbance .....

Un dosage de Hb est aussi réalisé en présence de réactif de Drabkin.

− Les automates les plus simples permettent d’effectuer une formule leucocytaire 3 populations ou
formule approchée, (GRA / Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par
analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules blancs, après lyse des GR, et
action différentielle d’une lyse ménagée sur les GB, lyse qui modifie leur volume.

Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur fonctionnelle, un automate de ce type
décharge l’automate principal du passage de sangs de patients sans anomalie.
Cf histogramme monodimentionnelle §1-3,
θ Les automates plus perfectionnés permettent d’effectuer une numération et d’établir une formule
leucocytaire complète.

Les différentes technologies des principaux appareils commercialisés :


Chaque société combine, sur ces automates, plusieurs technologies et donc plusieurs critères de
reconnaissance.
Exemples de quelques automates (Cf Fiche 3 : exploitation et interprétation )
Impédance + Conductivité Haute Fréquence + Diffusion lumineuse
BeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500, LH750
Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Actvité peroxydasique)
BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon H2, H3
Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulationsEo.)
HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120
Diffusion lumineuse + Cytochimie (coloration des granulations éosinophiles) + Cytolyse
Sysmex SF3000, XE2100

B1ABM CM © 107
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 2 – Pièges d'interprétation

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes automatisées – Fiche 2

Quelques pièges d'interprétation


Attention aux numérations très élevées : vérifier sur un prélèvement dilué.
Les alarmes affichées par l’automate ne correspondent pas toujours à une anomalie précise :en cas de
doute l’examen du frottis s’impose.

1 - Erreurs sur la numération des leucocytes


 Erreur par excès, due à la présence d’érythroblastes
Les cellules nucléées ne sont pas détruites par l’agent d’hémolyse, donc comptées avec les leucocytes
par la plupart des appareils (sauf l’ADVIA qui repère les cellules qui contiennent de l’hémoglobine
dans leur cytoplasme).
Donc, il faut déterminer le nombre d’érythroblastes pour 100 leucocytes sur un frottis sanguin lu au
microscope et l corriger le résultat de la numération automatique des leucocytes .
On observe des érythroblastoses notamment chez le nouveau né ou en cas d'anémie régénérative.
 Erreur par excès, due à des agrégats plaquettaires (comptés comme leucocytes) :

o sur les appareils à mesure par impédance


o mais pas sur les appareils à mesure par diffraction laser
Dans ce cas il faut recompter les leucocytes en cellule de Malassez.

2 - Erreur sur la concentration en hémoglobine


 Présence d’une opalescence du plasma (présence de chylomicrons) qui majore le taux
d’hémoglobine et la CCMH
 Présence d’un taux très élevé de leucocytes (par exemple plus de 100 G/L en cas de LMC )
peut élever faussement hémoglobine et CCMH de certains automates.

3 - Erreurs sur la numération des hématies, sur le VGM et/ou le


CCMH
 Présence d’agglutinines froides : présence d’agrégats d’hématies que les compteurs
considèrent comme des hématies de grande taille , d'où :
o Une sous estimation du nombre des hématies
o Un VGM surévalué
o Une CCMH calculée excessive.
Dans ces cas mettre le tube de prélèvement une demi heure à 37 °C puis le repasser .
Remarque : Dans ce cas l’ADVIA 120 donne une CCMH mesurée directement (CHCM) qui se
trouve alors nettement plus basse que la CCMH calculée .

108 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

4 - Erreurs sur la numération des plaquettes


 Par excès en cas de microcytose ou de présence d’hématies fragmentées (schizocytes) que
les compteurs par impédance prennent pour des plaquettes :
Dans ces cas il faut recompter les plaquettes en cellule de Malassez.
Remarque :L’ADVIA avec son comptage par diffraction laser donne généralement des résultats
exacts dans ces cas.
 Par défaut lorsqu’il y a des agrégats plaquettaires
o En cas de thrombopénie il faut toujours rechercher la présence d’agrégats sur un
frottis sanguin et recompter sur un prélèvement citraté.
o La présence d’agrégats peut être évoquée :
• sur une alarme agrégats affichée par l’automate (bien que celle ci puisse avoir
d’autres origines )
• sur l’apparition d’éléments de taille anormalement élevée sur les diagrammes
de répartition des plaquettes.

5 - Autres anomalies des hématies et /ou de l’hémoglobine


 Fausses anémies :
o Prélèvement de sang au voisinage d’une perfusion
o Perfusion massive entraînant une hémodilution
 Anémie masquée :
o Par une déshydratation (exemple du sujet âgé anémié et déshydraté)
 Anémie faussement arégénérative :
o La régénération d’une anémie n’est pas immédiate.
o Chez le sujet âgé cette régénération, peut être encore retardée
 Régénération sans anémie
o Il peut simplement s’agir d’une hémolyse chronique modérée que le malade compense
en accroissant sa production d’hématies
 Anémies complexes
o Normocytose due à la présence de 2 anomalies d’effet opposé su le VGM :
Carences combinées en fer et folates (ou vitamine B12)
o Microcytoses de causes combinées :
Carence en fer, inflammation, thalassémie hétérozygote
 Anémies ayant subi un début de traitement
o Carence en fer traitée
o Carence en folates traitée

B1ABM CM © 109
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 1 - Principes

Dans la plus part de ces cas on note :


• un indice de distribution des hématies (IDR) > 15 %
• des graphes de distribution des hématies par taille montrant 2 pics ou 2 nuages.
• parfois une élévation des réticulocytes.
 Élévation de la TGMH
Elle peut être liée à une augmentation du VGM du :
• à une carence en B12 ou folates.
• à une forte élévation des réticulocytes ( de VGM plus élevé)
• à la présence d’agglutinines froides
• à une macrocytose d’origine thérapeutique : traitements par des chimiothérapies
anticancéreuses ( notamment par des anti-foliques tels que l’Hydrea) ou d’une infection
VIH.

6 - Difficultés au niveau de la formule sanguine


(variables selon les appareils)
• absence de détection de blastes présents a taux modéré (et/ou peu différents de cellules
normales).
• absence de détection d’anomalies discrètes des lymphocytes observés dans : certains
lymphomes, leucémies à Tricholeucocytes, syndromes de Sézary, MNI.
• défauts de détection des granuleux : déficits en peroxydase congénitaux (rares) ou
acquis (secondaires à des traitements).
Il est des circonstances ou il faut effectuer une formule au microscope :
• nouveaux nés
• premier examen d’un malade avec nettes anomalies de numération
• variations brutales et inexpliquées par rapport aux NFS antérieures
• incohérences avec le contexte clinique ou thérapeutique
• alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication évidente au vu du
dossier et/ou des examens antérieurs.
• distributions de cellules inhabituelles sur les graphes.

110 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 1 – Hémogramme – Méthodes automatisées – Fiche 3

Analyses de résultats d'automates cellulaires


1 - Automate : « Coulter HmX»

1.1 - Principe
Combinaison de 3 mesures physiques simultanées :
➔ Impédance + Conductivité Haute Fréquence + Diffusion lumineuse

La visualisation des données s’effectue sur des histogrammes biparamétriques et/ou


monoparamétriques où des fenêtres de formes variables délimitent les sous-populations
cellulaires.

1.2 - Résultat
 N° Identification .................................
 Age du patient : 45 ans
 Sexe : masculin

B1ABM CM © 111
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 3 – Exercices

1.3 - Étude des histogrammes mono et biparamétriques


– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes :

Données:
Les sous populations leucocytaires sont réparties dans un espace cubique dont les coordonnées sont
le volume, la diffraction et la conductivité.
– La projection de la face DF1 donne un histogramme biparamétrique (Volume
Coulter/Diffraction).
– La projection de la face DF2 donne un autre histogramme (Volume Coulter/Conductivité) où
sont visibles les PB.

Indiquer précisément les grandeurs des abscisses de DF1, DF2 et DF3

Attribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

L’analyse des histogrammes permet de connaître les pourcentages et le nombre absolu des
différents types de leucocytes.

1.4 - Interprétation des résultats


Compléter le tableau ci-dessous et interpréter :
Unités Valeurs du patient Intervalles Interprétation
de référence
Erythrocytes T/L
Hb g/L
Ht L/L
VGM fL
TGMH pg
CGMH g/L
IDR %
Leucocytes G/L
PN G/L
PE G/L
PB G/L
L G/L
M G/L

Thrombocytes G/L

Rq. Des « alarmes » signalent la présence éventuelle de cellules anormales, nécessitant l’établissement
de la formule leucocytaire au microscope

112 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

2 - Automate : « Technicon ou Advia»

2.1 - Principe
Combinaison d’analyses chimiques et physiques dont certaines nécessitent des traitements préalables :
– Analyses cytochimiques : Etude des cellules par diffraction laser (petits angles) et étude de
l’activité peroxydasique des cellules.
– Analyse morphométrique : Etude de la diffraction aux grands angles après lyse sélective des
membranes des Mo, Ly, Ne et Eo.

→ Diffusion lumineuse + Cytolyse + Cytochimie (activité peroxydasique)

2.2 - Résultat
 N° Identification........................
 Age du patient :23 ans
 Sexe : femme

B1ABM CM © 113
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 3 – Exercices

2.3 - Étude des histogrammes mono et biparamétriques


– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogramme concentration de Hb dans les hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes,
Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes :

Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axes

Attribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

Données :
– analyse cytochimique : scattergramme biparamétrique : Diffusion aux petits angles/Activité
peroxydasique
– Analyse morphométrique : Histogramme biparamétrique (Diffusion aux petits angles/Diffusion
aux grands angles).

2.4 - Interprétation des résultats


Compléter le tableau ci-dessous et interpréter.
Unités Valeurs du patient Intervalles de Interprétation
référence
Érythrocytes T/L
Hb g/L
Ht L/L
VGM fL
TGMH pg
CGMH g/L
IDR %
Leucocytes G/L
PN G/L
PE G/L
PB G/L
L G/L
M G/L

Thrombocytes G/L

114 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3 - Automate : « Sysmex»

3.1 - Principe
➔ Diffusion lumineuse + fluorescence des acides ribonucléiques cellulaires) + Cytolyse
des cellules matures (pour l'analyse des cellules immatures) + impédance

3.2 - Résultat cas 1


3.2.1 - Contexte clinique
 N° Identification..................................
 Age du patient : 39 ans
Sexe : feminin
Consultation pour asthénie chronique (depuis plusieurs mois, voire une année)
Signes non spécifiques d’anémie : pleur, essoufflement, tachycardie, polypnée.

Le scattergramme correspond à l'étude de la fluorescence (noyau) en fonction de la diffraction SSC)

Histogramme GR (à droite) et histogramme PLT par impédance (à gauche)

B1ABM CM © 115
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 3 – Exercices

3.2.2 - Étude des histogrammes mono et biparamétriques

– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.
– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes:


Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axes
Attribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

– Etude du frottis coloré au MGG

La formule leucocytaire retrouve un nombre de neutrophiles bas (45 % ) et un nombre de lymphocytes


également diminué (46 % ) ; absence de cellules anormales

116 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3.2.3 - Interprétation des résultats

Compléter le tableau ci-dessous à l'aide des données précédantes et interpréter.

Unités Valeurs du patient Intervalles de Interprétation


référence
Erythrocytes T/L
Hb g/L
Ht L/L
VGM fL
TGMH pg
CGMH g/L
IDR %
Leucocytes G/L
PN G/L
PE G/L
PB G/L
L G/L
M G/L

Thrombocytes G/L

3.3 - Résultat cas 2


3.3.1 - Contexte clinique
 N° Identification..................................
 Age du patient : 5 ans
Sexe : masculin
Consultation au service des urgences : toux, hyperthermie (infection bronchopulmonaire)

B1ABM CM © 117
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 3 – Exercices

3.3.2 - Étude des histogrammes mono et biparamétriques

– Histogramme des hématies : à l'aide des valeurs du tableau ci-dessus, tracer l'allure de
l'histogramme et l'interpréter.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes:


Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axes
Attribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse.

3.3.3 - interprétation des résultats


Compléter le tableau ci-dessous à l'aide des données précédantes et interpréter.

Unités Valeurs du patient Intervalles de Interprétation


référence
Erythrocytes T/L
Hb g/L
Ht L/L
VGM fL
TGMH pg
CGMH g/L
IDR %
Leucocytes G/L
PN G/L
PE G/L
PB G/L
L G/L
M G/L

Thrombocytes G/L

118 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

4 - Automate : « Horiba ABX»

4.1 - Principe
➔ Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulations éosinophiles.)

4.2 - Résultat
 N° Identification 521432
 Age du patient : 40 ans
 Sexe : femme

4.3 - Étude des histogrammes mono et biparamétriques


– Histogramme des hématies : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.
– Histogramme des plaquettes : Indiquer les grandeurs sur les axes, Interpréter cet histogramme.

– Histogrammes biparamétriques ou scattergrammes des leucocytes:


Indiquer précisément les grandeurs des grandeurs sur les axes
Attribuer à chaque nuage de points une catégorie de leucocytes. Justifier votre réponse

B1ABM CM © 119
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 3 – Exercices

4.4 - Interprétation des résultats


Compléter le tableau de résultats suivant, et interpréter

Unités Valeurs du patient Intervalles de Interprétation


référence
Érythrocytes T/L
Hb g/L
Ht L/L
VGM fL
TGMH pg
CGMH g/L
IDR %
Leucocytes G/L
PN G/L
PE G/L
PB G/L
L G/L
M G/L

Thrombocytes G/L

4.5 - Étude de 2 scattergrammes

Les figures 1a et 1b sont des scattergrammes correspondant à deux patients adultes M. A et M.B.

Comparer ces deux figures au scattergramme précédent. Interpréter.

120 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

5 - Abréviations

Indiquer les abréviations rencontrées pour :

Érythrocytes

Hémoglobine

Hématocrite

Volume globulaire moyen

Teneur globulaire moyenne en


hémoglobine

Concentration globulaire moyenne en


hémoglobine
Indice de distribution des volumes
érythrocytaires
Leucocytes

Polynucléaires neutrophiles

Polynucléaires éosinophiles

Polynucléaires basophiles

Lymphocytes

Monocytes

Plaquettes

Thrombocrite

Volume plaquettaire moyen

Indice de distribution des volumes


plaquettaires

B1ABM CM © 121
Chapitre 1 – Hémogramme automatisé – fiche 3 – Exercices

122 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

- Chapitre 2 -
Le myélogramme
Généralités
Réaliser un myélogramme consiste à une étudier les cellules d'un frottis médullaire obtenu par
aspiration ou par ponction.

1 - Prélèvement
La moelle osseuse est obtenue par ponction ou aspiration (sternale ou iliaque) chez l'adulte à l'aide d'un
trocard. (Cf. module 1 - enseignement théorique- Étude de la moelle osseuse).
Réalisation de frottis médullaire :
Le prélèvement obtenu est ensuite étalé sur une lame de verre, :
– soit en écrasant les grains médullaires. Ce type d'étalement permet d'avoir une bonne idée de la
richesse cellulaire
– soit en étalant le sang médullaire comme le sang périphérique.
Les cellules médullaires sont ensuite fixées, colorées (MGG) puis observées au microscope.

Remarque : l'étude de biopsie ostéomédullaire nécessite la réalisation de coupe histologique : (cf


livret 5 – anatomopathologie).
La « carotte » ostéo-médullaire prélevée est décalcifiée, puis incluse dans la paraffine. Les coupes très fines réalisées par un
microtome sont déposées sur une lame de verre, déparaffinées puis colorées.

2 - Indication
L'indication de cet examen , se pose toujours au vu des résultats d'un hémogramme préalable anormal :
- anémie normo-macrocytaire arégénérative
- d'une thrombopénie inexpliquée
- de signes d'insuffisance médullaire (neutropénie, érythropénie, thrombopénie)
- d'une suspicion d'hémopathie maligne...

3 - But et lecture
But : étude cytologique quantitative et qualitative des frottis médullaires .
A la différence d'une formule leucocytaire, les résultats quantitatifs d'un myélogramme ne
peuvent être donnés qu'en pourcentage des populations cellulaires.

La lecture du myélogramme comporte trois temps successifs, tous trois indispensables:


À faible grossissement: À fort grossissement:
2) appréciation cytologique générale (aspect qualitatif)
1) appréciation générale des

B1ABM CM © 123
Chapitre 2 – Myélogramme – Généralités

frottis 3) décompte des éléments cellulaires (aspect quantitatif)

3.1 - Appréciation générale du frottis (grossissement x 100)


Toujours débuter par un examen au petit objectif,.
3.1.1 - Richesse en cellules médullaires
L'appréciation de la densité cellulaire est indispensable.
Ainsi, un taux anormal de 50 % de lymphocytes peut être interprété différemment :
– si la moelle est riche, ce pourcentage élevé suggère une infiltration lymphocytaire (ex: leucémie lymphoïde
chronique)
– si la moelle est pauvre, ce même pourcentage reflète une diminution des autres lignées et signe une aplasie
médullaire.
3.1.2 - Aspect du frottis
Dans une moelle normale, toutes les cellules sont morphologiquement différentes, leur aspect est donc
hétérogène.
Dans une moelle envahie (par exemple leucémie aiguë), les cellules peuvent être toutes identiques,
l'aspect des cellules est homogène, monotone.
3.1.3 - Richesse et aspect des mégacaryocytes
Les mégacaryocytes, sont faciles à repérer grâce à leur grande taille. Leur nombre est apprécié sur
l'ensemble du frottis.
3.1.4 - Recherche de cellules normales ou non autres que les mégacaryocytes
Exemples :
• Ostéoblastes (surtout pour les moelles des petits enfants), ostéoclastes, macrophages et
mastocytes.
• Cellules tumorales

3.1.5 - Recherche de zones favorables à observation à fort grossissement


Bien rechercher les régions du frottis où les cellules sont convenablement étalées, avec peu de cellules
éclatées (dans les régions trop épaisses les hématies sont superposées et les cellules rétractées sont
méconnaissables ou difficiles à identifier).

3.2 - Appréciation cytologique générale (aspect qualitatif)


Cette étude s'effectue à fort grossissement (x1000)
➢ En premier lieu, on recherche les cellules matures, que l'on connaît bien : les polynucléaires
neutrophiles et les lymphocytes.
➢ Puis on regarde les éléments immatures de la lignée granulocytaire, en recherchant les critères
qui identifient chaque stade (noyau, cytoplasme, granulations...).
➢ On étudie ensuite la lignée érythroblastique (noyaux ronds à l'état normal).
➢ Enfin on regarde les cellules moins fréquentes (monocytes, blastes).

Ceci permet de constater s'il existe ou non des anomalies morphologiques (défaut de granulations,
mégaloblastose...), appelées "anomalies qualitatives". Ce n'est qu'après cette étape que commence le
décompte: par comparaison aux valeurs normales, on définit les variations "quantitatives".

3.3 - Étude quantitative


On réalise autant que possible le décompte des cellules dans des régions bien étalées, repérées lors de
l'examen au faible grossissement: idéalement derrière les grumeaux de moelle.

124 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

3.3.1 - Cellules à compter


On compte habituellement tous les éléments nucléés du frottis que l'on observe,
sauf:
• les mégacaryocytes (appréciation au faible grossissement)
• les quelques cellules en mitoses (si nombre élevé : le mentionner en commentaire).
• les cellules éclatées et les éléments suffisamment altérés pour que leur identification en soit
rendue incertaine.
• les cellules rares, qu'elles soient normales (fibrocytes, cellules adipeuses, ostéoblastes,
ostéoclastes), ou pathologiques (métastases).

3.3.2 - Nombre de cellules à compter


Idéalement, il faudrait compter au moins 500 cellules, en plusieurs régions de la lame, et si possible
sur plusieurs lames (100 cellules par lame).
Par contre, il est important de compter beaucoup plus d'éléments et de répéter les comptes (plusieurs régions
différentes, plusieurs frottis) lorsqu'une augmentation du pourcentage d'une catégorie de cellules est constatée avec
des conséquences diagnostiques importantes: par exemple excès de blastes, de plasmocytes, de lymphocytes...

B1ABM CM © 125
Chapitre 2 – Myélogramme – Généralités

Fiches techniques

Myélogramme

Fiche 1 : Étude cytologique – Caractéristiques des cellules jeunes et des cellules sénescentes.
Fiche 2 : Morphologie des précurseurs érythocytaires
Fiche 3 : Morphologie des précurseurs granulocytaires neutrophiles
Fiche 4 : Morphologie des précurseurs granulocytaires éosinophiles et basophiles
Fiche 5 : Morphologie des précurseurs mégacaryocytaires
Fiche 6 : Exemple d'une fiche de résultats et intervalles de références

126 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 2 – Myélogramme – Fiche 1

Étude cytologique d'un frottis médullaire

1 - Observation à l’objectif x 10
Cette observation permet d'apprécier la qualité de la coloration, d'avoir une idée générale du frottis....
et permet , lors d'une étude d'un frottis médullaire, de choisir des zones où les cellules sont bien
étalées.

2 - Observation à l’objectif x 100 (immersion)

Les questions à toujours se poser :

Aspect général de la cellule :

• Taille (estimation par rapport aux hématies)


• Forme (ronde, ovalaire ou déformée)
• Contour (bien délimité, flou)

Étude du noyau :

• Taille (évaluation du rapport N/C)


• Forme (lobée ou non, arrondie, ovalaire, encochée, en drapeau…)
• Aspect de la chromatine (densité et texture : condensée, pâteuse, lâche, fine, nuageuse….)
• Présence ou non de nucléoles

Étude du cytoplasme :

• Affinité (acidophile, basophilie ou polychromatophilie)


• Granulations (nombre, taille, répartition, aspect et affinité  éosinophile, basophile, azuro-
phile, neutrophile)
• Présence ou non de vacuoles……..

B1ABM CM © 127
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 1 – Étude cytologique d'un frottis médullaire

Caractéristiques des cellules jeunes


Aspect général de la cellule :
• taille : assez grande (> 15 µm)
• forme arrondie ou ovalaire ou ...
• rapport N/C élevé

Étude du noyau :
• noyau arrondi ou ovalaire (jamais lobé)
• chromatine lâche, fine, violacée avec des nucléoles
fig 15: Cellule médullaire
Étude du cytoplasme : jeune, non différenciée
• cytoplasme basophile – bleu- (pas ou très peu de granulations) (coloration MGG)

Mort cellulaire
Les cellules peuvent :
– se nécroser.
La nécrose est une mort cellulaire accidentelle qui survient
généralement lors d'un dommage tissulaire. La cellule enfle, la
membrane cellulaire éclate déversant le contenu cytoplasmique dans
le milieu environnant et provoquant l'inflammation.
Il reste un noyau nu, dont la chromatine s'étale.
Les mitochondries et le noyau restent intacts tout au long de ce
processus.
fig 16: Nécrose
cellulaire (coloration
– se lyser par apoptose. MGG)
L'apoptose ou mort cellulaire programmée est une forme
physiologique de mort cellulaire hautement régulée, elle est
nécessaire à la survie des organismes multicellulaires.
Les cellules d'organismes multicellulaires s'autodétruisent lorsque
celles-ci ne sont plus utiles, lorsqu'elles sont endommagées ou
lorsqu'elles sont dysfonctionnelles. L'apoptose implique
habituellement des cellules individuelles dans un tissu et ne
provoque pas d'inflammation.
Le noyau devient picnotique, se casse en plusieurs fragments.
fig 17: Apoptose d'un
lymphocyte
(coloration MGG)

128 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 2 – Myélogramme – Fiche 2

L ignée érythrocytaire normale


Les précurseurs

Ces précurseurs proviennent de la différenciation des progéniteurs CFU-E et BFU-E.


Cette lignée se caractérise par l'absence de toute granulations, les cellules sont
généralement arrondies, le noyau rond et en position centrale, sauf pour l'érythroblaste acidophile.

1 - Proérythroblaste
Grosse cellule arrondie de 20 à 25 µm

Noyau :
- volumineux (N/C : 8/10),
- rond et en position centrale
- chromatine en fin réseau (non condensée), rouge
violacée
- 1 ou 2 nucléoles, pas toujours visibles (zone plus claire,
arrondie ou ovalaire)
Cytoplasme
- mince couronne très basophile (bleu foncé) car très
riche en ribosomes
- présence fréquente d'une zone plus claire autour du
noyau
-coloration non homogène du cytoplasme
-parfois une ou deux petites expansion cytoplasmique.

2 - Érythroblastes basophiles I et II

Cellules arrondies : 16 à 20 µm pour le type I


12 à 14 µm pour le type II
Noyau :
- assez volumineux
- rond et en position centrale
- chromatine légèrement condensée: petites mottes
violacées (1 à 2 µm) donnant au noyau un aspect de mûre
ou de rayons de roue
- les nucléoles ne sont plus visibles.
Cytoplasme
- plus étendu que le proérythroblaste
- plus ou moins fortement basophile selon le degré de
maturation de la cellule : bleu foncé pour le type I,
bleu cendré pour le type II
- présence fréquente d'une zone plus claire autour du
noyau.

B1ABM CM © 129
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 2 – Lignée érythroblastique

3 - Érythroblaste polychromatophile

Cellule arrondie : 8 à 12 µm
1
Noyau :
- rond, en position centrale et occupant la moitié de la
cellule
- chromatine bien condensée en assez grosses mottes
violet foncé (1 à 2 µm) (en rayons de roue)

Cytoplasme
- il contient des ribosomes qui fixent le colorant basique
bleu, mais aussi de l'hémoglobine qui fixe l'éosine orange
: le cytoplasme prend alors une teinte
polychromatophile, mauve, plus ou moins bleue ou rose
selon le degré de maturation de la cellule.

4 - Érythroblaste acidophile

Petite cellule arrondie : 8 à 10 µm


1
Noyau :
- rond, peu volumineux
- très souvent excentré car prêt à être expulsé

- chromatine très condensée : au début quelques masses


chromatiniennes sont encore visibles, puis les masses
fusionnent et la chromatine devient picnotique, violet
noir en tache d'encre.

Cytoplasme
- acidophile: beige rosé, souvent un peu plus gris que les
hématies car il contient en plus de l'accumulation de
l'hémoglobine encore quelques ribosomes.

5 - Réticulocytes

Cellules anucléées, possédant encore des mitochondries et


des ribosomes.
A la coloration de May Grünwald-Giemsa, ils
apparaissent polychromatophiles, mais il est souvent
difficile de les distinguer d'hématies matures.

130 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Proérythroblaste

Érythroblastes basophiles

Érythroblastes polychromatophiles Érythroblaste acidophile


fig 18: Précurseurs érythroblastiques - G x 1000 - coloration MGG

B1ABM CM © 131
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 2 – Lignée érythroblastique

Attention : ne pas confondre érythroblastes basophiles, lymphocytes et


plasmocytes

Érythroblaste basophile

Lymphocyte Plasmocyte

132 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 2 – Myélogramme – Fiche 3

L ignée granulocytaire neutrophile normale


Les précurseurs

Ces précurseurs proviennent de la différenciation du progéniteur CFU-GM.

1 - Myéloblaste neutrophile

Cellule arrondie ou ovalaire de 15 à 20 µm

Noyau :
- très volumineux (N/C > 8/10),
- plus ou moins ovalaire et rarement centrale
- chromatine en fin réseau rougeâtre
- présence constance de nucléoles (1 à 5) bien nets.
Cytoplasme
- peu étendu
- basophile (bleu vif) car riche en ribosomes
- absence de zone plus claire (Golgi peu important)
-quelques granulations azurophiles rouge violacé,
souvant localisées dans une zone.

2 - Promyélocyte neutrophile

Cellule arrondie ou ovalaire de 20 à 30 µm

Noyau :
- volumineux (N/C > 1/2),
- souvent excentré
- ovalaire : la face interne est aplatie ou légèrement
concave
- chromatine lâche mais un peu plus condensée que dans
le myéloblaste
- présence facultative de nucléoles (1 à 2) .
Cytoplasme
- basophile
- granulations azurophiles grosses et nombreuses
- présence d'un archoplasme : zone incolore proche du
noyau (appareil de Golgi).

B1ABM CM © 133
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 3 – Lignée granuleuse neutrophile

3 - Myélocyte neutrophile
Cellule arrondie ou ovalaire de 15 à 20 µm

Noyau :
- moins volumineux (N/C = 1/2),
- excentré
- en forme de haricot
- chromatine plus condensée que dans le promyélocyte
- les nucléoles disparaissent.
Cytoplasme
- devient incolore
- granulations azurophiles peu nombreuses et
nombreuses granulations neutrophiles, fines, beige à
violacé.

4 - Métamyélocyte neutrophile
Cellule arrondie de 15 µm

Noyau :
- peu volumineux (N/C < 1/2),
- nettement incurvé en U, parfois en S
- chromatine condensée
Cytoplasme
- aspect identique au polynucléaire neutrophile :
incolore avec de nombreuses granulations
neutrophiles.

5 - Granulocyte neutrophile à noyau non segmenté

6 - Granulocyte neutrophile à noyau segmenté

134 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Myéloblaste Promyé locyte ne utrophile

Myélocytes neutrophiles

Métamyélocyte neutrophile - Polynucléaire neutrophile


fig 19: Précurseurs granuleux neutrophiles - G x 1000 - Coloration MGG

B1ABM CM © 135
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 3 – Lignée granuleuse neutrophile

Attention : ne pas confondre myélocyte neutrophile et lymphocyte granuleux.

fig 20: Myélocyte neutrophile fig 21: Lymphocyte granuleux

136 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 2 – Myélogramme – Fiche 4

L ignée granulocytaire éosinophile normale


Les précurseurs
Ces précurseurs proviennent de la différenciation du progéniteur CFU-Eo.

1 - Myéloblaste éosinophile
Exceptionnel
Aspect très proche du myéloblaste neutrophile; il est
identifiable par ses granulations azurophiles plus
volumineuse.

2 - Promyélocyte éosinophile
Très rare
Présence de grosses granulations qui remplissent le
cytoplasme et masquent plus moins le noyau.
Selon le degré de maturation, ces granulations peuvent avoir
des affinités tinctoriales différentes : les plus immatures sont
azurophiles (rouge foncé), puis elles deviennent bleu foncé,
puis orangé (éosinophiles) à maturité. Les trois stades sont
présents simultanément.

3 - Myélocyte éosinophile
Cellule arrondie
Noyau : identique à celui du myélocyte neutrophile ou plus
rond.
Cytoplasme:
granulations spécifiques :
- bleues si elles sont immatures
- orangées si elles sont mûres
Il peut y avoir des granulations de teinte intermédiaire (vert
bronze).

4 - Métamyélocyte éosinophile
- Noyau incurvé en U, , non lobé
- Granulations spécifiques orangées.

5 - Granulocyte éosinophile
- Noyau incurvé en U, , non lobé
- Granulations spécifiques orangées.

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 4 – Lignée granuleuse éosinophile et basophile

Myélocytes éosinophiles

Métamyélocytes éosinophiles

Polynucléaire éosinophile
fig 22: Précurseurs granuleux éosinophiles - G x 1000 - coloration MGG

138 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

L ignée granulocytaire basophile normale


Les précurseurs

Les polynucléaires semblent avoir une voie de différenciation commune avec les mastocytes à
partir d'un progéniteur : CFU-Masto.

Les précurseurs des polynucléaires basophiles sont très rares dans la moelle osseuse. Ils sont
identifiables grâce à leurs granulations basophiles métachromatiques, violet foncé, analogues à celles
des polynucléaires basophiles du sang.

fig 23: Précurseurs de granuleux basophiles- G x 1000 – Coloration MGG

B1ABM CM © 139
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 4 – Lignée granuleuse éosinophile et basophile

A vous de jouer !
Identifier les cellules médullaires colorées par la technique de MGG et photographiées sur
le champ microscopique ci-dessous.

fig 24: Observation de cellules sur un frottis médullaire coloré par la technique
de MGG

140 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 2 – Myélogramme – Fiche 5

L ignée mégacaryocytaire normale


Les précurseurs
Les précurseurs de cette lignée sont peu nombreux (1 à 10 pour 1000 cellules nucléées), soit
10 à 100 par frottis médullaire.
Ils sont facilement repérables à faible grossissement (X100) grâce à leur grande taille.

1 - Mégacaryoblaste
Cellule très rare de 30 à 40 µm selon le degré de
polyploïdie

Noyau :
- volumineux (N/C > élevé),
- ovalaire parfois déjà binucléé
- légère, nucléolée, grossière et filamenteuse

Cytoplasme
- très basophile , présente des languette cytoplasmique
- aucune granulation.

2 - Mégacaryocyte basophile

Cellule de grande taille : 30 à 100 µm selon le degré de


polyploïdie

Noyau :
- forme irrégulière, plus ou moins lobulé
- chromatine se condensant
- pas de nucléole visible
Cytoplasme
- abondant
- basophile
- quelques granulations azurophiles regroupées vers les
centrioles.

B1ABM CM © 141
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 5 – Lignée mégacaryocytaire

3 - Mégacaryocyte granuleux

Stade le plus fréquent dans la moelle osseuse

Cellule de très grande taille : 40 à 100 µm selon le degré


de polyploïdie

Noyau :
- rapport N/C : faible
- forme irrégulière, de grands lobes irréguliers
- chromatine de plus en plus condensée

Cytoplasme
- abondant
- perd sa basophilie
- nombreuses granulations azurophiles, rouge violacé,
réparties régulièrement dans tout le cytoplasme.

4 - Mégacaryocyte thrombocytogène

Cellule de très grande taille : 40 à 100 µm selon le degré


de polyploïdie

Noyau :
- forme irrégulière
- chromatine très condensée, devenant picnotique

Cytoplasme
- les granulations azurophiles se regroupent en paquets
de 10 ou 12 dans tout ou une partie du cytoplasme.

Remarque :
Observation fréquente
– de noyaux nus liée au mode de formation des plaquettes
– de fragments cytoplasmiques car les mégacaryocytes thrombocytogènes sont très
fragiles.

142 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Mégacaryoblaste Mégacaryocyte basophile

Mégacaryocyte granuleux

Mégacaryocytes thrombocytogènes

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 5 – Lignée mégacaryocytaire

fig 25: Observation des mégacaryocytes à faible grossissement sur un


frottis médullaire coloré au MGG

144 CM © B1ABM
Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Chapitre 2 – Myélogramme – Fiche 6

F iche de résultats d'un myélogramme


Intervalles de référence
Référence du frottis médullaire:………………………
Âge du patient..........................
Lieu de ponction..........................................
INTERVALLES DE
LIGNÉES ET CELLULES STADES RÉFÉRENCE RÉSULTATS
non identifiées en pratique
CELLULES SOUCHES

GRANULOCYTAIRE 50 à 70 % ……………
NEUTROPHILE
- Myéloblaste 0,1 à 3,5 …………
- Promyélocyte N 0,5 à 5 …………
- Myélocyte N 5 à 20 …………
- Métamyélocyte N 10 à 30 …………
- P.N. 7 à 25 ………...

GRANULOCYTAIRE
ÉOSINOPHILE
1à3% ……………

GRANULOCYTAIRE
BASOPHILE
0,1 à 1 % ……………

ÉRYTHROCYTAIRE 8 à 30 % .............

- Proérythroblaste 0à2% ...........


- E. basophile 2à4% ...........
- E. polychromatophile 3à8% ...........
- E. acidophile 3 à 16 % ...........

LYMPHOCYTAIRE <20 % adulte


- LYMPHOCYTES : <50 % enfant ……………

- PLASMOCYTES : 0à3% ……………

MONOCYTAIRE <à3% ……………

10 à 100 cellules
THROMBOCYTAIRE par frottis
soit 0,03 à 0,3 %

B1ABM CM © 145
Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 6 – Fiche de résultats

Compte rendu
Rendre les résultats comme suit :

1 - Lieu de ponction
Indiquer le lieu de ponction et noter aussi les incidents éventuels lors de la ponction et la dureté de l'os.
La dureté de l'os apporte parfois un argument diagnostique majeur (os mous des myélomes, très durs
des splénomégalies myéloïdes, des mastocytoses, etc...).
Observer les grains ou grumeaux médullaires.

2 - Richesse et aspect du frottis (faible grossissement)


a- Richesse cellulaire
Exemples :
désertique, très pauvre (le frottis ressemble à un frottis de sang normal : entre 1 à 10 cellules/
champs)
hypoplasique (nombre de cellules par champs est plutôt faible : entre 10 à 30)
normal, les cellules sont relativement espacées (entre 30 à 60 cellules /champs)
hyperplasique, les cellules sont collées les unes aux autres (> 60 cellules/champs).
b- Aspect du frottis
Exemples :
L’aspect du frottis est normal, hétérogène.
L’aspect du frottis est homogène, monotone (cas des leucémies aiguës)
Présence ou non de placards cellulaires (souvent cellules métastasiques).

3 - Étude cytologique
a- Richesse et aspect des mégacaryocytes (étude à faible grossissement)
- Nombre des mégacaryocytes : ……………
. ce nombre est normal (si 10 à 100 cellules/frottis)
. ce nombre est diminué (si < 10 cellules /frottis)
. ce nombre est augmenté (présence de MK sur tous ou presque les champs).
- Aspect des mégacaryocytes :
. leur aspect semble normal ou …………..
. la pyramide de maturation semble respectée ou non…..
b – Étude cytologique à fort grossissement
 Étude qualitative
Il faut pouvoir d’emblée, avant même l’étude du myélogramme, distinguer une moelle :
- normale
- érythroblastique
- mégaloblastique
- lymphocytaire
- granulocytaire ou granulopénique…
Attention : Les commentaires dépendent aussi des résultats de l’hémogramme toujours fait AVANT
le myélogramme.

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Module 1 – Cytologie sanguine et médullaire Activités technologiques

Exemples de commentaires :
- très nombreuses cellules mégaloblastiques, aspect de « moelle bleue »
- ou nombreuses cellules en mitose, présence de cellules anormales (à préciser…ex : discordance de
maturation nucléaire et cytoplasmique des érythroblastes, présence de nombreux corps de Jolly …)

 Étude quantitative (fort grossissement)

lignée érythroblastique :
richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence)
aspect normal ou …..
pyramide de maturation respectée ou …….

lignée granulocytaire
richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence)
aspect normal ou …..
pyramide de maturation respectée ou …….

lignée lymphocytaire et plasmocytaire


richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence)
aspect normal ou …..

lignée monocytaire
richesse (pourcentage à comparer aux intervalles de référence)
aspect normal ou …..

Conclusion générale :
Exemples :
- Le frottis de moelle osseuse ne présente pas d’anomalie qualitative et quantitative
significative.
ou
- Le frottis présente des anomalies de répartition de cellules cytologiquement
anormales : à préciser ……..
ou
- Le frottis présente des anomalies cytologiques : à préciser…..
Ces anomalies associées aux résultats de l’hémogramme réalisé auparavant, évoquent ………
(préciser la pathologie).

Proposer éventuellement des examens supplémentaires pour orienter ou préciser le


diagnostic.

Le myélogramme doit confirmer ou infirmer les résultats de l’hémogramme


et jamais l’inverse.

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Chapitre 2 – Myélogramme – fiche 6 – Fiche de résultats

Annexe : l'hématopoïèse

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