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MCBT6U08 – Synthèse chimie et activité protéique

Synthèse du S2d 
Hydrolyse de la fonction ester

GANTOIS Tommy
MARQUEZ Génésis
Introduction | Contexte

Enzymes responsables de la
formation de la paroi bactérienne

substrat1 des DD-transpeptidases


N-benzoyl-D-Ala-thio-glycolate
S2d

Cibles des antibiotiques β-lactame -lactame

Étude des voies catalytiques

1 Llinás, A., Ahmed, N., Cordaro, M., Laws, A., Frère, J.-M., Delmarcelle, M. (2005). Inactivation of Bacterial DD-Peptidase by β-lactame -Sultams.
Biochemistry, 44(21), 7738–7746. doi:10.1021/bi050110o 1
Introduction | But 
N-benzoyl-D-alanine

Alanine Chlorure de benzoyle

N-benzoyl-D-Ala-thio-glycolate d’éthyle Thioglycolate d'éthyle

3 Lipase

Légende :
1. Protection d’amine par benzoyle.
2. Couplage entre un acide et un thiol.
3. Hydrolyse de la fonction ester.
S2d 2
Méthodologie | Étape d’hydrolyse

Hydrolase spécifique des esters


carboxyliques (EC 3.1.1) :

R-O-R' + H2O ⇌ R-OH + R'-OH R-OH + R'-OH

Lipase

Conditions nécessaires2 :

pH ~7

35° C

Salinité

2 Fickers, P., Destain, J., Thonart, P. (2008). Les lipases sont des hydrolases atypiques : principales caractéristiques et applications.
Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement, 12(2), 119-130. 3
Méthodologie | Étape d’extraction
Protonation Filtration Extraction liquide-liquide

Extraction optimale :
pKa3 ~ 4
pH < pKa - 2

À pH ~ 7 (tampon phosphate)

Ajout d’un acide de


Brønsted (HCl)

3 Llinás, A., Ahmed, N., Cordaro, M., Laws, A., Frère, J.-M., Delmarcelle, M. (2005). Inactivation of Bacterial DD-Peptidase by β-lactame -Sultams.
Biochemistry, 44(21), 7738–7746. doi:10.1021/bi050110o 4
Méthodologie | Étape d’extraction
Protonation Filtration Extraction liquide-liquide

Enzyme en support
solide

Retenue sur le filtre


avec les impuretés
insolubles

S2d protoné et
autres composés
solubles

5
Méthodologie | Étape d’extraction
Protonation Filtration Extraction liquide-liquide

Acétate d’éthyle Sélection du solvant organique4

Polarité Volatilité Sélectivité Densité

Dépend du Hotte Dépend de Moins


composé à disponible la gamme dense que
extraire d’analytes la phase
aqueuse

Le S2d est récupéré dans la phase organique

4 Wells, D. (2003). High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Elsevier, 307-326. doi:10.1016/s1464-3456(03)80011-x.
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Méthodologie | Étape de vérification

En silice

Migration selon
affinité

Cyclohexane et
acétate d’éthyle
(6/4)

La migration des composés apolaires est plus importante que celle des
composés polaires
7
Résultats

Masse théorique de S2d

453,90 mg

Masse expérimentale de S2d


R MR CS
418,05 mg Représentation schématique
de la plaque de CCM après
révélation

R : réactif de départ


Rendement (ρ) = 92% ) = 92%
MR : milieu réactionnel

CS : co-spot

Rf = 0,20

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Discussion

Problématique Solutions
possibles

Présence du composé Modification de


de départ dans le l’activité enzymatique5
milieu réactionnel 

R MR CS Présence d’impuretés Étape de purification

Représentation schématique

( )
de la plaque de CCM après
révélation 2
Le rendement est 25 mL
R : réactif de départ
donné avec des ρ) = 92% = 1 - = 99%
MR : milieu réactionnel impuretés (16 x 20 mL)+25 mL

CS : co-spot

5 Sarda, L., Marchis-Mouren, G., Constantin, M., Desnuelle, P. (1957). Sur Quelques Essais De Purification De La Lipase Pancréatique.
Biochimica Et Biophysica Acta, vol 23, pp. 264-274. Elsevier BV, doi:10.1016/0006-3002(57)90328-1. 9
Conclusions

1. Changer les conditions de l’hydrolyse peut modifier l’activité


enzymatique.

2. La filtration sous vide n’est pas suffisante pour éliminer les


contaminations.

3. Le solvant utilisé lors de l’extraction peut entraîner avec lui


des impuretés de nature polaire.

4. L’augmentation du rendement lié au nombre d’extractions


nécessite aussi des manipulations correctes.

5. Enfin, il est nécessaire de prévoir une étape de purification (e.


g. chromatographie de partage6).

10
6 Coskun, O. (2016). Separation Tecniques: Chromatography. Northern Clinics Of Istanbul. doi:10.14744/nci.2016.32757.