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Code : G.

MO-029
MODE OPERATOIRE
Date de création : 04/12/2009
Date de révision : 16/01/2013
PCR quantitative 16S bactéries
Plateforme GenoSol Version :2 Page : 1 / 6

PCR quantitative 16S bactéries

Version Date Modificateur Descriptif

0 04/12/2009 M. Lelievre Création du document


Changement de référence du mix SybrGreen
1 05/07/2011 M. Lelievre
ABgene → Applied master mix
MAJ complete : mise en page, en tête, plan,
2 24/10/2012 M. Lelievre
changement appareil et harmonisation du texte
Ajout détails sur le lieu de manipulation sur tout
le document (hotte ou paillasse)
3- Ajout lieu de manipulation du SybrGreen
2 16/01/2013 C. Bard
5- Ajout du lieu de stockage des produits
6- Ajout préparation de la gamme et non
conservation

Rédigé par : M. Lelievre Vérifié par : S. Dequiedt Approuvé par : L. Ranjard


Fonction : AI Fonction : IR Fonction : DR
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PCR quantitative 16S bactéries
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1- Mots clés :
PCR quantitative, bactéries, ADNr 16S, 515R, 341F

2- Objectif / principe
L’objectif de ce mode opératoire est de dénombrer le nombre de copies d’ADN ribosomal
16S de bactéries au sein d’un échantillon d’ADN. Ce dénombrement est réalisé par PCR en
temps réel en utilisant un couple d’amorces universelles spécifiques des bactéries : 341F
/515R.

3- Consignes de sécurité
La PCR en temps réel utilise des molécules mutagènes (SYBRGreen®) pour mesurer la
quantité d’ADN. Il est donc impératif de toujours travailler avec des gants, et de manipuler le
SYBRGreen sous la hotte.

4- Durée de l’expérience :
3h00 (1h de préparation de la plaque PCR et 2h00de PCR en temps réel)

5- Matériel et produits nécessaires


Matériel :
Appareil de PCR en temps réel (StepOne Plus)
Logiciel
Pipettes (spécifiques aux produits manipulés)
Consommables
• stock plateforme_conservatoire GenoSol
Plaque 96 puits/barettes/tubes 0.2ml de qualité optique (Applied Biosystems)
Film optique/bouchons optiques (Applied biosystems)
• stock commun
microtubes 2ml/1,5ml
pointes à filtres
pointes normales
plaque ABgene 96 puits + bouchon (strip*8 puits)

Produits de biologie moléculaire


Master Mix SYBRGreen® Applied Biosystems
T4 gene 32
Eau 5 PRIME
Gamme qPCR 16S à faire à chaque fois à partir du tube mère stocké à 0.5E9 copies/µL
Etalon interne (ADN environnemental)
Amorces 341F/515R 10µM purif RP-CARTRIDGE Eurogentec
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6- Méthode :

• Réserver l’appareil et un créneau

• Préparer le plan d’expérimentation

• Diluer les échantillons à 1ng/µl avec une prise d’essai minimum de 0.5-1µl selon la pipette
utilisée dans de l’eau UP (5 PRIME). Les échantillons peuvent être directement dilués en
plaque 96 puits selon le même plan de plaque que le plan d’expérimentation. La plaque 96
puits + bouchons doit être stérilisée aux UV pendant 15 minutes.
Si la dilution est réalisée plus de 24h à l’avance, conserver la plaque à -20°C jusqu’à son
utilisation.

• Stériliser la hotte PCR aux UV pendant 10 minutes en ayant pris soin de placer la plaque
96 puits en dessous sur son portoir spécifique, une paire de gants et l’eau UP, le réservoir,
le tube de mix vide.

• Mettre les aliquots d’amorces à dégeler, le master Mix SybrGreen (Applied). Préparer la T4
dans un bloc froid ou au congélateur.

• Pendant ce temps,
o Centrifuger la plaque d’ADN : short jusqu’à 1000-2000g
o Préparer la gamme à partir du tube mère : 6 points de gamme de 108 copies/µl à
103 copies/µl, avec au moins 2µl de prise d’essai (soit 2µl de sol mère + 18µl
d’eau UP).
La gamme est utilisable une seule fois car elle ne se conserve pas.
o Préparer l’étalon interne (utiliser le même pour un projet) à 1ng/µl

• Une fois les UV éteints, préparer le mix PCR selon la composition du mix du paragraphe 6
avec des cônes à filtre. Une trame d’analyse de mix est disponible dans la documentation
qualité. TOUT LE CONSOMMABLE SOUILLE AU SYBRGREEN DOIT ËTRE
EVACUE SPECIFIQUEMENT ET EN SECURIBAC !!

• Composition du Mix
Concentration quantité
initiale finale
Pour 1 Tube (µL)
marque
Master mix SybrGreen Life
2x 1x 10
(6mM MgCl2) Technologies
Primer 1 (515R) (10µM) Eurogentec 10µM 1µM 2
Primer 2 (341F) (10µM) Eurogentec 10µM 1µM 2
H2O 5PRIME - - 3.00
T4 apligene MP Bio 500µg/ml 0.500µg 1
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Séquences des primers :


341F: 5’ CCT ACG GGA GGC AGC AG 3’
515R: 5’ ATT ACC GCG GCT GCT GGC A 3’

• (sous la hotte) :Distribuer le mix (18µl par puits) dans la plaque 96 puits à l’aide de la
pipette distributrice ou d’une pipette multicanaux + réservoir.

• Ajouter 2µl d’ADN dilué (à 1ng/µl) ou de gamme dans la plaque 96 puits. (jamais d’ADN
sous la hotte!) Si vous plongez la pipette directement dans le mix, la pointe est souillée au
SybrGreen, et donc à évacuer en conséquence. Attention à ouvrir les tubes délicatement
pour éviter toute contamination entre les tubes d’ADN dilués.

• Recouvrir la plaque contenant le mix qPCR et l’ADN avec un film optique Applied et bien
maroufler le film plastique, particulièrement entre les puits, afin qu’il n’y ait pas
d’évaporation au cours de la réaction ni de contamination entre les puits.

• Centrifuger la plaque : short jusqu’à 1000-2000g.

• Homogénéiser la plaque sur l’agitateur de plaque pendant 30 secondes


La taq étant une hot start, il est possible de préparer l’expérimentation à l’avance et de
stocker la plaque quelques heures à 4°C !

• Placer la plaque dans le bon sens dans l’appareil PCR en temps réel et lancer la méthode.

Conditions PCR
- Dénaturation initiale : 15 minutes à 95°C
- Dénaturation : 15 secondes à 95°C

x 35 cycles
- Hybridation des amorces : 30 secondes à 60°C
- Elongation : 30 secondes à 72°C
- Acquisition des données : 20 secondes à 80°C (+ collecte données)
- Courbes de dissociation : 95°C_ 15 sec ; 60°C_15 sec ; (0.5°C/seconde) ; 95°C_15 sec

• Valider la plaque à l’aide de l’instruction de validation des analyses qPCR. Les critères ont
été fixés par la plateforme.

- Vérification qualitative d’une amplification PCR : amplification de l’étalon


interne
- Valider la gamme de standards : linéarité de la gamme et homogénéité entre
réplicats

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- La linéarité de la droite de régression doit être très bonne. Le coefficient de


corrélation (r²) doit être supérieur à 0,990.
- Les échantillons doivent être compris entre les bornes supérieure et inférieur de
la gamme. Il faut éviter d’avoir à faire des extrapolations.
- L’efficacité de PCR doit être comprise entre 85% et 110%, ce qui correspond à
une pente comprise entre -3,1 et -3,74.
- Les échantillons doivent se situés à au moins 1 log du témoin négatif (NTC, c.f.
Amplification plot) et sortir à des cycles compris dans l’intervalle défini par la
gamme de standards.
- Vérifier la "Melt Curve" : 1 pic
- Vérifier les erreurs signalées par le logiciel : les flags

• SI LA PLAQUE EST VALIDE, exporter les données qui seront alors analysables.

• Les données exportées seront analysées selon la méthode de la super gamme (utiliser le Ct
moyen de tous les étalons interne pour corriger les valeurs de Ct des points de gamme et
des échantillons et calculer le nombre de copies de gènes pour chaque échantillon avec une
nouvelle valeur de pente et d’ordonnée à l’origine)

7- Réactifs chimiques, éléments de sécurité


Produits Numéro CAS Formule chimique Toxicité Protection

SybrGreen
163795-75-3 C32H37N4S
H
Blouse, gants, travail sous hotte avec matériel dédié

mutagénicité

8- Evacuation des déchets


Les déchets liquides sont récupérés dans des flacons prévus à cet effet puis évacuer en
soute sous forme de bidon ou dans un sécuribac.
Les consommables sont éliminés dans des poubelles jaunes de laboratoire prévues à cet
effet. Ces poubelles sont évacuées une à deux fois par semaine par une société privée.
Les papiers et gants non contaminés sont évacués dans les poubelles conventionnelles. Les
déchets contaminés au SYBRGreen® sont évacués dans un sac placé sous la hotte PCR qui
sera ensuite placé en sécuribac.

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9- Référence(s) bibliographique(s)

P Plassart, S Terrat, R Griffiths, B Thomson , S Dequiedt, M Lelievre, T Regnier, V


Nowak, M Bailey, P Lemanceau, A Bispo, A Chabbi, P-A Maron, C Mougel, L Ranjard*.
2012. Evaluation of the ISO Standard 11063 DNA Extraction Procedure for Assessing Soil
Microbial Abundance and Community Structure. Plos one, 7:e44279.
P Lienhard, F Tivet, A Chabanne, S Dequiedt, M Lelievre, S Sayphoummie, B
Leudphanane, N Chemidlin Prévost-Bouré, L Séguy, P-A Maron and L Ranjard*. 2012. No-
till and cover crops shift soil microbial abundance and diversity in a Laos tropical grasslands.
Agronomy for Sustainable Development, in press.

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