Tesis de Posgrado

Mecanismo de acción del complejo

crotoxina de veneno de Crotalus
durissus terrificus
Canziani, Gabriela Alicia
1984

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias

Biológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca

Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
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Cita tipo APA:

Canziani, Gabriela Alicia. (1984). Mecanismo de acción del complejo crotoxina de veneno de
Crotalus durissus terrificus. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos
Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1874_Canziani.pdf

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Canziani, Gabriela Alicia. "Mecanismo de acción del complejo crotoxina de veneno de Crotalus
durissus terrificus". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de
Buenos Aires. 1984. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1874_Canziani.pdf

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 UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

MECANISMO DE ACCION DEL COMPLEJO CROTOXINA

DE VENENO DE CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS

VOLUMEN 1

Autor: LIC. GABRIELA ALICIA CANZIANI

Director de Tesis: DR. JUAN CARLOSVIDAL

Lugar de Trabajo: CONICET_ ¡DNEU

TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE DOCTOR EN

CIENCIAS BIOLOGICAS
A mi esposo y a mi hija.
A mis padres.
A mis hermanos.
 Deseo expresar mi gratitud al Dr. Juan Carlos Vidal por haber sabido
transmitir su enfoque ágil y optimista de la investigación, por su siempre
buena disposición para las consultas y las discusiones, y por habermeense
ñado que es posible trabajar con ponzoñas sin envenenarse la vida.
A mi Consejero de Estudios, Dr. José Maria Gallardo, sin cuya ayuda
no hubiese podido alcanzar esta meta,
al Director del Instituto de Neurobiologia (CONICET),Dr. Juan Trame
zzani, quien confió en el resultado de nuestro proyecto de investigación y
nos apoyó incondicionalmente,
al CONICET,
por haberme otorgado las becas de Iniciación y Perfeccig
namiento que hicieron posible la concreción del proyecto,
al Dr. Emilio Decima, profesor del School of Medecin, U.C.L.A.,quien
dedicó parte de su periodo sabático a introducimos en el complejo campo
de la fisiología de la unión neuromuscular,
a mis conpañeros de laboratorio Lic. Cristina Seki, HugoNisenbon y
Daniel Caso, por haber contribuido en amonio al trabajo de equipo,
a Marta Miranda y Gustavo Coutourier, inigualables guardianes de nues
tro equipo de cascabeles, cuya contribución fue esencial,
a Elvira Buonoy el equipo de dibujantes,
a Luis Millara y el equipo de fotografia, por su comprensión e inva­
lorable ayuda,
a las mecanógrafas Claudia Clemares, y muy eSpecialmente, Leticia
Scoccia, por la paciencia y dedicación c0n las que emprendieron la lectura
y transcripción de los manuscritos
y a todos aquellos que de una u otra manera colaboraron en la reali­
zación de esta tesis,
mi más profundo y sincero agradecimiento.

Gabriela Alicia Canziani.

Parte de los resultados presentados en esta tesis han sido
publicados según se indica a continuación:

Canziani G., Seki C., Vidal J.C., 1982. Accessibility of the

active site of crotoxin B in the crotoxin complex. Toxicon,
20 (5) : 809-822.

Canziani G., Seki C., Vidal J.C., 1983. The mechanism.of

inhibition of phospholipase activity of crotoxin B by
crotoxin A. Toxicon 21 (5) : 663-674.

Canziani G., Seki C., Vidal J.C., 1984. Crotoxin complex

dissociation promotedby acetylcholine. Acta Physiolocica
et Pharmacologyca Latino Americana (en prensa).
 INDICE

INTRODUCCION

Antecedentes y objetivos de esta Tesis

de Doctorado. Estado previo a nuestros estudios
sobre el mecanismo de acción del
complejo crotozina
Carácter de nuestra contribución al problema

CAPITULO I

Materiales y Métodos - Generalidades

Identificación de las fracciones
Actividad biológica de las fracciones
Actividad enzimática de las fracciones
Inhibición de la actividad fosfolipasa A2
Experimentos de ligadura directa

CAPITULO II

Purificación de los componentes del camplejo

crotoxina
Purificación y fraccionamiento del complejo
crotozina. Identificación de las fracciones
purificadas. Rendimiento del método
Discusión

CAPITULO III
Acción biológica del complejo crotozina
Control de la preparación neurOmuscular
aislada
Efecto tóxico del complejo crotozina
 Discusión

CAPITULO IV
Crotozina'B
n,.
Propiedades fisicas de la crotoxina B
Caracterización de la reacción catalizada
por crotozina B
Discusión e interpretación

CAPITULO V

Cinética de Za reacción catalizada por crotoxina

B. Influencia de la concentración del sustrato,
su estado fisico y el efecto del pH.
Actividad de Za crotoxina B sobre Zecitinas de
cadena corta
Efecto del pH sobre la hidrólisis de monómeros
Actividad de Za crotozina B sobre Zecitinas de
cadena larga
Efecto del pH sobre la hidrólisis de vesículas
Discusión

CAPITULO VI
Crotoxina A
Resultados
Discusión

CAPITULO VII
Actividad enzimática de la crotoxina B en eZ
complejo crotoxina
Actividad fosfolipásica del complejo crotoxina
con lecitinas monoméricas
 Inactivación del complejo crotozina por
bromuro de p-bromofenacilo 200

Actividad fosfolipásica del complejo crotozina

sobre sustratos agregados 203

Efecto del pHsobre la actividad fosfolipásica

de complejo crotozina 209

Experimentos de ligadura directa del complejo

crotozina a micelas mixtas 211
Discusión 213

CAPITULOVIII

Disociación del complejo crotoxina en la

sinapsis de la unión neuromuscular 225
Resultados 226
Discusión 234

DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES

Modelo del mecanismo de acción del complejo

crotoxina 238
El modelo convencional 239

El modelo propuesto por el presente trabajo 240

Comparación del modelo convencional con

el propuesto 241

Abreviaturas 257

APENDICES

BIBLIOGRAFIA
 INTRODUCCION

"Cnegó ven una ¿enpiente

que ¿e ¿ntenpglaba en gniego;"

Lew¿¿ Cannot!
Alicia en el paí¿
de Laó manauillaó
Desdelas civilizaciones más antiguas hasta nuestros dias las
serpientes han despertado las más variadas emociones. Para los
antiguos la serpiente encarnaba el espiritu de la tierra por su
naturaleza reptante y su capacidad de supervivencia. Comoen
las zonas desérticas se encontraban próximas a las fuentes de a
gua, se consideraban parte "de donde viene la vida humana y la
salud“. Para muchos pueblos fue dios y comienzo de todas las
cosmogonias, simbolo de fecundidad, salud, continuidad y eterni
dad (Leake, 1967; Boquet, 1979). Pero para los herederos de la
civilización occidental la serpiente es la encarnación del mal:
expulsada del Eden, condenada a_arrastrarse eternamente, produ­
ce el veneno comoesencia del mal que lleva adentro (Génesis).
Poca simpatía despiertan estos reptiles que nos provocan repul­
sión, incomodidad, temor y hasta pánico dependiendo de cuán cer
ca estén de nosotros, pero lo cierto es que las serpientes veng
nosas imponen respeto. Por muchotiempo los naturalistas, en
la contemplación de la naturaleza, no prestaron muchaatención
a las serpientes, pero no pasarOn inadvertidas ,a AriStóteles.
El analizó su anatomia y reproducción, y las describió en su
"Historia de los Animales"tratando de clasificar las criaturas
que se conocían 400 años antes de Cristo. Con el aporte de las
campañas de Alejandro Magnoéstas no debieron ser pocas y su e­
xotismo debió llamar la atención de los griegos. AunqueAnibal
de Cartago (247-183A.C.) no fue naturalista, tuvo éxito utili­
zando las serpientes comoarmas, pues tomó en cuenta las propig
dades de sus venenos sin hacer caso de la superstición o la mi­
tologia. Aterraba a los romanos lanzando hacia sus barcos vasi
jas de terracota repletas de serpientes venenosas de Africa del
Norte. Nikandros de Kolophon, poeta, gramático y médico, proba
blemente vinculado a1 Templode Esculapio, escribió en el siglo
<kB.AJLdos obrasgen versofde importancia mayor para 1a historia
natural: “Thériaca”, que trata de la ponzoña de los animales
venenosos, su acción y tratamientos de envenenamientos, y "Ale­
xispharmaca", sobre los venenos vegetales y minerales. Se sosf
pecha que la mayor parte de la información la obtuvo de los pa­
piros médicos egipcios que datan de 1600 años A.C. y que contig
nen descripciones de los tratamientos de mordeduras de una am­
plia variedad de animales. El resto de los conocimientos los
adquirió probablemente tomandonota de las tradiciones orales
propagadas entre los griegos a la vuelta de los soldados y médi
cos de Alejandro. Esto es lógico considerando que son pocas
las especies venenosas que hay en Grecia.
Los escritos de Nikandros tuvieron gran vigencia durante los pg
riodos greco-romano, medieval y aún el renacimiento. Fueron
traducidos al latin y‘publicados en Venecia en 1499. Luego el
texto griego con una traducción adosada apareció en Paris en
1549. Los eminentes hombres de ciencia que le sucedieron no hi
cieron más que copiar y clasificar la información de Nikandros,
y entre ellos podemosmencionar a Dioscorides del siglo primero
de nuestra era. Era médico de la corte de Nerón, clasificó los
principios curativos en una "Materia Médica" y alli incluyó los
tratamientos para mordedurasde serpientes¿ Plinio las considg
ró en su fantasiosa "Historia Natural" que escribió en el siglo
1 A.C. Sostenia que"entre todas las serpientes conocidas, el
basilisco era el más venenoso pues mataba con la miradaï Los
"bestiarios" de la Edad Media no fueron más que elaboraciones
imaginarias de sus trabajos, en donde se describian dragones,
serpientes monstruosas y reptiles horrendos. No contribuyeron
 V

al conocimiento de las serpientes venenosas pero alimentaron el

folklore. Galeno (131-201 D.C.) adjuntó a la Historia Médica,
algunas notas referentes al tratamiento de mordeduras tomando
la información de los trabajos de Nikandros. De la mismamane­
ra se informaron todos aquellos que se refirieron al efect03rel
tratamiento de las mordeduras de animales venenosos (Celsus, A­
viaena). Andrómaco, también médico de la corte.de Nerón, fue en
cargado de preparar antídotos contra las mordeduras de serpien­
tes. Preparó lo que llamó Teriaca o Triaca que pasó a signifi­
car por extensión: remedio obtenido a partir del mismodaño, o
mal prevenido con prudencia. Ha sido usado hasta tiempos rela­
tivamente recientes y consistía en una mezcla compleja de carne
de serpiente o-hígado de serpiente, o bien de otros animales y
plantas según el origen de la enfermedad, que contenía opio.
Conel afán desmesurado de extraer los principios curativos de
las sustancias naturales, particularmente de aquellas que pro­
ducían el daño, las serpientes venenosas tuvieron que padecer
más de 20 siglos, desecaciones, pulverizaciones, incineraciones,
maceraciones en vinagre, vino y aceite, e infusiones, todas e­
llas muchopeores que la condena Divina... Fueron consumidas
erudas, cocidas, en elixires, en jarabes y píldoras, aplicadas
en forma de pomadas y unguentos, como emplastos y cataplasmas
(Phisalix, 1940). Detentoras de la Vida y de la muerte, pose­
ían propiedades milagrosas a los ojos de los hombres del 1500,
1600, e incluso del 1700.
El estudio de los venenos no despertó realmente interés hasta
el siglo XVIII. No es sorprendente, pues antes de la aparición
de las ciencias experimentales vinculadas a la composición de
la materia no había una distinción clara entre sustancia y prg
ceso, entre elemento y acción. Se habló de principio vital o
de flogisto. Los conceptós sobre la composición de la materia
no estaban definidos. Van Helmont asimilaba los venenos de ser
pientes ("Orthus Medicinae", 1648) a "espiritus irritados" que
"eran tan frios que coagulaban la sangre en las venas y deteni­
an la circulación" y a pesar de que Redi en 1664 escribia lo
que puede considerarse el primer trabajo metódico sobre venenos,
demostrando que el veneno era solamente efectivo cuando se in­
yectaba bajo la piel e inefectivo por via oral, Charas, segui­
dor de Van Helmont (1685),sostenia que las picaduras de serpien
tes eran peligrosas sólo cuando el animal estaba irritado. Pos
teriormente, con la observación de que la secreción de los col—;
millos de serpientes vivas o muertas era igualmente peligrosa,
Redi echaba por tierra las teorias flogisticas. Fontana (1767)
prosiguió estos estudios, tnató sistemáticamente problemas de
toxicologia y fue precursor en el estudio experimental del veng
no de las serpientes.
Durante algunos años no se registraron novedades en el tema, pg
ro la actitud de vincular fenómenos, de repetir experimentos y
de elaborar controles se multiplicó, comoen todas las discipli
nas de las ciencias. Hacia fines del siglo XVIII la quimica se
habia transformado en una ciencia experimental ywse habian sen­
tado las bases de la "quimica de las sustancias transformadas
por los seres vivientes", la bioquímica (Goethoy,1787)
En el siglo XIXla fisiología tomó cuerpo bajo la influencia de
Bernard y la medicina dejó atrás las rígidas estructuras impues
tas por Galeno. Las escalas de comparación de las que se dis­
puso y la definición de nuevos parámetros, permitió determinar
1a composición y la acción de venenos enteros o de fracciones.
.Deallí en adelante la investigación de estas secreciones ora­
les altamente especializadas progresó constantemente a la par
de las nuevas técnicas de investigación.
Unode los primeros fenómenos detectados, consecuencia de la
acción tóxica de los venenos ofídicos, fue la interferencia
con el proceso de coagulación (Goeffroy y Hunault, 1737; Fontg
na, 1787). Se intentó clasificar los venenos conocidos hasta
ese momentode acuerdo con sus propiedades coagulantes o anti­
coagulantes, pero la superficialidad de las observaciones sólo
llevó a profundas discrepancias entre los investigadores.
Physalix (1899) demostró actividad coagulante a dosis altas y
anticoagulante a dosis bajas en venenos de vipéridos. Martin
(1893) habia obtenido idénticos resultados con venenos de elá­
pidos de Australia, sin embargo, los venenos de crotálidos y
de la cobra de la India presentaron, en general, propiedades
anticoagulantes (Mitchell, 1860; Cunningham, 1895; Stephens
Myers, 1898; Rogers, 1904).
Noc (1904ïtsuponía que los venenos de acción coagulante con­
tienen factores que contribuyen a la formación de la trombina,
o que la trombina está presente en los venenos. Arthus (1912)
y Stawska (1910) observaron que los venenos de crotálidos ac­
tuaban como trombina y el veneno de vipérido llamado de Russell
acehnabala transformación de la protrombina en trombina.
Los venenos de muchos ofidios contienen enzimas que participan
en forma especifica en las tres reacciones primordiales que
provocan la coagulación: (1) la formación de autoprotrombina
C (Factor xa), (2) la formación de trombina, y (3) la forma­
ción de fibrona. Las fracciones purificadas han servido para
-dilucidar distintos pasos en el proceso-de coagulación y son
actualmente utilizadas comoreactivos en el análisis de protrom
bina, de autotrombina III, para la determinación de fibrinógeno,
para estudios moleculares de los mecanismos de coagulación y en
terapéutica (Seegers y Ouyang, 1979).
Hacia mediados del siglo XIX , Luis Bonaparte, sobrino de Napo­
león, naturalista y agudo observador, fue el primero en asimi­
lar a fermentos digestivos un extracto de veneno de Viperaberus
en alcohol. Lo llamó'viperina"(Bonaparte, 1843).
La"crotalina',' semejante a la pepsinay a-laptialina fue extraída
por Mitchell (1860-1868), luego se aislaron la"nainahdel veneno
de cobra (Veaud Grand-Marais, 1867) y la"equidnasa¿de vipéridos
de acción semejante a la diastasa (Physalix, 1897). Se observó
la fuerte actividad proteolItica del veneno de crotálidos (No­
guchi, 1902; Noc, 1904) por oposición a la ligera proteólisis
que provocaban los venenos de elápidos. 'Se demostró la activi­
dad"lecitinasa"de los venenos de cobra y cascabel.
La naturaleza protéica de los componentes de veneno fue propues
ta por Pelder en 1878 y verificada por Reichert en 1883.
Por lo menos 26 enzimas diferentes han sido detectadas en veng
nos de serpientes hasta hoy. La mayoria son hidrolasas (ver
Tabla I).Doce familias de enzimas se encuentran en todos los vg
nenos, el resto se encuentra solamente en algunos grupos taxong
micos o en especies particulares. Las enzimas del mismotipo
distribuidas entre especies muyalejadas, comolas fosfolipasas
de cobras y de crotálidos, son antigénicamente distintas. Las
acetilcolinisterasas son caracteristicas de los venenosde elá­
pidos (Zeller, 1948), las endopeptidasas, arginina ester hidrg
lasas, las enzimas"thrombinlike? quininogenasa, y procoagulan­
tes están distribuidas predominantementeentre los vipéridos y
Tabla I : Enzimas identificadas en Zos venenos de ofidios E

Enzimasencontradas en todos los venenos estudiados:

Eosfolipasa A2 (3.1.1.4)
L-aminoácido oxidasa (1.4.3.2)
Fosfodiesterasa (3.1.4.1)
5'-nucleotidasa (3.1.3.5)
Deorxiribonucleasa (3.1.4.6)
Ribonucleasa (2.7.7.16)
Adenosinatrifosfatasa (3.6.1.8)
Hialuronidasa (4.2.99.1)
NAD-nucleosidasa (3.2.2.5)
Arilamidasa
Peptidasa

Ehzimascaracterísticas de venenosde crotálidos y vipéridos:

Ehdopeptidasa
Arginina este: hidrolasa
(3.4.4.21)
Enzimatipo traïbina (thratbinelike)
Activadora del Factor x
Activadora de protmrbina

Ehzimasencontradas principalmente en venenos de elápidos:

Aoetilconesterasa (3.1.1.7)
Fosfolipasa B (3.1.1.5)
Glioerofosfatasa

Ehzimas encontradas al algunos venenos:

Glutánüco-pirúvico transaminasa (2.6.1.2)
Catalasa (1.1.1.1.6)
Amilasa (3.2.1.1)
B-Gluoosaminidasa
lactato deshidrogenasa (1.1.1.27)
Enzimatipo heparinasa

9- De S.Iwanaga y T.Suzuki (1979) Snake Venoms. Handbook of mcp.Pham.52.

crotálidos y no han sido aún detectadas en los venenos de elá­
pidos (Deutsch y Diniz,1955). La variabilidad cuantitativa y
cualitativa de las enzimas de venenos en función de la édad del
ofidio o de su nutrición (Jimenez Porras,l964;Bonilla y col.,1973)
muestra qué dificultades se presentan en estudios interespecifi
cos del contenido enzimático de los venenos, por 10 que tOdO a:
nálisis de este tipo seria inútil por si solo.
Las diferencias enzimáticas son responsables de una parte del
espectro de acción biológica de los venenos. Estos contienen o­
tras sustancias biológicamente activas entre neurotoxinas, fac­
tores de crecimiento, lIticos, hemorrágicos y de acción autofag
macológica. En 1884, De Lacerda observó el efecto hemolitico
del veneno de Lachesis sobre una suspensión de glóbulos rojos.
No fue el único veneno que poseía esta propiedad, y el fenómeno
perturbó a los investigadores durante poco menos de un siglo.
En primer lugar, el efecto hemolítico era insuficiente para ser
considerado letal (Rogers,1904; Lamby Hunter,1904; Cunningham,
1908; Condrea y col.,1969), y en segundo lugar, no se podia di­
lucidar el mecanismode acción hemolítica porque no se conocia
la estructura de la membranacelular. A partir de los años 60,
el avance en el conocimiento de la composición y función de las
membranasbiológicas, en particular la del glóbulo rojo, permi­
tió comprender la acción de los factores hemolfticos de los ve­
nenos. Inmediatamente, esos factores sirvieron a su vez como
herramientas, comopor ejemplo, para localizar fosfolïpidos en
las membranas (Zwaal y col.,1973; Singer,1974). Las fosfolipa­
sas A2 hemoliticas indirectas están presentes en venenos de vi­
péridos y crotálidos, los factores liticos directos en elápidos,
vipéridos y crotálidos,pero existen además otros factores en el'veng
no de cobra que son responsables de la activación especifica
del sistema del complementoque también lleva a la lisis celu
lar. El estudio de esta interacción surgió paralelamente con
el descubrimiento de las propiedades antisépticas de los sue­
ros. La historia de la dilucidación del complementoestá es­
trechamente ligada a los venenos de serpiente, ya que el fac­
tor de veneno de cobra CVF, fue una herramienta importante en
la disección del sistema. Las primeras observaciones que pro
porcionaron la clave de la existencia de mecanismoslatentes
en el suero para la destrucción celular datan de la segunda
mitad del siglo pasado (Mitchell, 1860; Stephens y Myers,1898;
Stephens, 1900).
El veneno de cobra, aunque posee propiedades hemolItiCas defi
nidas, es letal por su acción neurotóxica. La neurotoxicidad
de los venenos fue estudiada en el siglo XIXcon el surgimien
to de las ciencias fisiológicas. La acción paralizante de mu
chos venenos era semejante a la del curare, descripta por Ber
nard (1850). Se observó la parálisis de los miembrosy el
paro respiratorio en animales inyectados con venenos de e15
pidos, y se demostró que el efecto era periférico, a nivel de
las terminales motoras, y prácticamente irreversible (Bruntos
y Freyer, 1874; Ragotzi, 1890). Sin embargo no se descartó u
na posible acción central. No se han descripto neurotoxinas
que actúen atravesando la "barrera" hematoencefálica. Sin em
bargo se purificaron dos categorias de neurotoxinas periféri­
cas: de acción posináptica o a-toxinas y de acción presinápti
ca o fl-toxinas. La a-bungarotoxina (a-BGT) (Changeaux,1970),
una de las a-toxinas más conocidas, interactúa tan especifica
mente con los receptores de acetilcolina, que su ligadura a g
 10

na proteína es suficiente para clasificar a esta última entre

los receptores nicotinicos (Changeauxy ool..1970)151descubri­
miento de las neurotoxinas posinápticas significó un avance
considerable en la investigación de la estructura y función
del receptor nicotínico que, independientemente, hubiera sido
más lenta. La a-BGTy/o la a-toxina de cobra han sido utili­
zadas para dosar receptores nicotinicos in-vitro y para puri
ficar receptores por medio de columnas de afinidad. Han per­
mitido estudiar cambios conformacionales y cinética de inter­
acción receptor-neurotransmisor, síntesis y metabolismodelos
receptores in vivo, evaluar el peso molecular del receptor y
han contribuido al entendimiento del rol de los receptores en
enfermedades tales comola miastenia gravis.
Conpocas excepciones, los venenos no han podido clasificarse
como"neurotóxicos", "paralizantes", "de shock", "hemorragi­
cos" o "hemotóxicos" debido a la multiplicidad de efectos prg
ducidos por sus variados componentes (Boquet, 1979). Aún la
supuesta predominancia de uno de estos efectos depende de va­
rios factores tales comola dosis, la vía de inoculación, y
la especie inoculada (Vidal, 1976). Sin embargo, los venenos
de las Elapidae, cobras, mambas, bungaros, y de las Hydrophi­
939, serpientes de mar, son fuertemente neurotóxicas, provo­
cando la muerte por parálisis respiratoria. Por otro lado,
los venenos de Viperidae y Crotolidae, comolas serpientes de
cascabel norteamericanas y las yararás sudamericanas (Gén.
Bothrops) son conocidos comoproductores de shock, hemorragias
locales y sistémicas, y necrosis, que llevan a la destrucción
extensiva de téiidos. Los crotálidos producen el veneno más
complejo entre los ofidios (tabla II) constituido por un mayor
Tabla II : Componentesdialisables y no dialisables de los ve­
nenos de elápidos, vipéridos y crotálidosg (Mebs,
196 9) .

mg de Veneno mg no dialisable %dialisado

El idos:
Naja naja 100 65 35
Naja naja atra 80 20 75
Naja nigmlcollis 100 61 39
Naja haje 40 15 62
Naja nivea 100 60 40
Hemachatus haemachatus 50 22 56
Ophiophagus hannah 100 55 45
Deondroaspis angusticeps 70 29 59
Bungarus fasciatus 100 66 34
Pvendechis coZZettii 100 62 38

Vi idos:

Vipera russeZZii 100 87 13

Bitis gabonica 40 38 5

Crotálidos:

CrotaZus atroz 100 90 10

Crotalus durissus termificus 100 87 13
Bothrops jararaca 100 83 17

E Los venenos disueltos en agua destilada (100 n‘gen 5 ml) fueron dialisadas en
oelofán contra 10 veces su volumen de agua a 4°C. Se realizaron 2 cambios a
las 24 y 48 horas. Luegoel residuo de dialisis y el dialisado fueron liofi­
lizados separadamente y se evaluó sus contenidos en proteína.
 12

númerode proteínas distintas, de mayor peso molecular y un

espectro de acción farmacológica y bioquímica más amplio. La
mayorparte de estas proteinas está provista de actividad en­
zimática, predominantementeproteolitica y lipásica.
No conviene perder de vista la finalidad del veneno de los o­
fidios en la Naturaleza. Aunque muchos componentes han sido
de muchautilidad para la investigación fundamental, para la
serpiente la función del veneno es procurar alimento, inmovi­
lizando a la presa rápidamente y, probablemente, colaborando
en la digestión. La muerte de la presa resulta del efecto si
nérgico de todos los componentes, que muchas veces actúan po­
tenciándose. La efectividad de los venenos es consecuencia
de su complejidad pues contienen más de una substancia para
alterar rápidamente procesos vitales tales comola transmisión
nerviosa y neuromuscular, la actividad cardíaca, la circula­
ción sanguínea, y la permeabilidad y estructura de las membrg
nas. Las proteinas enzimáticas y no enzimáticas son comunes
a todos los venenos y se encuentran en mayor proporción, acom
pañados de péptidos, aminas, áéidos nucléidos, pigmentos, li­
pidos, carbohidratos y sales inorgánicas de iones metálicos
que muchas veces son cofactores. Las proteinas son los compg
nentes más importantes funcionalmente, por lo que no es sor­
prendente que constituyan la mayor parte del veneno.

Lineo definió el orden de las serpientes en 1758. Se trataba

de un conjunto heterogéneo en el cabian lagartijas, basilis­
cos e iguanas (Wagler, 1830). Dumeril y Bibron (1854) clasi­
ficaron las serpientes de acuerdo con la característica más
conspicua para el hombre: el aparato bucal de inoculación y la
 13

presencia o ausencia de glándulas productoras de veneno. Las

serpientes conocidas comovenenosas pertenecen principalmente
a cuatro familias: hidrófidos, elápidos, vipéridos y crotáli­
dos (Klemmer,1963; Ohsaka,1979). Muchas veces la distinción
entre serpientes inocuas y venenosas es equivocada, porque se
entiende que la diferencia depende de la presencia o de la au­
sencia de glándulas productoras de veneno. Por el contrario,
esta clasificación depende exclusivamente de la habilidad de
cada clase para inyectar el veneno (Fonseca,1949). Varias es­
pecies de culebras, consideradas no venenosas, producen un ve­
neno que puede extraerse, pero cuyo estudio careció de interés
por la preponderancia que han ejercido los venenos que son ef;
cazmente inyectados y que, por lo tanto, son de suma importan­
cia para el hombre. Se le ha acordado status taxonómico a la
clasificación de las serpientes de acuerdo a su aparato bucal.
Asi es como, según el aparato bucal, las serpientes llamadas
venenosas pueden clasificarse en Proteroglifas y Solenoglifas,
cuyos colmillos están situados anteriormente en el premaxilar
superior. En los proteroglifos (Fam.hidrófidos y elápidos),
los colmillos fijos son fuertemente acanalados y bastante más
grandes que el resto de la dentadura (Fig.l). El veneno de
las glándulas es inoculado por medio de esos canales. Las so­
lenoglifas (Fam. Crotálidos y Vipéridos) tienen colmillos tubu
lares, generalmente con fusión completa de la canaleta y no
presentan dientes fijos en los maxilares. Los maxilares son
móviles, de tal manera que los colmillos que normalmente repo­
san replegados sobre el paladar, pueden ser erectos por la a­
pertura de la boca que provoca una rotación en bisagra de la
articulación del hueso lacrimal con la maxila. Cuandolos col
 V
®
hAGUFA

OPBTOGLWA

Fig.l Esquemageneralizado de 1a trans­

formación evolutiva de la dentición
de los ofidíos, con atención partí­
cular en el aparato ínoculador. Zona
sombreada: posición de las glándulas
de veneno.
 15

millos han penetrado la presa son llevados violentamente hacia

atrás por Contracción muscular y se introducenmás'profundamente.
Este movimiento puede acompañarse por la inyección de veneno.
El proceso completo dura un tercio de segundo y puede decirse
que la inoculación se produce por "picadura" en el sentido es­
tricto.
Las serpientes llamadas no venenosas son las aglifas (Fam. Co­
lubridae y Boidae) que carecen de colmillos inoculadores, y
las opistoglifas (Fam. Colubridae) cuyos colmillos acanalados
están ubicados en posición posterior. En los elápidos, hidró­
fidos y colúbridos, los colmillos más cortos y fijos hacen que
la serpiente deba permanecer en contacto con la presa durante
más tiempo.
Existen otras caracteristicas de importancia en la clasifica­
ción de las serpientes, comoforma y peculiaridades de los he­
mipenes, número y forma de las escamas, color y forma de la ca
beza y los ojos, órganos térmicos como, por ejemplo, los órga­
nos sensibles al calor, característicos de los crotálidos y
boideos, que le permiten "visualizar" el espacio en términos
de diferencias de temperatura (Gallardo,1977; Newmany Hart­
line:1982). Sin embargo no se ha llegado aún a una clasificación
universalmente aceptada.
La cascabel sudamericanaCrotalus durissus terrificus pertene­
ce a la familia de los crotálidos o subfamilia de los crotáli­
dos según distintos autores (Gallardo,1977) que agrupan a los
crotálidos entre los vipéridos. Está representada por cinco
géneros ampliamente distribuidos en América del Norte, Central
y Sur, y por dos géneros en Europa y ASia. La cascabel es so­
.1enoglifa. El veneno que produce difiere del de todos los crg
tálidos conocidos por ser fundamentalmente neurotóxico, porque no
provoca necrosis en el sitio de picadura y por no observarse hemg
rragias generalizadas en los animales inoculados.
El envenenamiento por mordedura de la cascabel sudamericana provg
ca esencialmente parálisis fláccida y lleva a la muerte por deteg
ción de los movimientos respiratorios (Houssay y Pavé,l922). Se­
gún la distribución geográfica de esta especie, se pueden o no ob
servar espasmosy convulsiones asociadas al efecto paralizante
del veneno. Los Crotalus distribuidos en el territorio argentino
y en algunas regiones de Brasil producen un veneno que provoca es
pasmos musculares y convulsiones tónicas que desembocan en la hi­
potonïa muscular y la parálisis respiratoria (Barrio y Vital Bra­
zi1,l949; Vital Brazil y col.,1966).. El componenteneurotóxico
potente ha sido llamado crotoxina (Slotta y Fraenkel-Conrat,1938)
y se ha demostrado repetidamente que produce los efectos tóxicos
más conspicuos del veneno entero (Vital Brazil,1966; Chang,1979;
Breithaupt,1976). La crotoxina constituye un 65%del peso seco
del veneno, seguida por 1a crotamina, que representa el 30 %y
es responsable de los espasmos y convulsiones (Moussatché y col.,
1956; Cheymol,1971) que preceden la acción paralizante de la org
toxina. Su ausencia en algunos crótalos explica las di­
ferencias que se observan en el síndrome de envenamiento
(Barrio y Vital Brazil, 1949). La toxicidad de 1a crotoxi
na depende de la especie siendo en orden de efectividad
más tóxica para el pollo que para el ratón y que para
la rata (Habermany Breithaupt, 1978). Para el hombre, las do­
sis efectivas son semejantes a las que provocan el síndrome ca­
racterístico en el ratón (Vidal y col.,comunicación personal).En
aves,la crotoxina es diez veces-vés potente que la toxina botulínica, y en ma
 17

míferos parece revertir la acción de esta última, compitiendo

por los sitios de ligadura (Chang, 1979)aunque posee un quin­
to de la potencia tóxica de la toxina botulínica.
La crotoxina fue aislada por primera vez por Slotta y Fraenkel­
Conrat en 1938 por precipitación isoeléctrica a pH 4.7-4.8 y
y fue cristalizada en acetato de piridina a pH 4.4. Esta frag
ción del veneno presentaba actividad fosfolipasa(singer y
Fraenkel-Conrat, 1950). Estudios de ultracentrifugación (Gra­
len y Svedberg; 1938) y electroforesis libre de Tiselius (Li
y Fraenkel-Conrat, 1942) habian indicado que se trataba de una
proteina homogénea. La crotoxina fue considerada durante tres
décadas comouna proteína pura y figuró en textos de enzimolo­
gía comouna de las primeras enzimas cristalizadas. Esta enzi
ma fue calificada de neurotóxica (DL50 i.v. 0,1 ug/g) y res­
ponsable de la letalidad del veneno (DL500,2 pg/g). Hasta la
década del 50, los principales grupos de investigación intenta
ron generalizar el mecanismode acción de los venenos, atribu­
yendo los efectos tóxicos a la actividad fosfolipasa A2, ya
que se la medía en prácticamente todos los venenos neurotóxi­
cos y fracciones hemorrágicas. Habermann y Newmann(1955) en­
tre tanto, lograron separar dos componentesde la crotoxina
por electroforesis en papel, utilizando crotoxina purificada
por cristalización. Unode los componentesestaba provisto de
actividad enzimática mayorque la de la substancia inicial,y el
otro componente, desprovisto de actividad enzimática que llama
ron crotactina era altamente.tóxico (DL500,04 ug/g). Singer
y Fraenkel-Conrat (1958) obtuvieron dos dinitrofenil péptidos
que se diferenciaban Por SU solubilidad Y comPOSi’
ción en aminoácidos. Paralelamente, las fracciones neurotóxi­
 18

cas de los venenos de diferentes especies de gala fueron puri­

ficadas y se encontraron neurotoxinas carentes de actividad en
zimática, lo que hizo bascular las teorias de relación activi­
dad enzimática-toxicidad a tal punto que a fines de los años
50 se descartaba la participación de la PA2en la toxicidad de
los venenos. Más recientemente, el análisis de las fracciones
neurotóxicas mejor purificadas y de homogeneidad comprobada,
ha demostradoque no es posible realizar una clasificación tan
radical puesto que hay tanto PA2tóxicas y atóxicas, comopro­
teinas no enzimáticas tóxicas y atóxicas.
La crotoxina fue finalmente resuelta aados componentes mayores,
de\condicione's drásticas de pHy fuerza iónica (Rubsameny 001,1970;
Hendony Fraenkel-Conrat, 1971): una fosfolipasa A2 básica, tg
xica"per se? llamada crotoxina B por ser el componentebásico
del complejo, y una proteina ácida, no enzimática, llamada crg
toxina A por ser el componente ácido. La crotoxina B y la crg
toxina A forman espontáneamente un complejo no covalente fuer­
temente unido, a pH neutro, aún a partir de soluciones dilui­
das (Canziani y col., 1982) que presenta propiedades idénticas
a las de la crotoxina nativa. Rübsamen (1971) encontró que en
el complejo reformado, la proteina ácida inhibe la actividad
enzimática de la fosfolipasa A2 y potencia, al mismotiempo,
su toxicidad diez a quince veces, por lo que llamó a la prote­
ína crotapotin.
 19

Antecedentes y objetivos de esta Tesis de Doctorado.

Estado previo a nuestros estudios sobre el mecanismodel com­

plejo crotoxina.

Luegodel aislamiento de la crotoxina por Slotta y Fraenkel­

Conrat (1938), el conocimiento avanzó notablemente al obtener
se la separación de subunidades, demostrándose que se trata
de entidades químicas estructural y funcionalmente distintas:
la fosfolipasa A2básica (crotoxina B) y la crotoxina A, áci
da y carente de actividad enzimática y de toxicidad. Asi pu
do demostrarse que (a) el agente farmacológico crucial del
complejo es la crotoxina B , ya que es capaz de reproducir tg
dos los efectos farmacodinámicos del complejo, si bien se re­
quieren dosis muyelevadas y (b) la actividad enzimática es g
sencial para la toxicidad (Rübsameny col, 1971: Hendon y
Frankel-Conrat, 1971). El segundo avance importante fue la
observación de que,.a partir de las subunidades A y B sepa­
radas se formaba espontáneamente un complejo en el que se reg
tauraban sus propiedades fisicoquimicas y enzimáticas, así c9
mo la elevada toxicidad del complejo crotoxina nativo (Brei­
thaupt y col, 1974).
El tercero consistió en la demostración de su modode acción
a nivel de la unión neuromuscular, lo que permitió clasificar
la comouna fosfolipasa que actúa esencialmente a nivel pre­
sináptico (Vital Brazi1.y col.,1966,1973; Breithaupt,1976;Chang
yLee,l977; Hawgood.y5mith11977).
Sin embargo quedaban demasiadas preguntas sin respuesta, es­
 20

pecialmente, la paradoja de que toda la acción enzimática y

tóxica residiera en la subunidad B, a pesar de Lo cual la
crotoxina A es necesaria para la expresión completa de la
toxicidad. Las evidencias farmacológicas acumuladas hasta
la actualidad no han permitido aVanzar en eltconocimiento
del mecanismode acción de la crotoxina más allá de los efeg
tos netos que produce. Esto es el resultado de aplicar un
sistema,en el que los parámetros son múltiples, interconec­
tados y, en consecuencia incontrolables todos a la vez CO­
moresulta ser la transmisión nerviosa,donde intervienenzla
naturaleza de la membranapresináptica, el mecanismode libg
ración de acetilcolina, con todas sus etapas dependientes del
balance iónico Na+ - K+ y del movimiento de Ca2+ , las re­
servas de acetilcolina, su movilización. Con ese tipo de
metodologia es imposible construir hipótesis plausibles so­
bre preguntas claves tales comosi el complejo crotoxina de
be disociarse para ejercer su efecto y si la crotoxina A es
sólo un transportador de la subunidad activa o un verdade­
ro potenciador en el sitio de acción.
Dosobservaciones bioquímicas contradictorias permitieron
generar una explicación plausible del? mecanismode acción
de la crotoxina. (a) Jeng, Hendon y Fraenkel - Conrat (1978)
empleandoeritrocitos y crotoxina doblemente marcada obser­
varon que sólo se ligaba la subunidad B. Además, empleando
un inhibidor dirigido a sitio activo de las fosfolipasas A2
demostraron que la subunidad B no se inactiva cuando se en­
cuentra en el complejo crotoxina, por lo que concluyeron que
el sitio activo de la fosfolipasa está “ocluído en el complg
 21

jo (Jeng y Fraenkel-Conrat, 1978), (b) Hendon y Tu (1979) de­

mostraron que el complejo crotoxina unido en forma covalente
por un reactivo bifuncional era carente de toxicidadsn bien
presentaba una actividad fosfolipasa idéntica a la del complg
jo crotoxina nativo.
Sobre esas bases se generó el concepto de "acompañante" (Cha­
peron), según el cual la crotoxina A es un transportador far­
macocinético de la fosfolipasa A2 básica, que actúa impidien­
do la ligadura de la enzima (y su ulterior inactivación) a si
tios de baja afinidad, mediante la oclusión del sitio activo
de la enzima. Los sitios de acción biológica, presumiblemente
receptores a nivel de la membranapresináptica (Habermanny
Breithaupt,1976; Mebs,l980; Chang y col.,1980) poseerïan una
afinidad por la crotoxina B aún mayor de la que posee la crotg
xina A. De manera que el complejo crotoxina actuaria como un
depósito circulante de crotoxina B debido a que la afinidad de
la subunidad A por la enzima es mayor que la de los "sitios i­
nespecificos" y menor que la del"receptor". La validez de las
pruebas que apoyan el modelo vigente es objetable:

(a) La suposición de que'la crotoxina A impide la interacción

de la crotoxina B con sitios inespecIficos mediante
la oclusión del sitio activo sugiere que tal sitio no
seria accesible para una interfase "inespecifica" como
la de las lipoproteinas de yema de huevo. Esto está
en contradicción con las evidencias experimentales que
demuestran que el complejo crotoxina exhibe una actividad
fosfolipásica de 50% de la que presenta la fosfoli­
pasa A2 básica pura. Más aún, si las subunidades Ay
 22

B se unen covalentemente, la actividad del complejo re­

sultante es igual a 1a que presenta el complejo nativo
(Hendon y Tu, 1979) y no menor, como podría esperarse
si la subunidad A ocluyera el sitio activo de la crotoxi
na B.

(b) La supuesta oclhsión del sitio activo de la fosfolipasa

por la subunidad A se basa en a observación de due un ig
hibidor dirigido al sitio activo de las fosfolipasas A2
(el bromuro de p-bromofenacilo) inactiva la crotrxina B
pura, mientras que no se observa inactivación si la enzi­
ma se encuentra en forma de complejo con crotoxina A.
Sin embargo, no se han realizado estudios sobre la reacti
vidad del sitio activo de la enzima en el complejo croto­
xina empleandoel sustrato, que es el mejor reactivo para
estudiar las propiedades del sitio activo de una enzima.

(C) En algunas preparaciones la actividad de crotoxina B pu­

ra decae con el tiempo, lo que no sucede con el complejo
crotoxina. Se ha sugerido (Chang y Su, 1978, 1981) que
en ausencia de CAla crotoxina B aislada podria "degradar
se" e inactivarse perdiendo sus propiedades tóxicas y en­
zimáticas, tanto en solución fisiológica comoen presencia
de tejido muscular.
De manera que la potenciación de la toxicidad de CBen el
complejo crotoxina se deberia a estabilización de su con­
formación activa por la formación del complejo con croto­
xina A . Esta interpretación es sorprendente teniendo
 23

en cuenta la inusual resistencia de la crotoxina B (así

comode otras fosfolipasas A2) frente a tratamientos f;
sicos drásticos (pH, temperatura) o agentes desnaturali
zantes (Breithaupt, 1976a). La aparente inactivación bien
puede resultar de las dificultades en la manipulación. En
efecto, la crotoxina B (no el complejo crotoxina) se ad”
sorbe fuertemente al material de vidrio (Habermanny Brei
thaupt, 1978) y a la. matriz de los geles usados comunmen
te para cromatografía (Rübsamenny 001.1971).

(d) La necesidad de postular la existencia de "sitios de al­

ta afinidad" o "receptores" en la membranapresináptica
(Habermann y Breithaupt, 1978; Mebs, 1980, Chang y col.
1980) que compitan con la crotoxina A es una complica­
ción adicional que oscurece el panorama en lugar de aclg
rarlo. Se desconocenlos detalles estructurales a nivel
molecular de la membrana presinápticaJ en la ¡que po­
drían existir áreas con una arquitectura molecular tal
que las propiedades fisicoquimicas la hicieran efectiva
para ligar la crotoxina B con mayor afinidad que otras.
Sin embargo, tales receptores no han sido caracterizados
o aislados y difícilmente se podria emplear ese argumen
to para explicar el efecto miotóxico (post sináptico) que
se observa solamente cuando se aplican concentraciones al
tas de complejo crotoxina a preparación neuromuscular:
aislada (Breithaupt,1976b; Hawgoody Smith,1977).
 24

Carácter de nuestra contribución al problema.

Ante este estado de cosas se procedió al aislamiento y purifi

cación hasta homogeneidad de las subunidades A y B del complg
jo crotoxina asi comola caracterización de sus propiedades
desde el punto de vista enzimático y tóxico. A continuación
se ensayó la reformación del complejo crotoxina a partir de
subunidades A y B aisladas y se compararon las propiedades del
complejo reconstruido con las del complejo crotoxina nativo.
La disponibilidad de preparaciones purificadas de crotoxina A
B y complejo crotoxina reconstituïdohizo posible revisar las
consideraciones básicas en que se apmülel modelo propuesto.

(1) En primer lugar se expkxó la accesibilidad y eficiencia

funcional del sitio activo de la fosfolipasa A2 en el complg
jo crotoxina en comparación con las propiedades que presenta
en la crotoxina B aislada empleando soluciones monoméricas
de lecitinas de cadena corta obtenidas por síntesis química.
Se demostró que el sitio activo de la fosfolipasa A2 Aen. el
complejo crotoxina es libremente accesible y cataliticamente
eficiente. La falta de reactividad de la enzima en el complg
jo con el reactivo bromuro de p-bromofenacilo debe renfinrpq;
tarse en términos de los requerimientos específicos del reag
tivo más que comoresultado de la oclusión del sitio activo.

(2) Si el sitio activo de la crotoxina B en el complejo cro­

toxina es libremente accesible al sustrato (monomérico) y oa
talíticamente funcional, la inhibición de la actividad fosfg
lipásica de la crotoxina B, propiedad caracteristica de la
 25

crotoxina A, se observa únicamente cuando el sustrato se en­

cuentra agregado, pero no con sustrato monomérico. Las ev;
dencias experimentales obtenidas sugieren que la crotoxina B
presenta un "sitio" funcional y topográficamente distinto del
sitio activo responsable del "anclado" de la enzima a interfg
ses fosfolïpidos-agua. La interacción de este "sitio" con in
terfases es aparentemente un prerrequisito para la "activa
ción interfacial" de la enzima. La inhibición de la activi­
dad fosfolipásica de la crotoxina B por crotoxina A se debe­
ria a que al formarse el complejo crotoxina, la subunidad A
bloquea la exposición de este "sitio" de la crotoxina B impi­
diendo así el anclado de la enzima a la interfase y, en consg
cuencia, la activación interfacial de la enzima.

(3) Si bien esta interpretación explica por qué el complejo

crotoxina debe disociarse a nivel de la membranablanco que­
dando la crotoxina B unida a la membrana, queda como incógni­
ta qué condición caracteristica de la membranapresináptica
en la unión neuromuscular es capaz de promover la disociación
del complejo. La acetilcolina, que se encuentra permanente­
mente en la proximidad de la membrana presináptica es un
agente disociante efectivo a las concentraciones en que se
encuentra normalmenteen el espacio intersináptico.
El gradiente de concentración de acetilcolina existente en g
se espacio y resultante de los procesos de liberación y re­
captación a nivel de la membranapresináptica y el de hidró­
lisis por la acetilcolinestarasa a nivel de la membranapost­
sináptica (Chang Lee, 1977) así comoel efecto miotóxico ob­
 26

servado cuando se aplica crotoxina a preparaciones neuromuscu­

lares aisladas en concentraciones altas (Breithaupt,1976; Haw­
good y Smith,1977) apoyan el rol de la acetilcolina en la deter
minación del blanco de la crotoxina.
Sobre estas bases experimentales se propone un módelo minimo pa
ra la acción del complejo crotoxina, que si bien puede no ser
la única explicación plausible, tiene la ventaja de estar fun­
damentado sólo en datos experimentales demostrados.
Al respecto, es pertinente considerar que la validez de un mode
lo, comorepresentación simplificada que explique el comporta­
miento del sistema real, depende del número de parámetros que
el modelo requiere. Cuanto mayor sea el número de entidades
incluidas en el modelo, mayor será el número de parámetros re­
queridos. Si la evidencia experimental disponible a partir del
sistema real es limitada, confusa o contradictoria, un modelo
con un número grande de parámetros tiene poco valor, ya que el
ajuste de los parámetros a los datos experimentales es un procg
so extremadamente ambiguo. Este es un punto crucial en el dise
ño de modelos físicos para sistemas biológicos, no siempre teni
do en cuenta.
 CAPITULO I

"La ¿cience deó pnojetó conóióte

a pneuen¿n Le¿ diáfiicufitéó de ¿'execution".
La Rochefioucauid
Réáiex¿onó, ¿entenceó
et maximeb monaieó
 MATERIALES Y METODOS

Generalidades

l) Veneno: El veneno fue extraído de especimenes sanos de

Crótalus durissus terrificgg mantenidosen cautiverio en
nuestro laboratorio.en cajas individuales - a 28°C-.
Los ofidios son alimentados con un ratón (25-28 g) por se­
mana. En estas condiciones se obtienen sobrevidas en cau­
tiverio mayores de 2 años. Las extracciones de veneno se
efectúan cada 20 dias. El veneno, colectado en placas de
Petri mantenidas sobre hielo se centrífuga a 16000 g duran
te 20 min.a 4°C y el sobrenadante, cuidadosamente separado,
se liofiliza y se mantiene en recipientes herméticos a
-60°C.

2 V
Materiales de fraccionamiento: Los tamices moleculares
Sephadex G-lOO Sephadex G-75 (S.F.); Sephadex G-25 (fine
grade) de Pharmacia Ltd.,Uppsa1a, Suecia, se prepararon de
acuerdo cdn las indicaciones de los fabricantes. Los in­
tercambiadores de iones DEAE-Sephadex A-SO y CM-Sephadex
C-50 (Pharmacia) se lavaron de acuerdo con la técnica des­
crita por Himmelhochy Peterson (1966).
Para la separación y purificación de fosfolípidos se emplg
aron óxido de aluminio (E.Merck, Darmstadt) y ácido silici
co (Mallinckrodt). El análisis de fosfolípidos se efectuó
P0r cromatografía en la capa delgada sobre placas de Silica
Gel (TLC-LKSV-Whatman). Los cromatogramas se desarrolla­
ron con cloroformo-metanol-agua (65:35:4, en volumen) y
 28

las manchas se revelaron con vapores de 12,0 bien por car­

bonización (30 min a 150°C) luego de haber sido tratadas
con un aerosol conteniendo formaldehído-SO4H2(3:97 en volu
men).

3) Otros reactivos y.métodos analíticos: Todos los reactivos

empleados fueron de calidad analítica. La albúmina de sue
ro bovino (BSA), el bromuro de p-bromofenacilo (pBPB), el
ácido iodoacético (cristalizado de una solución de etanol
segúnVidal y col.(l972)), la fosforilcolina (sal de cal­
cio) y acetilcolina se obtuvieron en Sigma Chemical Co.
(St. Lewis,Mo.,U.S.A.). El suero antiorotálico (Serie INM,
1976) fue proporcionado por el Instituto Nacional de Micro
biología "Dr. Carlos G. Malbrán". Los marcadores de peso
molecular empleados para calibrar las columnas de Sephadex
y en electroforesis en gel de poliacrilamida se obtuvieron
de MannResearch Laboratories (Richmond,Ca.,U.S.A.).
'Debido a la propiedad de la fosfolipasa A2 básica de que­
dar fuertemente absorbida al material de vidrio, las frac­
ciones se colectaron en tubos plásticos (Polystor) en to­
das las etapas de purificación. La concentración de protg
Inas en las fracciones eluidas se siguió espectrofotométri
camente a 280 nm. Las fracciones correspondientes a cada
pico se combinaron y se evaluó su contenido en proteína
por el método de Lowryy col.(l951) para el cálculo del
rendimiento del método. Luego se concentraron por filtra­
ción bajo nitrógeno en una celda Amicon(AmiconCo., Bloom­
ington, Ma.,U.S.A.) de 60 ml provista de membranaDiaflo
 29

UM-OSó UM-lO. Sin embargo, por la razón mencionada más

arriba las fracciones conteniendo fosfolipasa A2básica
debieron ser concentradas en CM-Sephadexequilibrada con
0.1M, formiato de amonio a pH 3.5 (baja fuerza iónica) pg
ra la retención de toda la proteina que fue luego eluida
en bloque por un fuerte incremento de la fuerza iónica
(3Mformiato de amonio a pH 3.5). El pico de fosfolipasa
A2 basica concentrada de esta manera fue dializado en ce­
lofán (Fisher Scientific Co.,Pittsburg, Pa.,U.S.A.) cut­
off PM12.000 La diálisis en celofán es el método
que permite la mayor recuperación de fosfolipasa básica.
La desalinización en columna de Sephadex G-25 es inapro­
piada para la fosfolipasa.básica, pero fue el métodouti­
lizado para desalinizar otras fracciones. Cuandofue ne­
cesario evaluar el contenido en proteinas de soluciones
muy diluidas se utilizó el método de Esen (1978) que em­
plea el azul de Coomass.eR-250 (pro análisis) como colg
rante específico.
Los contenidos de P de las soluciones de fosfolípido fue­
'ron determinados según el método de Chen y col. (1956) m9
dificado por Rouser y Fleischer (1954) con una sensibili­
dad hasta el décimo de microgramo de fósforo.

4) LIEidos: La fosfatidilcolina de yema de huevo se preparó

por cromatografía en óxido de aluminio y ácido silicico,
de acuerdo con el procedimiento de Ansell y Hawthorne
(1964). Su composición en ácidos grasos fue determinada
por cromatografía gas-líquido de los ésteres metílicos.
 30

Las lecitinas 1,2-dihexanoil-[PC(6:0)]; 1,2-diheptanoil­

[PC(7:0)]; 1,2-dioctanoil-[PC(8:O)] y 1,2-dimiristoil-[PC
(1420)]—sn-glicero-3-fosforilcolina se prepararon por sín­
tesis química por el método de Cubero Robles y Van den Bergh
(1969) o se adquirieron en Avanti Polar Lipids Inc., Birmig­
ham,U.S.A. Las 2,3-diheptanoil[D-PC(7:0)] y 2,3-didecanoil
[D-PC(10:0)]-sn-glicero-l-fosforilcolina fueron enviadas
por el Prof,Dr. G.A. De Haas (Universidad-del Estado, Utrecht,
Holanda); la pureza de las muestras fue ensayada por cromatg
grafía de capa delgada. La miristoil lisolecitina (l-mirig
toil-sn-glicero-3-fosforilcolina) fue preparadapor hidróli­
sis enzimática de PC(14:0) usando fosfolipasa A2_purificada
de veneno de Bothrops neuwiedii, de acuerdo con el método
descrito por Vidal y Stoppani (1971). El ácido graso libre
y la miristoil lisolecitina se separaron por cromatografía
en ácido silicico (Vidal y col.,1978).
La concentración micelar crítica de cada una de las lecitinas
de cadena corta fue evaluada por el corrimiento de la máxima
absorbancia de la Rhodamina 6G (British Drug Houses Ltd.,
England) ocasionado por su incorporación en la interfase de
las micelas que se forman al incrementar la concentración de
fosfolípido (Bonseny col.,1972) Fig.I-1. Los valores obte­
nidos fueron: 10 mmpara PC(6:0), 1,6 mmpara PC(7:0) y 0,19
mmpara PC (8:0). La c.m.c. de PC(14:0) es de 6 x 10-7 M
(Vidal y col.,1978) y la de las micelas mixtas de D-PC(10:0)
y liso PC(14:0) de 7 x 10-5 M.
 31

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Fig.I-1: Determinaciónde la concentración micelar crítica (c.m.c.) de

PC (7:0) por espectrofotometría diferencial. El cambiode pen
diente observado en el gráfico (0-0) por incremento en la con­
centración de licitina es indicación de la formación de agrega
dos debido al corrimiento en la absorbancia máximade la Rhodg
mina 6G al incorporarse a micelas (inserto).
Log [PC(7:0)] en función de la absorbancia permite obtener dos
rectas (A——-A)
que extrapoladas se interceptan en el punto co­
rrespondiente al valor de la c.m.c. en las abscisas. 0,2 mg/ml
Rhodamina 6G.

Las muestras de dihexanoil [PC(6:0)], diheptanoil [PC(7:0)]

dioctanoil [PC(8:0)]lecitinas y miristoil lisolecitina se
conservaron en etanol absoluto a -20°C.
Las muestras de D-didecanoillecitina [D-PC(10:0)] Y dimi­
ristoil lecitina [PC(14:0)] se conservaron en C14Ca -20°C
y la de lecitina de yema de huevo en hexano a -20°C.
Las suspensiones acuosas de las lecitinas de cadena corta
PC(6:0), D ó L-PC(7:0) y PC(8:0) se prepararon a partir de
muestras en medio orgánico que se desecaron bajo nitrógeno
y se suspendieron en un volumen apropiado de agua para ob­
 32

tener una concentración final de 15-20 veces la concentra­

ción micelar crítica correspondiente.
Se obtuvieron soluciones micelares claras con PC(6:0) y PC
(7:0) a temperatura ambiente, mientras que la solución a­
cuosa de PC(8:0) fue necesario mantenerla a 40°C para evi­
tar la separación en dos fases.
Las micelas mixtas de D-PC(10:0)y miristoil lisolecitina
(relación molar 1:1) fueron preparadas mezclando los fos­
folípidos disueltos,a concentraciones apropiadas, en sol­
ventes orgánicos que fueron luego evaporados. E1 residuo
secofue resuspendido en agua a una concentración de apro­
ximadamente 50 veces la c.m.c. La solución micelar clara
se mantuvo a 25°C. Las vesículas unilaminares de PC(14:0)
fueron preparadas por dispersión de fosfolípido seco en
0,15 MNaCl con ayuda de un vortex (concentracion final
3.0 mm), y sonicación de la suspensión en hielo con un de­
sintegrador ultrasónico MSE(Measuring and Scientific E­
quipment, Ltd.,London) a 20 KHz. Luego de 20 minutos de
sonicación en hielo la temperatura fue elevada a 25°C has­
ta finalizar el tratamiento (tiempo total: aproximadamen­
te 40 minutos o hasta clarificación de la solución cuando
aparece el efecto óptico de Tyndall). Las vesículas así
obtenidas fueron incubadas durante 60 minutos a 42°C para
su anillado (Lawaczecky col.,1976%. Las vesículas uni­
laminares fueron separadas de las multilaminares por cen­
trifugación según el método de Barenholz y col(1977) o por
cromatografía en Sepharosa 4B (Ver figura I-Zh.
 33

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Fig.I-2: Separación de vesículas unilaminares. A.Cromatografía en Sepng

rosa 4B-CL (110 x 2,3 cm) equilibrada con ClNa 0,15 M, Tris-HCl
25 mMpH 7,4. Flujo 2 m1.Cm_.hr'l. B.Corre1acíón entre Abs300
y contenido de P lipídico considerando únicamente tubos que es­
tán sobre la recta (zona grisada de A).

Identificación de Zas fracciones

1) Electroforesis en gel de poliacrilamida: La separación

electroforética de las distintas fracciones se llenó a cg
bo sobre la base del método descrito por Laemmli (1970)
con acrilamida 15%como gel de corrida y 3% en el gel de
concentración, conteniendo 0.1%(P/V) de dodecilsulfato de
sodio en amortiguador de Tris-ClH 0.125 M, pH 6.8. Las
muestras (5-20 mg de proteina) se corrieron durante 2-3
horas con una corriente aplicada de 3 mA/gel. Los geles
 34

se lavaron y fijaron durante 48 horas en ácido tricloroacg

tico 10% (P/V), luego en ácido acético 7% (V/V) y finalmen
te en una mezcla de isopropanol-ácido acético-agua (2,5:
1,0:6,5 en vol.) y el exceso de dodecilsulfato de sodio
fue eliminado de los geles por iontoforesis (30 mAdurante
3 hs., Fairbanks y col.,1971). Finalmente fueron teñidos
con Amido-Schwartzy decolorados por iontoforesis.

2 V Innmunoelectroforesis: Se llevó a cabo sobre portaobjetos

con una base de agar 0.5%(P/V) cubiertos con una capa con­
teniendo 1,5 g de agar en 100 ml de amortiguados de ácido
dietilbarbitúrico-dietilbarbiturato de sodio pH8.6, con
una fuerza iónica de 0.05. Las muestras (2-4 Pg de prote­
ïna) se corrieron durante 90 min. con una corriente aplica
da de 5 mA/portaobjeto. Se separó el gel de la cavidad
central, que fue cargada con suero anticrotálico, y se per
mitió la difusión de los componentes durante 48 horas. Los
portaobjetos se lavaron con solución ClNa 0.15 My agua bi
destilada durante 72 horas.
Finalmente, los portaobjetos fueron secados a 37°C, teñidos
con solución de Amido-Schwartz y decolorados en solución
de metanol-ácido acético-agua (4,5:1,0:4,5 V/V).

3) Determinación de peso molecular: El peso molecular de las

fracciones purificadas se determinó por dos procedimientos,
a saber:
(a) Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato de sodio (SDS), tal comose ha descrito
 35

más arriba, de acuerdo con el método de Laemmli (1970).

Se determinó la mobilidad de cada banda y se comparó
la mobilidad de las fracciones con los marcadores de
peso molecular conocido (Ver figura I-3)

(b) Cromatografía en tamices moleculares (Sephadex G-lOO):

El gel previamente hidratado se empaquetó en una colum
na de 100 x 1.2 cm adaptada para flujo ascendente. La
columna se equilibró con la solución amortiguadora a­
propiada a 4°C. Las muestras se sembraron a través de
una jeringa (250Au) provista de una llave de tres VI­
as. La elución se llevó a cabo a una velocidad de flu
-1
jo de 1,2 ml.cm-2.h ajustada mediante una bomba pe­
ristáltica Gilson MinipulsZ (Francia) y se colectaron
fracciones de 0,5 ml en un colector LKB2070 Ultrorac
II (Suecia). El volumen de la fracción excluida (V0)
se determinó como el volumen de elución de Blue-Dedzan
2000 que fue medido en el eluido espectrofotométrica­
mente a 620 mm. Los volúmenes de elución de los dis­
tintos marcadores (Ve) fueron determinados de acuerdo
con el procedimiento de Andrews (1964,1965) y se deter
minaron los valores de Kav “Kav = Ve - Vo)/(Ve - Vo)]
para cada marcador. Los valores de Kav se representa­
ron gráficamente en función del log. del p.m. y se ob­
tuvo una recta, cuyos parámetros coinciden con los des
critos previamente por Determann(1969).(Fig.I-3).
 36

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Ve-Vo Vt-
Vo
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Log. peso molecular

Fig.I-3: Determinación de pesos moleculares por filtración en .gel de S_g

phadex (G-100). Los marcadores utilizados son: (1) Sero albú­
mina bovina, dímero; (2) sero albúmina bovina, monómero; (3) 2
voalbümina; (4) quinotripsirógeno A; (5) Complejo crotoxina; '
(6) mioglobina; (7) citocromo c. ­

4) Fluorescencia intrínseca: La fluorescencia intrínseca de

la crotoxina y de sus componentes fue medida luego de ex­
citar las muestras con una longitud de onda inCidente de
290 nm.y registrando su espectro de emisión entre 300 y
600 nm con un espectrofluorometro automático Aminco Bow­
man (American Instrument Co.) a 20°C. Los espectros de
emisión fueron registrados en un Tohshin Electron (Japón)
sincronizado con el espectrofluorómetro.

5) Determinación de la toxicidad: La toxicidad de las frac­

 37

ciones purificadas fue comprobadaen ratón por vía intrapg

ritoneal. El cálculo de la DL50 (dosis letal media o do­
sis a la que el 50%de la población es sensible) es un'mé­
todo aproximativo que permite comparar valores numéricos,
y hablar de potencia tóxica de una sustancia, comopor e­
jemplo de la crotoxina o de sus componentes. Sin embargo
la DL50es independiente del tiempo de sobrevida de la po­
blación. El método de Litchfield y Wilcoxon (1949) permi­
tió determinar rápidamente las dosis medias efectivas con
limites de confianza (P = 0.05) dados por el test de X2,
utilizando métodos gráficos simples. El número de dosis
empleadas fue cinco (a intervalos de 10 unidades en el ran
go de toxicidad del veneno entero de Crotalus durissus te­
rrificus) y se inyectó a 6 ratones por dosis.

Actividad biológica de Zas fracciones

Preparaciones neuromusculares: Los preparados de nervio

frénico-diafragma de ratón fueron aislados comodescripto
por Bulbring (1949) y montados en una cámara de acrilico
(Fig.I-4A). El material de la cámara fue elegido en razón
de la fuerte absorción de la fosfolipasa A2 al vidrio. El
diafragma fue sumergido en una solución Ringer-Krebs de
composición: (mM) NaCl 118, KCl 4,8, NaHCO325, CaC122,5,
glucosa 11,2; a temperatura ambiente, ventilada con 95%
02-5% C02.
El pH de la solución fue de 7.4. El nervio frénico, sepa
 38

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Fig.I-4A: Cámarade incubación para preparados de ciático-sartorio de ba­

trac1o .

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Fig.I-4B: Cámarade incubación para preparados de frénico-diafragma de

ratón.
 39

rado del diafragma por un film de vaselina, fue montado en

un compartimento húmedoen contacto-con electrodos de est;
mulo y de registro como se muestra en la figura 4 A. De
la mismaforma, los preparados de “ciático-sartorio de sa­
po fueron montados en una cámara construida especialmente
(Fig.4 B) y el músculo fue sumergido en una solución Rin­
ger para batracios de composición (mM): NaCl 112, KCl 3.2,
CaCl2 2.7, Na2 HPO4 2.0, Tris 0,2, de pH 7.2 a 25°C y con
ventilación de 95%02-5% C02. La contracción del músculo
fue provocada por estimulo directo o indirecto con pulsos
rectangulares supramaximales de 0,5 a 2,0 volt y 20-30
msec de duración (indirecto) o de 10-30 V durante 0,1 msec
(directo). Se registró la tensión isométrica del músculo
por medio de un transductor fuerza-desplazamiento Grass
modelo FT03C acoplado a un poligrafo SAN-EI (Japón) Surgi
cal Monitor Type 5508. Se controló el estado del nervio
y del músculo registrando sus respectivos potenciales de
acción con un sistema de amplificación conectado a un os­
ciloscopio Beckman.
El sistema experimental descrito permitió comparar el e­
fecto neurotóxico de la crotoxina y de sus componentes pu
rificados al de drogas de acción semejante comoel curare
'y la galamina.

2 V Preparados para microscopía óptica y electrónica: El e­

fecto neurotóxico de las fracciones fue estudiado en el
tejido blanco. Se eligio el diafragma de ratón por su fé
cil disección y localización de los botones presinápticos.
 40

La zona rica en terminales nerviosas fue localizada por me­

dio de 1a coloración específica de Karnovsky (1964) que po­
ne en evidencia la acetilcolioresterasa del espacio sinápti
co. El tejido ligeramente*fijado en formaldehído 2%en a­
mortiguador fosfato, pH 7.6, fue incubado en presencia de
un sustrato de la acetilcolinesterasa, la acetilcolina cuyo
producto de hidrólisis es coloreado en presencia de sulfato
de cobre y ferricianuro de potasio a pH 6.0. La distribu­
ción de botones presinápticos aparece claramente en la figu
ra I-5.Los diafragmas incubados en ausencia del sustrato de
acetilcolinesterasa no resultaron coloreados.
Se procesó la región de botones terminales para microscopía
electrónica de la siguiente forma: se fijó el tejido por in
mersión en glutaraldehido 1%en amortiguador Millonig a pH
7.4 durante 60 minutos, los fragmentos fueron postfijados
en Oso4 1%en Millonig , luego deshidratados en una bateria
de alcoholes, coloreados"in toto"con acetato de uranilo 2.5
%y embebidos en Epon 812. Fueron cortados para el micros­
copio electrónico en un ultramicrótomo LKB(Suecia) y monta
dos en grillas cubiertas con Parlodion (Fischer). Los cor­
tes ultrafinos con color de interferencia plateado a blanco
fueron contrastado con acetato de uranilo 1%y citrato de
plomo (Reynolds, 1963) y observados en un microscopio Jeol
JEM100C transmision electron microscope.
Tres grupos de 9 ratones fueron inyectados por via intrape­
ritoneal con 10 veces las DL50de crotoxina inativa, croto­
xina B y crotoxina reconstituída respectivamente, y fueron
sacrificados a distintos tiempos luego de aparecer los pri­
* Entiéndase no más de dos horas.
 41

meros sintomas de bloqueo respiratorio (taquipnea, disnea­

y apnea). ‘En algunos especimenes se realizó la disección
luego de 1a muerte por asfixia.

Fig.I-5: Distribución de botones presinápticos en diafragma de ratón .

puestos en evidencia con el método de Karnovskypara la acetil
colinesterasa localizada en el espacio sináptico.
\

P Actividad Enzimática.de las fracciones

1) Actividad proteolítica: Fue medida utilizando caseína co­

mo sustrato según el método de Kunitz (1947) modificado
por Wagnery Prescott (1966).

2) Actividad-fosfodiesterasa: Fue medida por el método de Sul

kowskiy col.(1963) utilizando bis-(p-nitrofenil fosfato)2
 42

comosustrato.

V Actividad tamesterasa: Fue determinada por eh método es­

pectrofotométrico descrito por Hummel(1959) y demostrado
por Seki y col.(1980).

V Actividad fosfolipasa A: La crotoxina presenta actividad

fosfolipasa A2 y el componenteresponsable de la neurotoxi
cidad de la crotoxina es una fosfolipasa A2, de modoque
esta actividad enzimática fue determinada utilizando dis­
tintos métodoscon el propósito de caracterizar a la crotg
xina y comparar la acción biológica con sus propiedades en
zimáticas.
a) Métodotitrimétrico: Descripto por Vidal y col.(1977),
este método fue utilizado para las medidas de rutina de
actividad fosfolipasa A2. Consiste en la titulación de
ácidos grasos liberados de una emulsión de yema de huevo
(25 i pmol P.m1'1 , ClNa 0,2 M; C12Ca 5,0 mM; volumen fi­
nal: 9 ml) equilibrada a 10°C en un autotitulador Radio­
meter TTT2 equipado con una autobureta ABU12 como dis­
pensador de OHNa0,1 N. El pH de la mezcla se ajusta a
8,0 y se registra el consumode álcali requerido para man
tener el pH durante 5 minutos. A tiempo cero se adiciona
la solución de enzima en ClNa 0,15 My se registra el con
sumo de álcali para mantener el pH en 8,0 durante 3 min.
Una unidad de actividad se define comoel consumo (libera
ción) de 1 quuiv. de álcali (acido graso) por min. en
las condiciones experimentales mencionadas. La actividad
especifica se calcula como número de unidades por mg de
proteína.
 43

b) Métodoturbidimétrico: (Marinetti, 1965) Se preparó el

medio de reacción de 0,5 a 0,8 ml de una suspensión de
yema de huevo (0.32 i 0,03 umol p. ml’l) en 0,15 M ClNa
ajustada a pH 6.8 y equilibrada a 30°C en una cubeta de
espectrqfotómetro. ‘Se agregó 200 ul de muestra de acti
vidad desconocida. El cambio de absorbancia (925 nm)
de la mezcla se comparó con el de un control (al cual
se le agregó 200 ul de solución 0,15 M ClNa) que fue a­
justado a una absorbancia (925 nm) de 0,600 en un espeg
trofotómetro Gilford 250. Una unidad de actividad está
definida como la cantidad de enzima que produce una dig
minución de 0¡001 unidades de absorbancia por minuto.

CV Método semicuantitativo de la coagulación de 1a yema

de huevo: (Habermann y Neuman, 1954) A 2 m1 de una sus­
pensión de yema de huevo al 45% (V/V) (95 i 3 umol P.
ml-l) en 0,2 ClNa, 20 mMc1 2 c1, 1 mMEDTA y 5 mMamorti
guador Tris-HCl, pH 8.0 a 37°C se agregó 200 ul de mueg
tra de actividad desconocida en 0,15 MClNa. Se incubó
la muestra a 37°C con agitación durante 30,60 o 90 ming
tos. Se midió el tiempo de coagulación de la yema de
huevo de las muestras llevadas a 100°C en un baño María
en ebullición. Una unidad de actividad está definida
como la cantidad de enzima que aumenta en 1 minuto el
tiempo de coagulación del control. Los controles mues­
tran invariablemente un tiempo de coagulación de 90 Í
10 seg.

d) Análisis cualitativo y cuantitativo de los productos de

 44

reacción: Cuandola actividad fosfolipasa A2 debió ser

medida en medios fuertemente amortiguados se Signió el
CUISOde la hidrólisis en forma discontinua con alicuo­
tas de 1 ml de reacción (10 mMClZCa, 50 mMamortigua­
dor, a 30°C) conteniendo 40 ul de la muestra de activi­
dad desconocida en 0,15 MClNa. A distintos tiempos se
detuvo la reacción con 0,1 ml de EDTA0,3 M y se suspen
dió la alícuota en 10 ml de etanol absoluto. Las mues­
tras fueron evaporadas en un evaporador Buchi (Suiza)
termostatizado, suspendidas en benceno, secadas bajo ni
trógeno y retomadas en 200 ul de etanol absoluto. Ali­
cuotas de 20 a 50 ul de esta suspensión fueron sembra­
das en capa delgada de silica gel y resueltas en cloro­
formo-metanol-agua (65:35:4 V/V). Las manchas de leci­
tina y lisclecitina fueron reveladas y los Rx compara­
dos con patrones cromatografiados simultáneamente. Se
raspó cada mancha y se midió su contenido en fósforo.
Se determinó la hidrólisis relativa de lecitina en cada
tiempo. Los controles de composición similar fueron in
cubados en ausencia de enzima o en presencia de 30 mM
EDTAagregada en el tiempo cero. Los resultados negati
vos de amboscontroles permitieron (1) descartar la hi­
drólisis espontánea del sustrato y (2) la actividad en­
zimática posterior a la activación de la fpsfolipasa A2
por el gel de separación de los productos de hidrólisis
(ver Goerke y col.,1971).

e) Método espectrofotométrico: El uso del sustrato monomg

rico (ver Apéndice A) genera problemas en la titulación
 45

de productos de hidrólisis por la sensibilidad inadecua

da del métodotitrimétrico que restringe la reproducibi
lidad de resultados debido a las bajas concentraciones
de sustrato utilizadas. Por otro lado la alta absor­
ción de la fosfolipasa A2 básica a las superficies de
vidrio del electrodo y del recipiente de incubación, y
su posible activación en las interfases del vidrio y de
las burbujas de aire producidas durante la agitación,
reducen aún más la seguridad de una buena determinación.
Por esta razón se utilizó el métodoespectrofotométrico
de medida continua de los productos de hidrólisis des­
cripto por Wells (1972) que tiene la ventaja de reducir
las superficies inertes y no requiere agitación.
La muestra de la cubeta de cuarzo de 1 ml fue preparada
me2clando la enzima y CaCl2 a concentraciones apropia­
das y el indicador Azul de Bromotimol 0.5 mMen OHNa20
mM,el pH se ajustó a 8.0 con hidróxido de sodio 20 mM.
El blanco fue preparado con los mismos elementos salvo
el cofactor Ca++. Las medidas fueron registradas de un
espectrofotómetro Gilson 250 a 475 nm (absorbencia mini
ma de la forma básica del indicador). Después de lle­
var el registrador a cero absorbencia se agregó rápida­
mente elsustrato a las dos cubetas. Se mezcló bien y
se conectó el registrador a una velocidad de l cm/lO seg.
Un cambio de absorbencia de 0.01/10 seg. corresponde a
0.05 equiv. de ácido graso liberado por minuto. La ve­
locidad de hidrólisis es lineal Con la concentración de la
enzima y no se observan cambios de absorbancia en ausen
 46

cia de la enzima o en presencia de sustratos no hidro­

lizables (lecitinas de la serie D).
f V Método de la titulación de hidroxamatos: De Browny
Bowles (1966) modificado por Augustyn y Elliott (1969)
fue puesto a punto para evaluar 1a cinética de nidróli
sis de sustrato monoméricoren:función del pH (verCinéti
cas.fie hidrólisis,Cap.V.y VII).Los métodostitrimétrico
y espectrbfotométrico no admiten variaciones de pH, pero
el método de titulación de hidroxamatos permitió eva­
luar la hidrólisis de sustratos homogéneosentre pH 4.0
y 10.0 comose describe a continuación:
A una alícuota de 280 ul de la mezcla de reacción —1
(fosfolípido, enzima y C12Ca)se agregó, a distintos
tiempos, 400 ul de etanol absoluto y 200 pl de solu­
ción I preparada en el día mezclando l volúmen de 3.5
N NaOHy 1 volúmen de solución de 20 g de clorhidrato
de hidroxilamina en 220 ml de metanol.
Se dejó incu­
bar la mezcla durante 30 min., por lo menos, a tempe­
ratura ambiente, para que la reacción fuera completa
(formación de los hidroxamatos). Luego, se acidificó
la preparación con 120 ul de 3.3 N HCl y se agregó
100 ul de solución II que contiene 1 volúmen de solu­
ción de 100 g de cloruro férico (FeIIICl3) en 100 ml
de HCl 1.2 N y 9 volúmenes de etanol absoluto, lo que
resultó en la coloración de las alícuotas, de volúmen
final 1.1 ml, y cuya absorbencia fue determinada a
525 nm. Una curva standard de absorbencia en función
de la concentración mMde fosfolipido proporcionó el
 47

coeficiente de extinción nME = 0.32 .

La concentración de hidroxamatos formados en la reac­
ción con clorhidrato de hidroxilamina básico es el re­
flejo de la actividad hidrolítica de la fosfolipasa A2:

fosfatidilcolina
fosfolipasa A2
—————————————a.lisofosfatidilcolina
+ ácido graso
2 acil hidroxamatos 1 acil hidroxamato
+ _ +
glicerüfosforfl colina gliceerosforfl.
colina
Cuandola hidrólisis de fosfoleido en el medio de re­
acción es completa la concentración de hidroxamatos fo;
mados es 50%de 1a concentración inicial de hidroxama­
tOS .
 48

Inhibición de la actividad fosfolipasa A2

Se utilizaron inhibidores enzimáticos tales comoagentes

reductores y alquilantes (ver Capitulo II). Se observó que
el sitio activo de la enzima es especificamente sensible a
bromocetonas apolares comoel bromuro de P;bromofenacilo,
mientras que .10 es .menoa por bromoacetonas polares como
"¿1 ácido iodoacético. El bromuro de p-bromofenacilo modifi
ca de manerairreversible un residuo histidina del sitio ag
tivo de las fosfolipasas A2 (Volwerk y col., 1974). De acuer
do con el protocolo experimental utilizado se incubó la enzi
ma en presencia del inhibidor a una concentración ligeramen­
te superior a la de su solubilidad en medio acuoso que es de
10’4 M, y en relación molar enzima a .inhibidor de 1:65. En
dichas condiciones la concentración del reactivo disuelto se
mantiene constante y la reacción obedece una cinética de pri
mer orden. La constante de velocidad de inactivación de
pseudo primer orden (k') fue calculada a partir de gráficos
semilog de acuerdo con la relación:

[CB]
2,303 log o (1)
t [CBt]

donde [CEO] es la actividad enzimática inicial y [CBt] es

la actividad residual luego de t minutos. Cuando [CBt]=
1/2 [CBC], t = tl/2 (es decir, el tiempo medio de inactié
vación) y la ecuación (1) se reduce a k' =[2,303/tl/2]logz=
= 0.693/t1/2 .
 49

Se obtuvieron idénticas velocidades de inactivación a con

centraciones de pBPB entre 5 y 500 veces la concentración
molar de enzima, lo que confirma que la velocidad de inactiva
ción de las fosfolipasas A2 depende solamente de la concentra
ción de inhibidor disuelto.
Conel objeto de determinar las velocidades de inactiva­
ción de la fosfolipasa A2 básica y del complejo crotoxina en
distintas condiciones (por ejemplo, presencia o ausencia de
sustrato y cofactor) y en función de pH se empleó amortigug
dor Tris-maleato 0.1M, pH 5,0-7,5, ClNa 0.1M. Experimentos
control demostraron que no hay efecto de pH sobre la solubili
dad de pBPB. Las velocidades de inactivación fueron determi
nadas evaluando la actividad enzimática residual de aliomfiïs
prelevadas a distintos intervalos de tiempo. La reacción
de inactivación fue detenida, en todos los puntos, por la adi
ción de formiato de amonio pH 3,0, ClNa 0.1M . En el caso
del complejo crotoxina estas condiciones favorecieron la disg
ciación total del complejo y la evaluación de la actividad
fosfolipasa real. Los experimentos fueron realizados a 3012°C.

Experimentos de ligadura directa

La interacción de la fosfolipasa A2 básica pura y en el

complejo con el sustrato fue medida utilizando la técnica de
filtración en gel de aephadex en condiciones de equilibrio
(Hummaly Dreyer, 1962). Se empleó como ligando el análogo
no hidrolizable del sustrato D - diheptanoil hxitfiutD-PC(7:0)
 50

en solución monomérica, con el que se equilibró una columna

de Sephadex G-7S (14 x 1,2 cm) amortiguada a pH 8,0 , utili
zando 50 mr1 Tris-HCl. Una muestra conteniendo 10.2 /¿moles
de complejo crotoxina a pH 8.0 fue sembrada en la colum­
na y se determinó el perfil de eiución de la muestra en
relación con la concentración de lipido por evaluación del
contenido de proteina y de P de la fracción.
No se pudo realizar experimentos de ligadura en equili­
brio en presencia de la fosfolipasa A2 básica por su fue;
te tendencia a interactuar con los geles de separación (Brei
thaupt, l976a).
Se emplearon micelas mixtas de D- didecanoillecitina ,
D-PC(10:00) y L-ldniristoil lecitina en relación molar 1:1
para evaluar la interacción del complejo crotoxina y de la en
zima interfases lipido-agua. Muestras de la enzima y del com
plejo crotoxina fueron incubadas con micelas durante 60 minu­
tos y fueron luego cromatografiadas en una columna de Sepha­
dex - G 75 equilibrada a. pH 8.0 ó 10.0.
Las fracciones eluïdas fueron analizadas y se determinó
el contenido de proteina (Esen, 1978) de P lipidico (Rouser
y Fleischer, 1967) y la actividad enzimática de cada una.
 CAPITULO II

"Pnactica en iaó caóaó pequeñaó, pon

el aman del cielo, y ¿uego pnocede
a ¿datan Laó gnandeó."
Epictetuó
D¿¿cunóo¿ IV.¿
 51

PURIFICACION DE LOS COMPONENTES DEL COMPLEJO CROTOXINA

La serpiente de cascabel sudamericana, Crotalus durisus terri­

figgs, produce un veneno fuertemente neurotóxico a diferencia
de otras especies de crotálidos. Su picadura provoca hipoto­
nía muscular y parálisis flácida que podrían hacer pensar en
los efectos de los venenos de elápidos que poseen neurotoxi­
nas postsinápticas que bloquean el receptor de acetilcolina.
El agente neurotóxico del veneno de C.d. terrificus responsg
ble de estos efectos posee actividad fosfolipasa A2. Muchas
de las toxinas más potentes aisladas de los venenos de ofidios
son fosfolipasas A2 o están constituidas por fosfolipasas A2
asociadas a polipéptidos de peso molecular ligeramente menor
o similar. Estas toxinas son generalmente de acción neurotó­
xica, miotóxica y/o citotóxica. La crotoxina es el agente neu
rotóxico de este veneno del cual constituye un 60-65%del peso
seco y es un complejo no covalente formado por dos tipos de
fosfolipasa A (una ácida, pHi 4,7 y una básica, pHi 9,6)(Horst
y col., 1972; Breithaupt y col., 1975) y una proteína ácida
(pHi 3,7) no enzimática (Horst y col., 1972). La fosfolipasa
A2 básica es neurotóxica (DL501,0 ug/g) mientras que la fos
folipasa A2 ácida y la proteina ácida, no enzimática carecen
de toxicidad (DL50‘>50ug/g). Sin embargo, la proteina ácida
presenta tres propiedades relevantes para la acción tóxica del
complejo crotoxina: (1) cuando se combina con la fosfolipasa
A2 básica forma espontáneamente complejos estables, de mayor
peso molecular , en los que se restituyen las propiedades fis;
coquímicas del complejo nativo, (2) incrementa la toxicidad de
la fosfolipasa A2 básica, que se hace semejante a la del com­
plejo nativo y (3) inhibe la actividad de la enzima de modoes
pecífico, es decir, no puede ser.reemplazada por polianiones
comoel ácido poliglutánico o la heparina, ni se ha podido de­
mostrar, hasta el momento,que inhiba la actividad enzimática
de otras PA2 básicas (Habermann y Breithaupt, 1978). La pre
sencia de la fosfolipasa A2 ácida no modifica estas propie­
dades.
Complejos similares has sido descritos en venenos de vipéri­
dos. Tchorbanov y col. (1978) demostraron en el veneno de yi­
pera ammodztes un complejo neurotóxico constituido por la a­
sociación de una fosfolipasa-A2 de punto isoeléctrico elevado
y una proteína no enzimática de punto isoeléctrico bajo. La
actividad enzimática_es igualmente inhibida en un 60% por la
proteína ácida que, además, es capaz de inhibir las fosfolipa­
sas A2 de otros venenos. La separación de la fracción neurotg
xica de veneno de Viperagpalestinae ha igualmente puesto en ma
nifiesto un complejo entre una fosfolipasa A2 , que es, sin em
bargo, ácida (pHi 4,0) y un componente básico (pHi 9,5). Aun­
que ninguno de los componentes es neurotóxico por si solo, que
da demostrado que la actividad neurotóxica no esta restringida
a fosfolipasas A2 de punto isoclétrico elevado. En venenos ca
racterísticamente neurotóxicos, comopor ejemplo el de Naja na­
jg, se encontraron péptidos inhibidores de la fosfolipasa A2
(Braganca y col. 1970) aunque ni las fosfolipasas A2 ni estos
péptidos estarían involucrados en el efecto neurotóxico (Tu ,
1977). Por otra parte, en otros venenos no típicamente neuro­
tóxicos, por ejemplo el de _Bothrops neuviedii (Vidal y col,
 53

1971 y 1972) se encuentran dos fosfolipasas A2 (PM‘112000),

con pHi 4,5 y 4,7 respectivamente y un péptido (PM=*3500)de
pHi 6,8 que provoca-una fuerte inhibición de la actividad en
zimática en los complejos que forma con las fosfolipasas A2 de
este y otros venenos, pero que carecen totalmente de neurotoxi
cidad.
Por sus propiedades farmacológicas la crotoxina pertenece a
la familia de fosfolipasas A2 de acción presináptica reconoci­
da entre las que puede mencionarse la B-bungarotoxina (Chang
y col., 1973) compuesta por una fosfolipasa A2 y una cadena hg
móloga a los inhibidores de proteasas de veneno y de páncreas
que está covalentemente unida a la enzima (Mebs , 1980); la
taipoxina formada por tres subunidades de pHi muydistinto
que forman un complejo estable espontáneamente; la notexina
(Kamenskaya y Thesleff, 1974), constituida por una sola cadg
na peptidica y propiedades de fosfolipasa A2 caracteristicas
(Karlsson y col., 1972). Aunque la acción de las toxinas de
tipo presináptico depende totalmente de la actividad enzimáti­
ca (Strong y col., 1976; Halpert y col., 1976; Fohlman y col.,
1976) no se ha encontrado ninguna correlación entre la toxici
dad, evaluada por los métodos convencionales, y la actividad en
zimática medida in vitro (Mebs, 1980). Por otro lado, aunque
todas ellas bloquean la transmisión sináptica por su acción a
nivel presináptico, presentan una acción post sináptica, mayor
o menor, que es inseparable de la misma forma que se ha obser­
vado que la actividad neurotóxica no excluye la posibilidad de
que dichas fosfolipasas A2 presenten propiedades hemoliticas
(Jeng y col., 1978). No se ha podido encontrar caracteristicas
 54

generales de estas fosfolipasas A2 que permitan explicar (a)

su acción presináptica predominante en función de su actividad
enzimática, y (b) cómomoléculas estructuralmente diferentes
pueden tener un mismoblanco. Estas incógnitas son probable­
mente el resultado de pretender estudiar el mecanismode ac­
ción de las fosfolipasas A2 tóxicas a través de los efectos
que producen antes de conocer exhaustivamente sus propiedades
fisicoquïmicas y enzimáticas en condiciones definidas.
En este sentido, se aisló y purificó la fosfolipasa A2bá­
sica del complejo crotoxina a partir del veneno entero. Las
propiedades de la enzima en presencia y en ausencia de la pro
teïna ácida, también purificada a homogeneidad, han permitido
dilucidar, en los capítulos siguientes, los factores responsa
bles de la especificidad para la formación del complejo, el me
canismo de potenciación de la toxicidad en el complejo y el pg
pel de ambos componentes en la especificidad de bloqueo de la
unión neuromuscular.
 55

Purificación y.fracci0namiento del complejo crotoxina

La crotoxina fue obtenido por separación del veneno crudo de

Crotalus durissus terrificus. Una muestra de 200 mgde veneno
liofilizado fue resuspendido en solución amortiguadora de for
miato de amonio 20 mM, pH 4.0 y fuerza iónica de 0.2 MNaCl.
Fue centrifugada a 10.000 g durante 10 minutos y el sobrenadan
te amarillento fue cromatografiadd en una columna de Sephadex
G-75 ascendente equilibrada y eluida con la mismasolución a::r
mortiguadora de resuspensión, comofue descrito por Seki y col.
(1981). La figura II-1A muestra el diagrama de elución de los
componentesobtenidos por determinación espectrofotométrica
del contenido de proteina (absorbancia en el ultravioleta,
longitud de onda: 280 mm), se estimó el coeficiente de absor­
bancia 8: 1,0 mM'1.crfl11uegode determinar el contenido de pro­
teina de las fracciones. El pico sombreado (ver Fig. II-lA)
es eluido con un Kav de 0.44 correspondiente al peso molecular
estimado de la crotoxina, presenta actividad fosfolipasa sobre
lipoproteinas de yema de huevo y reproduce en ratones el sin­
dromecaracterístico irreversible de intoxicación por veneno
de cascabel con una DL50i.p. 0.1 u9/9- El bloqueo irreversi
ble de la transmisión sináptica en el preparado aislado del
diafragma frénico del ratón y la disminución de la dosis letal
media respecto al veneno crudo (0.2-0.3 ug/g) constituyen prug
bas adicionales de la separación del complejo crotoxina.
 56

Nu

o
\\
1°

O .°>
Q sv
280
ABSORBANCIA
nm

p .b
9N
1 4 1 n El

50

Fig.II-1A: Diagrama de elección típico de los componentes del veneno de

Crotalus durissus terríficus cromatografiado en SephadexG-75
y pH 4,0 comodescrito en el texto. El pico sombreado corres
ponde a la fracción del complejo crotoxina. El segundo pico
importante que se eluye en último lugar es la fracción de la
crotoxina.

El pico de crotoxina fue recromatografiádo, concentrado por se

gunda vez, llevado a pH 3.5 y fuerza iónica apropiada para ser
cromatografiado contra formiato de amonio 0.1 M a pH 3.5. En
esas condiciones se separaron los componentes y se eluyeron
luego de ser sembrados en un intercambiador iónico de tipo áci
do (CM-Sephadex)(Fig.II-1B). Al introducir la muestra en
la columna de intercambiador, se retuvieron todos los
componentes con la excepción del w más ácido que
 57

constituyó la fracción I. Una vez totalmente eluido el com­

ponente no retenido, se incrementó la fuerza iónica de la so
lución amortiguadora, aumentandola concentración de formia
to de amonio como se muestra en la curva de concentración de
amortiguador, superpuesta al diagrama de elución (Fig. II-lB,
escala derecha). El gradiente cóncavo entre 0.1 My 1.0 M
formiato de amonio es una modificación del método de Brei­

B
20

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FRACCION

Fig.II-1B: Resolución del complejo crotoxina por cromatografía en CM-Sg

phadex C-SO, pH 3,5. Las fracciones obtenidas han sido numg
radas (I-V). La escala derecha corresponde al gradiente de
concentración formiato de amonio (————)
utilizado para eluir
los componentesretenidos en función de 1a fuerza iónica.

thaup y col. (1975) que permite reducir el tiempo de cromatg'

grafía al 5%, conservando la resolución de los componentes.
Después de aplicar el último gradiente (1-3 M, lineal) se
habían eluïdo cinco fracciones que fueron identificadas se­
gún su carga, peso molecular, actividad enzimática y/o acti
 58

vidad biológica.
La primera fracción ácida no retenida concentrada y dializa­
da (Sephadex G-25) , fue purificada por cromatografía en un
intercambiador iónic0(DEAE) con amortiguador fosfato a
pH 6.9 (Rübsamen y coli, 1971). Se obtuvo un pico único y
simétrico que proporcionó un sólo arco de precipitado en im
munoelectroforesis sobre agar, después de haber migrado ha­
cia el cátodo. La segunda fracción (II) presentó actividad
fosfolipasa sobre yema de huevo (1300 ümol/mm_l. mg-1 pro
teína). Fue concentrada, y en immunoelectroforesis sobre g
gar se obtuvo un arco de precipitado (después de haber migra
do ligeramente hacia el cátodo)(Fig. II-2A). La tercera
fracción fue identificada comocrotamina por su acción tóxi
ca en ratón, (ver Introducción, Pág.16 ) no poseía activi­
dad fosfolipasa A2 determinable y era probablemente contami
nante (ver Fig. II-lA). Las fracciones IV y V, básicas, fue
ron eluídas al aumentar aún más la fuerza iónica hasta una
concentración de 3Men amonio. Se eluyeron dos fosfolipasas
A (picos IV y V) de distinta actividad específica ( 40pmol.
min-1 . mg—1 de proteína y 400 umol. min_1 . mg-l prg
teína respectivamente) que fueron resueltas debido al mayor
contenido en residuos ácidos de la fracción IV. Sin embar­
go, no siempre se obtienen las dos isoenzimas y algunos ve­
nenos estás desprovistos de la fracción IV. La fracción V,
con mayor actividad específica, fue purificada por cromato­
grafía en el mismointercambiador de fraccionamiento hasta
obtener un solo pico con actividad específica constante en
todos sus puntos (670 umoles . min.1 . mg.l de proteína).
 59

Fig.II-2A: Inmunoelectroforesis de crotoxina A (izquierda) y de fosfoligg

sa A ácida (derecha) purificadas en agar amortiguado a pH 6,8
por el método descrito (Cap.I).
' Fig.II-2B: Electroforesis en gel de poliacrilamída de la crotoxina B puré
ficada. La movilidad corresponde al doble del peso molecular
determinado por análisis de aminoácidos de la fosfolipasa A2
básica de C.d.terrificus (Breíthaupt y col.,1975). La banda e­
luída presenta actividad fosfolipasa A2 sobre lipoproteínas de
yema de huevo. ¡

La electroforesis en gel de poliacrilamida reveló una sola banda

correspondiente por su Rf al doble de peso molecular estimado pg
ra la fosfolipasa A básica de Crotalus durissus terrificus (Fig.
II-ZB).
 60

Identificación de las fracciones purificadas

La fracción I, no retenida en el gel, no presentó actividad

fosfolipasa A detectable con los métodos convencionales (ti­
tulación de ácidos grasos y cromatografía de productos de hi
drólisis en capa delgada). En una solución de 0.15 MNaCl
a temperatura ambiente, la mezcla en relación de conCentra­
ción 1:1 de esta fracción con la fosfolipasa A2 básica puri
ficada del pico V resultó,en menos de un minuto,en la for­
mación de un complejo fuertemente unido caracterizado por
(a) la disminución de la actividad fosfolipasa en un 65% ,
(b) el aumento de la toxicidad de la fosfolipasa A2 básica
15 a 20 veces, y (c) la recuperación dependiente del tiempo
(15 a 20 minutos) de la actividad enzimática inicial cuando
la mezcla es acidificada ( pH<3L
La fracción I fue identificada comocrotoxina A, o fracción
ácida del complejo por sus propiedades semejantes a las del.
potenciador de la toxicidad de la fosfolipasa básica descri
to por Rübsamen y col (1971) y Habermann y Rübsamen (1971); .
llamado también crotapotín (Breithaupt y col, 1974). La fos
folipasa A2 básica fue denominada crotoxina B (por básica)
para facilitar su identificación comola fosfolipasa parti­
cular que forma complejo espontáneamente con la crotoxina A
o crotapotín. En efecto, la fosfolipasa A2 ácida es inca­
paz de formar un complejo con crotoxina A, como lo demues­
trackalaactividad enzimática invariable en.su presencia.
Tampocoes neurotóxica en ausencia o en presencia de cro­
toxina A.
 61

Rendimiento del método

La proteina recuperada en las fracciones del complejo crotoxi

na sembrado es del 80 al 90%L(n = 6). La recuperación final
de crotoxina A purificada fue de alrededor de 90%de la pro­
teina del pico I y la de la fosfolipasa A básica (crotoxina B)
del 80%del total del pico V. Este último es un rendimiento
alto teniendo en cuenta la fuerte absorción de las fosfolipg
sas básicas a la superficie de los geles de cromatografía,
al celofán de diálisis y al material de vidrio (Breithaupt,
l976ahHabermany Breithaupt, 1978). Este alto rendimiento
es probablemente debido al uso de elementos plásticos en to­
das las manipulaciones.
Larelación nmlar en que se encuentran los componentes cro­
toxina A y crotoxina B en el complejo nativo es aproximada­
mente 1:1 (se recupera alrededor de 15 mg de CA y 30 mg de
CBpor 200 mg de veneno), aunque suele haber un exceso molar
de fosfolipasa A básica. Esto podria deberse a que durante
la separación de la crotoxina en gel de Sephadex G-75 a pH
4.0, (primer paso de purificación de la crotoxina) una frag
ción del complejo se disocia y parte de la crotoxina A que­
daria retrasada en la columna.
 62

DISCUSION

El efecto tóxico de la crotoxina es probablemente uno de los

más estudiados entre los efectos de los venenos ofídicos. El
avance en el conocimiento de la acción tóxica de 1a crotoxina
guarda una estrecha relación con sus propiedades fisicoquimi­
cas. En efecto, la crotoxina cristalizaba sin perder las prg
piedades tóxicas que caracterizan al veneno de Crotalus duris­
sus terrificus , y respondía a todos los criterios de homoge­
neidad que se conocían: electroforesis libre de Tiselius (Li
y Fraenkel - Conrat, 1942) y ultracentrifugacipn (Gralén y
Svedberg, 1938). Aunque Ghosh y De (1939) notaron una varia­
ción en la razón toxicidad a actividad enzimática de precipi­
tados de crotoxina tratada con cloruro de sodio, sólo el avan
ce en las técnicas de separación y de caracterización de las
proteínas despertó dudas sobre la homogeneidaddel complejo.
Las dudas fueron alimentadas por la demostración de la existen
cia de neurotoxinas carentes de actividad enzimática en vene­
nos de abeja y de otros ofidios (Neumanny Habermann, 1952,
1954; Habermann y Neumann, 1957; Habermann, 1968).
Sin embargo, la neurotoxina no enzimática que Neumanny Haber
mann (1955) lograron separar del complejo y llamaron crotacti
na, no resultó ser más que un artefacto a la luz de los cono­
cimientos posteriores. Slotta (1953,1955) discutió el concep
to de que podia tratarse de un complejo iónico entre una pro­
teina muybásica y una proteina muy ácida, pero no lo pudo de
mostrar. Habermann (1957) obtuvo dos fracciones por cromato­
grafía en de aluminio, sin embargo, la recuperación de
 63

la actividad fosfolipasa A sobrepasaba en 100%,y la toxici­

dad que se perdía en parte, no aparecia en ninguna otra frag
ción no enzimática, mientas que la fosfolipasa A básica que
se obtenía, presentaba muybaja toxicidad. Fraenkel-Conrat
y Singer (1956) habían obtenido dos fracciones dinitro fenila
das (por reacción de los grupos a-amino) importantes que se
diferenciaban por su solubilidad y contenido-de aminoácidos.
Aunquela heterogeneidad del complejo crotoxina estaba fuera
de duda, no se podia comprender la desaparición de la toxici­
dad al separar sus componentes, pues se pensaba que la toxic;
dad y la actividad enzimática estaban asociadas a la fracción
básica (Hendon y col., 1970). Habermann y Rübsamen (1970)
cromatografiaron crotoxina en medio ácido utilizando CM ce­
lulosa y Hendon y Fraenkel-Conrat (1971) separaron los compo­
nentes a pH 6.0 en presencia de urea 6M por cromatopofia en
DEAE-celulosa. Ambosobtuvieron una fosfolipasa básica, poco
tóxica en comparación con la crotoxina nativa, y una proteina
ácida. También lograron idénticos resultados Rübsamen y
col. (1071) y Breithaupt y col.,(197l). Ellos demostraron que
la crotoxina es un complejo no covalente constituido por una
fosfolipasa A-extremadamentebásica (Horst y Fraenkel, 1971;
Rübsamen y Col., 1971), de pHi 8.8 (Horst y Col., 1972) ó 9.6
(Breithaupt y col., 1974); que puede resolverse en dos isoen­
zimas (Briethaupt y col., 1975); una fosfolipasa A ácida de
pHi 4.7, que se encuentra en menor proporción en el complejo,
y un péptido ácido de pHi 3.7, que carece de toxicidad o acti­
vidad enzimática, denominadocrotoxina A (Horst y col., 1972).
La fosfolipasa A básica (Crotoxina B, Horst y col., 1972) es
 64

el componentecrucial para la acción neurotóxica del complejo

crotoxina. En efecto, puede reproducir las alteraciones far­
macodinámicasde la crotoxina nativa, si bien se requieren do
sis 15 a 20 veces mayores. La adición de crotoxina A a la
fosfolipasa A2básica resulta en tres efectos relevantes pa­
ra la acción del complejo crotoxina, a saber: (a) se forma un
complejo estable (Ka = 1.48 x 10­ 9 M, Hanley, 1979) que pre
senta propiedades fisicoquímicas similares a las del complejo
crotoxina nativo, (b) la toxicidad de la fosfolipasa A2 bási­
ca aumentahasta llegar a valores similares a los que presen­
ta el complejo crotoxina nativo (Hendony Fraenkel-Conrat,
1971; Rübsamen y col, 1971; Horst y col., 1972; Habermann y
Breithaupt, 1978) y (c) la actividad enzimática de la fosfoli
pasa A2 básica (crotoxina B) sobre fosfolípido agregado se in
hibe en un 50% (Breithaupt, 1976 a), que explica la alta recg
peración de actividad enzimática que obtenía Habermann (1957)
La separación por comatografia en gel de Sephade utilizada
para aislar el complejo crotoxina fue realizada por primera
vez por Seki y col. (1980) con ventajas técnicas cualitati­
vas y cuantitativas respecto al métododrástico de precipi­
tación isoeléctrica. En efecto, el procedimientohistórico
de separación de la crotoxina nativa no fue reemplazado por
métodos más acordes con los utilizados para el fraccionamien­
to de la crotoxina, curiosamente, aunque Breithaupt y col.
(1979) atribuyeran la variabilidad en el contenido de fosfoli
pasas A2 al método de separación utilizado.
La fosfolipasa A2 ácida que se separa del complejo no es neu­
rotóxica y la adición de crotoxina A no resulta en formación
 65

de un complejo ni en la aparición de neurotoxicidad. Puede

concluirse de estos estudios que la acción sinérgica de dos
de los componentes (crotoxinas A y B) resulta suficiente pa­
ra reproducir todos los efectos neurotóxicos del complejo
crotoxina.
 CAPITULO III

"IL y a peu de cho¿e¿

que nouó óachionó bien".
La Rocheáoueauid
Régiex¿onó, ¿entenceó
et maximeó modaleó
 ACCION BIOLOGICA DEL COMPLEJO CROTOXINA

El complejo crotoxina del veneno de Crotalus durissus terrificus

provoca sintomas de neurointoxicación en los animales inocula­
dos. Unos son más evidentes que otros pero aparecen, por lo ng
neral en el mismoorden, a saber, irreaularidad respiratoria
(taquipnea y dispnea), exoftalmia, parálisis fláccida de los
miembrosanteriores, lueqo posteriores, micción y defecación.
La muerte es consecuencia de la asfixia que resulta de la apnea
prolonoada. La fosfolipasa A2 básica del complejo crotoxina es
responsable de la neurotoxicidad y su actividad enzimática es
indispensable para el efecto tóxico. Es capaz de reproducir
por si sola la acción neurotóxica del complejo si bien se re­
quieren dosis más altas ( 0.40 uq/gm,i.p.en ratón). El efecto
tóxico de dosis letales de crotoxina B pura es rápido, sin em­
barqo, la formación del complejo con crotoxina A aumenta su efi
cacia, potenciando la toxicidad de la enzima 15-20 veces (Hen­
don y Fraenkel-Conrat,197l; Rubsameny col.,197l). La paráli­
sis respiratoria provocadapor la crotoxina es periférica por­
que (a) los potenciales de acción del nervio frénico no son m9
dificados en presencia de la toxina, aún a dosis altas de com­
plejo crotoxina (' 0.5 ug/a en ratón) (Habermany Breithaupt,
1978, Tabla III-1), (b) La interrupción de la respiración pro­
voca un aumento en la frecuencia de impulsos descendentes del
nervio frénico, comoresultado del control que ejercen los cen
tros respiratorios y (c) el müsculo,que no responde al estímu­
lo nervioso, se contrae por estímulo directo sin sufrir altera
ciones el potencial de membranay el umbral de estimulo. En
 67

humanosy en animales, los individuos intoxicados pueden ser

mantenidos en vida con ayuda de respiración artificial (Vital
Brazil,1966; Vidal,1983,Comunicación personal). Las eviden­
cias experimentales suqieren que el efecto bloqueante de la
crotoxina no se opera por un mecanismo semejante al de la d-tu
bocurarina y que la similitud de los efectos es sólo aparente.
La crotoxina produce parálisis fláccida semejante a la del müs
culo curarizado, sin embargo, la acción bloqueante de la crotg
xina no puede eliminarse por lavados sucesivos, ni puede des­
plazarse por la adición de anticolinesterasas en preparados
aislados incubados in vitro (Vital Brazil,1966; Hawqood,1982).
Por otro lado, la crotoxina es de acción proaresiva, por lo
que una disminución en la dosis aplicada no atenúa el bloqueo

Tabla III-1: Potencial de acción del nervio frénico de ratones

tratados con crotoxina in vivo.

Condición experimental unbral É Potencial de acción É

i 0.20 +
Control 0,75 V , 20 seq 1.5 mV-—0.50

inyección (i.p.) de crotg i 0.3 +

xina reconstituída (10 x 1,5 V , 20 seq 1.7 mV.- 0.20
LD 50 ) '

i 0.4 +
ncrdedura por cascabel 1,5 V , 20 seg 1.2 mV-—0.30

E determinadopor incrementodel voltaje hasta el registro del potencial

de acción
É Medidoen la pantalla del oscilosoopio de registro
n-= 3 (i i d.5.)

que se hace dependiente de tiempo. En contraste, el bloqueo de

 68

la respuesta muscular por la d-tubocuranina es proporcional a

la concentración, dentro de las dosis que provocan un efecto
predominantementepostsináptico (Katz,1966).
En terminos generales, el bloqueo de la transmisión neuromuscu
lar de tipo no depolarizante puede deberse a una de las tres
causas principales: (a) una disminución en la excitabilidad de
la fibra muscular, por alteración del potencial de membrana
(Katz,1966); (b) una disminución de la sensibilidad de la pla­
ca neuromuscular a 1a acetilcolina por modificación del recep­
tor (conformación desensibilizada), comoocurre con la d-tubo­
curanina y; (c) una reducción en la cantidad de neurotransmi­
sor liberado, por alteraciones en la función presináptica. La
causa (a) puede ser descartada ya que la excitabilidad del mus
culo no resulta afectada aún cuando la transmisión sináptica
ha sido completamente bloqueada por la crotoxina (Chano y Lee,
1977; Hawgoody Smith,l977; Hawgoody Santana de Sa,1979). Por
el contrario, dosis mayores (> 301n/ml de crotoxina o crotoxi­
na B pura, correspondientes a 30 veces la dosis mínima que pro
voca el bloqueo de la transmisión sináptica en preparados ais­
lados, llegan a ocasionar alteraciones en el músculo a nivel
del potencial de membranaque afectan la propagación de los pg
tenciales de placa terminal y provocan contractura (Breithaupt,
1976; Hawgoody Smith,l977). Estos efectos han sido atribui­
dos a la actividad fosfolipasa A2 de la crotoxina B sobre las
membranas musculares ya que estudios morfológicos en músculo
de ratón tratado con crotoxina B por inyección local de dosis
subletales presentan un aspecto desorqanizado con disolución
de miofibrillas e invasión de las fibras por macrófaqos, con
muestras visibles de degeneración. Estos cambios están prece
 69

didos por contractura y pérdida de la capacidad de contracción

(Goelakrishnakone y Hagwood,1984;ver resultados de este Cap;
tulo). La segunda explicación plausible, (b), ha sido motivo'
de discrepancia ya que, por un lado, la sensibilidad del re­
ceptor de acetilcolina, en ratón y en conejo, no es modifica­
da significativamente por la crotoxina (Vital Brazil,1966;
Chang y Lee,l977), y por otro lado, Bon y col. (1979) observa
ron la ligadura de CBa electroplaca aislada de peces eléctri
cos que se traduce en una modulación particular del receptor
nicotïnico. Según Vital Brazil (1966) y Chang y Lee (1977)
las curvas de dosis-respuesta obtenidas por aplicación de ace
tilcolina exóqena a diafragma denervado de ratón en presencia
o en ausencia de crotoxina presentan variaciones no significa
tivas, insuficientes para explicar por sí solas los efectos
bloqueantes de la toxina.
Bon y Jeng (1979) encontraron que la crotoxina B modifica la
ligadura de agonistas colinérgicos (por ej.carbacol) a recep­
tores de electroplaca aislada de Electrophorus electricus y
Torpedo marmorata. El receptor es mantenido en una conforma­
ción de baja afinidad por agonistas. Sin embargo, la crotoxi
na B no compite con a-toxinas por la ligadura al receptor por
lo que se piensa que actúa modificando las propiedades fisico
químicas de la membranaen el entorno receptor (Jeng y Bon,
1979). La crotoxina A no se liga a la membranapostsináptica
pero modula la ligadura de la crotoxina B. En efecto, en pre
sencia de complejo la ligadura de crotoxina B marcada se hace
aparentemente saturable. El complejo debe disociarse necesa­
riamente para que la crotoxina B se ligue tanto a membranas
biológicas (Jeng y col.,1978; Hendony Tu,l979) como a vesicu
 70

las de fosfolípido (Canziani y col.,1983) por 10 que este paso

podría estar implicado en la saturación aparente de la ligadu­
ra de crotoxina B (Jeng y col.,l978).
Los reqistros de potenciales de placa, utilizando electrodos
intracelulares, demostraron que existe una secuenCia de even­
tos que llevan al bloqueo de la liberación de acetilcolina (C)
(Vital Brazil,1973; Chang y Lee,1977; Hawgoody Smith,l977;
Hawgoody Santana de Sa,1979). En batracios y en mamíferos
sensibles, la presencia de complejo crotoxina nativo o recons­
tituído provoca en primer luqar una depresión cn la frecuencia
de potenciales espontáneos en la placa terminal (alrededor de
5 min. después de su aplicación e independientemente de la do­
sis). Alrededor de 30 minutos después se puede Observar incrg
mentos intermitentes en la frecuencia de los potenCialeS minig
tura cuya aparición y duración es impredecible. Las "explosig
nes" de potenciales de corta duración ( l seq) terminan abruE
tamente, aquellas que perduran durante varios eeaundos retor­
nan lentamente a la frecuencia inicial tomandohasta varios mi
nutos para hacerlo. Durante los intervalos entre explosiones,
la distribución de frecuencia de los potenciales espontáneos
es semejante a la de los controles. En efecto, en terminales
parcialmente intoxicadas (dentro de los 30 minutOS), la apari­
ción de potenciales evocados y espontáneos puede Ser prevista
de acuerdo con la distribución de Poisson (HawdoodY Santana
de Sa,1979), aunque hay un corrimiento de las amplitudes haCia
valores mayores. Las alteraciones en los potenCialeS espontá­
neos (explosiones de potenciales de baja amplitud y potencia­
leS giganteS) pueden persistir hasta después de las 2 horas
del bloqueo de la transmisión de potenciales evocados.
 71

En los botones sinápticos intoxicados, la aplicación de un té­

tano de 50 Hz al nervio aumenta la frecuencia de potenciales
de placa pero 1a duración de esta potenciación no sobrepasa el
estimulo, es decir, no persiste después de aplicado el tétano
(Hawgoody Smith,l977). Tétanos de 100 Hz, de corta duración
son capaces de restaurar la respuesta a estímulos simples de
nervio durante un tiempo. Sin embargo, la aplicación sucesiva
de tétanos semejantes resulta en respuestas cada vez más cor­
tas hasta su desaparición total. Curiosamente, en preparados
parcialmente intoxicados, cuya respuesta al estímulo indirecto
ha sido considerablemente disminuida, tétanos de 100 Hz provo­
can una facilitación de la contracción muscular, seguida por
una depresión o inhibición de Wedenski que, a su vez, es segui
da de una potenciación postetánica (ver Resultados). Esto in­
dica que durante la intoxicación, la conducción de potenciales
de acción por el nervio hasta la sinapsis no está perturbada
y que la integridad de la función presináptica no está seria­
mente comprometida, aunque no están descartadas alteraciones
en la neurosecreción.
El tiempo que se requiere para la desaparición de los potencia
les evocados y 1a aparición de irregularidades en los potencia
les espontáneos es considerablemente prolongado en presencia
de alto Mg2+ (80-180 mM)y bajo Ca2+ (0.5-l.0 mM)extracelular
(Hawgoody Smith,1977; Chang y Lee,1977; Hawgood,l982). No se
observa bloqueo cuando el Ca2+ es sustituido por Sr2+, que in­
hibe la actividad enzimática de la crotoxina B (ver Cap.IV),
ni cuando la actividad enzimática de la crotoxina B ha sido in
hibida por agentes alquilantes (ver Cap.IV; Chang,l979), Loque
confirma que la actividad fosfolipasa A2 es esencial para la
acción tóxica.
 72

En preparaciones totalmente intoxicadas de batracios y ratón

un incremento en la concentración extracelular de K+ no provo­
ca el aumentoen la liberación de acetilcolina que se observa
en los controles (Chang y Lee,l977; Hawgoody Santana de Sa,
1979). Ionóforos de Ca2+ tampoco favorecen la liberación de
neurotransmisor aunque en controles provoca un incremento en
la frecuencia de potenciales espontáneos (Hawgoody Smith,1977L
Sin embargo, el bloqueo puede ser parcialmente abolido por un
incremento importante de la concentración extracelular de Ca2+
(5.4 mM- 10.8 mM) según Hawgood y Santana de Sa (1979), o por
un incremento de la osmolaridad del medio en que se encuentra
el preparado aislado (Magazaniky col.,1979).
El tetrametilamonio, que reduce el potencial de reposo de la
membranapresináptica, provoca en controles un aumento en el
valor medio de las amplitudes de los potenciales evocados (m)
pero no afecta aquellos de la terminal intoxicada. Estos re­
sultados no permiten distinguir si la crotoxina B ligada in­
terfiere con los mecanismos de depolarización de la membrana
presináptica a la llegada de un potencial de acción o si modg
la la entrada de Ca2+controlando la liberación de los
de acetilcolina.
Inicialmente habíamos propuesto que la acción de la crotoxina
podía explicarse por tres efectos principales: (a) depresión
de la excitabilidad de la fibra muscular, (b) disminución de
la sensibilidad de la placa muscular a la acetilcolina y (c)
disminución de la cantidad de neurotransmisor liberado. Los
datos que apoyarían el punto (b) son los siguientes: (l) exis
ten evidencias experimentales de que en preparaciones de re­
 73

ceptor aislado el complejo crotoxina es capaz de modificar el

receptor de acetilcolina de peces eléctricos. Por otra parte,
(2) no hay razón para suponer que los receptores nicotímicos
de mamíferos, aves o batracios sean demasiado distintos (Peper
y col.,1982). Sin embargo,es difícil extrapolar los resulta­
dos obtenidos con preparaciones purificadas de receptor a sis­
temas más complejos, como la preparación neuromuscular de ra­
tón, pollo o sapo, en las que este efecto puede estar enmasca­
rado. Además, no existen evidencias de que el efecto del com­
plejo crotoxina sea predominantementepost-sináptico.
Los datos que apoyan la interpretación (a) son la demostración
de que a dosis muyaltas, tanto el complejo crotoxina como la
crotoxina B producen miotoxicidad, que podria explicarse como
el resultado de la actividad enzimática de la crotoxina B so­
bre la membranadel músculo (sarcolema). Sin embarqo, debe te
nerse en cuenta que los efectos miotóxicos se observan con do­
sis muypor encima de las necesarias para provocar el bloqueo
de la unión neuromuscular.
En consecuencia, el efecto principal observado con el complejo
crotoxina, aún a dosis subletales, seria la reducción paulati­
na de la cantidad de neurotransmisor liberado, de acuerdo con
la interpretación (c). La desaparición total de potenciales
espontáneos y evocados podria deberse a la depleción de acetil
colina de las terminales y/o desacoplamiento de los procesos
de depolarización de la membranay liberación de neurotransmi­
sor. La observación directa de terminales en ratón intoxicado
permite establecer una correlación entre las alteraciones ul­
traestructurales del botón presináptico (ver másadelante), el
 74

registro de los potenciales de placa intracelulares (comohemos

visto más arriba), y el efecto predominantementepresináptico
de la crotoxina.
En consecuencia, el bloqueo de la unión neuromuscular provocado
por crotoxina se produciría por lesión preferencial de la mem­
brana presináptica, propiedad que compartirïa con otras fosfo­
lipasas A2 neurotóxicas como la e-bunqarotoxina de veneno de
Bungarus multicinctus, la notexina de Notechis scutatus y la
taipoxina de Oxyuramusscutelatus. A favor de esta interpreta
ción existe abundante evidencia experimental.

Resultados obtenidos en preparados aislados

(a) Control de la confiabilidad de la nreparación neuromuscu­

lar aislada.

El modelo experimental de nervio y músculo aislados ha si­

do ampliamente utilizado en farmacología y, particularmen­
te, en el estudio de la acción de neurotoxinas purificadas
de venenos de ofidios. El resultado de los estudios sobre
el efecto de la crotoxina en preparaciones aisladas permi­
tió clasificarla entre las neurotoxinas de acción preferen
temente presináptica (Breithaupt,1976; Changy Lee,l977;
Hawgoody Smith,1977).
Los preparados aislados ciático-sartorio de sapo (Bufo are
narum, Leptodactylus Sp,) y frénico-diafragma de ratón (u­
ocasionalmente de rata) fueron ensayados en las condicio­
nes descritas en el Capítulo I (Materiales y Métodos). Se
 75

buscó la condición óptima de incubación, según los requeri­

mientos de las especies utilizadas, para lograr la viabili­
dad y estabilidad máximasde los preparados. En efecto, el
bloqueo irreversible de 1a transmisión neuromuscular que
provoca la crotoxina debe ser medido en preparados cuya de­
gradación con el tiempo es conocida, para que el registro
de contracción muscular por estimulo del nervio sea el re­
sultado de la acción de los productos en estudio, no la de
una superposición del efecto tóxico de la degradación de la
conductibilidad del nervio y/o de la fatiga del músculo. En
este sentido, se determinó la vida media de la transmisión
sináptica correspondiente a la reducción del 50 %de la reg
puesta al estímulo indirecto comoaparece en la Tabla III-2.

Tabla III-2: Sobrevida de la transmisión sináptica en prepara­

dos de nervio-músculo aislados.

Preparado Tiempo (horas)*

02/C02 (95%/5%) Sin oxigenación

Ciátioo-sartorio (sapo) 6 É 2_(s.d.¡n=6) 3 Ï 2 (n=5)
Frénioo-diafragma(rata) 7 Ï 1 (s.d.,n=4) -----­
Fïénico-Diafragma (ratón) 7 Ï 1 (s.d.,n=3) ---————­

* Tienpo en que se reduce al 50%la respuesta al estímulo indirecto, toman

do cana referencia la respuesta a1 estimulo directo.

Se comprobóque el estimulo intenso del preparado provoca

el deterioro de la actividad sináptica. En efecto,
 76

de estímulos de 10 Hz, aplicados con intervalos de 0,5 mi­

nutos y duración de 5 segundos reducen la respuesta muscu­
lar al estímulo indirecto al 15%de la inicial luego de 20
minutos. La fatiga del preparado se debe en primer lugar
a una disminución en la eficiencia de la transmisión sináp
tica. Esta disminución podría deberse al deterioro del
nervio, a la alteración mecánica de la sinapsis durante el
manipuleo del preparado y al deterioro de los mecanismos
de liberación de neurotransmisor en la terminal sobreexci­
tada. Contrariamente, la respuesta del músculo al estímu­
lo directo se mantiene constante durante ese lapso, por lo
tanto, la sobrevida del tejido muscular no es el factor li
mitante en este modelo experimental mientras (a) se manten
gan constantes las concentraciones de K+ y Ca2+ que permi­
ten la respuesta máximadel preparado y (b) se conserve el
pH óptimo como consecuencia de la ventilación continua de
la solución amortiguadora de incubación. Los preparados
de batracios , que por su resistencia no son generalmente
ventilados, mostraron mayor estabilidad con una oxigena­
ción continua (ver Tabla III-2).
Luegode establecer la tensión óptima para el registro má­
ximo de la contracción isométrica del músculo, se observó
el comportamiento de los preparados en diversas condicio­
nes experimentales . En primer lugar se registró la res­
puesta al estímulo indirecto en función de la concentra­
ción de Ca2+. En ausencia de Ca2+ (4.0 mMEDTA) y/o en
presencia de Mg2+ alto (18 mM)v.. bajo Ca2+ (0.2 mn), la
respuesta al estímulo indirecto decae rápidamente. Se re­
 77

esh'mulo indirecto , 0,8V 0,2mseg

1... 1+ 1+ Ego-T;
somM Ca l 5,0mM Ca 2,5mM Ca .Mg directo

estímulo directo , 30V 2mseg

2,5mM Ca lavados 50mM Ca

so 3o 25 15
minutos

Fig.III-1: Registros característicos del efecto de variaciones de Ca2+

del medio de incubación sobre la contracción muscular en el
preparado de ciático-sartorio aislado, estimulado directa e
indirectamente. Secuencia de los registros: de derecha a iz
quierda. _
 78
50Hz 50Hz lavado 50Hz JO Hz 50 Hz Galamuna

Neost igmina 100Hz

minutos

Neostigmina Galamina

+ Neostigmina lavados

¡7 ¡5 ¡2 8 7 6
minutos

Fig.III-2: Efecto de la galamina (20 ug/ml) sobre la preparación neuro

muscular aislada y antagonismo de la neostígmina (50 ug/miï
sobre el ciátíco-sarxorío aislado.
 79

. .
cupera incrementando la concentrac1ón de Ca2+ del medio
.

(1.25 mM). Sin embargo, aunque un incremento progresivo

.
en la concentrac1ón de Ca2+ (2.5 y 5.0 mM)provoca una res
puesta mayor del músculo, dosis de un orden de magnitud ma
yor (50 mM)reducen progresivamente la contracción muscu­
lar (Fig.III-1). El estímulo directo del músculo demues­
tra que la reducción de la respuesta se debe a la depre­
sión de la excitabilidad de la membranamuscular. En efeg
to, según Kuffler (1944), concentraciones altas de Ca2+ no
afectan la aparición de potenciales de placa, pero estos
no son capaces de provocar la depolarización de la membra­
na. Por otro lado, la aplicación de un bloqueante de tipo
no depolarizante como la galamina (20ug/ml) provoca la dig
minución de la respuesta al estímulo indirecto hasta la de
saparición, mientras que el estímulo directo no es modifi­
cado, Fig.III-2. El efecto bloqueante de la galamina pue­
de ser desplazado por la aplicación de un tren de estímulos
de alta frecuencia, a nivel de nervio, o por la adición de
una anticolinesterasa (neostigmina y prostigmina —50 g/ml)
al medio de incubación del preparado (Fig.III-Z).
La acción de las anticolinesterasas es la de prolongar la
depolarización postsináptica comoconsecuencia de un esti­
mulopor su inhibición de la hidrólisis de acetilcolina.
Este efecto se observa claramente en los preparados de cié
tico-sartorio de sapo. Sin embargo, en el caso de los pre
parados de frénico-diafragma de ratón, durante la aplica­
ción de un tren de estímulos de alta frecuencia, la respueg
ta muscular presenta una potenciación luego de una marcada
 80

25°“! 150Hz -« zoOHz 100Hz

SOOHZ 300Hz 3OOHZ

Fig.III-3: Efecto de la prostigmina sobre la preparación aislada de dig

fragma-frénicc de ratón. La aplicación de trenes de estímulo
de > 200 Hz en estas condiciones provoca una depresión, lue­
go una facilitación que no se observa en los controles.
 81

depresión que no se observa en los controles (Fig.III-3).

Masland y Wigton (1940) y Feng y Li (1941) demostraron una
acción excitatoria por efecto de anticolinesterasas a nivel
presináptico que podria explicar este comportamiento.
En efecto, la presencia de prostigmina (0.1 ug/ml), la apli
cación de un tren de estímulos permitió observar durante
1-2 minutos los llamados "potenciales antidrómicos" (Bars­
tad,1962) comoresultado de la acumulación de acetilcolina
en el espacio sináptico luego del estimulo intenso del ner
vio (Fig.III-4). Dichos potenciales antidrómicos de póla­
ridad contraria a la del potencial de acción del nervio se

Fig.III-4: Potenciales antidrómicos detectados en preparado aislado de iré

nico-diafragma de ratón observados en presencia de 0,1 pg/ml de
prostigmina. La aplicación de trenes de impulsos mayores de 10
Hz bloquean estos potenciales que son de polaridad opuesta a la
del potencial de acción. Registro superiorí(P.A.) 1rdV, 0,5 nsec
registro inferior: 20 uvolt, 5 msec.@parkfióhde mfiuhonficog,
 82

deberían según Hubbard y Sdmúth(1961) a la presencia de re­

ceptores de acetilcolina en el botón presináptico o en el
axón. Su función sería la de modular la conducción de los
potenciales de acción por impulsos deferentes, es decir, de
dirección inversa ala de transmisiónde los potenciales de aCción.

(b V Acción del complejo crotoxina reconstituïdo sobre la prepa­

ración neuromuscular aislada.

El bloqueo de la transmisión sináptica se observa en todas

las preparaciones estudiadas, inclusive en frénico-diafrag­
ma de la rata, que es más resistente a la acción tóxica de
la crotoxina. Es sabido que la latencia en la iniciación
del bloqueo de la respuesta del músculo al estímulo indireg
to es menor en el pollo, más prolongado en ratón e importan
te en la rata (ver Fig.III-S). El preparado de ciático-sag
torio de sapo se comporta de igual manera, y la latencia
del bloqueo se ubica entre aquella del preparado frénico­
diafragma de ratón y frénico-diafragma de rata. Puede ob­
servarse también la diferencia en la latencia de la acción
neurotóxica del complejo crotoxina entre preparados de fré­
nico-diafragma y ciático-soleo de ratón, siendo menor en
diafragma, por lo que estas diferencias pueden tener un
Sentido muyrelativo (Vital Brazil y col.,1966a).
 83

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0.012 0,01- 0.12 0,4 1,2 10,0 12 ¿0

Log [crotoxina](ugllnn

Fig.III-5: Latencía del efecto bloqueante del complejo crotoxína para dig
tintas especies de vertebrados, en función de la concentración.
Pollo (o), ratón (A), sapo (o) y rata (A).

H
 84

estímqu . Grotoxina
commuo detenido continuo ¡miedo d¡reclo

60 3o o
ÓÓÍECÍO _ ‘ 100,12

‘ 120 Wedenski
100 Hz lavados

19 o ' Wedenski 130

directo

1 95
. minutos

Fig.III-6: Registro característico de la acción bloqueante del complejo

crotoxína reconstituído (relación molar 1:1) (15 ug/ml). Se
puede observar 1a ineficacia de los lavados sucesivos, de la
acción de prostigmína (50 ug/ml) y de suero anticrotálíco p_a­
ra suprimir la acción tóxica.
 85

La transmisión sináptica en preparados de ciático-sartorio

de Bufo arenarum es prOgresivamente bloqueada por el com­
plejo crotoxina reconstituïdo (relación molar 1:1), Fig.
III-6. Sin embargo, a diferencia de los resultados obte­
nidos con galamina, la acción de la crotoxina no puede ser
eliminada por lavados sucesivos, no es desplazada por pros
tigmina y no es parcialmente suprimida por trenes de im­
pulsos de alta frecuencia y de duración prolongada. Por
el contrario, a mayor estímulo, menor tiempo de bloqueo
(ver Fig.III-6 y Fig. III-7). El efecto bloqueante de la
crotoxina puede ser retardado por lavados sucesivos, por
la eliminación del Ca2+ del medio de incubación o por el
aumento de la concentración de Mg2+ (Chang y Lee, 1977;
Hawgood y Smith, 1977; Hawgood y Santana de Sa, 1979) pe­
ro no puede ser detenido. El suero anticrotálico que neu
traliza la actividad enzimática y tóxica de la crotoxina
B pura in vitro no es efectivo para detener o retardar el
efecto de la crotoxina ligada (ver Fig.III-G).
Los preparados parcialmente bloqueados, la aplicación de
un breve tren de estímulos de alta frecuencia (100 Hz, 4
seg.) resulta en el fenómenode depresión o inhibición de
Wedenski que es seguido por una potenciación postetánica
de duración importante. Dicho fenómeno de condicionamien
to afecta los fenómenossinápticos en condiciones no;
males luego de trenes de impulsos aplicados durante 1 mi­
nuto o más. En la sinápsis intoxicada el fenómeno es rá­
pidamente evocado. La facilitación, la depresión y la pg
tenciación son probablemente el resultado de insuficien­
 86

cias presinápticas y postsinápticas (Katz,1966). Por un

lado la inhibición puede ser explicada por el prolongado
período refractario de la membranamuscular que no permite
la propagación de potenciales de placa sucesivos y mantie­
ne a la fibra en un estado de inexcitabilidad (Katz,1963).
Por otro lado, parte de la inhibición puede deberse a una
disminución en la efectividad de los mecanismosde libera­
ción de acetilcolina.

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10 20 30
minutos

Fig.III-7: Efecto de la frecuencia de estímulo indirecto de preparado de

ciático-saxtorio de sapo sobre la respuesta del músculo par­
cialmente bloqueado por complejo crotoxina reconstituído (50
¡ug/m1). Estímulo directo (-——),estímulo indirecto (C ) cada
10 sec 0,3 Hz, estímulo indirecto contínuo 0,3 Hz (A ).Can1‘.rol,
eshïnulo jndhecto (A)
 87

En presencia de prostigmina, el preparado intoxicado (en el

que los potenciales descendientes del nervio no son capa­
ces de promover la contracción muscular) contrariamente a
lo observado en presencia de galmina (al igual de la d-tu­
bocurarina, Hubbard y Schmith,1961), Pueden ser detectados
potenciales antidrómicos luego de estímulos de alta fre­
cuencia.
En consecuencia, no es posible concluir que el bloqueo de
la transmisión sináptica pueda deberse al agotamiento de
las reservas de acetilcolina y esto está de acuerdo con lo
concluído por Hawgood(1982). Finalmente, en contraposi­
ción con lo observado por otros autores, el tratamiento de
preparados aislados de frénico-diafragma de ratón con cro­
toxina B pura lleva al bloqueo de la transmisión sináptica,
tal comose ha observado en ciático-sartorio de rana (Haw­
good y Santana de Sa,1979).

(c V
Ultraestructura de la unión neuromuscular intoxicada.

La ultraestructura de las placas neuromusculares de ratón

intoxicado fue observada,comodescrito, en cortes ultrafi­
nos de diafragma a nivel de los botones sinápticos (ver Ca
pítulo I) con la ayuda de un microscopio electrónico. La
morfología de la unión neuromuscular de los controles es
similar a la descrita en mamíferos (De Robertis y col.,
1953). El botón terminal está en estrecho contacto con el
músculo totalmente rodeado por el sarcolema muy plegado e
invaginado ofreciendo una mayor superficie de contacto con
el botón presináptico (ver Fig.III-8a). El botón presináp
 88

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Fig.III-8: Ultraestructura de 1a unión neuromuscular de ratón. a. En el

preparado control, b. En el preparado intoxicado, donde las
mitocondrias están alteradas y las vesículas presinápticas han
migrado hacía los sitios de exocítosis (flechas), Lin (1977)
x 20,000.
 89

tico control contiene un citoplasma poco denso, rico en Vg

sículas, microtúbulos y neurofilamentos, con mitocondrias
alargadas. Excepcionalmente, pueden observarse figuras de
exocitosis que según la hipótesis vigente, es uno de los
mecanismospor el cual la acetilcolina es liberada en for­
ma cuántica (Cecarelli, 1973),Lin (1977,Tesis) demostró que
1a inyección intraperitoneal de dosis letales de crotoxina
reconstituïda (0,5 ug/g)(10 x LD50), provoca la muerte por
parálisis de los movimientosrespiratorios dentro de las
9 a 12 horas de aplicación. Los animales intoxicados fue­
ron decapitados o muertos por dislocación cervical a dis­
tintos tiempos después de la inoculación de crotoxina a
fin de observar la ultraestructura en función de la evolu­
ción de la parálisis de los músculos voluntarios y la re­
ducción de los movimientos respiratorios. Cuandotodos
los síntomas de intoxicación son visibles se observó en 3
ratones que a nivel de la unión neuromuscular los botones
presinápticos están intactos con algunas mitocondrias altg
radas (redondeadas). Hay una aparente migración de las ve
sïculas sinápticas hacia el axolema agrupándose en torno
de las zonas densas donde se cree está favorecida la exoci
tosis (Fig.III-8b). En ratones disecados en el instante
en que se detuvieron los movimientos respiratorios (n = 3)
se observan botones presinápticos aparentemente desprovis­
tos de vesículas presinápticas y dilatados. Presentan un
gran númerode figuras en " " características de las célu­
las que están segregando transmisor activamente, pero el
número elevado de figuras "congeladas" hace pensar que los
 90

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Fig.III-9: Ultraestructura del botón presináptico severamente intoxicado. a.

Terminal desprovista de vesículas presinápticas, con numerosas fi­
guras en Q. b. Terminal alterada, donde la integridad de 1a membrí
na presináptica está comprometidasin observarse modificación del
tejido muscular, Lin (1977) x 25,000.
 91

¡31:1

A.
x._.

Fig.III­ 10 Ultraestructura del müsculo. a. ’ toxícado con

En diaf ragma 1n
crotox1na, b. En di afragma tratado con CBpurificada, x 20.000.
 92

eventos característicos de la exocitosis están bloqueados.

Se observan, además, neurofilamentos alineados y agregados,
Fig.III-9a . Hay botones presinápticos que presentan un
citoplasma floculento, cuyas mitocondrias están en degene­
ración, en los que la integridad del axolema se ha perdido,
Fig.III-9b. Es importante señalar que, con estas dosis la
fibra muscular del ratón paralizado no se encuentra altera
da. Puede observarse que las mitocondrias y la organiza­
ción miofibrilar están intactas, Fig.III-lOa. Por el con­
trario, en ratones inoculados con muyalta dosis de croto­
xina B pura ( 10 x DLSO)se observa que durante la evolu­
ción de la intoxicación las fibras musculares son también
alteradas (Fig.III-lob), con la estructura característica
de las miofibrillas totalmente desorganizada y mitocondrias
alteradas, las fibras musculares dan muestra de necrosis
importante del tejido,( Canziani observación personal).

DISCUSION

La crotoxina nativa o reconstituïda peude bloquear irreversi­

blemente la transmisión sináptica en la preparación neuromuscu
lar aislada sin alterar las propiedades de excitabilidad de la
membranamuscular (Tabla III-3). Por las limitaciones del mo­
delo experimental utilizado en este trabajo, es imposible des­
cartar de manera inequívoca un efecto postsináptico de la cro­
toxina, por ejemplo a nivel del receptor de acetilcolina en ba
tracios y mamíferos. Sin embargo, la persistencia de los po­
tenciales antidrómicos en la terminal totalmente bloqueada
 93

Parecerïa indicar que al menoslos receptores nicotïni­

cos presinápticos no son afectados por la crotoxina, en tanto
que la galamina los elimina eficazmente. Los experimentos reg
lizados por otros autores utilizando electrodos intracelulares
han permitido demostrar que la crotoxina no modifica la sensi­
bilidad de la placa terminal a acetilcolina exógena (Changy
Lee,1977; Hawgoody Smith,1977), en los estadios iniciales de
intoxicación, donde aparecen los efectos presinápticos de la
crotoxina, a saber, (a) modificación de la frecuencia de los
potenciales miniatura (b) modificación del contenido cuántico
de los potenciales de placa y (c) inhibición de la liberación
evocadade acetilcolina. Las pruebas ultraestructurales apo­
yan la acción presináptica preferencial del complejo crotoxina
puesto que la integridad del músculo no es alterada aún cuando
el botón presináptico tiene un aspecto francamente alterado
(Fig.III-9b y III-10a).
En síntesis, el complejo crotoxina aislado, fraccionado y re­
constituïdo (Capítulo II) es de acción preferentemente presi­
náptica y de comportamiento semejante al descrito precedentemen
te (Habermanny Breithaupt,1978).
Las evidencias presentadas demuestran que la crotoxina es un
complejo no covalente formado por dos proteinas que difieren
en su composición en aminoácidos y en su punto isoeléctrico.
El comportamiento básico (crotoxina B) de p.m. 16.300, pH 9.7
presenta actividad de fosfolipasa A2 y reproduce el efecto tó­
xico, si bien a dosis altas comparadas con las del complejo crg
toxina (LD50 i.v. en ratón 0.5 mg/Kg, Rubsameny col.,1971).
El efecto tóxico de la crotoxina B depende de la especie, y en
 94

orden decreciente de sensibilidad es pollo ) ratón )-conejo>

sapo > rata (Breithaupt,l976), lo que coincide con el orden de
sensibilidad observado empleando el complejo activo.
La crotoxina B es el agente farmacológico esencial del complejo
crotoxina, ya que es capaz de reproducir todos los efectos far­
macodinámicosde la crotoxina, si bien se requieren dosis más
elevadas (Brazil y Excell,l97l; Brazil y col.,1973). En este
sentido, la crotoxina B parece compartir la acción presináptica
de otras fosfolipasas A2 tóxicas como B-bungarotoxina (Chang y
col.,1973); taipoxina (Kamenskayay Thesleff,1974) y notexina
(Karlsson y col.,1972) entre otras descritas recientemente. La
actividad fosfolipásica de la crotoxina B es indispensable para
la toxicidad. Evidencias probatorias surgen de dos líneas indg
pendientes, a saber: (a) la actividad fosfolipásica de CBpuede
ser selectivamente inactivada por reacción con bromuro de p-brg
mofenacilo (inhibidor de sitio activo de las fosfolipasas A2 ­
Volwerk y col.,1974; Halpert y col.,1976) que produce la alcohi
lación de un residuo de histidina del sitio activo. Sin embar­
go, la CBmodificada (inactiva) retiene su capacidad para for­
mar un complejo con crotoxina A (Fraenkel-Conrat y col.,1978).
Además, Chang y Lee demostraron que la enzima modificada en el
\.comp1ejo es capaz de provocar la disminución inmediata de la
contracción por estimulo indirecto del músculo seguida por un
aumentode la contractilidad, similar al provocado por el com­
plejo activo. Se interpreta que este proceso es el resultado
de la ligadura a la membranapresináptica ya que es independien
te de la presencia de iones Ca2+. Pero, a diferencia del com­
plejo crotoxina nativo, el complejo c0n la enzima modificada es
incapaz de producir el bloqueo irreversible de la unión neuro­
muscular; (b) El otro argumento que demuestra el paralelismo
entre actividad enzimática y toxicidad se basa en que ambosre
quieren específicamente iones Ca2 . El ión Sr2+ puede reemplg
zar a Ca2+para la liberación de acetilcolina, pero es inhibi­
dor competitivo con respecto a la actividad de fosfolipasa A2.
CuandoCa2+ se reemplaza por Sr2+, se inhiben tanto la activi­
dad fosfolipásica de la CBcomoel efecto tóxico sobre la re­
gión presináptica de la unión neuromuscular (Hawgoody Smith,
1977).

Tabla III-3: Excitabilidad del sartorio aislado en presencia

y en ausencia de complejo crotoxina.

Condición experimental Umbral

Control 25 Ï 3 v, 2 msec
+ crotoxina 200 g/ml 25 Ï 2 v, 2 msec
+Ca2+ 511M 20Ï5V, 2msec
+Ca2+ 50mM* 35Ï2v, 4msec

* Altas concentraciones de Ca2+disminuyen la excitabilidad de la membrana

IITUSCU.ar.

Los estudios electrofisiológicos con crotoxina B aislada indi­

can que bloquea el mecanismode liberación de acetilcolina y
si bien se requieren dosis menores, la diferencia de sensibili­
dad según la especie es similar a la que presenta el complejo
crotoxina nativo o reconstituído (Breithaupt,1976b; Hawgoody
 96

Santana de Sa, 1979).

Tanto la crotoxina B aislada comoel complejo crotoxina provoca
inicialmente anomalías en la liberación espontánea de neurotrang
misor, consistentes en heterogeneidad de la amplitud de los po­
tenciales miniatura de placa terminal y explosiones de potencia
les miniatura. A continuación se observa la disminución en nú­
mero de los fenómenos de liberación espontánea intercalados con
breves períodos de recuperación. Con el tiempo los intervalos
de recuperación se hacen más cortos hasta que se establece el
bloqueo estable de la liberación de neurotransmisor.
Teniendo en cuenta que la alteración de la función mitocondrial
por la adición de un desacoplante (TTFB)determina una acelera­
ción constante de los efectos provocados por crotoxina B, sin pg
ríodos de recuperación, sugiriendo que la función mitocondrial,
al menosen los estadios iniciales de la intoxicación, no sería
alterada y que los efectos no son mediados por un incremento gg
neral e indiscriminado de la permeabilidad de la membrana.
Estos efectos aislados e impredecibles provocados por la crotoxi
na B del complejo, la diferencian de otras toxinas presinápticas
como la B-bungarotoxina de veneno de Éuggarusnmlticinctus y el
veneno de Latrodectus mactans (viuda negra). En efecto, con pre
paraciones aisladas, intoxicadas por s-bungarotoxina, si bien pue
den presentarse explosiones de potenciales miniatura, lo típico
es el incremento inicial en el frecuencia de liberación de neurg
transmisor asociado a un aumento sostenido de la amplitud de los
potenciales miniatura (Obergy Kelly,1976). Con preparaciones
aisladas tratadas con veneno de viuda negra es tipica la apari­
ción de explosiones de potenciales miniatura, de comienzoy fina
 97

lización igualmente bruscos que han sido atribuidos a la induc­

ción transiente de canales permeables a cationes (Del Castillo
y Pumplin, 1975). En cambio, con crotoxina B si bien pueden
observarse explosiones de potenciales miniatura, estas no fina­
lizan abruptamente, sino que su frecuencia disminuye gradualmen
te hasta desaparecer.
En consecuencia, se ha sugerido que la actividad fosfolipásica
de la crotoxina B produce incrementos transientes en la permea­
bilidad de la membranaresultantes en aumentos discretos de la
.
concentrac1ón de Ca2+ que, a1 menos inic1almente
. . . . .
serían diSipa­
dos por los mecanismos reguladores de la concentración de Ca2+
propios de la terminal (Baker,l974). De manera que el efecto
inicial se produciría por alteración de la estructura altamente
organizada de la "región activa" de la terminal, que interferi­
rïa con los cambios conformacionales inducidos en el canal de
calcio por la llegada del impulso nervioso.
La presencia de productos de hidrólisis resultaría en una estrug
tura más desordenada que haría posible cambios transientes en la
permeabilidad y alteración de los procesos involucrados en el a­
coplamiento depolarización-secreción (Hawgoody Santana de Sa,
1979). De acuerdo con esta interpretación, la acción de la cro­
toxina B sería puramente local, a nivel de la membranade la te;
minal y determinada exclusivamente por su actividad enzimática.
En preparaciones aisladas severamente intoxicadas con crotoxina
B, que ya no presentan potenciales espontáneos o evocados, con­
centraciones altas de K+ ó la adición de ionóforos de Ca2+ son
incapaces de provocar la liberación de neurotransmisor. Sin em­
bargo, existe evidencia experimental que indica que la terminal
 98

puede recuperar la respuesta al estímulo del nervio en presen­

cia de concentraciones de Ca2+ de 5,6 mM(Hawgood y Santana de
Sa,l979). Por otra parte, la adición de soluciones de Ringer
hipertónicas (sacarosa 0,15 M) a terminales bloqueadas por o­
tras fosfolipasas neurotóxicas provoca la liberación de canti­
dades de acetilcolina importantes (Magazaniky col.,1979) lo
que sugiere que la inefectividad de concentraciones altas de K+
o ionóforos de Ca2+ no podría ser explicada por la depleción de
neurotransmisor. Estos resultados paracen contradictorios con
los estudios ultraestructurales, que muestran una disminución
significativa de vesículas presinápticas en las terminales (Go­
palakrishnakone y Hawgood,l979). Sin embargo, modelos recien­
tes sobre el mecanismode secreción de acetilcolina sugieren que
el neurotransmisor se encuentra parcialmente libre en el cito­
plasma y que en esa forma es liberado al espacio sináptico (Du­
nant e Israel,l979), lo que implicaría que la contradicción en­
tre los resultados de los estudios electrofisiológicos y morfo­
lógicos podría ser sólo aparente.
En preparaciones de ratones intoxicados con dosis altas de cro­
toxina obtenida en el momentoen que se produce la parálisis
respiratoria o bien intoxicados en forma crónica con dosis sub­
letales, el examende los botones presinápticos por microscopía
electrónica muestra un citoplasma.floculento, fragmentos de mi­
tocondrias y cuerpos densos, quedando así una "estructura limi­
te" en la que no se puede asegurar la integridad de la membrana.
De todas maneras, tal como lo describen otros autores (Chang y
Lee,1977; Hawgoody Smith,l977), es llamativa la diferencia en­
tre el relativamente pobre efecto tóxico de la crotoxina B "in
 99

vitro" y el efecto dramático observado "in vivo". Empleando

crotoxina B en dosis de 1-5 DL50por vía intraperitoneal en ra
tones, la muerte se produce en aproximadamente la mitad de tiem
po que requieren cantidades isoactivas de complejo crotoxina.
La poca intensidad del efecto tóxico de CBpura observada con
preparaciones neuromusculares "in vitro" puede deberse a proble
mas metodológicos. En efecto, la crotoxina B se adsorbe fuerte
mente al vidrio y a numerosos soportes (matriz de geles, celo­
fán de diálisis, etc.) lo que podria determinar una importante
disminución de la concentración efectiva de la enzima. El lava
do repetido no permite recuperar la enzima absorbida y se requig
ren fuerzas iónicas muyelevadas para eluír la crotoxina B de
CM-Sephadex(Canziani y col.,1982) o de celofán de diálisis(BrerE
haupt,1976a).
El lavado repetido de preparaciones aisladas tratadas con croto­
xina puede retardar la acción tóxica, pero no eliminarla (Chang
y Lee,l977; Hawgoody Smith,1977).
El componente ácido del complejo crotoxina (crotoxina A) tiene
un peso molecular de 8000-10000 y un punto isoeléctrico de 3.7
(Horst y col.,l974) 0 3.4 (Breithaupt y col.,1974) que carece de
toxicidad (LD50i.p. en ratón >50 ug/g ) cuando se adiciona
a crotoxina B pura se observan varios efectos relevantes en cuan
to al mecanismo de toxicidad del complejo. Estos son: (a) forma
un complejo estable con crotoxina B de peso molecular más eleva­
do y punto isoeléctrico bajo ( 4.5) que reproduce la mayor parte
de las propiedades fisicoquïmicas del complejo crotoxina nativo;
(b) inhibe especificamente la actividad fosfolipásica de la cro­
toxina B sobre lipoproteínas y (c) potencia la toxicidad de la
 100

crotoxina B (no de fosfolipasa A2 de otro origen - Hendony

Fraenkel-Conrat,1976) alterando el comportamiento farmacociné­
tico de la enzima de modoespecífico. La toxicidad del complg
jo reconstituido es muchomayor que la de la crotoxina B aísla
da y similar a la que presenta el complejo crotoxina nativo,
tanto con respecto a la sensibilidad de distintas especies como
1a localización periférica de la parálisis respiratoria (Vital
Brazil y col.,1966). La potenciación de la toxicidad de croto­
xina B es probablemente el resultado más importante de la forma
ción del complejo con crotoxina A.
A diferencia de la crotoxina B pura, el complejo crotoxina re­
constituído no presenta absorción inespecífica de superficies y
probablemente sea ésta la razón por la cual los resultados obtg
nidos con preparaciones aisladas y animales enteros resulten
más comparables que los obtenidos con crotoxina B pura (Hawgood
y Smith,1977; Breithaupt,1976b). Esta propiedad puede explicar
la estabilidad del complejo frente a la aparente "inactivación"
de la crotoxina B pura en las incubaciones con preparados aísla
dos, Chang y Lee (1978,1981). Del mismo modo, la ausencia apa­
rente de toxicidad de la crotoxina B pura sobre preparaciones
neuromusculares observada por Hawgoody Smith (1977) y su brus­
ca recuperación luego de la adición de crotoxina A podrian ex­
plicarse por la interacción de la crotoxina B con superficies
inespecificas. La adición de crotoxina A es capaz de provocar
la desorción de la enzima de superficies de vidrio y la forma­
ción del complejo crotoxina, resultando en un aumento de su con­
centración efectiva. Así es comola actividad fosfolipasa absor
bida a esferas de vidrio (ver Tabla IV-2) es totalmente recupera
 101

da en el sobrenadante por la adición de crotoxina A en ligero

exceso molar (2 a l, CA: CB, aproximadamente). En consecuencia,
el incremento en la toxicidad de crotoxina B por la adición de
crotoxina A "in vitro" resulta muchomayor (30-50 veces) que el
observado con el complejo reformado "in vivo" (16-20 veces).
Sin embargo, el aumento de la toxicidad es mayor del que podría
esperarse si el único efecto de la crotoxina A fuera el de res­
cate de la crotoxina B ligada a superficies inespecíficas. La
crotoxina A potencia efectivamente la toxicidad de crotoxina B
por algún otro mecanismo. Puede suponerse que la alta afinidad
de la crotoxina A por crotoxina B justifique considerarla como
un transportador farmacocinético apto para impedir la interac­
ción inespecífica de la enzima con tejidos distintos del blanco
de la toxina. Estudios cinéticos realizados por Habermanny cg
laboradores (1972) utilizando crotoxina B marcada con iodo 125
y crotoxina A marcada con iodo 131 demostraron que la marca de
la crotoxina B se acumula en hígado mientras que la inyección
del complejo resulta en una acumulación de la radioactividad en
los músculos que es estadísticamente significativa. Además,la
concentración de CB-I 125 circulante luego de su inyección por
vía subcutánea aumenta en presencia de crotoxina A. Se ha com­
probado que crotoxina B y crotoxina A inyectadas con un interva­
lo de 10 segundos provocan un efecto tóxico similar al del com­
plejo preformado (Hendony Fraenkel-Conrat,1976), pero la inyec­
ción de ambos componentes separada por 30 minutos entre cada uno
no provoca efectos tóxicos. Esto ha dado lugar a la hipótesis
de que la crotoxina A cumple el papel de "protector" de la crotg
xina B ("Chaperoneconcept",cf. Hendon y Tu,1979). De acuerdo
 102

con este criterio, los sitios específicos de acción biológica

presentarían una afinidad por la fosfolipasa A2 mayor aún que
la de la crotoxina A, de manera que el complejo crotoxina fun­
cionaría comoun depósito circulante, con una afinidad interme­
dia entre los sitios de baja y de alta afinidad en los tejidos.
Existen evidencias experimentales que demuestran que el comple­
jo crotoxina debe disociarse para ejercer su efecto tóxico.Jeng
y col.(1978) demostraron que luego de incubar eritrocitos ente­
ros o hemoligados con el complejo CA-3H- CB1251, la crotoxina
B125 I era sedimentada junto con las membranasmientras que la
CAgHquedaba en el sobrenadante, de donde concluyeron que la li
gadura de la crotoxina B requiere la disociación de su complejo
con crotoxina A. La crotoxina BlgsI ligada a dichas membranas
no era desplazada en presencia de un exceso de crotoxina B nat;
va. De igual forma, Bon y col.(1979) encontraron que la croto-;
xina nativa incubada con electroplaca del órgano eléctrico de
Torpedo marmorata desaparecïa del medio. En su lugar, crotoxina
A es detectada en el sobrenadante mientras que crotoxina B per­
manecía ligada a las membranas. Finalmente, en el precipitado
Hendony Tu (1979) encontraron que el complejo crotoxina, unido
covalentemente por un reactivo bifuncional, carecía de toxicidad
pero conservaba una actividad enzimática comparable a la del com
plejo nativo.
La ligadura de CBmarcada a membranade eritrocitos no es satura
ble. En presencia de CA la CB se liga a las membranas en menor
proporción (Jeng y col.,1978) pues la disociación obligatoria
del complejo es limitante. En el caso de la membranade electrg
placa de Torpedo, la ligadura de crotoxina B en presencia de crg
 103

toxina A es saturable y de magnitud semejante a la de a-toxinas.

En este caso, la ligadura de CBapoyaría la existencia de sitios
específicos de ligadura o de receptores que contribuirïan adicig
nalmente a la disociación del complejo.
Cuandopreparaciones aisladas se incuban con mezclas de toxinas
presinápticas (B-bungarotoxina, taipoxina y crotoxina) la acción
tóxica se potencia (Chang y Su,1980) por que se ha sugerido que
el sitio de ligadura de cada una de estas toxinas debe ser difg
rente y específico.
Estos resultados no permiten una interpretación inequívoca, te­
niendo en cuenta que todas las toxinas empleadas son fosfolipa­
sas A2. Asi, la potenciación de la acción de una toxina por o­
tra podría deberse a que ambas actúan en forma sinérgica sobre
los fosfolípidos de membranay sea por "efecto de masa" (ya que
catalizan la mismareacción) o bien porque presentan selectivi­
dad diferencial por las distintas clases de foSfolípidos de la
membrana(Dawson,l913). Por otra parte, si bien debería espe­
rarse que los productos de hidrólisis sean inhibidores de la ag
tividad enzimática, esto no es siempre cierto cuando el sustra­
to está estructurado en una membrana,ya que los requerimientos
de empaquetamientode los productos de hidrólisis resultantes
de la acción de una toxina deben necesariamente distorsionar la
estructura (Israelachvili,Marcelja y Mitchell,1981) lo que po­
dría facilitar el ataque por la otra enzimatóxica.
Por otra parte, la existencia de receptores o "sitios de alta
afinidad" para la crotoxina en la membranapresináptica no ex­
plica los efectos miotóxicos observados en presencia de concen­
traciones elevadas de crotoxina (Breithaupt,l976b).
Igualmente, los resultados de Hawgoody Santana de Sa (1979) no
 104

sugieren la existencia de "sitios específicos" para la crotoxi

na, sino más bien que el efecto tóxico sería el resultado de
su acción local como fosfolipasa A2.
Puede concluirse que esta línea de estudios no permite avanzar
en el conocimiento del mecanismo de acción de la crotoxina. En
principio, el empleo de la preparación neuromuscular aislada
sólo permite estudiar la acción de la toxina una vez que ésta
se encuentra ligada al blanco; en consecuencia, difícilmente
pueda esperarse obtener información de eventos previos como SII
el reconocimiento y la ligadura.
La interpretación de los estudios electrofisiológicos se ha bg
sado en la existencia de receptores para crotoxina, por lo que
se han empleado los diseños experimentales (p.g.potenciaci6n,
inhibición y suma de efectos) usuales para el modelo de recep­
tores, si bien se carece de evidencias probatorias sobre la e­
xistencia de tal receptor. Si los resultados de estos estufios
fueran coherentes, reforzarïan el modelodel receptor para neu
rotoxinas presinápticas. Sin embargo, la dificultad para inter
pretar esos resultados en forma coherente (Changy Lee,1980;
Harvey y Karlsson,1982) es un fuerte argumento para cuestionar
dicho modelo. La elucidación de problemas como (a) por qué me­
canismo la subunidad A potencia el efecto tóxico de la crotoxi
na B; (b) qué condiciones locales a nivel de la unión neuromus
cular provocan la disociación de un complejo tan estable en con
diciones fisiológicas , determinandoasí la especificidad de
blanco de la toxina; (c) la condición necesaria, la existencia
de un receptor especifico o "sitio de alta afinidad“ para ex­
plicar el mecanismode acción del complejo crotoxina, requiere
 105

otro tipo de aproximación experimental complementaria.

El complejo crotoxina y sus subunidades poseen propiedades fi­
sicoquímicas bien definidas y su estudio puede ser importante
para caracterizar los tipos de interacción entre las subunida­
des y con 1a membranablanco, la que podria aportar informa­
ción adicional para responder esas preguntas.
 CAPITULO IV

"0bjet¿u¿dad: Díceóe de La capacidad

de un ¿ajeto
M
de aazonaa como un objeto".

Pequeño Chulak
Ituátnado
"Aóh an ¿mpeatinent queótion and
you wiki get the peatinent anówen".
Bnonow¿kq
The Aócent og
Man
 106

CROTOXINA B

Comose ha demostrado en el Capítulo anterior, la Crotoxina B

es el agente farmacológico crucial del complejo crotoxina
(Breithaupt,l976b;Habermann y Breithaupt,1978) y su actividad
catalítica comofosfolipasa es indispensable para la toxicidad
(Breithaupt,1976b;Rubsamen y col.,l971; Hawgoody Smith,1977).
Se han aislado y purificado fosfolipasa A2 de venenos de abeja
(Shipolini y col.,l974), escorpiones (Krupg1966),ofidios (pa­
ra una revisión ver "Snake Venomes", Capítulos 4 y 12,1979) y
tejidos de mamíferos (De Haas y col.,l968). Sin embargo, sólo
algunas exhiben neurotoxicidad. Por ese motivo es importante
estudiar sus propiedades físicas y las características de la
reacción catalizada por la crotoxina B.

Propiedades físicas de Za Crotoxina B

(a) Separación e identificación: La cromatografía del comple­

jo crotoxina en CM-SephadexC-50 resulta en la separación
de dos o tres picos con actividad fosfolipasa A2. El pico
de la fracción II , corresponde a una fosfolipasa A2, de
punto isoeléctrico bajo (Fig.II-1B), que carece de neuroto­
xicidad así comode capacidad para formar complejos con crg
toxina A. La crotoxina B puede eluírse como un pico único
en la fracción V o en dos picos correspondientes a las frag
ciones IV y V. Esto último se debe a la presencia de dos
isoenzimas que difieren ligeramente en su composición en a­
minoácidos (Breithaupt y col.,1975) pero que exhiben la mis
 107

ma neurotoxicidad y capacidad de formar complejo con cro­

toxina A. La aparición de la isoenzima que se eluye con
la fracción IV es inconstante y, cuando está presente,
puede representar no más del 20%del total de la activi­
dad de fosfolipasa A2 recuperada como crotoxina B. El pi
co correspondiente a la fracción V (Fig.II-1B) que repre­
senta entre 80 y 100%de la crotoxina B pura recuperada
es el que se empleó en forma habitual en el presente tra­
bajo. Por electroforesis en gel de poliacrilamida en pre
sencia de SDS, la crotoxina tiene una movilidad correspon
diente a un peso molecular de alrededor de 13 000 (Horst
y col.,1972). Breithaupt y col. (1974), empleandocroto­
xina B reducida y carboxamidometilada observó por electro
foresis y ultracentrifugación un peso molecular de 15 800,
mientras que el obtenido por cromatografía en gel de Se­
phadex (en presencia de cloruro de guanidinio 6.0M) fue
14 500. El menor peso molecular aparente obtenido por
filtración en gel de Sephadexpuede explicarse por la fue;
te interacción de la proteína con la matriz del gel (Ha­
bermann y Breithaupt,1978). Además, como se observó en
la Fig.II-2B la electroforesis en gel de poliacrilamida,
en presencia de SDS, de la proteína reducida con mercaptg
etanol presenta una banda correspondiente al dimero, lo
que demuestra su considerable tendencia a la autoagrega­
ción (cf.Breithaupt,1974). El peso molecular calculado a
partir del análisis de la composición en aminoácidos es
16 300, lo que concuerda con los resultados publicados por
Breithaupt y col.(1975). La composición en aminoácidos de
la crotoxina B (fracción V en la Fig.II-1B) se presenta en
 la Tabla IV-l.

Tabla IV-l: Composición en aminoácidos de Za crotoxina B (Frag

ción wi.

Lis 11,36 (ll)

His 2,26 (2)
Arg 11,44 (12)
Asp 10,91 (11)
Treo 7,71 (8)
Ser 6,74 (7)
Glu 9,85 (10)
Pro 5,30 (5)
Gli 12,50 (13)
Ala 7,06 (7)
Cis-SH 15,61 (16)
Val 2,01 (2)
Met 2,16 (2)
Ileu 4,85 (5)
Leu 6,87 (7)
Tyr 11,55 (12)
Fen 6,91 (7)
Trpg -- (3)
Total: 140
Peso Molecular: 16294

Datos tomados de Breithaupt y col.,l975.

ID‘
Im
Determinado espectrofotométricamente.

A pesar de contener 16 residuos de cisteïna, no se titulan

grupos SH-libres en la crotoxina B nativa o en presencia de
urea 8.0Mtanto con reactivodeElhmm (5:5‘biS'P'nitr0ben29
ato) comocon p-cloromercuribenzoato. Esto implica que los
 109

residuos de cisteína se encuentran involucrados en la for­

mación de 8 puentes S-S.

(b V
Estabilidad: La crotoxina B exhibe una notable estabilidad
frente a numerosostratamientos físicos. Así, es estable
al tratamiento térmico (90°C) durante una hora a pH 3.0.
La estabilidad es menor a valores de pH más elevados (unos
20 minutos a pH 7.5, 90°C). La incubación a pH 7.0 y 25°C
en presencia de urea (6.0 a 8.0M) durante 10 horas no afeg
ta su actividad. Se pierde alrededor de 10%de su activi­
dad por tratamiento con cloroformo-metanol (19:1 en volu­
men) y piridina. No se observa disminución de la activi­
dad por congelamiento y descongelamiento repetidos, o por
liofilización. En cambio es rápidamente inactivada por in
cubación con tripsina a pH 8.0 o con pepsina a pH 3.0. Es
importante destacar que la crotoxina B se adsorbe fuerte­
mente al vidrio (ver Tabla IV-2), a la matriz de los geles
de Sephadex y al celofán de diálisis, lo que obliga a ex­
tremar las precauciones durante su purificación y ulterior
manipulación. La enzima absorbida conserva su actividad
catalítica intacta y, por ejemplo, puede recuperarse casi
cuantitativamente por el lavado repetido de celofán de dig
lisis con solución de ClNa 3.0M ajustada a pH 2.5 con áci­
do clorhídrico.
Tabla IV-2: Absorción de la crotoxina B a perlas de vidrio de
diámetro controlado.

Area de vidrio Actividad de fosfolipasa Actividad de fosfolipasa

A /h& ligada/cm2 de vidrio (%de
(sz) (a) 2 (%) teórico)

0.00 100 -­
0.63 45 96

1.26 28 99

2.50 12 98

(a) Se admite que la superficie del vidrio es conpletanente regular

Caracterización de la reacción catalizada por crotoxina B.

La crotoxina B es una fosfolipasa A que hidroliza todos los ti

pos naturales de 3-sn-fosfogliceridos dando comoúnicos produg
tos de hidrólisis ácidos grasos y lisofosfátidos (Roholt y SCQ
lanowitz, 1960). Con el objeto de confirmar la naturaleza de
la reacción y esteiquiometria, una muestra conteniendo vesícu­
las de lecitina de yema de huevo en ClNa 0.15M, C12Ca 10 mM, a
justada a pH 8.0 con OHNa10 mM, se incubó con 10 ul de solu­
ción de crotoxina B a 30°C. La velocidad de hidrólisis se de­
terminó titulando los ácidos grasos liberados con la solución
de álcali. A diferentes intervalos de tiempo se extrajeron ai
lícuotas de 1.0 m1 que se recibieron en 0.1 ml de solución de
EDTA(concentración final 27,3 mM)para detener la reacción
y, en 10 ml de etanol. Las muestras evaporadas a sequedad,
disueltas en 0,2 ml etanol, se analizaron por cromatografía
en capa delgada. Las manchascorrespondientes a lisolecitina
y lecitina residual se rasparon y se determinó el contenido
de fósforo lipïdico,(P).

(a) Esteiouiometria: Los productos de hidrólisis obtenidos

fueron ácidos grasos y 1-acil-sE-glicero-3-fosforilcolinas
(lisolecitina). Las relaciones (quuiv.ácidos grasos li­
berados/pmollecitina hidrolizada) y (mel lisolecitina
formados/umollecitina hidrolizada) en las alicuotas obtg
nidas a distintos intervalos de tiempo fueron de 1-0, lo
que concuerda con la esteiquiometría:
1 mol de lecitina + 1 mol de lisolecitina + 1 equivalen­
te de ácido graso.
No se detectó hidrólisis en las preparaciones control in­
cubadas con crotoxina B en presencia de EDTApor lo que
pueden descartarse artefactos debidos a activación de la
enzima en la placa de cromatografía de silica gel (Goerke
y col.,l971).
(b) Sitio de hidrólisis: Es sabido (Menzel y Olcott, 1964) que
la distribución de los ácidos grasos en la lecitina de ye
ma de huevo es caracteristica: los ácidos grasos satura­
dos se encuentran preferencialmente en la posición 2; en
consecuencia, el estudio de la composición de los ácidos
grasos liberados por la enzima ylcs que quedan ligados al
lisofosfátido permite identificar el sitio común. Tenien
do en cuenta estos aspectos se determinó la composición
Tabla IV-3: Productos de hidrólisis por crotomina B de Zeciti
a
na de yema de huevo —.

Acido grasoÉ LecitinaE Acido graso E- Acido grasoE

libre en lisofosfátido

16:0 28,0 6,5 59,2

18:0 16,1 6,5 34,0
20:0 0,2 0,2 Tr
16:1 0,2 0,4 0
18:1 39,5 59,0 1,9
18:2 9,5 16,6 0,1
18:3 0,1 0,2 0
20:4 4,0 5,9 0,8
22:6 1,9 4,2 0

Utilizando 50 mg de fosfatidilcolina de yema de huevo soni­

cados en 2 ml de EDTA-CaClz-NaCl-Tris-HCl, pH 7.5 incubados
con 13,5 g de CB durante 6 horas a 30°C bajo nitrógeno. Los
productos de reacción fueron extraídos, separados y analiza
dos como se ha descrito en el Capitulo I (Materiales y métg
dos).
Notación: número de átomos de carbono seguido por número de
uniones dobles.
IO Los valores indican %de ácidos grasos totales; tr (trazas)
0.05%. Acidos grasos saturados entre C11 y C15. No se han
considerado todos los ácidos grasos que se presentan en la
mezcla.
en ácidos grasos de una muestra de lecitina de yema de
huevo sometida a hidrólisis por crotoxina B. Los produc­
tos de hidrólisis se separaron por partición de acuerdo
con el método de Dole y Meinert (1960) por partición. La
fase superior polar, conteniendo los ácidos grasos libres,
se separó cuidadosamente y se evaporó a sequedad. Los li
sofosfátidos contenidos en la fase inferior apolar fueron
extraídos en cloroformo y evaporados a sequedad. Las
muestras fueron tratadas durante 5 minutos a 65°C con 0.5
ml de una solución de F3B 14%en metanol absoluto y la re
acción se detuvo por la adición de 0.5 ml de agua. Los
ésteres metílicos extraídos mediante tres lavados sucesi­
vos en 1 ml de hexano y concentrados por evaporación bajo
nitrógeno se analizaron por cromatografía gas-líquido.
Los resultados presentados en la Tabla IV-3, muestran que
la crotoxina B libera preferencialmente ácidos grasos in­
saturados,independientemente de la longitud de la cadena
y del grado de insaturación. Recïprocamente, los lisode­
rivados contienen ácidos grasos saturados. Esto indica
que la crotoxina B actúa selectivamente sobre la posi­
ción 2 del fosfolípido (cf. Breithaupt, 1976) . En
consecuencia se concluye que la crotoxina B es una
fosfolipasa del tipo A2 (Fosfátido acilhidrolasa, EC
3.1.1.4.) que hidroliza selectivamente la unión éster del
ácido graso unido al OH del glicerol de los 1,2-diacil­
sg-glicero-3-fosforilderivados, de acuerdo con el esquema:
 0
0
l H
HICI —0-C-R¡ H1C1—O-C-R|
o I H1 O 9
R2—C-0>C24H R2 C o H0>C2
I l

OH H C —0 0
"¡CFR/¡0 2’ \//
P P
0 \
-0/ \0—R3 ‘0/ O'RgO

1 dlacilfosfoglicérido la'cidograso l aciltosfoghce'rido

Ru =cadena saturada R2 =cadena Insahnada R3= colina,etano|amina_etc.

Que es similar al esquema de reacción de fosfolipasas de

otros venenos no neurotóxicos (Tu, 1976) así como de la en
zima de páncreas porcino (De Haas y col.,1968).

(c) Estéreoespecificidad: La estéreoespecificidad de la croto­

xina B se demostró de dos maneras, a saber (1) en presencia
de una mezcla racémica de (D,L)-dipalmítoil lecitina, la
crotoxina B hidroliza sólo el 50%del fosfolípido. La le­
citina residual no es hidrolizada por fosfolipasa A2 de
 115

Bothrops nuewiedfi.o de páncreas porcino que atacan esterg

oespecíficamentela 1,2-diacil-sg-glicero-3-fosforilcoli­
nas (es decir, de la serie L)(Vidal y col.,l97l; De Haas
y col.,1968), (2) la crotoxina B no hidroliza la 2,3-di­
heptanoiljsnfglicero-l-fosforilcolina (D-PC(7:0))mien­
tras que el enantiomorfo (PC(7:0)) es rápidamente hidroli
zado. Puede concluirse que la crotoxina B es estereoespg
cïfica para los fosfolfpidos de la serie L (normal), pro­
piedad que comparte con otras fosfolipasas del tipo A2.
Efecto de iones sobre la actividad enzimática: Si bien los
efectos de cationes divalentes dependende la naturaleza
del sustrato empleado (fosfolipidos puros o bien lipopro­
teinas), puede afirmarse que la crotoxina B requiere espe
cïficamente iones Ca2+para la hidrólisis de lecitinas pu
ras, y no puede ser sustituido por Mgz+; Ba2+ o S r2+. En

presencia de Ca2+ los iones M92+ no afectan la velocidad

de reacción, mientras que Ba2+ y Sr2+ se comportan como
inhibidores competitivos puros.
. . . . .
El mecanismo de 1nh1b1c1ón en presenc1a. de iones
.
Cu2+ ,
2+ 2+
Zn , Fe y Fe3+ es más complejo, ya que no es revertido
.
completamente por concentrac1ones elevadas de Ca2+ . .
Sin
embargo la inhibición puede ser revertida en forma casi
completa por la adición de EDTAy Ca2+ en exceso.
Cuando se emplean lipoproteïnas de yema de huevo como sus
trato, la adición de C12Ca 5 mMproduce un muy discreto
aumento de la actividad enzimática. Este efecto moderado
probablemente se debe a que las lipoproteínas contienen
2+
iones Ca ligados (Vidal y Stoppani, 1971). Asi la act;
 116

vidad sobre lipoproteïnas puede inhibirse completamente

por la adición de EDTA10 mMy puede ser restituída com­
pletamente por la adición de Ca2+ en exceso; pero no por
+
M92 r Ba2+ o Sr2+. La presencia de Ca2+ ligado en la li­
poproteína podria explicar el discreto efecto activador
que se observawcon este sustrato luego de la adición de
algunos cationes divalentes (002+, Mg2+, Cd2+) que desplg
zarían el Ca2+ ligado aumentando la concentración de Ca2+
disponible para la reacción enzimática.
Con lipoproteïnas de yema de huevo como sustrato, los a­
niones citrato, oxalato y fosfato inhiben la actividad en
zimática de la crotoxina B, probablemente debido a su ca­
pacidad de ligar iones Ca2+.
Ademásde los efectos específicos pueden observarse modi­
ficaciones de la actividad debidas a cambios en la fuerza
iónica. Empleando lipoproteïnas de yema de huevo, la ac­
tividad de crotoxina B aumenta con la concentración de Cl
Na o ClK con un máxima de 0,2 M. Concentraciones superig
res (mayores que 1.0 M) producen inhibición.

(e V Efecto de inhibidores especificos: La crotoxina B presenta

una notable estabilidad frente a ciertos agentes desnatura
lizantes.
(i) La crotoxina B (10 ug)noeS inactivada por p-cloromercu
ribenzoato a concentraciones hasta 100 mMa pH 4.6 ó 7.0.
(ii) La actividad de crotoxina B no es afectada por incuba
ción con DFP, hasta 100 mM, a pH 7.0.
(iii) En contraste con la resistencia frente a los inhibi­
dores mencionados, el tratamiento con reductores (2-mercap
toetanol,ditioeritritol,dimercapto-propanol, pH7.5) resul
ta en una inactivación casi completa de la crotoxina B.
(iv) Frente a ciertos agentes alquilantes la crotoxina B
presenta caracteristicas particulares. La incubación de
20 g de crotoxina B en solución amortiguadora de Tris-HCl
50 mM,pH 7,2, a 25°C conteniendo ácido iodoacético 5.0 mM
resulta en inactivación de la crotoxina B del 50%en alre­
dor de 30 min. Sin embargo, es especialmente interesante
el efecto del bromuro de p-bromofenacilo, un inhibidor di­
rigido a1 sitio activo de las fosfolipasas del tipo A2
(Volwerky col.,1974). La crotoxina B es rápida e irrever
siblemente inactivada por este reactivo debido a la alqui­
lación de un residuo de histidina del sitio activo de la
enzima (Jeng y Fraenkel-Conrat,l978). Comose presenta en
la Fig.IV-l, la inactivación de la crotoxina B por bromuro
de p-bromofenacilo a pH 7.2, sigue una cinética de pseudo
1
primer orden (k = 0.39 min- ). El estudio de la dependen
cia de la pseudo constante de primer orden con el pH indi­
ca que en la reacción está involucrado un residuo de aming
ácido con un pKa de alrededor de g¿l. Comose presenta en
la Fig.IV-l, cuando la mezcla de reacción conteniendo la
enzima a pH 7.2, en presencia del cofactor o de un análogo
de sustrato se incuba con bromuro de p-bromofenacilo, la
reacción de inactivación sigue igualmente una cinética de
pseudo primer orden, sin embargo la pseudo constante de ve
locidad para la inactivación decae a k' = 0.22 min"l en
2+ 1
presencia de Ca 10 mMy 0.06 min- en presencia de D-PC
(7:0) 0.77 mM.
 118

“s. D-PC(7=0)0.73 "IM

Küamss '“

’­
E”
RESIDUAL
LOG
PORCENTAJE
ACCTIVIDAO
DE
\
\ ec'Homu
tu 3.
_.. z­
\\K'-0.22 min" 1‘ ¡_
\ ¡ ¡ l
‘ so ao 70 pH
l I l
20 30 40
MINUTOS

Fig.IV-l Inactivación de 1a actividad fosfolipasa A2 de 1a CBpor

el pBPBen presencia y en ausencia de sustrato y cofactor.
Temperatura de incubación 30°C 'i' 2. CB pura (-), CB+ co­
factor y/o sustrato (----). Inserto: Constante de pseudo
primer orden en función del pH, pK- 6,1.

Se obtiene una protección óptima cuando se encuentran pre­

sentes simultáneamente Ca2+ (10 mM) y D-PC (7:0) (k' = 0.04
. -1 . . .
min ); Sln embargo, debe notarse que, en contrapOSiCión a
los resultados obtenidos con otras fosfolipasas (Volwerky
col.,1974), la protección obtenida en presencia de Ca?+ 10
mMes muy pobre (cf. Fig.IV-1) lo que sugiere-que la cons­
tante de disociación del complejo crotoxina B-Ca2+ debe
ser muyelevada. Este resultado concuerda con la falta
aparente de protección por Ca2+ observada por Jeng y Fraen
kel-Conrat (1978).
 Con respecto al grado de protección obtenido en presencia
de lecitinas monoméricas, éste depende de la composición
en ácidos grasos. Comose muestra en la Fig. IV-2, para
una conCentración fija (0.1 mM)de lecitinas monoméricas,
la eficiencia de protección es en el orden de PC (6:0)<<
PC (7:0)<< PC (8:0), indicando que aumenta con la longitud
de cadena de ácidos grasos. La importancia de la longitud
nde la cadena de ácido graso comodeterminante de la afini­
dad de la enzima por la lecitina está apoyada en el hecho
de que la fosforilcolina (equivalente a la cabeza polar)es
incapaz de proteger a la crotoxina B frente a la inactiva­
ción por el pBPBa concentraciones de hasta 5,0 mM.

RESIDUAL
FOSFOLIPASA
°/o
ACTIVIDAD
LOG

o é m ¡5 20
MWUTOS

Fig.IV-2: Protección del sitio activo de la CBpor lecitinas monoméricas

de longitud de cadena creciente contra 1a inactivacíón de la
enzima por pBPB, en ausencia de Ca2+ (10 mMEDTA). Sin sustrg
to (0); 0,1 mMPC(6:O) (A); 0,1 mMPC(7:0)(D); 0,1 mMPC(8:0) (n),
temperatura 30 Í 2°C, pH 7,2.
 120

La protección obtenida con D-PC (7:0) es idéntica a la ob

servada con el isómero L, de donde puede concluirse que
la crotoxina B es capaz de ligar tanto L como D-PC (7:0)
al sitio activo con la misma afinidad. De modoque la es
tereoespecificidad absoluta de la enzima es una expresión
de especificidad catalitica y no de ligadura, tal comoo­
curre con otras fosfolipasas A2 (Bonsen y col.,1972).
Debe recalcarse que en los experimentos presentados en las
Fig. IV-l y IV-Z , las lecitinas empleadas se encontraban
en concentraciones bien por debajo de las respectivas con
centraciones micelares criticas (Apéndice A); de modoque
la protección frente a la inactivación por pBPBseria el
resultado de la formación de complejos con monómerosen
el sitio activo de la crotoxina B.
Comose presenta en la Fig. IV-3, la velocidad de inacti­
vación por pBPBdisminuye a medida que la concentración
de PC (7:0) aumenta. Sin embargo, por encima de la con­
centración micelar crítica, ya no se observa protección
sino un aumento de la velocidad de inactivación. Este re
sultado aparentemente anómalo puede relacionarse con las
propiedades de solubilidad del reactivo. El pBPBes solu
ble en agua hasta aproximadamente 10-4 M, y la velocidad
de inactivación de la crotoxina B parece depender sólo de
la concentración del reactivo disuelto. Las lecitinas de
cadena corta en estado de solución molecular no modifican
la solubilidad del pBPB. En cambio, por encima de la con­
centración micelar crítica, el reactivo es solubilizado
en las micelas de fosfolípido aumentando su concentración
efectiva.
 121

F-H

.8 c>
Í

pBPB
por

deinacfivacidn
Velocidad

0,5 1,0 1 2,0

[PC (7:0)1 c.m.c­

Fig.IV-3: Protección de la CBcontra la inactivación por pBPBen/función

de la concentración de PC (7:0), c.m.c. 1,6 mM. Temperatura
30 Í 2°C, pH 7,2.

DISCUSION E INTERPRETACION

La identificación de los productos de hidrólisis asi comola

estequiometría de la hidrólisis de lecitina de yemade huevo
justifican caracterizar a 1a crotoxina B comouna fosfolipasa
A. La identificación comofosfolipasa A2 se basa en las evi­
dencias presentadas en la Tabla IV-3. Resultados similares
fueron comunicadospor Breithaupt (1976a)utilizando lecitinas
mixtas sintéticas.
Otras fosfolipasas tales como las de venenos de abejas (Shipo­
 122

lini y col.,1974) y de otros ofidios (Strong y col.,l975; Vi­

dal y col.,l972; Braganca y col.,l970) y la de páncreas porci­
no (De Haas y c01.,1968), bovino (Duthil y Van Wezel,1973), y
humano, son también del tipo A2. Además, la crotoxina B ataca
estereoespecificamentelos l,2-diacil-sn-glicero-3-fosforilco­
linas (de configuración L), como las enzimas de venenos de
Crotalus adamanteus (Wells, M.A. y Hanahan, 1969) y de pán­
creas porcino (De Haas y col.,l968).
Su composición en aminoácidos presenta dos caracteristicas sa­
lientes, a saber:
(a) La presencia de 16 residuos de cisteïna comprometidos en
ocho puentes S-S, propiedad que comparte con otras fosfoli
pasas A2 (Shipolini y col¿,1974; Krupp,1966; De Haas y col.
1968; Vidal y c01.,1972). Este elevado número de puentes
S-S sería el responsable de la notable estabilidad frente
al tratamiento térmico, o agentes desnaturalizantes como
la úrea. La inactivación producida por reductores (2-mer
captoetanol, ditiothreitol, 2,3ddimercaptopropanol)puede
atribuirse a la reducción de esos puentes S-S, que serian
indispensables para mantener la conformación funcional de
la enzima.

(b) Si bien la suma de los residuos de aminoácidos básicos (N=

25) no es muy distinta de la de los residuos de amiácidos
ácidos (N=21), su punto isoeléctrico ha sido estimado en­
tre 8,8 (Horst y col.,l972) y 9,7 (Breithaupt y col.,l975L
lo que sugiere que gran parte de los residuos ácidos deben
encontrarse en forma de amidas. El elevado punto isoeléc­
trico es una propiedad compartida solamente por algunas
 123

fosfolipasas A2 neurotóxicas comola B-bungaro-toxina, no­

texina, taipoxina (HabermannyBreithaupt, 1978).

La crotoxina B requiere iones Ca2+ comocofactor específico;

al igual que otras fosfolipasas de tipo A2 (Haberman,1957;Long
y Penny,1957; Shipolini y col.,l971, Pieterson y col.,l974) no
puede ser sustituido por Mg2+(Breithaupt, l976a)y los iones
Ba2+ y Sr2+ son inhibidores competitivos (Breithaupt,1976a)Ha—
bermannijreithaupt,l978).
Empleando lipoproteínas de yema de huevo como sustrato y en
presenc1a. de concentrac1ones
. .
bajas de Ca2+ , los iones
.
Mg2+ ,
Cd2+y Co2+producen un discreto incremento de la actividad en
. . .
zimática. Es p051ble que estos iones desplacen el Ca2+ combi­
.

nado con el sustrato, incrementando asi la concentración de

Ca2+disponible para la activación de la reacción enzimática
(Vidal y Stoppani,197l). La concentración óptima de Ca2+ de­
pende del sustrato empleado. Breithaupt (1976a)ha estimado
concentración óptima de Ca2+ de 50 mMusando como sustrato di­
heptanoil lecitina 3,0 mMy 400 mMusando lipoproteina de yema
de huevo. Sin embargo esta estimación no se basa en un análi­
sis cinético preciso. Los aniones afectan muypoco la activi­
dad de la crotoxina B, excepto el citrato, okalato y fosfato
en altas concentraciones, debido a su capacidad de complejar
Ca2+.
La fuerza iónica óptima para la hidrólisis de lipoproteïnas de
yema de huevo es similar a la observada con las fosfolipasas
A2 de veneno de Crotalus adamanteus (Saito y Hanahan,1961) y
de Bothrops neuwiedii (Vidal y col,,1972). El efecto de la
fuerza iónica es dedificil interpretación debido a la compleji­
 124

dad de la estructura del sustrato. Cuandose emplean leciti­

nas puras de cadena corta, la actividad de la crotoxina B tam­
bién es dependiente de la fuerza iónica. En este caso, el au­
mento en la concentración sales determina cambios en el estado
de agregación del fosfolïpido (Tausk y col.,1974; Allyer y
Wells,l979), que resultan en un fuerte incremento en la veloci
dad de hidrólisis por fosfolipasas A2 (Pieterson W.A., Tesis,
Universidad del Estado, Utrecht, Holanda, 1972Ï.
Los estudios sobre la acción de reactivos específicos de gru­
pos permiten obtener varias conclusiones. La estabilidad de
la crotoxina B frente a p-cloromercuribenzoato concuerda con
la ausencia de grupos -SH- titulables por el mercurial tanto a
pH 7,0 como a pH 4,6, aún en presencia de urea 8,0 M. Resulta
dos similares se obtuvieron con las fosfolipasas A2 de Crota­
lus atrox (Wuy Tinker,l969), C. adamanteus (Wells y Hanahan,
1969), Naja naja (Salach y col.,1971), y B. neuwiedii (Vidal y
col.,1972) y de páncreas porcino (De Haas y col.,1968). La
crotoxina B no es sensible frente a DFP, un reactivo altamente
específico para hidrolasas-serina. Lo mismosucede con las en
zimas de C. adamanteus (Wells y Hanahan,1969), de N. naja (Sa
lach y col.,1971), de B. neuwiedii (Vidal y col.,1972) y de
páncreas porcino (De Haas y col.,1968), mientras que la enzima
de C. atrox parece ser inactivada (Wuy Tinker,1969). La inag
tivación por ácido iodoacético sugiere que un residuo de histi
dina sería esencial para la actividad enzimática (Vidal y col.
1972; Van Wezel y col.,1976) ya que en ausencia de grupos -SH—
libres, el residuo imidazol de histidina sería el mejor candi­
dato para reacciones de carboximetilación (Gurd,1967). De to­
das maneras es importante recalcar que la reactividad de este
 125

residuo de histidina no es particularmente alta (cf. Van Wezel

y col.,l976). La inactivación de crotoxina B en presencia de
pBPBse debe a la alquilación selectiva de un residuo de histi
dina del sitio activo. Este es uno de los numerosos ejemplos
en que un reactivo que no posee una especificidad de grupo bien
definida, ni presenta semejanzaestructural con el sustrato,
es capaz de producir la modificación selectiva de un residuo
esencial en la enzima.
En estos casos, es necesario definir si el reactivo se compor­
ta comoun inactivador dirigido a sitio activo (esto es, si el
residuo modificado se encuentra en el sitio activo). Para e­
llo es necesario satisfacer dos criterios minimos (Riordan y
Vallee,l969), a saber: (a) la inactiVación debe correlacionar­
se estequiométricamente con la incorporación del reactivo mod;
ficador y (b) la enzima debe ser protegida efectivamente en
presenCia de sustrato, productos o análogos. En el caso de la
crotoxina B se satisfacen amboscriterios. En efecto, se ob­
tiene inactivación completa cuando 1 mol de pBPBreacciona con
1 mol de crot031na B (Jeng y Fraenkel-Conrat,l978). Además,
se observa protección de la enzima en presencia de Ca2+, leci­
tinas de cadena corta y análogos (p.ej. D-PC (7:0)) por debajo
de la concentración micelar crítica.
Es interesante considerar por qué una halometilcetona apolar
comoel pBPBreacciona tan especificamente con el sitio activo
de la crotoxina B. En este sentido, deben tenerse en cuenta
dos observaciones, a saber: (1) el bromuro de p-bromofenacilo
no reacciona con histidina libre en condiciones en las que se
produce una rápida inactivación de la crotoxina B. Además, es
te readtivo esterifica específicamente un residuo de aspartoilo
 126

en la pepsina (Erlanger y col.,l966) y alcohila un residuo de

metionina 192 en la a-quimotripsina (Sigman y col.,l969). En
consecuencia, no es un reactivo de histidina; (2) la histidina
del sitio activo de la crotoxina B no es particularmente reac­
tiva frente a agentes alcohilantes comoel iodoacetato (ver
más arriba, cf. Vidal y col.,1972; Van Wezel y col.,1976); de
modoque la elevada velocidad de inactivación dificilmente pug
de ser atribuida a una especial reactividad de la histidina
sensible.
Puede admitirse que si el bromuro de p-bromofenacilo se compor
ta comoinhibidor dirigido a sitio activo se debe a que la es­
tructura de la enzima es la que favorece la reacción con la
histidina. Esto sugiere que debe existir cierta complementa­
ridad entre la estructura cercana al sitio de modificación y
la del bromuro de p-bromofenacilo. La falta de reactividad de
la bromoacetona (Volwerk,197ü) sugiere que el anillo aromático
o bien un cierto grado de hidrofobicidad es necesario para la
interacción. El hecho de que se obtenga protección eficiente
con sustratos monoméricosy que la afinidad de estos sustratos
por la enzima aumente con 1a longitud de cadena de los ácidos
grasos (Fig.IV-2) podría indicar que la histidina reactiva se
encuentra cerca de una región apolar de la proteina. Esta re­
gión apolar en la crotoxina B podria orientar la molécula de
pBPBde manera tal que la formación de la unión covalente re­
sulte favorecida. La protección debida a la adición de Ca2+
parece ser pobre. Sin embargo, comola reacción de inactiva­
ción en presencia del catión divalente sigue una cinética de
primer orden, es posible aplicar el método de Scrutton y Utter
(1965) para determinar la constante de disociación del comple­
 . . 2+ . . . .
jo en21ma—Ca así como la efic1enc1a de proteCCión por el ca­
tión. La ecuación empleada es

t1 2 k 1 — (t t )

___/_L = 2 + KCa( “23+ 1/2 ) (1v.1)

t1/2 k1 [Ca ]

Donde t 1/2o y t 1/2 son los tiempos medios observados para la

inactivación de crotoxina B por pBPB en ausencia y en presen­
cia de Ca2+, kl y k2 son las constantes de velocidad para la
inactivación de la crotoxina libre y el complejo CB-Ca2+res­
pectivamente. Si se determina los tl/2 para la inactivación
de crotoxina B sola y en presencia de concentraciones varia­
bles de Ca2+, la representación gráfica de tl/20 y tl/2 en fun
ción del término entre corchetes del segundo miembrode la e­
cuación (IV.l) debe ser una recta, cuya pendiente (KCa) es la
constante de disociación del complejo crotoxina B-Ca2+y la o;
denada (kz/k1) da una medida direCta de la eficiencia de la
protección. En el caso de máximaeficiencia (esto es la unión
del ligando e inhibidor son mutuamente excluyentes) k2 debe
ser cero. Los resultados presentados en la Fig.DFQmuestran
que el ión Ca2+es un protector muyeficiente, si bien la cons
tante de disociación es excepcionalmente elevada (10 mM). Bs­
to explica la pobre protección observada en presencia de Ca2+
5 mM (Jeng y Fraenkel-Conrat,l978).
El mismotratamiento no es viable para estudiar la protección
por D-PC (7:0) debido al escaso rango en el cual puede variar­
se la concentración de monómero(cf. Volwerk y col.,l974). Sin
embargo, es posible obtener una estimación de la constante de
disociación KLdel complejo crotoxina B-D-PC (7:0) sobre la ba
se de las consideraciones generales.
La velocidad de inactivación de la crotoxina B por pBPB (I) en
presencia de D-PC (7:0) (PC) puede describirse por la reacción:

KL
CB + Pc 4­
_+ CB - Pc
+
I
lki
CB - I

donde CB y PC son las concentraciones de crotoxina B y D-PC

(7:0) libres, respectivamente; CB-PC es la concentración del
complejo crotoxina B-D-PC(7:0), ki es la constante de veloci­
dad para la inactivación de CBlibre por el inbibidor I y KL
es la constante de disociación del complejo CB-PC.
Las suposiciones básicas son:
(a) que el equilibrio entre CB, PC y CB-PCse alcanza rápida­
mente y (b) que la velocidad de inactivación del complejo CB­
PCes despreciable con respecto a la velocidad de inactivación
de la CBlibre (cf. Volwerk y col.,1974).
La ecuación de conservación es:

[CEO] = [CB] + [CB-PC] (IV.2)

y la constante de disociación KLes:

KL
=Mi (m3)
[CB-PC]
 129

de donde

[CB]=(c1301—1 (IV.4)
1 + LES].
KL

La velocidad de inactivación de CBen ausencia de D-PC (7:0),

(Vo) es:

Vo =fi-d dtCB = ki[CB]t[I] (IV.5)

donde [CBlt es la concentración de crotoxina B activa en el

tiempo t, y si el inhibidor I se encuentra en exceso, puede in­
tegrarse para dar

—1n[c13]t = ki[I]t - 1n[c1301 (IV.6)

donde CBC] es la concentración iniéial de CB. Es claro que VO

está relacionada en forma lineal con ki[I], ya que la represen
tación gráfica de -ln[CB]t en función de "t" será una recta de
pendiente kill].
La velocidad de inactivación de CBen presencia de PC,(Vi) es:

-d [CB]t
Vi = ——- = kiICB][Il (IV.7)
dt
sustituyendo 1a ecuación (IV.4) en la ecuación (IV.7)se obtie­
ne

-d[CB]t
V.=——=k[CB]o 1
————[I] (IV.8)
l
dt 1+L119].
KL
si las concentraciones de [I] y [PC] son mucho mayores respec­
to de [CBJG , la forma integrada de la ecuación (IV.8) es

- 1n[c13]t = [I] ki ————l———— . t - ln[CBo] (IV.9)

1 + LBSL
KL

donde Vi presenta una relación lineal con el término que con­

tiene I en el segundo miembro de la ecuación (IV.9), ya que la
representación gráfica de -ln[CB]t en función de t es una rec­
1
ta de pendiente [I] ki
1 IPC!
KL

Si la inactivación por pBPBsigue una cinética de primer orden,

en lugar de las velocidades pueden emplearse los períodos de
semirreacción o vidas medias en ausencia (tl/zo) y en presen:
cia (t1/2) de PC. i
Así la concentración de crotoxina activa cae en la mitad de 1a
concentración original ([CB]t = 1/2[CB]0) en un intervalo de­
tiempo t, la ecuación (IV.6) puede escribirse como

___l____
ln[CB]o - ln[CB]t = ln 2 = ki[I]( 1+[LCL ) t 1/20 (IV.10)
KL

En presencia de D-PC (7:0), ecuación (IV.9) puede escribirse

COI'l'lO

ln[CB]o - ln[CB]t = ln 2 = ki[I](———3L——-)t1/2

1 + LBSL (IV.11)
KL

combinando las ecuaciones (IV.10) y (IV.11), se obtiene

 1/20

t1/2
=- 1

1 + LÏÉL
KD

que puede reordenarse para dar

t1/2O 1' t1/2o/t1/2

_______ = KL __——_————_—————— (IV.13)
tl/2 [PC]
La relación entre los tiempos medios de inactivación de CBen
ausencia y presencia de D-PC (7:0), 0,1 mM(Fig.IV-2) es 0,546
Ï 0,04 (í Ï c.s.m., n=3) introduciendo este valor en la ecua­
ción (IV.3), con PC = 0,1 mMse obtiene un valor de KL 0,13 Ï
0,02 (í Ï c.s.m., n=3) mM.
Este resultado se basa en la suposición de que la velocidad de
inactivación del complejo CB-PCes insignificante, lo que re­
quiere eficiencia completa de protección por PC. Si esta supo
sición es correcta, la distinta eficiencia de protección obseï
vada con concentraciones idénticas de PC (6:0), PC (7:0) y PC
(8:0) serian atribuibles a diferencias en la afinidad de esas
lecitinas por sitio activo de crotoxina B. Introduciendo los
valores de tl/20 y tl/2 obtenidos con PC (6:0) y PC (8:0) (Fig.
IV-2) en la ecuación (IV.13) se obtienen valores de KL 1,5 mM
[PC (6:0)]y 0,02 mM[PC (8:0)1. Estos datos representan ener­
gías libres estandar de ligadura AG°de 16,27 PC (6:0), 22,6
PC (7:0) y 27,4 PC (8:0) KJ/mol a 30°C.
La representación gráfica de AG°enfunción de la longitud de
cadena es una recta con una pendiente de 11,15 kJ, que extrapg
 132

la a AG°= 0 aproximadamente con PC (3:0) y a longitud de cade­

na cero (correspondiente a la cabeza polar sola) a aproximada­
mente AG°=+ 12 KJ;mol-l. Esto significa que la interacción
de la crotoxina B con la cabeza polar aislada de la lecitina
es termodinámicamente desfavorable, lo que concuerda con la ob
servación de que la fosforilcolina es incapaz de proteger la
crotoxina B de la inactivación por pBPB. Además, la represen­
tación gráfica de AG°/RTen función del número de metilenos,
es una recta con una pendiente de 1,01/RT, que representa la
contribución al AG°de asociación por cada metileno. El valor
obtenido (660 cal por mol de CH2) concuerda con el observado
para la interacción apolar de anfifilos de una sola cadena
(Shinoda,1963), lo que implica que las dos cadenas de ácido
graso de los PC interactúan independientemente una de la otra,
presumiblemente con una región apolar de la proteína.
La interpretación de los datos termodinámicos es coherente con
el rol que parece tener la estructura de la enzima respecto a
la reactividad importante de la histidina del sitio activo.
Finalmente, se ha observado que la autoagregación del sustrato
en micelas produce un aumento en la velocidad de inactivación
en lugar de protección. Es probable que la inclusión de molé­
culas de pBPBen la interfase fosfolipido-agua y la interac­
ción de la enzima con esta interfase aumente la concentración
efectiva del reactivo cerca del sitio de inactivación y el re­
sultado neto sería un aumentoen la velocidad de inactivación.
Sin embargo, pueden existir factores adicionales que contribu­
yan al incremento en la velocidad de inactivación observada,
comop.ej.: un aumentoen la suceptibilidad (nucleofilicidad)
 133

del anillo imidazólico de la histidina del sitio activo induci­

do por la interfase fosfolipido-agua. De este modopodria pen­
sarse que la modificación quimica de (fosfo)1ipasas pueda depeg
der del estado fisicoquïmico del inhibidor empleado, así como
la velocidad de hidrólisis es afectada por el estado físico del
sustrato .
 CAPITULO V

"En ¿a aubencia de COÁaAextnaondinaniaa,

apnec¿am06 que nOA pnopongan cneen en
aquetiaó que apanentemente ¿o ¿on".
La Rocheáoucauid
Oeuneó Cho¿¿¿¿ de
Vauvenangueó
 134

CINETICA DE LA REACCION CATALIZADA POR CROTOXINA B

INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO, SU ESTADO FISICO

Y EFECTO DEL EH

La arquitectura molecular particular de los fosfoglicéridos,

determina que estas sustancias se comporten comoanfïpatas pre
sentando una región polar, y otra apolar correspondiente a las
cadenas parafínicas de los ácidos grasos. Tales sustancias
presentan propiedades fisicoquimicas peculiares, tales como
las de formar espontáneamente agregados organizados en medio
acuoso, comportarse comoagentes tensioactivos y concentrarse,
adoptando una orientación definida en la interfase de dos me­
dios con distinta constante dieléctrica. La estructura de la
molécula (Fig.V-l) favorece la segregación entre la porción pg
lar y la parte apolar hasta el punto que puede admitirse un
comportamiento independiente de cada una de ellas.
La solubilidad de una sustancia en agua y en un medio no polar
dependerá del balance entre las influencias de ambas clases de
grupos. Si la cantidad (masa) de grupos polares supera la in­
fluencia de la masa de la porción apolar, el resultado será
que la molécula pasará completamente a la fase acuosa y perma­
necerá en ella. Si, por el contrario, predomina la influencia
de la región apolar (alcoholes superiores, ésteres del coles­
terol), la molécula se disolverá por completo en la fase apo­
lar.
En el caso de los fosfoglicéridos, la influencia que ejercen
los grupos polares y apolares sobre la afinidad de la molécula
son equilibrados, de manera que la tendencia de la región po­
 135

lar a introducirse en medio acuoso es suficientemente pronun­

ciada comopara que la sustancia muestre una solubilidad deteg
table en agua, mientras que el efecto de la región apolar de­
termina su fuerte tendencia a la agregación y a ocupar la in­
terfase entre un medio polar y otro no polar.

Fig.V-l: Molécula de lecítina mostrando la cabeza polar (zona A) y las cg

denas parafínicas apolares (zona B).

Comoconsecuencia de estas propiedades, los fosfoglicéridos se

disuelven al estado de dispersión molecular en agua en cantida
des muypequeñas. Si se introducen en el medio acuoso cantida
des mayores de fosfolipido, por encima de la llamada "concen­
tración micelar critica", se forman agregados en los cuales
las moléculas se disponen orientadas, creando un centro apolar
en estado cuasi-líquido (por encima de la temperatura de tran­
sición Tc - Apéndice C) y una interfase fosfolípido agua en la
cual se encuentran las cabezas polares.
La fuerza directriz de la agregación es el cambio de energia
libre de Gibbs asociado a la remoción de las cadenas apolares
del medio acuoso (Sundaraünganyjflmcn,1965) y el tiPO de agregí
do resultante (micelas o vesículas) depende de las propiedades
termodinámicas del sistema (los agregados con menor número de
agregación están favorecidos entrópicamente, ver Apéndice B) y
de las restricciones geométricas de las moléculas (Tanford,
1973) dependientes de su composición en ácidos grasos.
La disponibilidad de fosfolipidos con composición en ácidos
grasos definida de distinta longitud de cadena permite obtener
distintos estados de agregación (monómeros,micelas, vesículas)
y estudiar la actividad enzimáticaxdela crotoxina B en función
del estado de agregación del sustrato. Este punto es de impor
tancia crucial en lo que se refiere a la actividad de las enzi
mas (fosfo)lipoliticas. En efecto, en presencia de fosfolípi­
dos sintéticos conteniendo ácidos grasos de cadena corta, solu
bles en agua y de iones Ca2+, la enzima liga la molécula de
sustrato (al estado de monómero)y Ca2+en el sitio activo pa­
ra formar un complejo ternario productivo. A continuación se
produce la reacción catalizada y se liberan los productos (Tu,
1976, De Haas y col.,1968).
Por otra parte, cuando el fosfolipido se encuentra en forma a­
gregada, la enzima se liga a la interfase fosfolïpido-agua con
su sitio activo orientado hacia el ensamble regular de molécu­
las de sustrato y ligará una molécula de sustrato para formar,
en presencia de Ca2+, un "complejo ternario interfacial". La
reacción de hidrólisis procederá tal comoen el caso del sus­
 137

trato monomérico, excepto por el hecho de que la velocidad de

reacción aumenta en forma dramátina (hasta 4-5 órdenes de magni
tud) comoresultado de la interacción enzima-interfase (Wells,
1972; Pieterson y col.,1974). La falta de discriminación entre
estas dos situaciones ha generado una seria confusión, que per­
siste aún en la literatura reciente.
Si se define el sitio activo de una enzima lipolïtica comoel
conjunto de elementos estructurales responsables de la ligadura
del sustrato monomérico,especificidad y catálisis, la investi­
gación de esas caracteristicas propias del sitio activo debe e­
fectuarse empleando sustratos o análogos al estado monomérico.
Solamente en ese caso es posible emplear la poderosa herramien­
ta del análisis cinético convencional ya que los parámetros Km
y Vmtienen un significado fisico definido; ya sea que se em­
plee la aproximación de equilibrio rápido, en que la concentra­
ción de cada forma de la enzima puede asimilarse a un cociente
reducido entre la concentración de ligando y la constante de di
SOCiación adecuada (Dixon y Webb,1979; Segel,l975) o la de esta
do estacionario, en las que lmsconstantes cinéticas representan
relaciones entre constantes de velocidad (Segel,1975).
El empleo de lecitinas sintéticas conteniendo ácidos grasos de
cadena corta PC (6:0) en estado de solución molecular, propues­
ta por Roholt y Schlamowitz (1961) para estudiar la reacción ca
talizada por la crotoxina fue retomado por Wells (1972) para es
tudiar el mecanismocinético de la reacción catalizada por las
fosfolipasas A2 del veneno de Crotalus adamanteus y por Pieter
son y col. (1974) para estudiar la fosfolipasa A2 de páncreas
porcino.
Si bien el empleo de lecitinas de cadena corta permite estudiar
 138

las propiedades especificas del sitio activo sin otras contribu

ciones, deja de lado 1a propiedad más caracteristica e intere­
sante de las enzimas lipoliticas, esto es, el incremento en la
velocidad de reacción producido en presencia de sustrato agrega
do, que es la forma en que se encuentran los fosfolïpidos natu­
rales. El uso de sustratos agregados tales como los que se em
plean rutinariamente para medir actividad de fosfolipasa A2 no
es adecuado para obtener información cuantitativa sobre las prg
piedades del sitio activo. En principio, la agregación del fos
folipido introduce incertidumbre con respecto a la concentra­
ción real de sustrato accesible a la enzima. En segundo lugar,
se producen mayores complicaciones si el sustrato está presente
en varios estados de agregación (Tinker y Pinteric,l971. Ver
Apéndice B) que pueden presentar diferente afinidad y/o suscep­
tibilidad al ataque por 1a enzima. En consecuencia, los parámg
tros experimentales Kmy Vmson funciones de otras variables
que no pueden ser medidas o aún estimadas con los datos disponi
bles.
La hidrólisis enzimática de sustratos agregados es un proceso
extremadamente complicado, en el cual hay pasos adicionales (c9
mo la absorción de la enzima a la interfase) en los que pueden
estar involucradas otras regiones de la proteína enzimática di­
ferentes del sitio activo (cf. Slotboomy col.,l973). Finalmen
te,la ligadura de la enzimaa la interfase resulta en un incre­
mentodramático de la eficiencia catalítica ("activación inter­
facial") fuertemente influido por las propiedades fisicoquími­
cas de la interfase y cuyo mecanismo no está aún aclarado (De
Haas y col.,1975).
En el presente capítulo se estudiará la reacción catalizada por
 139

crotoxina B en función del estado físico del sustrato. Para e­

llo se han empleado lecitinas sintéticas de cadena corta PC(6:m
PC (7:0), PC (8:0) al estado de solución molecular (monomérica)
y micelar (por encima de la concentración micelar crítica) así
comolecitinas sintéticas con ácidos grasos de cadena larga,
que forman vesículas.

Actividad de CBsobre lecitinas de cadena corta

A semejanza de otras fosfolipasas A2 de venenos de serpientes

(Wells,1972; Viljoen y col.,l974) la cinética de hidrólisis de
lecitinas monoméricas por crotoxina B es compatible con un me­
canismo secuencial Bi-Test ordenado (Cleland,19C7)con el primer
reactante (Ca2+) en equilibrio termodinámico con el complejo
enzima-Ca2+.
La representación gráfica de la velocidad inicial de hidrólisis
en función de la concentración de PC (6:0), en presencia de una
concentración fija de Ca2+se presenta en la Fig.V-Z.
Puede observarse que, a concentraciones de PC (6:0) hasta aprg
ximadamente 6,0 mM(esto es bien por debajo de la c.m.c., re­
gión a en la Fig.V-Z), la representación gráfica es hiperbóli­
ca, tal como lo describe la ecuación de Michaelis-Menten

Vrna x l PC(6:0)]
__JL____________ (V-l)
Kmap + [ PC(6:0)]

donde Vo es la velocidad inicial de hidrólisis de PC (6:0),

Kmapy Vmapson la constante de Michaelis aparente para la hi­
drólisis del monómero,y la velocidad máximaaparente respecti­
 140

vamente Y [PC(6:0)]la concentración de sustrato monomérico.

¡oo­

3
3
3' 52% /
Q
É 4o­
D
<
e
8_l ao­
lu
>
20- o

IO­

o .1 l l l 4
IO 20 30 40 50
[PC(6:O)]mM

Fig.V-Z: Velocidad inicial de hidrólisis por CBen función de la concen­

tración de sustrato,PC(6:O) cuya c.m.c.CÍ10,0 mM.

En la región de alta concentración de micelas (por ejemplo, a

concentraciones de PC (6:0) mayores de 30 mM,(región C de la
Fig-V-Z), la curva de velocidad iniCial (Vo) en función de la
concentración de sustrato también es hiperbólica, si bien los
parámetros cinéticos son diferentes, especialmente debido a1
notable incremento de la velocidad inicial producido por la
agregación del sustrato en micelas, denominado "activación in—
terfacial" (ver más arriba). En el rango de concentraciones
de PC (6:0) entre 6 y 15 mM(región B de la Fig.V-Z), la reprg
sentación gráfica de la velocidad inicial en función de la con
 141

centración de sustrato presenta un comportamiento anómalo. En

efecto, en ese rango de concentraciones de PC (6:0), la repre­
sentación gráfica ya no es hiperbólica sino parabólica (los gré
ficos de (V0)1/2 en función de la [PC (620)] proporcionan rec­
tas, cf. Allgyer y Wells,1979). Este comportamiento "anómalo"
de la curva de velocidad en función de la concentración de sus­
trato se hace más evidente cuando los datos experimentales se
presentan en gráficos de Hanes-Wolff (Fig.V-3) de acuerdo con
la ecuación

Km
El = _aP_ + 1 [S] (V4)
Vo Vmap Vmap

donde [S] es la concentración de PC (6:0), Vo es la velocidad

inicial,-Kma P y Vma
P tienen el significado explicado en la ecug
ción (V-l). Si el comportamiento cinético se ajusta al modelo
de Michaelis-Menten, la ecuación (V-l) predice que la represen­
tación gráfica de [S]/Vo en función de [S] debe ser una recta
de pendiente l/Vmap, ordenada Kmap/Vmape intersección extrapo­
lada sobre el eje de abscisas en —Kmap.
La Fig.(V-3) muestra que la ecuación (V-2) es obedecida en la
región de monómeros (región a en Figs. V-2 y V-3) y en la alta
concentración de micelas (región c.en Figs. V-2 y V-3), pero
no lo es en el rango de concentraciones de PC (6:0) correspon­
dientes a la "región anómala" (región b en Figs. V-2 y V-3).
Si se emplea una concentración de Ca2+ constante, los datos de
velocidad de reacción en las regiones a y C (Figs.V-Z y V-3)
pueden asimilarse a una reacción unisustrato que sigue una ci­
nética michaeliana. En consecuencia, los parámetros cinéticos
 142

Fig.V-3: Gráfico de Hanes-Wolf para la hidrólisis de PC (6:0) por CB. Las

velocidades fueron medidas por el método espectrofotométrico a
26°C, pH 8,0, 10 mMCIZCa, a las concentraciones de PC(6:0) ind;
cadas, con 13,5 g CB. Cada punto (0) representa el promedio de
3 valores con la d.s. representada en el área del símbolo. Las
regiones (a) y (c) corresponden a la zona de sustrato monomérico
y micelar de alta concentración,respectivamente. La región (b)
coresponde a la zona anémala (Vl ziys.[S les una recta,INSERTO)
La curva de trazado contínuo fue calculada aplicando el modelo
de separación de fases para la formación de micelas (Apéndice B)
a la cinética de hidrólisis. La curva de trazado quebrado fue
calculada empleando el modelo premicelar (Apéndice B) de acuerdo
con la ecuación V-6.
Vmap y Kmaé
para las regiones de monómerosy de alta concentra
ción de micelas fueron evaluados por el método de Eisenthal y
Cornish-Bowden (1974). Los valores obtenidos para la región
de monomeros, a 26°C en presencia de una concentración fija de
2+
Ca (10 mM), fueron Vmágon) 3,6” moles de sustrato hidroli­
. -1 -1
zado.m1n .mg crotoxina B y Km(mon)
ap = 1,8 mM(Fig.V-4). Pa­
ra la región de alta concentración de micelas, los valores ob—
tenidos fueron Vmáglc) = 1300u mol de sustrato hidrolizado.
. -1
min (mic)
.mg"l crotoxina B y Kmap 36 mM.
 143

l l

“[8] [S]

'Fig.V—4:Gráfico de Eisenthal-Cornish Bowdende velocidad inicial de hi­

drólisis en función de la concentración de sustrato¿ [PC (6:0)]
Cada recta ha sido trazada pasando por los valores Vo (Í d.s.
0,4; n=3) y [s] correspondiente a esa medida Km= 1,8 mMy Vm=
3,6 umol.min’1.mg‘1 CBson las coordenadas del punto de inter­
sección mediano en el cuadrante superior derecho.

la presencia de una "región anómalá‘en la curva de VOen fun­

ción de la concentración del sustrato no depende del sustrato
empleado ya que también se observa claramente con PC (7:0) en­
tre 1,0 y 2,5 mM(ver Capítulo VII). Diversos autores han men
cionado anomalías cinéticas similares con fosfolipasas A2 de
otros venenos (Allgyer y Wells,l978) y con otras enzimas lipo­
liticas, de modoque no se trata de un fenómenocaracterístico
de la crotoxina B., Finalmente, una anomalía cinética similar
se observa en las curvas de velocidad en función de la concen­
tración de sustrato obtenidas con crotoxina B por otros auto­
res (Breithaupt,l976a), por lo que no puede atribuirse a las
propiedades de nuestra preparación de crotoxina B.

facto del pH sobre Za hidrólisis de monómeros

Los efectos del pH sobre la velocidad de reacción deben inter­

pretarse en términos de los grupos ionizables presentes en el
sitio activo de la enzima, en el sustrato, en el complejo enzi
ma-sustrato o en cualquier otro componente (coenzima o activa­
dor) involucrado en la reacción. En este caso particular, da­
do que la lecitina (sustrato) tiene carga neta cero entre valg
res de pH de 3,0 a 12,0, las variaciones en la velocidad obser
radas deben atribuirse a cambios en el estado de ionización de
grupos presentes en la enzima.
Teniendo en cuenta que, como se ha descrito más arriba, es po­
sible asimilar el modelo cinético al de una reacción unisustrg
to, las variaciones de la velocidad de reacción con el pH po­
orïan deberse a modificaciones del Km(mon) (mon) 0 de
ap , de la Vmap
ambas. Sin embargo, es lícito admitir que si se emplean con­
centraciones de sustrato cercanas a la saturación para cual­
quier valor de pH, los efectos sobre el Kmágon)pueden descar­
¿rse ya que prácticamente [Etotal] = [ES], y Vmágon)= kcat.
.Total], donde kcat es la constante de velocidad para 1a des­
composición del complejo ES en enzima libre y productos de la
reacción.
la Vm(m0n) varía con el pH, siendo [Etotal] constante, la
aP
:¿riación debe ser atribuida a cambios en el valor de kcat.
El valor de kcat puede variar con el pH por dos razones, a sa­
 145

ber (a) sólo una de las especies iónicas del complejo enzima­
sustrato (ES*) se descompone en enzima libre y productos de la
reacción a una velocidad significativamente mayor que las o­
tras y (b) la fracción molar de complejo enzima-sustrato en
ese estado de ionización depende del pH. En consecuencia, el
valor de kcat comprende dos componentes: (1) la constante de
velocidad (kcat*) caracteristica para la descomposiciónde la
especie iónica ES*, que es independiente del pH y (2) una fun­
:ón de pH apropiada (fes*) que determina la concentración de
la especie ES* a cualquier valor de pH. El valor de fes* (ver
Apéndice D) es tal que [ES*l/[Etotal] = 1/fes* . En consecuen­
cia resulta:
*
kcat . E Vm(mon)
Vm(mon) _ Í totafl = ap (V_3)
ap f es* f es*

de donde

log Vm(mon)=
ap log Vm<mon)—log
ap f es* =

_ (mon) _
— log Vmap + pfes* (V 4)

La representación gráfica de log Vmágon) en función de pH pre

sentará regiones lineales cuyas pendientes serán proporciona­
+ .
‘s al exponente al que se encuentra elevada [H ] en el térm¿
dominante de fes*, y las inflexiones entre esas regiones
¿rcales representarán los valores de pKa de los grupos ioni­
z bles involucrados.
Fig.V-5 presenta los resultados obtenidos con PC(7:0) en
vuncentraciones con las que se obtiene alrededor de 70%de la
”“(mon)
¿P
 146

Vo
Log

0,0

FigïV-S: Gráfico de Dixon para la hidrólisis de monómerosde PC(7:O) por

CBen función del pH. La hidrólisis de monómeros (26°C) fue e­
valuada por el método de dosaje de hidroxamatos (Cap.I) en mues
tras amortiguadas al pH correspondiente, y conteniendo 13,5 ug
CB, 0,5 mMPC(7:0) y 10 mMCa2+. El cambio de pendiente (1 a 0)
indica el pK del residuo involucrado en la hidrólisis del monó­
mero (intersección de tangentes a la curva).

Se observan dos regiones lineales con pendientes +1 y cero,

con una inflexión a pH 6,0. Esta inflexión probablemente re­
presenta el pKdel residuo de histidina del sitio activo. El
pKde este residuo calculado a partir de la variación de la
pseudo constante de primer orden para la inactivación por bro
muro de p-bromofenacilo (pBPB) con el pH (Canziani y col.,
1982) es 6,2 y el corrimiento a valores de pH más bajos está
relacionado con la interacción del sitio activo con Ca2+ como
se ha demostrado para las fosfolipasas A2 de páncreas equino
(Aguiar y col.,l979), de páncreas bovino (Verhey y col.,l980),
de páncreas porcino y de veneno de Naja naja siamensis(Teshi—
 147

ma y col.,1981). En la Fig.V-5 no se observan cambios adicio­

nales que sugieran 1a influencia de otros grupos ionizables sg
bre la velocidad de hidrólisis de sustrato monomérico.

Actividad de crotoxina B sobre Zecitinas de cadena larga

Las suspensiones acuosas de lecitinas de cadena larga, cuando

se someten a agitación ultrasónica a temperaturas superiores a
la transición gel-liquido cristalino (Tc) formanvesículas uni
laminares homogéneas con una distribución de tamaños muyestrg
chas (Apéndice C). Estas preparaciones no son adecuadas para
el análisis cinético debido a (a) el estado de agregación in­
troduce incertidumbres respecto de la concentración efectiva
del sustrato, y (b) comoya lo hemos mencionado, la compleji­
dad del proceso de hidrólisis de un sustrato agregado determi
na que los parámetros cinéticos Kmy Vmsean funciones de o­
tros parámetros que no pueden determinarse o calcularse a par
tir de los datos disponibles en la literatura. Sin embargo,
estos sistemas presentan dos grandes ventajas, (l) la concen­
tración micelar critica es extremadamente baja ( 10-10M)y el
fosfolipido agregado en vesículas se intercambia muy
lentamente con el monómero (Israelachvili y col., 1977,
ver Apéndice A). En consecuencia, la contribución de la
velocidad de hidrólisis del monómeroa la velocidad medida es
despreciable; (2) los agregados pueden considerarse como
monodispersos.
 148

a 0-0-4

6
4h
.-

u
UI

(pmolesmml'mg
CB)
enzimahca
Actividad

o EL l J I l
|5 20 25 30 35
Temperoiura (°C)

rig.V—6:Efecto de la temperatura sobre 1a hidrólisis de vesículas unila

minares de PC(14:0) por CB. Las velocidades iniciales de hidré
lisis a temperaturas cercanas a la temperatura de transición del
lípido (0,75 UM)fueron evaluadas por el método espectrofotomé­
trico descrito en el Cap.I, utilizando 10 ug CB, en presencia
de 5 mM Caz+.

Éiecto de la temperatura: Comose observa en la Fig.V-6, la

velocidad de hidrólisis de vesículas de PC (14:0) es una fun­
ción compleja de la temperatura, como lo demuestra el brusco
‘rcremento a aproximadamente 23°C, que corresponde a la tempg
"¿tura de transición (Tc) del fosfolípido. Teniendo en cuen­
gr La notable estabilidad de la enzima al tratamiento térmico,
es improbable que la discontinuidad observada resulte de un
efecto de la temperatura sobre la enzima. Por otra parte,los
gráficos de Arrhenius obtenidos por encima y por debajo de la
temperatura de transición Tc son lineales y las energías de
 149

activación aparentes resultan similares.

Bmgleandovesículas de PC (16:0) se observan discontinuidades
con características similares, excepto por su posición en el
eje de abscisas (a 43°C), que coincide con la temperatura de
ÏTaHSÍCiÓn Tc de este fosfolíPidO­
imbio, no se observan discontinuidades en los gráficos de
velocidad de hidrólisis en función de la temperatura cuando se
:mploa como sustrato vesículas de lecitina de yema de huevo
E —20°C). Estos resultados permiten concluir que los cam­
bios bruscos de la actividad de crotoxina B en función de la
temperatura reflejan los cambios termotrópicos en el estado fí
sico del fosfolípido más que efectos directos de la temperatu­
ra sobre la enzima.

Efecto del pH sobre la hidrólisis de vesículas

figura V-7 muestra la representación gráfica de log Vo en

iunción del pH sobre vesículas de PC (14:0) en la que pueden
‘¿5ervarse varios resultados interesantes. En principio, pa­
rece claro que el pH óptimo para la hidrólisis de vesículas de
citina se encuentra cerca de pH 5,4, que no concuerda con el
valor aceptado de 7-8 (Breithaupt,l976a). Sin embargo, este
rntltado no es del todo inesperado si se tiene en cuenta que
determinación del pH óptimo por Breithaupt (1976a) se efes
“:6 empleandoel método titrimétrico. En efecto, los valores
)ntenidos por este método dependen de la eficiencia de titula
y los ácidos grasos liberados se deprotonan completamen­
,
solo a valores de pH = 8 oI superiores.
. .
Estudios .
realiza­
 149

activación aparentes resultan similares.

Bmyleandovesículas de PC (16:0) se observan discontinuidades
con caracteristicas similares, excepto por su posición en el
eje de abscisas (a 43°C), que coincide con la temperatura de
ransición Tc de este fosfolípido.
r cambio, no se observan discontinuidades en los gráficos de
velocidad de hidrólisis en función de la temperatura cuando se
:mploa como sustrato vesículas de lecitina de yema de huevo
(Tc ü -20°C). Estos resultados permiten concluir que los cam­
bios bruscos de la actividad de crotoxina B en función de la
temperatura reflejan los cambios termotrópicos en el estado f;
sico del fosfolípido más que efectos directos de la temperatu­
ra sobre la enzima.

Efecto del pH sobre Za hidrólisis de vesículas

figura V-7 muestra la representación gráfica de log Vo en

iunción del pH sobre vesículas de PC (14:0) en la que pueden
urservarse varios resultados interesantes. En principio, pa­
rece claro que el pH óptimo para la hidrólisis de vesículas de
¿scitina se encuentra cerca de pH 5,4, que no concuerda con el
valor aceptado de 7-8 (Breithaupt,l976a). Sin embargo, este
asaltado no es del todo inesperado si se tiene en cuenta que
determinación del pH óptimo por Breithaupt (1976a) se efes
empleandoel método titrimétrico. En efecto, los valores
ntenidos por este método dependen de la eficiencia de titula
y los ácidos grasos liberados se deprotonan completamen­
sólo a valores de pH = 8 o superiores. Estudios realiza­
I - n c
 150

dos con fosfolipasa A2 de veneno de N. naja empleando vesicu­

¡”J
as de lecitina comosustrato, en los que la velocidad de hi­
Q:
rólisis se determinaba por el método titrimétrico y por crema
tografïa en Capa delgada, indicaron que el pH óptimo de esta
enzima se encuentra alrededor de pH 5,0

Fig.V-7: Log VOde hidrólisis de vesículas de PC(14:O) por CBen función

del pH. La hidrólisis de lípido determinada por análisis de los
productos de reacción en capa delgada (ver Cap.I) fue determiní
da en muestras amortiguadas al pH correspondiente conteniendo
CB (13,5 ug), PC(14:0) 1.3 mMy Ca2+ 1o mM. Los cambios de pen
diente (1 a O, 0 a —1) indican los pK de los residuos de amino­
ácido involucrados en la hidrólisis de agregados, determinados
por la intersección de las tangentes a la curva.

En el gráfico presentado en la Fig.V-7 se observa un cambio

de pendiente de 0 a 1 con una inflexión a pH 5,4. Este valor
puede corresponder al pK del residuo de histidina del sitio
.czivo desplazado comoconsecuencia del efecto de "pantalla"
e,ercido por la interfase fosfolipido-agua de carga neta cero.
Además, se observa una segunda inflexión a pH 8,5, que resul­
ta en un cambio de pendiente de 0 a —1.

DISCUSION

La dependencia de la velocidad de hidrólisis en función de la

concentración de PC (6:0) (Figs.V-2 y V-3) muestra que el COE
portamiento del sistema es bien diferente según el rango de
concentraciones del sustrato que se considere. En la región
de bajas concentraciones de PC (6:0), en las que el estado f;
sico en que se encuentra el sustrato es el de solución monomg
rica, la velocidad de hidrólisis aumenta con la concentración
de sustrato de acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten,
comolo demuestran las representaciones gráficas de Hanes4knlf
(Fig.V-3) y de Eisenthal y Cornish-Bowden (Fig.V-4). Lo mis­
mo sucede en la región de alta concentración de micelas (Fig.
V-2 y V-3), en la que el fuerte incremento de la velocidad
puede atribuirse al efecto de "activación interfacial". En
la región intermedia (entre 6 y 15 mM), que hemos denominado
"anómala" el incremento de Vo con la concentración de PC(6:0)
es mayor que el que predice la ecuación de Michaelis-Menten y
la dependencia de Vo con la concentración de sustrato es para
bólica (Fig.V-3). Este incremento de Vo no puede explicarse
pc! una ocupación más completa del sitio activo por el sustra
to, como lo demuestran los valores de Km(mon) En consecuen­
ap °
cia debe suponerse que esta región "anómala" representa un
rango de concentración de sustrato en el cual el estado de
agregación de la PC (6:0) se modifica, si bien la naturaleza
de esta modificación no ha sido aún definida.
 152

Con el objeto de explicar esa "anomalía" de la curva de velo­

cidad, es necesario conocer las concentraciones y propiedades
de los distintos estados de agregación que pueden existir en
solución. Comola agregación es dependiente de la concentra­
ción de PC (6:0), el modelo a desarrollar debe predecir cam­
bios en el estado de agregación que permitan explicar las "a­
nomalías" observadas.
La aproximación más simple consiste en aplicar el modelo de
separación de fases al proceso cinético (Ver Apéndice B). E5
to requiere suponer que la solución de PC (6:0) contiene dos
sustratos para la crotoxina B, monómerosy micelas, cada uno
de ellos con sus parámetros Kmy Vmcaracterísticos. En este
caso la ecuación cinética apropiada es:

Vo = Vmágon) [mon]
.
+ Vmágic)
.
. [mic]

Kmámon)<1+
P
——[m1°
1 >+ [mon]
Km(mic)
Kmámlc)<l
p
+ My
Km(mon)
[mic]
ap ap

(V-5)

donde Voes la velocidad inicial de hidrólisis de sustrato,

[mon] y [mic] es la concentración de las fracciones molecular
y agregada respectivamente, Kmágon) y Vmámon)los parámetros
cinéticos para la hidrólisis de monómeroy Km(:1c) y Vmámlc)
los parámetros cinéticos correspondientes a la hidrólisis de
las micelas.
De manera que se comportaría como un sistema con dos enzimas,
cada una de las cuales es específica para uno de los sustra­
tos pero que sería inhibida competitivamente por el otro Sus­
trato. Sustituyendo los valores de concentración de monóme­
 153

ros [mon] y de micelas [mic] de acuerdo al modelo de separa­

ción de fases (Apéndice B) y los valores de las constantes ci­
néticas Kmámon), Vmágon), KmágiC) y Vmágic) obtenidos del aná­
lisis gráfico según Eisenthal y Cornish-Bowden (Fig.V-4) en la
ecuación (V-5), se obtiene un buen ajuste de los resultados ex
perimentales en la región de monómerosy en la de alta concen­
tración de micelas (Fig.V-3) pero no en la "región anómala", a
menos que se varïen los valores de Kmy Vmen forma arbitraria
en esta región. Sin embargo, no existen por el momentodatos
físicos que justifiquen esa variación de los parámetros ciné­
ticos.
Comosolución alternativa, se empleó el modelo de Tanford
(1974) para la formación de micelas de dihexanoil lecitina,
que admite la distribución estadística de micelas de distinto
númerode agregación, para tratar de correlacionar las propie­
dades de las micelas con los resultados del análisis cinético
(Apéndice B). Si bien este modelo resulta en un valor correc­
to para la c.m.c. y establece una distribución de tamaños muy
estrecha, lo que concuerda con los resultados experimentales
de Tausk y col.(l974), no predice una concentración suficien­
te de agregados a concentraciones totales de PC (6:0) entre 6
y 15 mM,como para aplicar los cambios de velocidad observa­
dos en la "región anómala". En efecto, la aplicación de este
modeloa los datos cinéticos da resultados indistinguibles de
los obtenidos con el modelo de separación de fases (Fig.V-3).
En un estudio reciente sobre entalpía de dilución, Johnson y
col.(1981) concluyen que para ajustar las entalpías obtenidas
a bajas concentraciones de PC (6:0) es necesario agregar ex­
plícitamente la existencia de pequeños agregados conteniendo
n monómeros (con n = 2-5) y de micelas formadas a partir de la
asociación de los pequeños agregados (Apéndice B). Las cons­
tantes de asociación calculada para el proceso de agregación
premicelar es Kn = 34,1 (n = 2) y para la micelización es Km=
2,33 x 1010(m = 36) (cf.Johnson y col.,1981)
Si se admite que monómeros (mon), agregados premicelares (ag)
y micelas (mic) son sustratos de la enzima, la ecuación de ve­
locidad es:

Vm(mon) [mon] + Vm(ag) [ag] + Vm(mic) lmic|

aP Km(m0n) ag Km(ag) ap Km(mic)
vo = ap ap ap (V-6)

Km(mon) K (ag) Km(mic)

ap ap ap

Empleando las constantes cinéticas para monómerosy micelas

obtenidas experimentalmente, se encontraron valores respecti­
vos de Kmágg)y Vmágp) para obtener el mejor ajuste a los da­
tos experimentales. Comose muestra en la Tabla V-l, se oth
vo un ajuste satisfactorio (dentro de los límites de incerti­
dumbre de los valores medidos experimentalmente) con Km(ag)
ap
5,0 mMy Vmágg) = 80-100 pmoles de sustrato hidrolizados.min_1.
rng_l crotoxina B.
Esta sencilla modificación del modelo de separación de fases
en el cual se incluye explícitamente un equilibrio separado
para pequeños oligómeros, explica no sólo los datos de ental­
pia de dilución (Johnson y col.,1981) sino también el incre­
mento de la velocidad inicial observado a concentraciones
bien inferiores a concentración micelar crítica, que resulta
en la"región anómala" de la curva de velocidad en función de
la concentración de sustrato. Es claro que la adición de un
equilibrio separado para la formación de pequeños oligómeros
al modelo de Tanford o bien a otro modelo relativamente sofis­
ticado meequilibrios múltiples podría ajustar bien los resul­
tados rrnéticos. Pero consideramos que esto es innecesario y
aún inadecuado, teniendo en cuenta que el presentado es el mo­
delo más simple que ajusta adecuadamente los resultados.
Las Jelocidades de hidrólisis en la región de alta concentra­
ción ¿e micelas son de unos tres órdenes de magnitud mayores
que las que se obtienen en la región de monómerosy se deberia
al aumentode la eficiencia catalïtica resultante de la inter­
acción de la crotoxina B con micelas.
Si bien la "activación intefacial" es una caracteristica gene­
ral de las enzimas lipoliticas, el mecanismono ha sido aún
elucidado (Wells,1974; De Haas y col.,1975). En consecuencia,
este argumento puede emplearse sólo si se demuestra que la oro
toxina B es capaz de ligarse firmemente a interfases fosfoli­
pido-agua. Los experimentos de ligadura directa comoel que
¿e presenta en la Fig.V-8, prueban en forma inequívoca que la
crotoxina B es capaz detligarse efectivamente a micelas mix­
tas no hidrolizables de D-PC(10) y miristoillisolecitina.
yor oLra parte, las importantes modificaciones de la eficien­
cia catalítica en función de la temperatura presentadas en
la Fig V-6, determinadas por la transición gel-liquido cristg
lino de la PC (14:0) demuestran que la actividad de la croto­
xina B es modulada efectivamente por los parámetros fisicos
de los ácidos grasos. Este comportamiento implica una fuerte
situación de la crotoxina B con la interfase fosfolipido-agua
La"modulación viscotrópica" (Sandermann,l979) de la actividad
comorespuesta al cambio en el estado fisico de los fosfoli­
 156

pidos es de observación frecuente en las enzimas asociadas a

membranas.

m
o O
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Vo= 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 OB

Kay: Ve - Vo
W-W

Fig.V-8: Perfil de elución de una mezcla de mialas mixtas y CBobtenido

por cromatografía en Sephadex G-75 (14 x 1,2 cm). La muestra de
1,0 ml (volumen final) conteniendo 0,50 g CB, 10 mMCa2+ a pH
8,0 y 25°C fue incubada con 0.1 mMde una mezcla de D-PC (10:0)
y miristoil lisolecitina durante 60 min. Se colectaron fraccig
nes de 0,5 ml con un flujo de 4.0 ml/cmz/hr. en las que se eva­
luó el contenido en fósforo (0), proteína (o) y se midió la ac­
tividad fosfolipasa (fl) sobre yema de huevo.

Comose ha mencionado previamente la hidrólisis de sustratos

agregados por una enzima lipolítica como la crotoxina B es un
proceso sumamente complicado en el cual la enzima anclada a
\
la interfase y con su sitio activo orientado hacia la disposi
ción regular de moléculas de sustrato ligará una molécula de
monómeropara formar (en presenc1a. de Ca2+ ) un complejo
.
terna
rio "interfacial". La catálisis se producirá por el mismome
canismo que en los complejos formados con lecitinas monoméri­
cas, pero cabe preguntarse si la interacción enzima-interfase
 157

se produce a través del sitio activo únicamente o bien requig

re la contribución de otras regiones de la superficie de la
crotoxina B. En este sentido, los efectos del pH sobre la hi
drólisis de lecitinas monoméricasy agregadas proveen informa
ción de particular relevancia.
La Fig.V-S, muestra que la hidrólisis de lecitinas monoméri­
cas, que es función exclusiva del sitio activo de la crotoxi­
na B, está gobernada únicamente por el estado de ionización
de un residuo de pK 5,8 que probablemente corresponde a la
histidina del sitio activo. En cambio, la Fig.V-7 indica que
además de un grupo de pK 5,4 correspondiente al residuo de
histidina del sitio activo, la hidrólisis de lecitinas agrega
das está también gobernada por el estado de ionización de un
segundo residuo de pK 8,5. La influencia de este segundo grg
po no es detectable cuando se estudia la hidrólisis de sustra
tos monoméricos, lo que implica que no afecta la ligadura del
monómeroni la reacción catalítica. En consecuencia, puede
admitirse que no está relacionado con la función del sitio ag
tivo de la crotoxina B. Si se excluye la función del sitio
activo, el estado de ionización de este residuo debe estar re
lacionado con algún paso esencial para la hidrólisis del sus­
trato agregado, y este paso parece ser la ligadura de la cro­
toxina B a la interfase fosfolipido-agua. En efecto, la Fig.
V-9 demuestra que a pH 9,8 la crotoxina B es incapaz de ligar
se a micelas mixtas de D-PC(10:0) y miristoillisolecitina.
Este resultado es de importancia fundamental para interpretar
la acción de la crotoxina B. En efecto, la interacción de la
enzimacon interfase fosfolípido-agua requiere una región:es­
pecifica de la crotoxina B funcionalmente distinta del sitio
 158

activo. La conformación apropiada de esta región está gober­

nada por el estado de ionización de un grupo de pK 8,5­

O
Í -—o-o—c—a——o—-0—H—4—-O—O—-o—

adNMad fosfolipasa
AZ

Fig.V-9: Perfil de elución de una mezcla de micelas mixtas y CB, por crg
matografía en Sephadex G-75 a pH 9,8. La muestra preparada e
incubada en condiciones idénticas a las descritas en la Fig.V-8
fue sembrada en una columna descendente (14 x 1,2 cm) y fraccig
nes de 0,5 ml fueron colectadas con un flujo de 4,0 ml/cm /hr.
En dichas fracci0nes se evaluó el contenido en fósforo (0) y se
midió la actividad fosfolipasa sobre yema de huevo, pero sólo
se recuperó el lípido (95 z), mientras que pudo medirse activi­
dad enzimática asociada al gel de cromatografía.

La prueba de la independencia funcional de esta región respeg

to del sitio activo es la posibilidad de alterar selectivamen
te la función de uno de ellos manteniendo intacta la del otro.
Así, la ligadura e hidrólisis de lecitinas monoméricas,que
dependen de la función del sitio activo, están gobernadas por
el estado de ionización de un residuo de histidina (pK 5,8)
que puede ser selectivamente modificada por reacción con bro­
muro de p-bromofenacilo. La crotoxina B modificada es incapaz
de ligar lecitinas monoméricasy resulta catalïticamente inag
tiva, si bien es apta para interactuar con interfases y mem­
branas naturales (Changy Lee,1981). Por otra parte, la capa
cidad de la crotoxina B para ligarse a interfases fosfolipi­
do-agua está gobernada por el estado de ionización de un gru­
po de pK 8,5. Así, a pH 9,0 la crotoxina B es incapaz de li­
garse a micelas mixtas de D-PC(10:0) y miristoillisolecitina
(Fig.V-9) si bien mantiene su capacidad para ligar y catali­
zar la hidrólisis de lecitinas monoméricas.
Las evidencias que indican que la actividad catalitica y la
ligadura a interfases dependen de regiones funcionalmente in­
dependientes en la crotoxina B parecen ser suficientes. Sin
embargoes conveniente considerar su posible correlación con
el proceso de "activación interfacial". En este sentido es
interesante considerar los resultados de protección de la
crotoxina B por lecitina frente a la inactivación por bromu­
ro de p-bromofenacilo presentados en la Fig.IV-3 . Si bien
comopodria esperarse, el grado de protección aumenta con la
concentración de PC (7:0) al llegar a la concentración mice­
lar critica la velocidad de inactivación aumentahasta hace;
se mayor que la observada en ausencia de PC (7:0). Este efes
to aparentemente paradojal podria explicarse sobre la base
de las consideraciones siguientes: (l) el bromuro de p-bromg
fenacilo es muypoco soluble en agua y se solubiliza en micg
las lo que determina un aumento en la concentración efectiva
del inhibidor y (2) la ligadura de la crotoxina B a micelas
que contienen el inhibidor determina un considerable aumento
de la concentración local efectiva de enzima y reactivo res­
pecto de la que tendrían en solución y una mayor posibilidad
 160

de colisión efectiva. Factores adicionales de proximidad y o­

rientación favorecerían la reacción de inactivación.
Las causas mencionadasserían suficientes para explicar el au­
mento de la velocidad de inactivación de la crotoxina B por el
bromuro de p-bromofenacilo en presencia de micelas, si no se
tiene en cuenta la protección por PC (7:0). En efecto, tanto
la PC en estado monomérico como la que se encuentra agregada
en micelas deben ligarse al sitio activo de la enzima y resul
ta difícil explicar por qué la PC (7:0) en estado de solución
monomérica (Fig. IV-3) en una relación [PC]/ [inhibidor] en­
tre 1 y 10 protege efectivamente a la crotoxina B de la inac­
tivación y no la protege cuando se encuentra agregada en micg
las en las que la relación [PC]/[inhibidor] oscila entre 50 y
200.
Unaexplicación coherente de estos resultados es la siguiente:
la ligadura de la enzima a la interfase fosfolïpido-agua re­
sultaría en un aumentode la reactividad (nucleofilicidad) del
sitio activo, tanto para el sustrato comopara el bromurode
p-bromofenacilo. Esta modificación ("optimización funcional")
de las propiedades del sitio activo, resultante del anclado de
la enzima a la interfase se evidencia como un incremento en la
(mic) o bien como
eficiencia catalítica (p.ej. Vmap >> Vm(mon)),
aP
un aumento de la velocidad de inactivación en presencia de bro
muro de p-bromofenacilo. De esta manera, ambos efectos serían
expresiones del mismofenómenode "activación interfacial".

¿(#14th v fiáfi/
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

MECANISMO DE ACCION DEL COMPLEJO CROTOXINA

DE VENENO DE CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS

VOLUMEN 2

Autor: LIC. GABRIELA ALICIA CANZIANI

Director de Tesis: DR. JUAN CARLOSVIDAL

Lugar de Trabajo: CONICET- IDNEU

TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE DOCTOR EN

CIENCIAS BIOLOGICAS ‘;
JJ,
198M
 CAPITULO VI

" 1 am nat bound to piea¿e ¿hee

thh my anówQAA".
Sh Loch
The Menchant 06 Venice
(Act IV, Sc. 1, 65)
 CROTOXINA A

El otro componente del complejo crotoxina es un péptido de pug

to isoeléctrico pHi = 3,7 (Horst y col.,l972) ó 3,4 (Breithaupt
y col.,1974), que se eluye de la columna de CM-Sephadex C-SO
con la solución de partida, ya que no es absorbido al intercam
biador (Fracción I de la Éig.II-1B). El peso molecular estima­
do por filtración en gel de Sephadex es 8000, en presencia de
cloruro de guanidinio 6,0 Mes 9000 (Horst y col.,l972; Breit­
haupt y col.,1974), mientras que por electroforesis en gel de
policrilamida con dodecilsulfato de sodio se ha estimado entre
8.000 y 12.000 (Horst y col.,1972).
Estudios hidrodinámicos (Paradies y Breithaupt,1975), indican
un peso molecular de 12.600 con un coeficiente de sedimenta­
ción Szo,w = 1,46 y viscosidad intrínseca = 3,35 ml.g_1, que
permiten describirlo comouna esfera hidratada con un radio de
Stokes R0 = 17,5 Á a pH 7,5. A pH 5,5 se comporta como una m9
lécula más asimétrica, si bien esta asimetría parece debida
más a un efecto de hidratación que a cambios en la forma del
péptido. En este medio la molécula puede ser descrita como un
elipsoide de revolución oblado con una relación axial 1:4, ra­
O

dio de giro RG = 13,4 A y grado de hidratación 0,4g Hzo.g de

proteína-1. El análisis de la composición en aminoácidos ha
sido estudiado por Breithaupt y col.(1974) y parece estar for­
madopor tres cadenas peptidicas (Horst y col.,l972; Breithaupt
y col.,1974) de pesos moleculares 4300, 3700 y 1600, respecti­
vamente, unidas entre sí por puentes S-S.
La crotoxina A carece de actividad enzimática o tóxica determi
 162

nables. La propiedad más característica consiste en la forma

ción de complejos no covalentes, pero muyestables, con crotg
xina B. Esos complejos, de menor punto isoeléctrico presen­
tan tres propiedades importantes respecto al papel de la cro­
toxina A en el complejo crotoxina, a saber: (a) exhiben caras
teristicas fisico-químicas similares a las del complejocrotg
xina nativo (Horst y col.,1972; Breithaupt y col.,1974; Para­
dies y Breithaupt,1975; Hendony Fraenkel-Conrat,l976); (b)la
toxicidad de la crotoxina B se incrementa entre 10 y 20 veces
(Breithaupt y col.,1975; Hendony Fraenkel-Conrat,1976; Haber
many Breithaupt,1978) y (c) se observa inhibición de la act;
vidad fosfolipásica de la crotoxina B sobre lipoproteïna de
yema de huevo (Breithaupt,1976; Habermany Breithaupt,1978).
Debido a esos dos efectos: potenciación de la toxicidad e in­
hibición de la actividad enzimática de la crotoxina B, Rübsa­
meny col.(197l) determinaron a la crotoxina A "crotapotin".
Por otra parte,Jeng y Fraenkel-Conrat demostraron que si bien
el pBPBinactiva rápida y especificamente la crotoxina B por
alcohOlización de un residuo de histidina del sitio activo de
la enzima, este residuo no es modificado por el reactivo en
el complejo crotoxina.
Se ha sugerido que la crotoxina A podria considerarse comoun
transportador farmacocinético de la crotoxina B (Habermany
Breithaupt,1978), de manera que el complejo crotoxina se com­
portaria comoun reservorio circulante de crotoxina B. De es
te modosurge virtualmente el concepto de que la crotoxina A
debe funcionar como "cuidador o acompañante" impidiendo la li
gadura de la crotoxina B a sitios inespecíficos de baja afini­
 163

dad, y reservándola para sitios especificos de alta afinidad a

nivel de la membranablanco. Estos sitios serian capaces de
competir efectivamente con la crotoxina A por la ligadura de
crotoxina B lo que aumentaría la eficiencia de ligadura espe­
cífica de la enzima y podría explicar la potenciación de la tg
xicidad (Bon y Jeng,1979; Jeng y col.,1978; Hendon y Tu,l979).
Se ha sugerido que la potenciación de la toxicidad de crotoxi­
na B por crotoxina A debe considerarse como un fenómeno farma­
cocinético (Habermany Breithaupt,1978).
La crotoxina A funcionaría como "cuidador o acompañante" impi­
diendo la ligadura y/o inactivación de la crotoxina B a sitios
inespecificos, de baja afinidad, y reservándola para sitios es
pecificos de alta afinidad a nivel de la membranablanco capa­
ces de competir efectivamente con la crotoxina A por la subuni
dad B (Bon y Jeng,1979; Jeng y col.,l978; Habermany Breithaupt
1978; Hendon y Tu,l979).
Con respecto al mecanismo de la crotoxina A, Jeng y Fraenkel­
Conrat (1978) demostraron que el bromuro de p-bromofenacilo,
un inhibidor dirigido al sitio activo de las fosfolipasas A2
(Volwerky col.,1974; Halpert y col.,1976) inactivaba inespec;
ficamente la crotoxina B con la pérdida de un residuo de histi
dina, pero este residuo no era accesible al reactivo en el com
plejo crotoxina, por lo que sugirieron que el sitio activo de
la enzima queda "ocluido"como consecuencia de la formación del
complejo con crotoxina A.

Resultados

La formación de un complejo entre crotoxina A y crotoxina B

 164

(relación molar 1:1, concentración final 0,77 mg.ml-1) es com­

pleta en alrededor de 1 minuto. Comose presenta en la Tabla
VI-l, la formación del complejo a partir de las subunidades A
y B resulta en dos propiedades caracteristicas, a saber: (a)
la toxicidad del complejo resulta 16 a 20 veces mayor que la
de una cantidad equivalente de la crotoxina B pura y (b) inhi­
bición de la actividad fosfolipásica de alrededor de 50%de la
que presenta la crotoxina B sobre lipoproteïna de yema de hue­
vo. Esta inhibición no se modifica por preincubación (60 min.
a 25°C) del complejo con €12Ca o D-diheptanoil lecitina 0,7 mM.
A pesar de la disminución de la actividad especifica, la rela­
ción entre actividad enzimática y concentración del complejo
es lineal.
Respecto a la especificidad para el efecto inhibitorio sobre
la actividad fosfolipásica de crotoxina B, la crotoxinaiA pue­
de ser parcialmente sustituida por heparina o por valvatoxina
A (Jeng y Fraenkel-Conrat,1976) pero no por otros polianiones
comoácido poliglutámico. Por otra parte, la crotoxina A care
ce de efecto inhibitorio sobre la actividad enzimática de otras
fosfolipasas A2 como la isoenzima ácida de veneno de C.d.terrí—
figug, las fosfolipasas A2 de veneno de Bothrops neuwiedii o de
páncreas porcino (cf. Habermany Breithaupt,l978).
La incubación del complejo crotoxina en soluCión amortiguadora
de formiato de amonio 0.1 M pH 3,0, ClNa 2:0 M a 25°C resulta
en un incremento progresivo de la actividad específica de fos­
folipasa A2 hasta llegar a ser igual al de la crotoxina B para
luego de 15 min., reflejando la disociación del complejo croto­
xina en las condiciones experimentales empleadas.
Tabla VI-l: Propiedades del complejo crotoxina y sus componentes

Actividad eSÏecificaïa- Toxicidad E

umol sustrato.min’ .n‘g‘l fosfg l/DL50(9419-1)
lipasa
Crotoxina B (CB) 670 l,00—1,80
Crotoxina A (CA) ‘o no detectable
Complejo (CA-CB) . e ._
relación molar 1:1 369 ' 20:0 30,0

Relación ¿SÉ-¡1 0,55 _ 10-20

É Determinadapor el métodotitrimétrico.
lU‘
En ratón; = 8 por dósis aplicada

°°*%o——o'°*x>o4*°**°
«o m
o

'320 _ _
“¡30° É É
, 3 8

E |50_
O
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1 I,
J AL 4 J |
\|\.l 1 1
Vo=0 0.! 0.2 05 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 09 I.0
Vc-Vo
Kov(W)

?ig.V+1: Filtración del complejo crotoxina (CA-CB,relación molar 1:1) en

Sephadex G-75. El complejo se eluye en un solo pico (O), simétrico
con un Kav correspondiente a su peso molecular estimado. La actiyi
dad específica (o) es constante en todas las fracciones e idéntica
a la de la muestra original. La actividad aumenta 2-3 veces luego
de llevar las alícuotas a pH 3.0
La formación de un complejo entre dos subunidades A y B a valg
res de pH cercanos a la neutralidad, puede demostrarse por di­
versos métodos fisicos; a saber:
(a) Si se siembra una pequeña cantidad de crotoxina B (lOpmol)
en una columna de Sephadex G-75 preequilibrada y eluïda a
20°C en solución amortiguadora de Tris-ClH 50 mMpH 8,0,
la enzima no se eluye debido a su fuerte absorción a la
matriz del gel (cf. Rübsameny col.,1975). Por el contra­
rio, si se siembra una mezcla equimolecular de crotoxina A
y B en las mismas condiciones experimentales, como se pre­
senta en la Fig. VI-l, el complejo se eluye comoun pico
simétrico con un Kav = (VC-V0)/(Vt-V0) = 0,458: 10 que
corresponde a un radio de Stokes R0 = 20,7 Á y un peso mo­
lecular de 28000. La cantidad de proteína recuperada re­
presenta el 96%de la cantidad sembrada (crotoxina A + Crg
toxina B) y la actividad específica de fosfolipasa A2 medi
da sobre lipoproteínas de yema de huevo como sustrato (350
moles de sustrato.min_l.mg crotoxina B_1) es constante a
través del pico e igual al de la muestra original. Compa­
rada con la actividad específica de crotoxina B pura (720
moles de sustrato hidrolizado.min_l.mg crotoxina B_1) re­
fleja la inhibición de la actividad enzimática de la subu­
nidad B debido a la formación del complejo con la subuni­
dad A.

El valor de Kav obtenido se lo relaciona positivamente con

el coeficiente de sedimentación 520,w = 3,0. Por otra par
te, el logaritmo del coeficiente de difusión presenta una
relación lineal con el valor de Kav, de acuerdo con la e­
 167

cuación:

Log D20,w = a ' Kav + b

donde 3 y g son constantes calculadas a partir de los volg

menes de elución de proteinas conocidas empleadas comomag
cadores. El valor de D20wI resultante para el complejo
crotoxina se presenta en la Tabla VI-2.

Tabla VI-2: Valores de Kav y D20,” para diferentes proteínas

O I a
maraadorae y el compleao arotozzna —.

Proteína Kav Dzo'w x 107

Suero de albúmina bovina 0,0375 5'94E

Ovoalbúmina 0,188 7,76
Qufinotriprinógeno 0,387 9,5
Citrocrmlos 2: 0,631 11,4
Crotoxina 0,458

g) Las proteinas se sembraron en una colurma de Sephadex G-‘7S (87 x 1.5 un)
adaptada para flujo inverso preequilibrada y eluïda a 2-4‘c con solución
amortiguadora de Trio-CIE 50 mMpH 7,4. Se colectaron porciones de 1.2
nu a una velocidad de flujo de 1,2 m1.cm_2.hora-1.

E Los Valores de 1320,Wpara las proteinas se obtuvieron de: M.L.wagner y

H.A.Scheraga (1956),J.Phxn.Cham.,60,1066-10763 0.Lann¡y A.Polson (1936)
Biochem¿J.,19o,799-806: S.Pa16ua y K.G.Pau1 (1963) en “The Enzymes“ Ofid‘
P.D.Boyes,H.Lardy; K.Myrb&ck),Vbl.BB,pp.97-112-Aoademic Press,N.Y.

Estos resultados coinciden con los publicados por Paradies

y Breithaupt (1975) sobre propiedaden hidrodinimicas del
complejo crotoxina, de lo. cuales resultan un coeficiente
 de sedimentación S20,W = 3,09; peso molecular 30900; Vis­
3
cosidad intrínseca = 3,5 cm .g_1; radio de giro RG=
19,7 Á y radio de Stokes 25 Á. De aCuerdo con esos datos
la partícula hidrodinámica a pH 7,0 puede describirse co­
mo un elipsoide de revolución prolado con una relación a­
xial a/b = 3:1 y un grado de hidratación de 0,259 H20.g
proteína-l, probablemente responsable de la asimetría.
(b) El espectro de la fluorescencia de la crotoxina B (exci­
tación a 290 nm, emisión máxima a 360 nm) exhibe una in­
tensidad de emisión mayor que el espectro correspondiente
a una cantidad equimolecular de crotoxina A (excitación
290 nm, emisión máxima a 350 nm), Fig.VI-ZA. Ambos espec­
tros presentan muypocas variaciones con el pH,excepto
por una discreta extinción observable a valores de pH me­
nores que 3,0;
La Fig.VI-ZB presenta el espectro de emisión a pH 7,0 de
una mezcla equimolar de crotoxina B + crotoxina A (exci­
tación a 290 nm; emisión a 338 nm). La intensidad de emi­
sión observada es aproximadamente de 30%con respecto a
crotoxina B pura, con un corrimiento al azul de unos 20
nm. Los cambios observados en el espectro de emisión de
la mezcla con respecto a los espectros de los componentes
separados pueden explicarse como consecuencia de la forma
ción de un complejo entre las subunidades A y B.
La intensidad de emisión determinada con el complejo crotg
xina no se modifica en el rango de pH entre 10 y 4,5 pero
es mucho menor que la calculada como la suma de las contri
buciones de crotoxina B + crotoxina A (Fig.VI-3).Con el
complejo
 169

«goL

iso­

>10 _.._‘_B—-...--_

O Ou

un c:

lNTENSïFY..

bO

ua c:

F1UORESCENC5

20

l I I l l‘ l

¿.00 350 300 450 ¿oo 350 nm

EMISSION WAVELENGTH ­

Fig.VI-2: Espectros de fluorescencia del complejo crotoxina y sus componeg

tes. A.Espectros de CB (3,3 M) y CA (4,4 M) a pH 3,0 6-9 y 7.0
(-—-). La emisión máxima de CBmuestra extinción a pH 7.0 probg
blemente debido a su tendencia a la agregación. B.Formación del
complejo crotoxina a pH 7.0 demostrada por 1a extinción de la ig
tensidad de fluorescencia de la mezcla de CAy CB. La formación
es rápida dentro del primer minuto, luego se hace dependiente del
tiempo (tiempos indicados en los espectros).
 170

90

OD C)

\) CD

O) C)

m. C)
NCE!NTENSWY

I> CD

FLUORESCI
(A) c>

1. I J

400 350 300 nn)

EMISSION WAVELENGTH

Fig.VI-3: Dependencia del pH de 1a fluorescencia del complejo crotoxina.

Se trazo el espectro de emisión de 3,3 M crotoxina a pH 3,0
(——)y 7,0 (--—) a 25°C. Las curvas a y c representan los es­
pectros obtenidos directamente a pH 7,0 y 3,0 respectivamente.
Las curvas b y d corresponden a espectros calculados a partir
de la contribución individual de cada componente(intensidad
CA+ intensidad CB) a pH 7,0 y 3,0 respectivamente.
 171

66 » CAl'CB

compmp
FLUORESCENCM

Fig.VI-4: Efecto del pH en la fluorescencia del complejo crotoxina (o). En

el rango de pH 2,0 a 10,0. Hanley (1979) ha demostrado que a pag
tir de pH 3,0-2,5 el complejo se encuentra completamente disocia­
do comolo indica la suma de las contribuciones de las dos subuni
dades (A + CB) a la intensidad de fluorescencia (o). Entre pH 4,5
y 10,0 el complejo crotoxina es estable comolo demúestra la in­
tensidad de fluorescencia constante. A pH 4,0 se observa un
discreto corrimiento de los valores máximosde fluorescencia ha­
cia el rojo (A). Los resultados obtenidos concuerdan con estos da
tos.

Fig.VI-5:
Gráfico de Hill para la di­
sociación del complejo cro­
toxina en función del pH,
log x/(l-x), donde x es el
T grado de disociación del
complejo en función del pH.
El gráfico de Dixon de -log
' x/(l-x)(derecha) en función
del pH (arriba) es idéntico.
 172

crotoxina a valores de pH inferiores a 4,5 se observa un

incremento en la intensidad de emisión con un movimiento
en la posición del máximohacia el rojo. Este incremento
llega un máximo alrededor de pH 2,5 y se mantiene en el
máximo aún a valores de pH inferiores. Los cambios en la
intensidad de emisión del complejo crotoxina en función
del pH son completamente reversibles y no presentan "histg
resis" respecto del pHde la solución de partida. Fig.VI-4
El incremento en la intensidad de emisión a valores de pH
inferiores a 4,5 están relacionados con la disociación re­
versible y dependiente del pH del complejo crotoxina en
las subunidades A y B (cf. Materiales y Métodos, Hendon y
Fraenkel-Conrat,1976; Hanley,1979). En efecto, si se com­
paran las intensidades de emisión del complejo crotoxina
con la calculada por la sumade las contribuciones indivi­
duales de las subunidades A y B, se observa que sólo coin­
ciden a valores de pH de 2,5 o inferiores, esto es, en con
diciones en las que el complejo se encuentra completamente
disociado. Pig. VIn3 y Pig. VI-4.
Dada una concentración fija de complejo crotoxina, la in­
tensidad de emisión medida a valores de pH superiores a
4,5 representa la contribución del complejo asociado mien­
tras que la intensidad de emisión medida a pH 2,0 represen
ta las contribuciones de las subunidades A y B totalmente
disociadas. Para cualquier valor de pH intermedio (2,0 <
pH< 4,5) pueden establecerse las cantidades AF (intensi­
dad de emisión al pH medido —intensidad de emisión a pH
4,5), proporcional a la fracción de complejo disociado a
ese pH y AFmax(intensidad de emisión a pH 2,0 - intensi­
dad de emisión a pH 4,5), proporcional a la concentración
total de complejo completamente disociado. La relación
AF/AFm
ax representa la fracción molar de complejo disocia
do.
Comola disociación del complejo dependiente del pH es un
proceso completamentereversible, la condición de equili­
brio puede representarse por la ecuación:

[ complejo crotoxina] + n H+;:t[ ccmplejo disociado - n H+] (VI-1)

.
donde n es el número de iones H+ requeridos
. .
para produc1r
la disociación completa de un mol de complejo crotoxina.
La constante de equilibrio aparente es:
G _ + n
KI [complejo crotox1na] .[ E4L
4.
(VI_2)
[complejo disociado n.H ]
Si la fracción del complejo sin disociar se representa c9
mo (AFmax- AF)flsFmax y la fracc1on de complejo disoc1ado
se representa comoAF/AFmax, la ecuación(VI-2) puede es­
cribirse

[carrp1e30
' di
soc1'ad o . n H+l = AF = x 11+ n
=[__L. (VI-3)
[ crnplejo crotoxina ] APHlax-AF (l-x) K'

donde se representa la fracción del complejo disociado.

Tomandologaritmos es posible expresar 1a ecuación (VI-3)
en una forma análoga a la ecuación de Hill

log x = - log K' + n loq[ H+] (VI-4)

(l-x)
de modoque la representación gráfica de log x/(l-x) en
 174

función de log {H+] según la ecuación (VI-4) debería ser

una reCta de pendiente igual a n.
Comose presenta en la Fig. VI-5 la representación gráfica
según la ecuación (VI-4) presenta varios segmentos aproxi­
madamentelineales con pendientes variables de alrededor
de 1,0, 2,5, 1,4 y 1,0 en los rangos entre -2 a -2,5; -2,5
a -3,0; -3,0 a -3,7 y -3,7 a -4,5 unidades logaritmicas de
H+respectivamente. El resultado es superponible con la
representación gráfica de —log x/(l-x) en función del pH
según Dixon (Fig.VI-5).
Por otra parte, si la concentración de complejos contenien
do menosde n protones ligados se considera despreciable,
los términos [14+]n serán dominantes y la ecuación (VI-3)
puede reordenarse como

+ l'l
AF = ¡H 1 (VI-5)
AF max K' + (¡1+1 n

o bien

AF 1
max = 1 + K'.———— (VI-6)
AF [afin
de modo que de acuerdo con la ecuación (VI-6), la represen­
tación gráfica de AF /AF en función de 1/[H+]n debe ser
max enLo
una recta de pendiente K' ordenadaAe intersección extrapolar
sobre el eje de abscisas en -1/K'.
Si se trazan representaciones gráficas de AFmax/AFen fun­
ción de la recíproca de [H+] elevada a diversos exponentes,
el valor de n será aquel que resulte en una línea recta. La
 175

/ l l 1 1
o 1000 2000
105x1/[H*]“(M-2-3)

Fig.VI-6: Gráfico de l/x (AFmax/AF)en función de 1/[H+]2’3. La interseg

ción extrapolada sobre el eje de abscisas es 1/[H+]2’ .
 176

Fig. VI-G muestra que los gráficos de AFmax/AFen función

de 1/[H+]2'3 son razonablemente lineales y la intersección
extrapolada sobre el eje de abscisas es l/[H+]2'3 = 1,22 x
107. Siendo K' = [H+]3,5, esto es la [H+]n que produce la
disociación de la mitad del complejo, resulta [H+]gI 5 =
z’ifK' = 8,3 x 10-4 M. Este valor corresponde a un pH 3,4
que concuerda con el resultado experimental de que a pH
3,0 se obtiene la disociación de la mitad del complejo.
Sin embargo debe tenerse en cuenta que las ecuaciones flfl-ü
y (VI-6) suponen la simplificación de que la concentración
de todos los complejos que contienen menos de E iones [H+]
ligados es despreciable. Si éste no es el caso, el valor
de n que rectifica el gráfico de dobles recíprocas será un
valor de g aparente (nap) menor que el número real de io­
nes [H+] que deben ser ligados, pudiendo resultar comoen
el presente caso, un valor de n fraccionario.
Estos resultados pueden interpretarse comoel requerimien­
to de la protonación cooperativa de por lo menos dos grupos
en el complejo crotoxina para su disociación completa. Sin
embargo, teniendo en cuenta que el valor de nap calculado
por este tipo de análisis es casi siempre menor que el nú­
mero real de ligados (Sege1,1975,"Enzyme Kinetics" p.361)
puede admitirse que el número entero inmediatamente supe­
rior al valor de nap representa el númeroreal de ligandos,
en el presente caso este número seria 3.
De acuerdo con estos datos 1a estabilidad del complejo cro­
toxina estaría determinada predominantementepor interaccig
nes electrostáticas. La neutralización de cargas positivas
fijas en la crotoxina B como resultado de 1a formación
del complejo con crotoxina A sería responsable de la dis­
minución del punto isoeléctrico del complejo crotoxina.
Experimentos de sedimentación en equilibrio con el complg
jo crotoxina a pH 6,0 sugiere en la existencia de un equi
librio de asociación-disociación con una constante de di­
-10
sociación aparente Kd = 1,2 x 10 M (Paradies y Breit­
haupt,1975) que representa un cambio de energía libre
(AG°ap) de formación de -5 1. kJ. mol_l (-12,2 k cal.
mol-1) y da una idea de la alta estabilidad del complejo
crotoxina, comparable a la del dímero de hemoglobina (Cho
tia y Janin, 1975).
Respecto de la estequiometría del complejo crotoxina, si
bien se observa una clara preferencia por la relación mo­
lar CB 1:1 (como es lo usual en el complejo crotoxina na­
tivo), esta puede variar dentro de límites bastante am­
plios. Así, con la mezcla de CA/CBen relación molar 2:1
se observa una rápida disminución de la actividad fosfoli
pásica especifica al 50%de su valor original en el pri­
mer minuto, seguida por una inhibición progresiva que lle
ga al 25%de la actividad original luego de 10 min. La
mezcla de CA/CBen relación molar 3:1 determina una inhi­
bición de la actividad fosfolipásica del 90%que es par­
cialmente revertidapor 1a adición de C12Ca100 mMpero no
por la adición de ClNa ó ClK hasta 2,0 M. Además, el our
so de la hidrólisis de lipoproteïnas de yema de huevo por
complejos enriquecidos en crotoxina A suele presentar una
fase de latencia inicial cuya duración es proporcional a
 178

la fracción de crotoxina A presente en el complejo.

La inhibición de 1a actividad fosfolipásica de la crotoxi
na B por la formación de complejo con crotoxina A depende
del orden de adición de los reactantes. Empleandolipo­
proteína de yema de huevo como sustrato no se observa in­
hibición si a la mezcla se adiciona crotoxina B y luego
de 30 segundos crotoxina A.
Además,comose presenta en la Tabla VI-3, la presencia de
vesículas de lecitina impide la inhibición de la actividad
fosfolipásica de crotoxina B por crotoxina A. En efecto,
la máximainhibición se obtiene cuando se adiciona al sus
trato el complejo preformado. La inhibición no es signi­
ficativa cuando a una mezcla de vesículas de lecitina con
teniendo crotoxina B se adicionan crotoxina A + Ca2+ o
bien cuando a una mezcla de vesículas de lecitina, crotoxi
na A y Ca2+ se adiciona crotoxina B. Si la inhibición de
la actividad enzimática de la crotoxina B requiere la for­
mación previa del complejo con crotoxina A, estos resulta­
dos sugieren (a) que la ligadura de crotoxina B a vesícu­
las de lecitina impide la formación del complejo con cro­
toxina A, esto es, que se trata de procesos mutuamenteei
cluyentes y (b) que si bien la presencia de iones Ca2+ es
indispensable para la hidrólisis del fosfolípido, no lo es
para la ligadura de crotoxina B en las vesículas de leci­
tina.
 179

DISCUSION

El complejo crotoxina es el responsable del bloqueo presinápti

co de la unión neuromuscular (Vital Brazil y col.,1973),Chang
y Lee, 1977; Chang y col.,1977; Hagwoody Smith, 1977) y, al i
gual que otras toxinas de este tipo, presenta actividad de fos
folipasa A2 (Hendon y Fraenkel-Conrat, 1971; Haberman y Breig
haupt, 1978), Tambiénexhibe actividad hemolïtica indirecta
(Hendony Fraenkel-Conrat,1971; Jeng y col., 1978), miotóxica
(Breithaupt, 1976) y postsináptica (Bon, 1982). En eritrocitos
y membranasde electroplaca, la interacción de la crotoxina
con la superficie determina la disociación de sus componentes:
la subunidad B se liga mientras que la subunidad A es liberada
al medio (Jeng y col.,1978; Bon y col., 1979) y la disociación
es esencial, ya que cuando la crotoxina A se une covalentemen­
te a la crotoxina B por un reactivo de entrecruzamiento, el
complejo resultante es atóxico, si bien retiene su actividad
fosfolipásica (Hendony Tu, 1979).
Debe considerarse si alguna de esas actividades en el complejo
son cualitativamente distintas de las que presentan las subuni
dades por separado. Paradójicamente, todas las actividades
biológicas del complejo crotoxina residen en la subunidad B ,
de modo que si bien la crotoxina A se requiere para una mayor
letalidad no tiene otra función identificada. Se ha sugerido
que la crotoxina A funcionaría comoacompañante o transporta­
dor de la crotoxina B impidiendo su absorción a sitios
no específicos (Jeng y col., 1978; Bon y col., 1979), pero
el hecho de que para la ligadura de la .crotoxina B
a la membrana la subunidad A debe ser liberada
 180

indica que la crotoxina A debe ejercer su función en el comple

jo crotoxina antes de que éste llegue al tejido blanco. Al
respecto, Breithaupt (1976a)indicó que 1a crotoxina A inhibe
la actividad fosfolipáSica de la crotoxina B sobre lipoproteí­
nas de yema de huevo o micelas de PC (7:0) de una manera alta­
mente específica. Hasta la fecha este el único cambio funcio­
nal cualitativo descrito para la crotoxina A al asociarse a
crotoxina B.
Los distintos métodos fisicos empleados dan resultados coheren
tes en cuanto a la formación del complejo entre las subunida­
des A y B, su alta estabilidad a valores del pH cercanos a la
neutralidad así comosu tendencia a la disociación en medio á­
cido. Los espectros de fluorescencia del complejo y de las sub
unidades aisladas indican que la fluorescencia intrínseca está
dominadapor la presencia de residuos de triptofano. La aso­
ciación de las subunidades A y B resulta en una drástica dismi
nución en la intensidad de emisión y un corrimiento de la lon­
gitud de onda para la emisión máximahacia el azul. Con el
complejo crotoxina se observan cambios pronunciados en el es­
pectro de emisión en el rango de pH entre 2 y 4 que pueden re­
vertirse completamente y son independientes del valor de pH i­
nicial de la muestra. La imposibilidad de explicar estos cam­
bios dependientes del pH por la suma de las contribuciones de
las subunidades aisladas (Fig.ïï-mm implica que están inequïvg
camente relacionados con el estado de asociación-disociación
del complejo. Estos cambios en el espectro de fluorescencia
pueden interpretarse suponiendo que, comoconsecuencia de la
formación del complejo (pH 4,5 6 superior) los residuos de trip
tofano (fluoróforo dominante) pasan de un entorno hidrofílico
 181

a otro apolar (cf. Hanley,1979).

Se ha demostrado que la crotoxina B contiene tres residuos de
triptofano, mientras que la crotoxina A contiene sólo uno (Ver
TablaVL2,Hendony Fraenkel-Conrat,197l; Breithaupt y col.,1974L
La oxidación de los triptofanos accesibles con N-bromosuccini­
mida a pH 6,0 (complejo formado) modifica el residuo de triptg
fano de la crotoxina A y uno de los triptofanos de la crotoxi­
na B (Hanley,1979). En esas condiciones la fluorescencia a pH
4,5 o superior prácticamente desaparece, lo que implica que e­
sos dos residuos deben ser los responsables de la emisión indg
pendiente de pH en el complejo crotoxina nativo. Sin embargo
el incremento de la intensidad de emisión a valores de pH infg
riores a 4,5 se mantiene, de donde los dos residuos de tripto­
fano de la crotoxina B, no accesibles a la modificación, serí­
an los responsables de esta estos cambios de fluorescencia in­
trínseca. En cuanto al origen de estos últimos es imposible
que la asociación de las subunidades A y B induzca (o sea indu
cida) por modificaciones conformacionales en una o ambas subu­
nidades. Los cambios observados del dicroïsmo circular en el
U.V.lejano por la formación del complejo podrían atribuirse a
estabilización de las interacciones CA/CBpor la formación de
un dominio intersubunidad ordenado o a cambios conformaciona­
les. Por otra parte, los cambios en la fluorescencia y la ac­
cesibilidad de los triptofanos a la oxidación por N-bromosucci­
nimida, apoya la inmovilización de los residuos aromáticos (en
particular triptofanos) en un dominio apolar creado por la in­
teracción de las dos subunidades para formar el complejo (cf.
Hanley,1979). Tchorbanov y col.(1977) concluyen que los trip­
tofanos están localizados en la zona de interacción entre las
 182

Tabla V-3: Efecto del orden de adición de Zos reactivos sobre

Za hidrólisis de vesiculas de PC(14:0) por CBy el
complejo CA-CB.

Adiciones a1 nedio velocidad inicial É» Grado de hidrólisisE

de reacción-É (uequiv.ndn-1.ng—l.CB) (%de PC total)

. + +
A. Cnmxnuna B 12.8 - 0.6 65 - 4
B. Complejo CA-CB f i
prefo 30 0.6 0.4 8 2
C. Crotoxina B seguida, + +
luego de 30 seg por CA. Adi 11.3 - 0.5 55 - 3
ción posterior de Ca2+

É Al nedio de reacción conteniendo 0.1 o 3.o nm PC(14:0), pH 8,0, a 24°C

É-Las velocidades iniciales fueron evaluadas por el nétodo espectrofotométrioo
utilizando 0.1 HMPC(14:0), 10 mMClzca y 6,75 ug CB (experimento A) o una
cantidad idéntica de enzima en complejo con CAen relación nolar 1:1 (experi
mento B). En el experinento C, la mezcla de reacción contenía 0.1 HMPC
(14:0), 10 mMClZCa y 8,84 ug CB. Después de 30 seg. se agregaron 6,75 pg
CA. Los resultados están expresados cono i Ï d.s., n = 3.
IO
El grado de hidrólisis fue determinado por análisis en capa delgada de las
nuestras. Las muestras contenían 3 mMPC(14:0), 10 mMC12Ca y 13,5 ug CB
(experimento A) o una cantidad idéntica de enzima en complejo con CA (1:2)
(experinento B). En el experimento C, la muestra contenía 3 mMPC(14:0) y
13,5 ug CB. Luego de 30 seg. se agregaron 17,68 ug CAy ClZCa hasta una con
centración final de 10 mM. Los productos fueron evaluados luego de 3 minu­
tos de incubación. Los valores corresponden a i Ï d.s., n = 3.
 183

subunidades y que los cambios de fluorescencia reflejan la mo­

dulación de la estabilidad del complejo por el pH.
La disociación del complejo crotoxina en medio ácido sugiere
que la interacción entre las subunidades A y B está estabiliza
da por uniones electrostáticas. La asociación de las subunida
des se produce con disociación de iones H+, probablemente de
grupos básicos de la crotoxina B, lo que resulta en una dismi­
nución de su carga neta positiva y explica el bajo punto isoe­
léctrico del complejo (pHi 4,5). Esos grupos podrían estable­
cer puentes de hidrógeno con grupos carboxilo de la crotoxi­
na A titulables a valores de pH inferiores a 4,5 (Paradies y
Breithaupt,1975).
En cuanto al mecanismode disociación, los resultados presenta
dos indican que se requiere la ligadura concertada de dos o
tres protones.
Si los iones H+ se encuentran siempre en equilibrio con los
grupos ionizables (-R-), la probabilidad P de encontrar a uno
de esos grupos en la forma protonada (-RH) es:

p = ___3L__——— (VI-7)
1 + Eini­
l H+l

donde Kint es la constante de disociación intrínseca del grupo

RHy [H+]es la concentración de ión H+ libre. Si los grupos
—R-fuesen idénticos (p.ej. presentan el mismovalor de Kint)y
no interactuantes, la probabilidad Pn de encontrar 2 grupos R­
simultáneamente protonados será el producto de las probabilida­
des individuales y resultará proporcional a la fracción molar
de complejo disociado, esto es:
 184

= l = [compleio disociado l = AF

n (l + [H+]
Kint )n [ crotoxina total ] AFmax
(VI-8)
La ecuación (VI-8) puede reordenarse:

Í\ '
n n

uFmax
A F
= (1 + [Klnt-)
H 1
, o bien íE:Ïfiggi
VA F
= 1 + Kint
H+
(VI_9)
de donde

1 = 1 + K_i¿1_t___ . 1 (VI-10)
n n n -—’——
m x/Apmax \/AFmax l H+1

y; de acuerdo con la ecuación (VI-10),la representación gráfi­

ca de 1/QJKÏ en función de l/[H+] deberia ser una recta de pen
diente Kint/DVZÏ;;;, ordenada en l/nvfiígg; e intersección ex­
trapolada sobre el eje de abscisas en - l/Kint. Tales repre­
sentaciones no son lineales para valores de n = 2 ó 3, lo que
excluye que la disociación del complejo crotoxina requiera 1a
protonación de sitios idénticos y no interactuantes.
Los resultados de los gráficos de Hill (Fig.VI-5), así comola
linealidad de los gráficos de AFmax/AFen función de l/[H+]2'3
sugieren que 1a disociación del complejo crotoxina requiere la
protonación de, al menosdos grupos que exhiben cooperatividad
positiva. Si bien no es posible, por el momentoasegurar si
tales grupos son idénticos o se trata de grupos distintos. En
efecto, un a-carboxilato IpKint = 2,9] no puede considerarse
idéntico a un 5-carboxilo de un residuo de aspartoilo o a un
Y-carboxilo de glutamilo [pKint = 4,7].
Sin embargo estos resultados no permiten obtener conclusiones
 185

inequivocas respecto al número real de sitios que deben ser

proton‘ados para obtener la disociación ¡Completa del complejo
crotoxina.
Por otra parte, si bien los gráficos según Hill y según Dixon
(Fig.VI-5) son superponibles (ya que aparentemente 1a ecuación
de Dixon se obtiene por un cambio de signo de la ecuación de
Hill), la información que se obtiene de ambos tipos de repre­
sentación gráfica es diferente. En efecto, el tratamiento
gráfico según Dixon predice que si fuera requerida la protong
ción de sólo dos grupos, las pendientes de los segmentos line
ales nunca pueden ser mayores que 2.0 aún en el caso de que
esos grupos exhiban una fuerte cooperatividad positiva.
Si la especie completamente protonada (en este caso el complg
jo completamentedisociado) exhibe tres ionizaciones sucesi­
vas, se comportará de acuerdo con el esquema:

Cn-3 K1 Cn“? + H+ K1 = [cn-2h 3+1/[cn’3] (VI-10.a)

Cn--2 K2 Cn-l + H+ K2 = [Cn-1][H+]/ïcn_2] (VI-10.b)

Cn-l K3 Cn + H+ K3 = [Cn1[H+]/[cn'1] (VI-10.C)

donde n representa la carga negativa neta del complejo croto­

xina mientras que K1, K2 y K3 son las constantes de disocia­
ción macroscópicas (globales) para cada estadio de disocia­
ción.
La ecuación de conservación es:

[Ctotal] = [Cn-3] + [Cn-2] + [Cn-1] + [Cn] (VI-11)

Empleandolas relaciones presentadas en las ecuaciones (VI-10.

a), (VI-10.b) y (VI-10.c), es posible expresar la concentra­
 186

ción de una de esas especies iónicas en función de la concen

tración de cualquiera de las otras (ver Apéndice D-2).Es pos;
ble definir las funciones fcn, an-l, fcn-Z y an-3 en térmi­
nos de las constantes de disociación y de la concentración de
iones H+ , tales que la fracción molar de cada especie ióni­
ca sea la recíproca de la función apropiada (o bien la concen
tración de una especie iónica determinada es igual a la con­
centración total de complejo crotoxina dividida por 1a función
f correspondiente). Si se admite que la especie triplemente
protonada (Cn-3) representa el complejo totalmente disociado,
es:

cn'3 = EEE-ll , o bien {Cn-fl = 1 (VI-12)

-3
fcn_3 [ctotail fcn
donde (ver Apéndice D-2) es:

fcn—3 = 1 + KL__ + _Kl_52_ + Kl_52_53_ (VI_13)

[ HH l ¡1+1 2 l 11+] 3

En consecuencia:

x [Cn-3] _ 1

(1_x) [Ctotai] - [Cn-3] (an_3 _ 1)

- 109 x = log (fcn-3 —1) (VI-14)

(1-X)

La comparación de los segundos miembros de las ecuaciones (VI­

4) y (VI-14) demuestra que la información obtenida de los grá­
ficos de Hill y de Dixon no son equivalentes.
El inconveniente de este tipo de análisis reside en que los cam
 187

bios observados tienen lugar en un rango de unas 2 unidades de

pH. En consecuencia, las pendientes de las zonas aproximada­
mente lineales no serán números enteros ya que,a cualquier
valor de pH,más de un término del segundo miembro de la ecua­
ción (VI-13) contribuirá significativamente al valor de an-3
(ver Apéndice Da2).De todas maneras, es posible efectuar la
siguiente.aproximación:
La ecuación (VI-13) puede reescribirse como

+
fcn—3 _ 1 = _Kl_ Kl_52 + _Kl_KZÉ5; =
l H+1 I H+1 2 l H+1

+
—K—1—(1+—Kg—+—KZ—K3—> + 2 (VI-15)
[H ] [H ] [H 1

y aplicando logaritmos a la ecuación (VI-15) se obtiene

log (f n-3-DÉ - pK1 + pH + log< 1 + K2 + —KZ—K3—) (VI-16)

c [H+] [H+]2

Debe notarse que el primer miembro de la ecuación (VI-16) es

igual al segundo miembro de la ecuación (VI-14), en consecuen
cia la representación gráfica de —log(x/(1-xñ en función de
pH puede considerarse en términos de la ecuación (VI-16).
A valores de pH bajos ([H+] << K2,K3), la contribución de K2/
[H+]y K2 K3/[H+]2 en el término entre paréntesis del segundo
miembrode la ecuación (VI-16) puede considerarse despreciable
con respecto a 1, de modoque, en esas condiciones el término
entre paréntesis se aproxima a cero (log 1). La ecuación pag
de escribirse:

log(an-3 - 1): - p K1 + pH (VI-17)

 188

y la representación gráfica de log an-3 - l en función de

pH será una recta de pendiente 1.0.
Obviamente, cuando log fcn-3 - 1 = 0 es pKl = pH = 3.98 (K1 —
1 x 10'4M).

A valores de pH superiores, Kl/[H+]será extremadamente peque­

ño, de modo que la ecuación (VI-15) puede escribirse como:

fcn-3 - 1 g .51_52_
IH+12 + K1 K2 K3
“¿+13 = K1 K2
[HÜZ < 1 + —53—l)
“1+1 (VI-18)

y tomando logaritmos
4 K
log(fcn—3 -1) = - pK1 - pK2 + 2 pH + log(1 + ígiï) (VI-19)

La representación gráfica de log (fcn-3 - 1) en función de pH

tendrá una pendiente igual a 2 + log(1 + K3/[HÜ),2<pendiente <
3,y se intersectará con la primera región lineal en un punto
donde pH = pK2 = 2.5(K2 = 3.1 x 10' 3 M).
., +
A valores de pH aún más elevados si la relac1on K3/[H ]es ex­
tremadamente pequeña, la ecuación (VI-15) puede escribirse c9
mo:

_ _ z * _52_ _
fcn 3 1 _ K1 /’[H j . <1 + [H]
+ > (VI 20)
y tomando logaritmos resulta:

log(f c n-3 - 1) S - pKl + pH + log (1 + —13L—>

+ (VI-21)
[H]
De modoque la representación gráfica de log (an-3 - l) en
función de pH tendrá una pendiente 1 +(log Kz/[H+n(l<P<2)­
De acuerdo con las ecuaciones (VI-18) y (VI-20) esta porción
se intersectará.con la posición anterior cuando
 189

K K K
1 + 1 2 = 1 2 + 1 (VI-22)
+ + + 3
[H 1 [H 12 [3+]2 [H 1

o bien, simplificando
K K
1 = ——¿—4ï- , o bien [H+]2= K2K3 (VI-23)
+ 2
[H ]

de donde

pH = 1
2
(pKz + pK3) (VI-24)

Luego 2.9 = 1/2 (2.5 + pK3) o bien pK3 = 3.23 (K3= 5.8 x 10'4M)
Si bien este análisis explica la curva experimental obtenida
en 1a representación gráfica de log an-3 = - log(x/(l-XÜ en
función de pH, los valores estimados para pKl, pK2 y PK3 PO‘
drían tener un error del orden de Ï 0.5 unidades de pH, que es
poco importante si el objeto del estudio es sugerir posibles
grupos funcionales que estarian involucrados en la disociación
del complejo crotoxina. De todas maneras el error por arras­
tre puede estimarse, teniendo en cuenta que, cuando el grado
de disociación del complejo llega al 50%, es

[Cn-3] = 1 = 1,0 (VI-25)

[Ctotal]-[Cn-3] K1 KK + K1'K2 K3

y en esas condiciones el denominador de la segunda igualdad

debe ser 1,0. Tomandoel valor de [H+]para el cual se obtie­
ne 50%de disociación del complejo crotoxina y sustituyendo
los valores de K1, K2 y K3 obtenidos del análisis gráfico, re
sulia
 190

K K K K K K
1 + 1 2 + 1 2 3 = 0.98
IH+1 ÍH+12 [H 1

Esto sugiere que el error en los valores de pK estimados no

debe ser mayor de 0,3 unidades de pH, lo que resulta más acep­
I

table. Por otra parte AGap = - RT.ln(-l— ’—l—'—l—)= - 13.07

K1 K2 K3
kcal/mol, valor que concuerda con el obtenido experimentalmen
te (Paradies y Breithaupt,l975).
Empleando los valores obtenidos para K1, K2 y K3 es posible
n-3 n-2
calcular las fracciones molares de las especies C C
Cn-1 y Cn (ver Apéndice DhZNsi la-proporción de gue la espe­
cie Cn_3 representa el complejo crotoxina completamente diso­
ciado es correcta, la representación gráfica de la fracción m9
lar de complejo en la forma Cn­3 en función del pH debe super­
ponerse con la curva obtenida a partir de los datos de intensi
dad de emisión, tal comose presenta en la Fig.VI-5.
El análisis empleadosugiere que se requieren tres ionizacio­
nes sucesivas para disociar el complejo crotoxina.
Debe enfatizarse que la única suposición empleada en el pre
sente tratamiento es que los procesos de ionización ocurren rá
pidamente, de manera que las distintas formas iónicas de cada
uno de los componentes del sistema se encuentran siempre en e­
quilibrio unas con las otras. Por este motivo, el tratamiento
empleado es lícito independientemente de la naturaleza e iden­
tidad de los grupos ionizables, asi comode la existencia de
cooperatividad entre los grupos. En el presente caso, confirma
la existencia de cooperatividad positiva para la protonación de,
al menos dos de los grupos, como lo demuestra el hecho de que
 191

K2,K 3>>K1. Dos condiciones explican este comportamiento, a

saber: (a) la crotoxina B se comporta como un catión poliva­
lente que debe ser desplazado de esa combinación con crotoxi­
na A Y (b) la protonación (disociación) del complejo crotoxi­
na resulta en cambios conformacionales groseros.
La elevada energía libre de formación del complejo crotoxina
a valores de pH cercanos a la neutralidad refleja
contribuciones entálpicas y entrópicas . Las primeras
probablemente relacionadas con la formación y ruptura de unig
nes. El cambio de entropía puede ser considerado como 1a su­
ma de tres tipos de contribuciones, a saber:
(a) La rigidez y pérdida de grados de libertad impuesta a las
Subunidades A y B como consecuencia de la formación del
complejo crotoxina, que resulta en una disminución de en­
tropía.
(b) Las modificaciones estructurales de ambos componentes,re
sultantes de la distorsión de las estructuras de los com­
ponentes aislados, así comode la distorsión de la distri
bución de cargas en la zona de contacto, cuando forman el
complejo. El cambio de entropía resultante puede ser posi
tivo-o negativo.
(c) La liberación de moléculas de agua con un aumento de los
grados de libertad rotacionales, probablemente sea la con
tribución más importante al incremento de entropía en re­
acciones que involucran grupos iónicos ("230 moles de
agua por mol de complejo formado)
La contribución debida a modificaciones estructurales de las
SUbunidadeS en la formación del complejo es importante ,como lo
indican los gruesos cambios conformacionales que ocurren esPÉ
cialmente con la subunidad B durante la formación del comple­
jo detectables por medidas hidrodinámicas (Paradies y Breit­
haupt,1975). Del mismo modo los cambios en el espectro de
fluorescencia debidos a la formación del complejo pueden atri­
buirse a la inmovilización de los residuos de triptofano en
una región apolar a nivel del área de interacción entre las
subunidades A y B, como fue sugerido por Hanley (1979)- La P9
sibilidad de que en el área de interacción entre las subunida­
des se genere una región apolar está apoyada por evidencias
experimentales. En efecto, se ha demostrado (Canziani y col.,
1982) que las lecitinas monoméricas son capaces de promover 1a
disociación del complejo crotoxina. Ese efecto es dependiente
de la longitud de las cadenas apolares de la lecitina y no pue
de ser reproducido empleando fosforilcolina solamente (equiva­
lente a la cabeza polar de PC), lo que sugiere que la presen­
cia de las cadenas apolares es esencial para promover la diso­
ciación del complejo.
La importancia del orden de adición en relación a la formación
del complejo crotoxina constituye una evidencia adicional en
favor del modelo que sugiere que el área de la superficie de
la crotoxina B responsable de la interacción con crotoxina A
es la misma o (se superpone parcialmente) en la zona involucra
da en la interacción crotoxina B - fosfolïpido.
La ubicación topográfica de esa área específica en o superpues
ta al área de interacción entre las subunidades explica por
qué las interacciones crotoxina - crotoxina B y crotoxina B ­
interfase son mutuamenteexcluyentes.
 193

Por otra parte, la función de esa región específica requerida

para la interacción con interfases no depende de la presencia
de iones Ca2+, a diferencia de la función del sitio activo,
para el cual la presencia de iones Ca2+es esencial. Esto sg
giere que se trata de regiones ("sitios") funcionalmente dis­
tintos.
 CAPITULO VII

"¡No!,¡no!- dijo La neina- Pnimeno

La ¿entenc¿a, Luego el uenedicto".
Lew¿¿ Cannoii
AchLa en el paíó de
Laó manauiUlaA

"No eó pobLbLe ahoganóe do¿ veceó

en el m¿Amonio".
HenáclLto
ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA CROTOXINA B EN EL COMPLEJO CROTOXINA

Comoconsecuencia de la formación del complejo con crotoxina A,

la actividad fosfolipásica de la crotoxina B sobre lipoproteï­
nas de yema de huevo como sustrato disminuye a la mitad (Breit
haupt, 1974; Canziani y col., 1982). Esta observación se ha
relacionado naturalmente con la falta de reactividad de la crg
toxina B en el complejo crotoxina con pBPB. En efecto, si bien
la actividad fosfolipásica de la crotoxina B es rápida y espe­
cïficamente inactivada por pBPBcon la pérdida simultánea de
un residuo de histidina (ver Capítulo IV), esa histidina no es
accesible al reactivo en el complejo crotoxina por lo que se
ha sugerido que el sitio activo de la crotoxina B se encontra­
ría oculto en el complejo (Jeng y Fraenkel-Conrat, 1978).
A esta interpretación se contraponen dos observaciones, a sa­
ber: (a) la demostración de la actividad enzimática del comple
jo crotoxina frente a lecitinas monoméricas (Canziani y col.,
1982) y, (b) la demostración de que el complejo crotoxina uni­
co en forma covalente por un reactivo bifuncional presenta
una actividad de fosfolipasa A2 similar a la del complejo nat;
vo (Hendon y Tu, 1979). Ambas lineas de evidencia no concuer­
dan con la postulada oclusión del sitio activo de la crotoxina
en el complejo. La aparente contradicción entre las inter­
pretaciones mencionadas puede deberse al empleo no discrimina­
¿a de sustratos monoméricosy agregados utilizados para la me­
Oida de la actividad enzimática. De acuerdo con los resulta­
dos discutidos previamente, se estudió la actividad enzimática
del complejo crotoxina sobre sustratos monoméricos y agregados
(micelas y vesículas).
 195

Actividad fosfolipásica del complejo crotoxina con Zecitinas

monoméricas.

_\ o-Pc(7-0) ,i
E E
C C
m m‘
N F
q É
8 8
<4: 0,04- -0.20.4
8 Puwm z 8
3..J 003- ¡í
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2
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o ’ J. 1
Q5 LO L5
Minutos

Fig.VII-1: Cinética de hidrólisis de lecitinas de cadena corta a conceg

traciones inferiores a la c.m.c. (PC(6:0) 1,5 mMy PC(8:0)
0,19 mM). Las velocidades iniciales de hidrólisis por CB 6-9
y el complejo CA-CB (—-——)
son similares. La D-PC (7:0),no
hidrolizable por la CB, no muestra variaciones de Abs. con el
tiempo en presencia de la enzima (inserto).

Comose muestra en la Fig. VII-1, empleando el método espec­

trofotométrico con PC (6:0) y PC (8:0) al estado monomérico,
el complejo crotoxina presenta una actividad especifica de fos
folipasa A2 similar a la de la crotoxina B pura. La Fig.VII-2
muestra que se obtiene un resultado similar cuando se comparan
el curso de la hidrólisis de PC (7:0) al estado monoméricoca­
talizado por crotoxina B o complejo crotoxina por cromatogra­
fía en capa delgada. En las mismas condiciones experimentales
 196

no se detecta hidrólisis en muestras que contienen D-PC (7:0)

(Fig. VII-l, inserto) o bien PC (7:0) y un exceso de EDTA,de
donde quede concluirse que la actividad enzimática observada
no es un artefacto.

70­

50

40
!---—--r-<}—o—-+——-o

0)
hidrolizado

de
PC(7

%
"­
5 IO ""20 4o
minutos

Fig.VII-2: Hídrólisis de PC (7:0) en solución molecular, 0,78 mM or la

CB (O) y el complejo CA-CB (0) en pesencia de 10 mMCa + ó
con la adición de EDTAa tiempo O'(I). Alícuotas fuerOn
analizadas a distintos tiempos por cromatografía en capa del­
gada y evaluación del contenido en P de lecitina y lisoleciti
na (ver Cap.I). Se utilizó igual concentración de CBpura y
en el complejo.
 197

Por otra parte, las representaciones gráficas según Eisenthal

y Cornish-Bowden(Fig. VII-3) de las velocidades iniciales ob­
tenidas con complejos crotoxina CA;CBa relaciones molares 1:1
o; 2:1 en función de la concentración de PC (6:0) dan valores
de Km(mon) (mon) = 3,6 umol sustrato . min.1 . mg
ap = 1,8 mM y VmaP
crotoxina B_l similares a los obtenidos con crotoxina B pura
(ver Cap. V).

'[S] [S]
Fig.VII-3: Gráfico de Eisenthal-Cornish Bowdende velocidad inicial de
hidrólisis Vo en función de la concentración de PC(6:O) a con
centraciones por debajo de la c.m.c. para el complejo CA-CB
(1:1,——), (2:1,w). _
Cada recta ha sido trazada entre cada valor de Vo (Í d.s.,
n=3) y [s] correspondiente.
Km = 1,8 mMy Vm = 3,6 umol.min"1.mg_1 CB en el complejo son
las coordenadas del punto de intersección mediano en el cua­
drante superior derecho.
 198

Con el objeto de comparar el valor de KD (constante de disocig

I
ción del complejo crotoxina PC) con el calculado para el com­
plejo crotoxina B-PC, se efectuaron experimentos de ligadura
directa de D-PC(7:0) al complejo crotoxina.por filtración en
gel de Sephadex en condiciones de equilibrio según la técnica
descripta por Hummely Dreyer (1962), y los resultados se pre­
sentan en la Fig. VII-4.

-no 98
NHY»—W° -mog
;v240 ¡6
A, q
.—-».‘ - 375 m
I ‘\ l’­
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D.

50- \\
¿í
I l I l l l l

V0.0 01 02 a3 04 05 os a7 os Q9 L0
vo -Vo
Kov( w. vo)

Fig.VII-4: Cromatografía del complejo crotoxina en equilibrio con sus­

trato monomérico. Una muestra de complejo reconstituído in
vitro, en relación molar 1:1 fue sembrada en una columna de
Sephadex G-75 equilibrada con D-PC(7:0) 0,37 mMy Ca2+ 10 mM,
pH 8,0. El pico correspondiente al complejo, eluído en el
Kav correspondiente tiene asociado un aumento de la concentra
ción de PC por encima de la concentración de equilibrio. —

El aumento en la concentración de D-PC (7:0) por encima de la

concentración de equilibrio en las fracciones en que se eluye
el complejo, representa la D-PC (7:0) ligada al complejo cuan­
do la concentración de D-PC(7:0) libre es la de equilibrio.
 199

Teniendo en cuenta que el complejo crotoxina contiene un sólo

sitio de ligadura por mol y las ecuaciones de conservación:

[ct] = [c] + [C_pc] y [PCt] =i[PC] + [C-PC L (VII-1L

donde [Ctotal] y [C ]representan las concentraciones total y

libre de complejo crotoxina; [PCtotal] la concentración total
de D-PC (7:0); [PCeq 11a concentración de D-PC (7:0) de equili
brio empleada, mientras que [C-PC ]es la concentración de D-PC
(7:0) ligada a crotoxina. Esta última se determina para cada
fracción comoel cociente:

[C-PC ]= [PCtOtal 1- [Pceq l (VII-2)

[Ctotal]

y representa el número promedio de moles de D-PC (7:0); ligados

por mol de crotoxina, cuando la concentración de D-PC (7:0) li
bre es la concentración de equilibrio empleada.
Entonces es:

Kd: [EEQEEll_:LE:ÏE_], [pceq 1 (VII-3)

[C-PC ]

El valor de Kd así determinado es 0.13 mMy resulta similar al

valor de la constante de disociación calculada para el comple­
jo crotoxina B-D-PC (7:0) (0.12 mM,ver Capítulo IV). Debe ng
tarse en la Fig. VII-4, que el área del pico de D-PC (7:0) es
significativamente menor (40-60%)que el área del valle. Ade­
más, la cantidad total de complejo recuperada disminuye a alrg
dedor de un 40%del total de complejo aplicado a la columna.
Este resultado no es un artefacto ya que se obtiene sistemática­
mente,y su interpretación será retomada en la sección DISCUSION.

Inactivación del complejo crotoxina por bromuro de p-bromofena­

cilo (pBPB).

2.0

g
N complejo
K'- 0.003! min"

complejo
+D-Pc (7:0), K'=0.0083 msn-I

camw
Küossmin-4
LOG
DE
PORCENTAJE
ACTIVIDAD
RESIDUAL

Jl I L
IO 20 30 40
MINUTOS

Fig.VII-5: Cinética de inactivacióndefla CBpura (0) o en complejo con

CA (O) por el pBPB. En presencia de sustrato monomérico no
hidrolizable, D-PC(7:0) (fl), se observa una mayor accesíbíli
dad del sitio activo por el inhibidor.
En contraste con el comportamiento de la crotoxina B pura, en
condiciones experimentales idénticas (ver Capitulo V), la acti
vidad fosfolipásica del complejo crotoxina no es inactivada en
presencia de bromuro de p-bromofenacilo. Los resultados pre­
sentados en la Fig.VII-5, permiten estimar un valor máximopa­
ra la pseudo constante de primer orden de aproximadamente
10-4min-l , lo que contrasta fuertemente con la alta velocidad
de inactivación (k'= 0,39 min-l) de la crotoxina B.
 203

Otra diferencia importante entre el comportamiento de la crotg

xina B y el complejo crotoxina es el efecto de la adición de
lecitinas monoméricas (o análogos). En efecto, la adición de
D-PC(7:0) en concentraciones inferiores a la c.m.c. y en con
diciones experimentales idénticas a los empleados en los expe­
rimentos de protección de la Crotoxina B (ver Capítulo IV) de­
termina un discreto pero significativo aumentoen la velocidad
de inactivación del complejo crotoxina. -Comose presenta en
la Fig. VII-5, la adición de D-PC (7:0) 0.79 mMa una mezcla
de reacción que contiene complejo crotoxina pBPBresulta en un
incremento en el valor de la pseudo constante de primer orden
hasta aproximadamente un orden de magnitud (8.3 x 10-3min_l).

Actividad fosfolipásica del complejo crotoxina sobre sustratos

agregados.

(a) Actividad sobre lecitinas de cadena corta: La representa­

ción gráfica de las velocidades iniciales en función de
las concentraciones de sustrato obtenidas con el complejo
crotoxina y PC (6:0), PC (7:0) y PC (8:0) se presentan en
la Fig. VII-6 (curvas a, b y c respectivamente). Puede og
servarse que con todas las lecitinas ensayadas se observa
un modelo similar en cuanto a la dependencia de la veloci­
dad con la Concentración de sustrato; esto es, se ajustan
a hipérbolas en el rango de concentraciones en los que el
sustrato se encuentra predominantemente comomonómerosy
en la región de alta concentración de micelas (>30 mM).
 204

mo A '/y (o) (b) (c)

40;
100‘

80- f . l
60- ' l l
A. 4
> H

m PC (8 ¡0) PC (7:0) PC(6 ¡0)

i5­
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1'0- E
E

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5" 3 Ï ¡
Á
¡I __::=y/9Á //__,=:==:=======/H’
O¡’&=’_':;_='====,=Víí=T:-- l P l I l E l L
01 02 O4 06 0.8 10 2 4 6 8 40

[Lecithin] (mM)

Fig,VIl“6: Velocidades iniciales de hidrólisis de PC(6:O), PC(7:O) y PC

(8:0) por CB y el complejo CA-CBen función de la concentra­
ción de sustrato. Las velocidades fueron medidas por el meto
do espectrofotométrico utilizando 13,5‘ug CB (0) o una cantia
dad idéntica en complejo con CA 1:1 (0) y 1:2 (u). Curvas:(a)
PC(8:O), (b) PC(7¿0) y (c) PC(6:O). Control (I) sin Cazl. Va­
lores graficados x i d.s., n=3 + (c.m.c.).

Cerca de la c.m.c. las representaciones gráficas ya no se

ajustan a la ecuación cinética de Michaelis-Menten. El in
cremento de la velocidad inicial con la concentración de
sustrato es mayor que el que predice la ecuación, lo que
resulta en curvas parabólicas más que hiperbólicas. Este
comportamiento se pone en evidencia en forma más clara en
la Fig. VII-7 donde los datos de velocidad inicial en fun­
ción de la concentración de PC (6:0) se presentan en forma
de gráficos de Hanes-Woolf (ver Capítulo V). Si la cinéti
ca se ajusta a la ecuación de Michaelis-Mentne, la repre­
 205

sentación gráfica de[ S]/V0 en función de[ S] debe ser una

recta de pendiente 1/Vm, ordenada Km/Vme intersecéión ex­
trapolada sobre un eje de abscisas en-Km. En la Fig.VII¿7
puede observarse que esta representación es lineal a con­
centraciones de PC (6:0) por debajo de 6.0 mMy en la re­
gión de alta concentración de micelas por encima de 30 mM.

30- W

<4E

o 5 8 S 8 8L
B]

Fig.VII-7: Gráfico de Hanes-Wolfpara la hidrólisis de PC(6:0) por el com­

plejo CA-CB.Las velocidades iniciales fueron medidas por el mg
todo espectrofotométrico en condiciones idénticas a las descri­
tas en la Fig.V-3, con 13,5ug CB en complejo 1:1 y 1:2 con CA.
Cada punto (o) representa el promedio de 3 valores con la d.s.
dada por el área del símbolo.Las regiones (a)y(c) corresponden
a la zona de sustrato monoméricoy micelar de alta concentraciqry2
resvectivamente.La región (b) corresponde a 1a zona an5mala (V
Y5.[S]es una recta. INSERTO) .La curva de trazado contínuo fue
calculada aplicando el modelo de separación de fases para la for
mación de micelas (Apénd.B) a la cinética de hídrólisis.Las cur—
vas de trazado quebrado fueron calculadas empleando el modelo
premicelar (Apénd.B) de acuerdo con las ecuaciones B-9 y B-10.

Los valores de Vm(mon) = 3.6 umol de sustratolhidrolizado.

ap
min-1. mg crotoxina 8-1 y Kmágon) 1.8 mMse obtuvieron cg .
mohemos Visto, por el análisis gráfico según el método de
Eisenthal y Cornish-Bowden (Fig.VII-B). Los valores obte­
nidos en la región de alta concentración de micelas fueron
 205

sentación gráfica de[ S]/V0 en función de[ S] debe ser una

recta de pendiente 1/Vm, ordenada Km/Vme intersecéión ex­
trapolada sobre un eje de abscisas en-Km. En la Fig.VII-7
puede observarse que esta representación es lineal a con­
centraciones de PC (6:0) por debajo de 6.0 mMy en la re­
gión de alta concentración de micelas por encima de 30 mM.

h . VII-«7: Gráfico de Hanes-Wolf para la hidrólisis de PC(6:O) por el com­

plejo CA-CB.Las velocidades iniciales fueron medidas por el mg
todo espectrofotométrico en condiciones idénticas a las descri­
tas en la Fig.V-3, con 13,5ug CB en complejo 1:1 y 1:2 con CA.
Cada punto (o) representa el promedio de 3 valores con la d.s.
dada por el área del símbolo.Las regiones (a)y(c) corresponden
a la zona de sustrato monoméricoy micelar de alta concentración
respectivamente.La región (b) corresponde a la llamada zona ani
mala donde (V0)1/2 [S](inserto).La curva de trazado contínuo fue
calculada aplicando el modelo de separación de fases para la for
mación de micelas (Apénd.B) a la cinética de hidrólisis.Las cur­
vas de trazado quebrado fueron calculadas empleando el modelo
premicelar (Apénd.B) de acuerdo con las ecuaciones B-9 y B-lO.

Los valores de Vm(mon)

ap = 3.6 umol de sustrato hidrolizado.
1 (mon)
min--l mg crotoxina Bh y Kmap = 1.8 mMse obtuvieron c9
mohemos visto, por el análisis gráfico según el método de
Eisenthal y Cornish-Bowden (Fig.VII-3). Los valores obte­
nidos en la región de alta concentración de micelas fueron
Vmáglc) = 130 umoles de sustrato hidrolizado . min-1. mg
crotoxina B_1 y Kmáglc) = 36 mM. En el rango de concen­
tración de PC (6:0) entre 6 y 15 mM,correspondiente a la
región "anómala", considerando la presencia de agregados
premicelares (ver Discusión Cap. V), se obtiene un buen
ajuste de los resultados obtenidos con el complejo CA-CB
(relación molar 1:1) con valores de Vmágg) = 100 pmoles .
min- . mg crotoxina B.l y Kmágg) = 5 mM, mientras que pa­
ra los datos obtenidos con el complejo CA-CB(relación mg
lar 2:1), el mejor ajuste se obtiene con valores de Vmágg)=
80 umoles . min-1. mg crotoxina B-1 y Kmágg) = 5 mM(Fig.
VII-8). Conel objeto de apreciar mejor el ajuste de los
valores de velocidad inicial calculados empleandola ecua
ción deducida a partir del modelo de Tanford o de separa­
ción de fases (Apéndice B, Ecuación B-l), o a partir del
modelo de agregación premicelar (Apéndice B, Ecuaciones
B-9 y B-10) con los resultados experimentales, éstos se
presentan juntos en la Tabla VII-1.
 207

Tabla VII-l: Valores observados y calculados de Za cinética de

hidrólisis PC(6:0) por eZ complejo crotoxina.

PC(6:O) velocidad inicial crnplejo CA-CBÉ

m
( M) CbserwmüiÉ. Cahmflada

aqxuación Agregmks pre­

dezfimesfi núoehnrs__

1,76 1,80 i 0,03 1,80 1,80

2,00 1,90 i 0,02 1,90 1,90
3,00 2,25 i 0,04 2,25 2,25
4,00 2,52 i 0,03 2,48 2,50
5,00 3,44 i 0,10 2,64 3,45
6,00 4,10 i 0,05 2,76 4,44
8,00 8,98 i 0,03 2,94 8,38
10,00 14,30 i 0,05 4,16 13,20
30,00 28,30 i 0,06 13,21 28,84
50,00 31,25 i 0,04 21,79 31,00

. —1 . -1
g mol.min .mg crotox1na B .
2+
9 26°C, pH 8.0, 10 mM Ca .
g Utilizando la ecuación (V-5) y los parámetros correspondien
tes (Fig.VII-8).
g Utilizando la ecuación (V-6) y los parámetros correspondien
tes (Fig.VII-8).
El error cuadrático medio del ajuste de los valores experimen
tales al modelo de agregación premicelar, por encima de la
c.m.c. es 0,891.
El ajuste de los modelos a los resultados experimentales fue
evaluado por análisis de la regresiógklineal de Fraser y Suzg
ki (1973).
 208

(b) Actividad fosfolipásica del complejo crotoxina sobre vesí­

_culas de lecitina de cadena larga: El grado de hidrólisis
de vesículas de PC(14) por el complejo crotoxina es consi­
derablemente menor que el obtenido con crotoxina B (alrede
dor de 10% a 24°C). Además, como se presenta en la Fig.‘
VII-8, la velocidad de hidrólisis de las vesículas de PC
(14:0) por el complejo crotoxina aumenta en forma monotóni
ca con el incremento de temperatura y no presenta cambios
drásticos relacionados con las modificaciones del estado
físico del fosfolipido a la temperatura de transición gel­
lïquido cristalino.

(p
Activity
Equiv/min/mg
CB)

Enzyme
¿ár­
5-
15 20 25

Temperature (°C)

Fig.VII-8: Efecto de la temperatura sobre la hidrólisis de vesículas uni

laminares de PC(14:0) por CB,(O) y el complejo CA-CB(O). La
actividad enzimática fue evaluada por el método espectrofoto­
métrico, Cap.I, en condiciones idénticas a las descritas en
la Fig.V-6.
 209

Efecto deZ pH sobre Za actividad fosfoZipásica del complejo

crotoxina.

El efecto del pH sobre la actividad enzimática del complejo crg

toxina se estudió empleandocomosustrato una concentración fi­
ja (0.5 mM)de PC (7:0), en presencia de Ca2+ 5.0 mM. En estas
condiciones la PC (7:0) se encuentra fundamentalmente como monó
mero, y la velocidad inicial de hidrólisis es aproximadamente
80% de la Vm(mon)
ap Las muestras se equilibraron a 25°C con 25
g de complejo crotoxina A-B en relación molar 1:1. A distin­
tos intervalos de tiempo (1, 3 y 5 min) se tomaron alícuotas y
se determinó el grado de hidrólisis por el método de los hidro­
xamatos (ver Capitulo I). En la Fig. VII-9 , curva A, se pre­
sentan los resultados experimentales de acuerdo con la represen
tación de Dixon (Dixon y Webb, 1980), donde las inflexiones de
‘la curva corresponden a los valores de pKa aparentes de grupos
ionizables. Teniendo en cuenta que el sustrato es Zwitterióni­
co (carga neta cero) entre pH 3 y 10 los valores de pKa observa
dos representan grupos ionizables del complejo crotoxina. En
el gráfico de la Fig.VII- 9 se observa una inflexión a pH 6.8,
en el cual el cambio de pendientes es de l a 0. Esto implica
que la diferencia entre la forma inactiva [crotoxina-PC ]n+l y
activa [crotoxina-PCJn, corresponde a la disociación de un solo
protón (n es la cargQÏEZgativa dela enzüfla . Teniendo en cuenta
que el sitio activo de CBes accesible y catalíticamente efi­
ciente en el complejo crotoxina, este pK, probablemente corres­
ponde al del residuo de histidina de sitio activo (ver Cap. IV)
desplazado a valores de pH superiores respecto al que se obser­
 210

va con CB (5.8, ver cap.IV) posiblemente como consecuencia del

efecto de grupos vecinos en la crotoxina A. Aparte de ésta no
se observan nuevas inflexiones que sugieran la intervención de
otros grupos ionizables.

Vo
Log

Fig.VII-9A: Gráfico de Dixon para la hidrólisis de monómerosde PC(7:0)

por el complejo CA-CBen función del pH. La inflexión de 1a
curva corresponde a1 pK del residuo aminoácido involucrado
en el sitio activo.

Los resultados obtenidos empleando vesículas de PC (14:0) como

sustrato se presentan comográficos de Dixon en la Fig. VII- 9 B.
Se observa una inflexión a pH 6.0, con un cambio de pendiente
de l a O y probablemente representa la ionización del mismogrg
po del sitio activo. Pero, a diferencia con la crotoxina B no
se observan inflexiones netas a pH superiores.
 211

Vo
log

Fig.VII-9B: Gráfico de Dixon para la hidrólisis de vesículas unilamiqg

res de PC(14:0) por el complejo CA-CBen función del pH. La
única inflexión de la curva corresponde al pK del residuo
aminoácido involucrado en el sitio activo.

Experimentos de ligadura directa del complejo crotoxina a miei

las mixtas.

Con el objeto de evaluar la capacidad del complejo crotoxina

para ligarse a interfases lecitina-agua, se preincubó el complg
jo Conmicelas mixtas de D-PC (10:0) y miristoil lisolecitina
(relación molar 1:1). La mezcla se sembró en una columna de
Sephadex G.75 preequilibrada y eluïda a 25°C con amortiguador
de Tris-ClH 25 mM pH 7.4. Se colectaron fracciones de 0.3-0.4
ml a una velocidad de flujo de 8.0 ml/cmz/hr. El diagrama de
 212

elución, se presenta en la Fig.VII—JD. Las micelas mixtas fue

ron eluidas en el volumen muerto (V0) con una recuperación (mg
dida como fosforolipidico) de aproximadamente 90%de la canti­
dad total sembrada en la columna. El complejo crotoxina fue
eluido como un pico Simétrico con un valor de Kav (Kav = (Ve ­
V0)/Vt - V0)) de 0.45, similar al obtenido con complejo croto­
xina solo. La actividad especifica de fosfolipasa A2 fue cong
tante en la fracciones que contenían complejo crotoxina e idég
tica a la de la muestra original y el total de unidades de ac­
tividadrecuperadmsrepresentó entre 93 y 96%el total de unida­
des sembradas en la columna.

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w= on 02 03 Q4 05 os 07 oe
Kay: Ve-Vo
Vt-Vb

Fig.VII-10: Perfil de elución de una mezcla de micelas mixtas y de comple

jo CA-CBobtenido por cromatografía en Sephadex 6-75 como se_
ha descrito en el Cap.I. Se evaluó el contenido proteico (C)
y de fósforo (0) de las fracciones y se midió la actividad
fosfolipásica (n) utilizando lipoproteína de yemade huevo c2
mo sustrato.
 213

DISCUSION

si propósito de este estudio era compararla actividad fosfoli

pásica de la crotoxina B en el complejo con crotoxina A. Los
datos de velocidad inicial de hidrólisis con PC (6:0), y PC
(8:0) (Fig. VII-1) asi comoeflhcursode 1a hidrólisis enzimáti­
ca de PC (7:0) al estado monomérico (Fig. VII-2) sugieren que,
luego de la formación del complejo con crotoxina A el sitio ag
tivo de la crotoxina B es accesible al sustrato monoméricoy
retiene su capacidadcatalitica.
A esta conclusión se llega luego de eliminar escrupulosamente
los posibles artefactos metodológicos capaces de falsear la de
terminación de la velocidad de hidrólisis de lecitinas monomé­
ricas (ver métodos). Los resultados obtenidos con PC (6:0) y
PC (8:0) empleando el método espectrofotométrico son coheren­
tes con las medidas del grado de hidrólisis de PC (7:0) en fun
ción del tiempo seguido por la determinación de lisofosfátido
lecitina residual luego de la separación de los mismospor
cromatografía en capa delgada. Si bien esta última técnica no
es adecuada para la medida de velocidades iniciales de hidróli
sis, asegura la identificación inequívoca y la determinación
precisa del producto (lisolecitina) y el sustrato residual (lg
citina), lo que permite demostrar la relación entre el produc­
to liberado y sustrato hidrolizado es 1:1, de acuerdo con la
estequimetría de su reacción. El requerimiento de iones Ca2+,
y la estéreoespecificidad (Fig.VII-1, inserto), confirman que
la hidrólisis de lecitinas monoméricases catalizada por el
complejo crotoxina. Los resultados presentados indican además
que la eficiencia catalítica del complejocrotoxina sobre le­
 214

citinas monoméricases similar a la de la crotoxina B pura, cg

mo lo demuestran los valores de Km(mon) obtenidos de las velo­
ap
cidades iniciales de hidrólisis de PC (6:0) (Fig. VII-3). La
similitud en las constantes cinéticas mencionadaspodría ser
interpretada -sobre la base de dos hipótesis, a saber: (a)
que la ligadura de lecitina monoméricaal complejo crotoxina
resulta en la disociación de sus componentes, de modoque la
alta actividad enzimática observada Seria debida a la crotoxi­
na B libre resultante de dicha disociación y (b) que la aCtiví
dad enzimática de crotoxina B sobre lecitinas monoméricasno
sea afectada por la formación del complejo con crotoxina A.
La distinción entre estas explicaciones alternativas es funda
mental en cuanto a la interpretación del mecanismode acción,
ya que la hipótesis (a) implica que la formación del complejo
crotoxina altera la afinidad y/o la eficiencia catalitica
del sitio activo de la enzima, lo que concuerda con la sugereg
cia de oclusión del sitio activo en el complejo; Por el con­
trario, la hipótesis (b) implica que el sitio activo de la crg
toxina B es libremente accesible al sustrato monoméricoy cata
líticamente funcional aún en el complejo crotoxina, de donde
la actividad inhibidora de la crotoxina A no podría explicarse
por oclusión del sitio activo de la enzima.
Ciertas evidencias experimentales indican que las lecitinas mg
noméricas son capaces de promover la disociación del complejo
crotoxina. La primera es que si bien la adición de D-PC (7:0)
protege efectivamente a la crotoxina B pura de la inactivación
por pBPB (ver Cap.VI) con el complejo crotoxina el efecto pare
ce ser el opuesto. En efecto, comose ha indicado (ver Fig.
VII-ó) la velocidad de inactivación de la fosfolipasa A2 en el
complejo crotoxina por la adición de pBPBaumenta significati­
vamente en presencia de D-PC (7:0) 0.78 mM.
El incremento en la velocidad de inactivación puede explicarse
mejor por el aumento en la concentración de crotoxina B libre,
resultante de la disociación del complejo promovida por el mo­
nómero, que por una mayor reactividad del sitio activo. La
comparación de los valores de k' para la inactivación de crotg
xina B pura y del complefio crotoxina en presencia de D-PC (7:0)
0.78 mMsugiere que el grado de disociación del complejo crotg
xina en el equilibrio seria de 13%.
la segunda evidencia en favor de la disociación del complejo
crotoxina provocada por lecitinas monoméricasresulta de expe­
rimentos comolos presentados en la Fig.VII-4. Si se cromato­
grafía complejo crotoxina en gel de Sephadex G-7S preequilibrg
da y eluida con solución amortiguadora de Tris-ClH 50 mM,pH
7.5 (Fig.VI-l) , se recupera alrededor del 95%de la cantidad
sembrada. Por el contrario, si la solución amortiguadora con­
tiene D-PC (7:0) 0.37 mMla recuperación del complejo crotoxi­
na es de alrededor de 40%de la cantidad sembrada (Fig.VII-4).
La disociación del complejo crotoxina.promovida por lecitinas
monoméricas permite explicar por qué en los experimentos de
cromatografía en condiciones de equilibrio presentado en la
Fig.VII-4 se observa: (a) una disminución de la recuperación
del complejo crotoxina, ya que la crotoxina B libre quedaría
fuertemente absorbida a la matriz de gel ÁRfibsameny col.,
1971) mientras cue la crotoxina A libre seria retrasada con
respecto al complejo, debido a su menor peso molecular, (b)
que el grado de disociación sea mayor que el estimado a partir
de los experimentos de inactivación con pBPB, ya que el complg
 216

jo que migra a través de la columna no se encontraría en equi­

librio con los componenteslibres, y (c) que las áreas del pi­
co y del valle de concentración de D-PC (7:0) sean desiguales.
El área del valle representa la cantidad de lipido ligado por
el complejo crotoxina presente en la muestra original y debe
ser necesariamente mayor que el área del pico, que representa
la cantidad de D-PC (7:0) ligada al complejo crotoxina no disg
ciado residual.
Si bien la disociación del complejo crotoxina promovida por le
citina monoméricatiene apoyo experimental, no es suficiente
para explicar por qué la actividad catalítica del complejo crg
toxina es similar a la que presenta la crotoxina B pura. En
efecto, los resultados presentados en la Fig. VII-4, demues­
tran (a) que la disociación está lejos de ser completa en las
condiciones experimentales empleadas y (b) que el complejo crg
toxina, manteniendo sus propiedades fisicoquimicas y enzimáti­
cas intactas es capaz de ligar D-PC (7:0) monomérica con una
constante de disociación KD= 0.12 mM(Ecuación (VII-3)), simi
lar a la constante de disociación calculada para el complejo
crotoxina B, D-PC (7:0) (ver Capitulo IV). La similitud de
las constantes de disociación es la prueba más concluyente en
favor de la libre accesibilidad del sitio activo de la crotoxi
na B en el complejo crotoxina. La única evidencia seria en
contra de esta hipótesis es la falta de reactividad del sitio
activo de la fosfolipasa A2 en el complejo crotoxina con bro­
muro de p-bromofenacilo (Jeng y Fraenkel-Conrat, 1978, Fig.
VII-5 ). Comose ha discutido previamente (Capitulo IV) la es
pecificidad y alta reactividad del pBPBcon el sitio activo de
la fosfolipasa A2 estaría determinada por la estructura de la
 217

enzima. Se ha indicado que una región apolar en la superficie

de la crotoxina B cercana a la histidina reactiva (probablemen
te la mismaa la que se unen las cadenas apolares del sustrato)
podría estar involucrada en la ligadura y orientación del inhi
bidor. Si esta región apolar se encontrara deformada o par­
cialmente encubierta por la subunidad A en el complejo crotoxi
na, la rigidez del anillo aromático del pBPB podria impedir
su propia ligadura y/o su orientación adecuada para reaccionar
con el sitio activo. Por el contrario, esta región podría acg
modarlas cadenas apolares cortas y flexibles de las lecitinas
monoméricas. De manera que la falta de reactividad de la enzi
ma en el complejo crotoxina puede interpretarse en términos de
Los requerimientos del pBPB (Capitulo IV) sin necesidad de pos
tular la oclusión del sitio activo. De todas maneras, el sus­
trato es el mejor reactivo para explorar la accesibilidad del
sitio activo de una enzima.
Los resultados mencionados hasta aqui permiten obtener dos con
clusiones importantes, a saber: (a) la inhibición de la activi
dad enzimática de la crotoxina B, propiedad caracteristica de
la crotoxina A (Breithaupt, 1976) no se observa cuando se em­
plean lecitinas monoméricas comosustrato y (b) la inhibiCiÓn
por crotoxina A no se debe al enmascaramiento del sitio activo
ie la crotoxina B. En consecuencia, debe determinarse en qué
condiciones 1a crotoxina A inhibe la actividad fosfolipásica
de la crotoxina B.
Una primera aproximación surge del análisis de las curvas de
velocidad inicial de hidrólisis de PC (6:0) por el complejo
crotoxina en función de la concentración del sustrato. La com
paración de las constantes cinéticas con las obtenidas para
crotoxina B pura (capitulo V) indica que la crotoxina B y el
complejo crotoxina exhiben una actividad similar sobre monóme­
ros y agregados premicelares, mientras que la actividad del
complejo crotoxina sobre micelas es mucho menor que la de 1a
crotoxina B. comoaparece en la Fiq. VII-11.

Fig.VII-11: Gráficos de Hamas-Wolfpara la hidrólisis de PC(6:O) por CB

y el complejo CA-CB.La superposición de las curvas permite
comparar las cinéticas de hidrólisis de la enzima puraoy en
el complejoven la región de monómeros (a), de agregados pre
micelares (b), y de micelas a altas concentraciones de leci
tina (c).

Comose presenta en la Fig.VII-7 y Tabla VII-1 (pág.%W), se

obtiene un buen ajuste axmlos resultados experimentales con
( mon) A, ( a ) _ , (núC) _ . (mon) _
Kma p 1.8 mM, Kmapfl —
I 5.o mM, Kmap — 36 mM, Vmap —

3.6; Vmágg)= 80-100 y Vmáglc) = 130 umoles smirato hidrolizado.

min_l . mg crotoxina B-l. El ajuste no puede mejorarse modifi­
(ag) o Km(ag). Este resulta­
cando los valores de Vm(:gc) Vm ap ap
do sugiere que la inhibición de la actividad fosfolipásica de
 219

la crotoxina B por crotoxina A podria depender del estado de

agregación del sustrato y se observa sólo cuando el sustrato
se encuentra agregado.
Esta afirmación debe considerarse con reservas cuando está ba­
sada sólo en los datos cinéticos. En efecto, para cualquier
concentración total de PC (6:0) por encima de la c.m.c., se
encontrarán presentes monómerosy agregados premicelares junto
con las micelas; de manera que las velocidades iniciales rendi
das serían la suma de las velocidades de hidrólisis de monóme­
ros, agregados premicelares y micelas. Si bien se podrian co­
rregir los valores de velocidad teniendo en cuenta las contri­
buciones de cada especie, la interpretación sería aún complica
da. En primer lugar, las micelas pueden ser polidispersas (A­
péndice A) dependiendo de la conCentración total de lecitina
(Tausk, 1974; Allgyer y Wells, 1979).
En ese caso la ecuación de velocidad debería incluir términos
conteniendo valores de Kmy Vmcaracterísticos para cada espe­
cie micelar con un número de agregación definido. En segundo
lugar, los monómeros, agregados premicelares y micelas se en­
cuentran en equilibrio rápido (Tanford, 1973; Israelachvili y
col., 1976). Si el complejo crotoxina fuera cataliticamente
activo únicamente sobre monómerosy agregados premicelares, la
degradación de estos en productos (con una c.m.c. más elevada)
determinaria la desagregación de micelas en pequeños agregados
y monómerosaptos para ser hidrolizados, dando como resultado
una sobreestimación de la actividad del complejo crotoxina.
Mássignificativos son los resultados obtenidos con vesículas
de PC (14:0) que son monodispersas (Huang y Thompson), la c.
m.c. ('10-9H) es muy baja y los monómeros se recambian lenta­
 220

mente con el fosfolipido agregado (Israelachvili y col.,1976).

Coneste sustrato, la velocidad de hidrólisis por el complejo
crotoxina es 10%del que se obtiene con crotoxina B pura y
aumenta en forma monotónica con la temperatura (Fig.VII-B )
sin presentar discontinuidades bruscas relacionadas con la
transición gel.liquido-cristalino de la PC (14:0), (TC23.7°C).
Este resultado parece confirmar la hipótesis de que en el com
plejo crotoxina, la inhibición de la actividad fosfolipásica
de la crotoxina B por la subunidad A se manifiesta cuando el
sustrato se encuentra agregado formandouna interfase fosfoli­
pido-agua.
En cuanto al mecanismode la acción inhibidora, debe tenerse
presente otro factor capaz de gobernar la velocidad y el grado
de hidrólisis del fosfolipido agregado. En el caso de las le­
citinas, la forma dinámica de la molécula es groseramente ci­
líndrica (Apéndice A) y no habiendo repulsión entre las cabe­
zas polares puede presentar altas densidades de empaquetamien­
to, sólo limitadas por el radio de curvatura de la monocapaeg
terior de las vesículas (Israelachvili y col.,1978). La densi
dad de empaquetamientopodria constituir el paso limitante de
la hidrólisis, impidiendo el acceso de la enzima a la unión és
ter sensible (Pieterson y col.,1973; Zwaaly col., 1975), y su
efecto seria más importante sobre el complejo crotoxina cuyo
tamaño efectivo es mayor que el de la crotoxina B.
Esa posibilidad fue explorada mediante experimentos de ligadu­
ra directa comoel que se presenta en la Fig.VII-10. Para ello
se emplearon micelas mixtas del análogo no hidrolizable D-didg
canoil lecitina y miristoil lisolecitina en relación molar 1:1.
Estas micelas (220 monómeros) presentan una concentración mi­
celar critica baja y una estructura suficientemente laxa como
para descartar las restricciones de empaquetamiento(Pieterson
y col.,1973). El diagrama de elución de una mezcla de micelas
mixtas y complejo crotoxina (Fig.VII-10) demuestra que, a di­
ferencia con lo que se observa con crotoxina B (Fig.V-8).
el complejo es práéticamente incapaz de ligarse a esas micelas.
Es sabido que la interacción entre las subunidades A y B para
formar el complejo crotoxina resulta en cambios conformaciona­
les groseros (ver Discusión Capítulo VI) y éstos podrian estar
relacionados con la incapacidad del complejo crotoxina para li
garse a interfases fosfolïpido-agua. Sin embargo, tales cam­
bios conformacionales no afectan la accesibilidad y capacidad
funcional del sitio activo.
Estas observaciones llevan a la importante conclusión de que
el sitio activo no está involucrado en la interacción de la ¿
crotoxina B con interfases. En efecto, comose indicó en el
Capitulo V, esta interacción está gobernada por el estadd de
ionización de un grupo de pK 8.5. Ese grupo esencial para ia
interacción con interfases estaria bloqueado en el complejo
crotoxina ya que no es detectable cuando se estudia el edecto
del pH sobre la velocidad de hidrólisis de PC (14:0) (Fig.VII­
9B), coincidiendo con la incapacidad del complejo crotoxina
para ligarse a interfases (Fig.VII-10).
Las conclusiones del capitulo anterior junto con las del pre­
sente capitulo coinciden en indicar que la interacción de la
crotoxina B con interfases requiere la exposición de una región
especifica de la enzima, funcional y topográficamente distinta
del sitio activo. Esta región puede considerarse comoun si­
tio específico de la crotoxina B, cuya conformación apropiada
 222

la protonación de un grupo de pK 8.5 que posiblemente

¿ormar una unión iónica con un carboxilato de la enzima.
Est; región no implica necesariamente una estructura ri­
sino un área de la superficie de la proteina cuya exposi
conformación podria depender de las propiedades fisico­
de la interfase fosfolipido-agua. Desde el punto de
Ínncional, esta región es responsable del anclado de la
la interfase con el sitio activo dirigido hacia ella,
necesaria para la activación interfacial.
complejo crotoxina, esta región de la crotoxina B es o­
como consecuencia de la interacción con la subunidad A,
ïaeras que el sitio activo conserva su accesibilidad y capa­
funcional intactas. En consecuencia, es probable que
usté región específica se encuentre en la zona de interacción
entre las subunidades A y B.
>5Locontexto es posible interpretar en forma coherente los
pcsultados obtenidos con micelas de PC (6:0) y vesículas de
(1;:0). El complejo crotoxina puede ligar un monómeropor
con micelas o vesículas, ya que el sitio activo es
cccrible y cataliticamente funcional. Pero comoes incapaz
anclarse a la interfase, el monómeroligado será hidrolizg
¿a velocidad característica para los sustratos monoméri­
müdiOacuoso. Esto explica por qué, en contraste con
ÏJCLOXinüB, la actividad del complejo crotoxina sobre ve­
sículas de PC (14:0) es poco sensible a cambios en el estado
del fosfolípido. El aumentoen la eficiencia cataliti
. . (mic) mon
nrse:vada con crotox1na B pura (Vmap >> Vmáp )) resul­
la interacción con la interfase no se observará con
complejo crotoxina. Los resultados discutidos hasta aquí
 223

permiten elaborar una explicación coherente de la interacción

del complejo crotoxina con fosfolípido agregado sobre la base
de dos conclusiones, a saber (a) el sitio activo de la croto­
xina B es accesible y catalíticamente funcional en el comple­
jo crotoxina; (b) en comparación con la crotoxina B, el com­
plejo crotoxina es deficiente en su capacidad de ligarse a in
terfases fosfolípido-agua.
La validez de este modelo puede juzgarse comparando los resul
tados experimentales obtenidos en condiciones
definidas con el comportamientoteórico predecible a partir
del modelo:

(l) En principio, si el área responsable de la interacción CB­

interfase se encuentra en la zona de interacción con la subuni
dad A, la ligadura de la crotoxina B a interfases o a crotoxi­
na A deben ser procesos mutuamente excluyentes. Esto es, si
la subunidad B se liga a la interfase, la subunidad A debe di­
sociarse. Esta interpretación está apoyadapor diversas evi­
dencias experimentales, a saber (a) Se observa inhibición de
la actividad fosfolipásica de CBsobre vesículas de PC (14:0)
sólo empleando el complejo A-B preformando y no cuando la sub­
unidad A se adiciona a una mezcla de vesículas de PC (14:0) y
crotoxina B (ver Capitulo VI), (b) Se ha demostrado que la li
gadura de crotoxina B a membranade eritrocitos (Jeng y col.,
1978) o electroplacas (Bon y col.,1979) se produce con diso­
ciación de la subunidad A.

(2) La ligadura de crotoxina B a interfases no requiere la pre

sencia de iones Ca2+ (ver Capítulo VI), que en cambio son re­
querimiento absoluto para la hidrólisis (Ver Capítulo V), lo
 224

que demuestra la independencia funcional de esta región especí­

fica del sitio activo. Este resultado concuerda con los obten;
dos por Chang y Lee (1977) y Bon (1982) quienes indican que los
efectos pre y postsinápticos de la crotoxina están precedidos
por un paso de ligadura independiente de Ca2+.
(3) La subunidad A es incapaz de reformar el complejo cuando la
crotoxina B se encuentra ligada a interfases, aún en condicio­
nes de equilibrio. Esto requeriría un AG°de ligadura a inter­
fases más negativo que el AG°de formación del complejo (-51.0
kJ/mol, Hanley,1979), por lo que la ligadura de CBa la interfg
se resultará prácticamente irreversible (Breithaupt,1976 b).
Si bien hay un cuerpo de evidencia importante en favor del mode
lo presentado, éste no permite predecir por qué el complejo se
disocia a nivel de la unión neuromuscular. En efecto, al menos
en presencia de interfases lecitina-agua el complejoes estable.
Es posible que propiedades fisicoquïmicas particulares (pHsu­
perficial, densidad de cargas, etc.) prevalentes a nivel de la
interfase en la unión neuromuscular tengan un papel importante
para favorecer la disociación del complejo y la completa exposi
ción de esa área específica en la superficie de la crotoxina B
esencial para su ligadura. Este problema será tratado en el ca
pítulo siguiente.
 CAPITULO VIII

"No hay que multiplican io¿ enteó

¿Ln neceóidad".
Guiiieamo de Occam

"Reaiidad: El ¿ueño de un ¿Lióboáo 10cc;

¿o que queda en ei ¿thno cuando ¿e 6¿¿tna
un ¿antaóma; La zona de mayon denóidad
de un vacío".
AmbnOóe Bianca
 DISOCIACION DEL COMPLEJO CROTOXINA EN LA SINAPSIS DE LA

UNION NEUROMUSCULAR

El bloqueo de la unión neuromuscular a nivel presináptico re­

quiere la ligadura de la crotoxina B a la membranay existen
evidencias experimentales abundantes (Jeng y col.,1978; Hendon
y Tu,1979; Bon y col.,1979; Chang y Lee,1981) que demuestran
que cuando la crotoxina B se liga a la membranael complejo
crotoxina debe disociarse. Experimentos de doble marcación
CBIZSI - CA3Hdemuestran que la ligadura de crotoxina B se a­
compañade liberación de la subunidad A proveniente de la di­
sociación del complejo crotoxina (Jeng y col.,1978). La diso- “
ciación es necesaria pero debe notarse que se produce en condi
ciones de pH, temperatura, composición y fuerza iónica que de­
berían favorecer la asociación de las subunidades y estabili­
zar el complejo. En consecuencia, puede admitirse que la disg
ciación del complejo crotoxina a nivel de la membranablanco
deberá estar determinada por un conjunto de propiedades fisicg
químicas particulares existentes a nivel de la membranapresi­
náptica. Se ha postulado la existencia de sitios de alta afi­
nidad o receptores específicos que podrían competir eficiente­
mente con 1a crotoxina A (Habermann y Breithaupt,1978; Mebs,
1981). sin embargo, la postulación del mencionado receptor no
explica la observación de que cuando preparaciones neuromuscu­
lares aisladas se incuban en concentraciones elevadas de com­
plejo crotoxina, las alteraciones características del botón
presináptico determinantes del bloqueo de la transmisión pre­
sentan alteraciones de la placa muscular y lesiones en el müscu
 226

lo (Breithaupt,1976; Hawgoody Smith,1977; Gopalakrisnakone

Y COI-¡1984), lo que requeriría la presencia de sitios de alta
afinidad en la región postsináptica.
La especificidad del complejo crotoxina por uniones de tiPO C9
linérgico sugiere que ciertos componentesasociados o presen­
tes en este tipo de uniones podrian ser responsables de la di­
sociación del complejo. En este sentido, evidencias experimen
tales obtenidas por tres lineas metodológicas independientes
indican que la acetilcolina, en concentraciones similares a
las estimadas comofisiológicas, es capaz de desestabilizar el
complejo crotoxina y promover la disociación de sus componen­
tes a valores de pH cercanos a la neutralidad, mediante la ti­
tulación de carboxilatos de la crotoXina A. Este mecanis
mopuede contribuir, por lo menos en parte, a la disociación
del complejo crotoxina cerca de la membranablanco y, en consg
cuencia, a la especificidad de la crotoxina B por la membrana
presináptica de la unión neuromuscular.

RESULTADOS

1) Efecto de la acetilcolina sobre la actividad fosfolipásica

especifica del complejo crotoxina: La incubación de comple­
jo crotoxina reconstituido (relación molar CA/CB2:1) a pH
7.4 amortiguado y 25°C con acetilcolina (en un exceso de 30
veces) resulta en un progresivo incremento en la actividad
fosfolipásica especifica, que alcanza el 72%de la obtenida
con la misma cantidad de crotoxina B.
No se observa este incremento en la actividad especifica de
 227

fosfolipasa A2 si en condiciones experimentales idénticas

incuban crotoxina B pura en presencia de acetilcolina, o si
la acetilcolina se adiciona a1 sustrato de la fosfolipasa
A2. Estos resultados sugieren que el incremento de la acti
vidad especifica de fosfolipasa A2 puede atribuirse a la di
sociación del complejo promovidapor acetilcolina.
Los grados de disociación obtenidos para distintas concen­
traciones de acetilcolina con este método son mayores que
los obtenidos con otros procedimientos (ver más abajo). Es­
to puede ser debido al desplazamiento del equilibrio provo­
cado por la presencia de lipoproteina de yema de huevo en
exceso, ya que se ha demostrado (Canziani y col.,1983) que
la ligadura de crotoxina B a interfases fosfolípido - agua
impide la formación de complejo con crotoxina A. Sin embar
go, este desplazamiento del equilibrio por el sustrato agrg
gado no parece ser capaz de disociar completamente el com­
plejo crotoxina. Esto es probablemente debido al incremen­
to en la concentración de crotoxina A libre que favorecerá
la formación dá.complejo con crotoxina B, asi comoa la li­
gadura de crotoxina A a complejo preformado para dar otros
con distintas relaciones estequiométricas (p.ej. CA/CB3:1,
4:1, etc.).
2 V Espectroscopiachafluorescencia: Los estudios de disociación
del complejo crotoxina en medio ácido (ver Cap.VI) muestran
que la disociación del complejo crotoxina en sus subunida­
des resulta en un incremento de la fluorescencia intrínseca.
En consecuencia se dispone de un método sensible y preciso
para estudiar la disociación.
 228

La adición de acetilcolina (en un exceso de 30 veces) a una

muestra que contiene 3.3 umoles de complejo crotoxina refor
mado (relación molar CA/CB2:1) a pH 7.0, resulta en un rá­
pido incremento en la intensidad de emisión, seguido por un
incremento progresivo, dependiente de tiempo, que llega a
un máximoestable alrededor de los 15 min. El incremento
de la intensidad de emisión en presencia de acetilcolina se
produce con un corrimiento de Amaxde 330 a 350 nm, y resul
ta comparable a la disociación observada a pH 3.0. El gra­
do de disociación en equilibrio estimado a partir de las mg
didas de intensidad de fluorescencia (ver Capítulo VI) es
de 0.4. Si luego es ajustado el pH de la muestra a 2.0 se
obtiene la disociación completa del complejo en unos minu­
tos; sin embargo, el máximoincremento en la intensidad de
emisión nunca fue mayor que el obtenido en medio ácido sin
la adición de acetilcolina. La dependencia del grado de di
sociación con la concentración de acetilcolina se presenta
en la Tabla VIII-I.
Tabla VIII-I: Grado de disociación del complejo crotoxina en
función de Za concentración de acetiZcoZina evaluado por fluo­
rimetria.

Acetihxflina Gflïk>db disocüxfifin

omo (X)

0,4 0,39 Ï 0,03

0,6 0,66 Í 0,10
+
2,0 0,83 - 0,05
6,0 0,89 Í 0,07

Los espectros de fluorescencia del carplejo crotoxina (3,3 M) a pH 7-0,

25°C, fueron analizados en ausencia y en presencia de cantidades crecientes
de acetiloolina.
Se registró el inCIEmentomáximoen la fluorescencia de la muestra para ca­
da concentración de acetilcnlina que es proporcional a1 grado de disocia­
ción del ocmplejo crotoxina (ver Capitulo VI).

3) Inactivación de la actividad fosfolipásica del complejo cro­

toxina por bromuro de p-bromofenacilo: El bromuro de p-bro­
mofenacilo es un inhibidor dirigido a sitio activo de las
fosfolipasas A2 (Volwerky col.,1974; Halpert y col.,1976)
que inactiva rápidamente a la crotoxina B libre debido a la
alcohilacíón de un residuo de histidina del sitio activo
de la enzima (Volwerk y col.,1974; Jeng y Fraenkel-Conrat,
1978). Por el contrario, 1a incubación del complejo crotoxi
 230

na con bromuro de p-bromofenacilo en condiciones experimen­

tales similares no resulta en inhibición significativa de
la crotoxina B (Canziani y col.,1981). La diferencia de
comportamiento entre crotoxina B pura y en complejo con crg
toxina A en presencia de bromuro de p-bromofenacilo hizo pg
sible el diseño de un tercer modelo experimental para ensa­
yar la disociación del complejo crotoxina promovida por ace
tilcolina. La inactivación de crotoxina B pura a pH 7.2 y
25°C por bromuro de p-bromofenacilo sigue una cinética de
pseudo-primer orden con una constante k' = 0,39 min-1. En
condiciones experimentales idénticas el complejo crotoxina
no es inactivado. Sin embargo, la adición de acetilcolina
(exceso molar de 32) resulta en un decrecimiento progresivo
de la actividad fosfolipásica. La reacción de inactivación
no sigue una cinética de pseudo-primer orden, debido a que
la enzima modificada (inactiva) es aún capaz de formar com­
plejos con crotoxina A que poseen una estabilidad'similar a
la del complejo formado a partir de las subunidades nativas
(Jeng y Fraenkel-Conrat,1978; Chang y Lee,1980). Comocon­
secuencia el "complejo crotoxina" presente en el medio de
reacción es en realidad una mezcla conteniendo crotoxina B
nativa (no modificada) asi comocrotoxina B inactiva, y la
fracción de esta última aumenta con el tiempo. Sin embargo
puede demostrarse que, cuando se corrige por la fracción m9
lar de enzima inactiva, la cinética de inactivación se ajus
ta a una cinética de pseudo-primer orden. Para una concen­
tración fija de complejo crotoxina y concentraciones cre­
cientes de acetilcolina las velocidades iniciales de inacti
 vación serán directamente proporcionales al grado de diso­
ciación del complejo crotoxina. Los resultados de la velo
cidad inicial de inactivación en función de la concentra­
ción de acetilcolina permitieron estimar el grado de diso­
ciación del complejo. Esos datos se presentan en la Tabla
VIII-2.

Tabla VII-2: Velocidades iniciales de inactivación de la activi

dad fosfolipasa del complejo crotoxina por el pBPBen función
de la concentración de acetilcolina y grado de disociación esti
mado.

Acetilcolina Gradode disociación velocidad inicial

de inactiyación
(mm) (x) (mol.min 1)

+
0,2 0,20 - 0,09 1,00
0,40 Ï 0,05 2,00
0,6 0,71 Í 0,05 3,54
2,0 0,81 Í 0,03 4,05
6,0 0,90 Í 0,04 4,35

Muestras de 0,2 ml, volunen final, con un contenido en complejo crotoxina

de l mnol, 1.0 mMEDTA,0,1 M Tris—maleato fueron incubadas a 30°C en pre­
sencia de pBPB3.0 mM(concentración final).
Alicuotas de 50 ul fueron prelevadas 2,5 minutos y recibieron 150 ul de
0,1 Mformiato de anonio, pH 3.0 para detener la reacción de inactivación,
por un lado, y disociar completamenteal ccnplejo. La actividad fosfolipa­
sa A2 residual de cada alícuota fue evaluada crno se ha descrito en el Cap;
tulo I. La constante de disociación estimada por el cnmplejo crotoxina es
de 1.2 x 10-1OMa pH neutro. En presencia de acetilcolina, la KDpara el
complejo es 1.6 x 10-4M.
 232

Sobre estos resultados se examinó el grado de disociación del

complejo en función de la concentración de acetilcolina.
La representación gráfica de TÏÉÏT en función de logIaxiilaflinm
según Hill se presentan en la Fig. VIII-1. La representación
gráfica exhibe varios segmentos razonablemente lineales con
pendientes promedio de 1.0; 2.3; 1.3 y 1.0. En la Fig.VIII-2
se muestra que la representación doble recíproca de [x]
.en función de [acetilcolinalz’ 3 es razonablemente lineal. La
intersección extrapolada sobre el eje de abscisas (-1/K'hepr9
duce a -3 x 10-7M_1. En consecuencia, la concentración de a­
cetilcolina requerida para la mitad de la máximadisociación
resulta [Acetilcolinaloo5 = 3.97 x 10-4M(esto es, -3.4 unida
des logaritmicas de concentración de acetilcolina), lo que
concuerda con los resultados experimentales.
Por otra parte, el análisis de los resultados experimentales
por el tratamiento de Dixon resulta compatible con un modelo
de tres sitios que deben ser ocupados. Se obtiene un buen a­
juste con los datos experimentales empleando los valores de
K1 = 2 x 10'4 M; K2 = 1.4 x 10’3 M y K3 = 6.3 x 10’5 M (Fig.
VIII-3) calculados a partir de un análisis del gráfico de
Dixon similar al efectuado para la disociación del complejo
en medio ácido.
 —Iog[AcChol]
4 3 2
l 1 ¡

Fig.VIII-1:
1- —-1 Gráfico de Hill para la
disociación del complejc
A L crotoxina en función de
1‘ o ¿g la concentración de ace­
EE tilcolina,donde x'es el
x0_ -0: grado de disociación. E]
cn -‘ gráfico de Dixon: log -x
53 ;L (1-x)(derecha) en funcié
" de la concentración de a
cetilcoliua [Ac Chol](an
_1_ .1 ha) es idéntico.
l l l
' -3 -2
logtAcChoU

J l l
0 1000 2000 3000
105x 1/[AcChoD¿’(M'¿3)

Fig.VIII-2: Representación doble recíproca de lazfgacción de complejo digg

ciada x en función de [acetilcolina] ’ . La intersección extpg
polada sobre el eje de abscisas se produce a —3x 10'7 M’l.
 234

\o SAC2*CAC3.o".

Fracción
molar

- log [AcChol]

Fig.VIII-3: Ajuste de los valores experimentales (o) a las fracciones mo­

lares calculadas para crotoxina (C) con 2 y 3 moléculas de a­
cetilcolina asociadas (CAC2+ CAC3).Las distribuciones res­
pectivas para todas las formas de complejo crotoxína asocia­
do o no a la acetilcolina aparecen también en función de -log
[Ac Chol](concentrac16nde acetilcolina utilizada).

DISCUSION

El propósito de este estudio es el de examinar del efecto de

ciertas sustancias de interés biológico relacionadas con la
unión neuromuscular y que fueran capaces de promover la diso­
ciación del complejo crotoxina. De acuerdo con los resultados
presentados en el Capitulo VI, se buscó un ácido fuerte de una
base débil, que se encontrara a concentración suficiente cerca
de la membranablanco (la membranapresináptica de la unión
 235

neuromuscular), y la acetilcolina surgió comoun excelente can

didato.
Las evidencias experimentales que demuestran su capacidad para
promover la disociación del complejo crotoxina son (a) el in­
cremento de la actividad específica de fosfolipasa A2 cuando
se 'incuba con el complejo crotoxina; (b) el incremento de la
intensidad de emisión que provoca en el espectro de fluorescen
cia del complejo crotoxina y (c) la inactivación, dependiente de
[Acoll,de la actividad fosfolipásica del complejocrotoxina
por bromuro de p-bromofenacilo. El grado de disociación del
complejo en función de la concentración de acetilcolina obteni
dos por el método espectrofluorométrico y por las medidas de
velocidad inicial de inactivación por bromuro de p-bromofenaci
lo son similares (Tablas VIII-1 y VIII-2) y esos datos se em­
plearon para caracterizar la disociación del complejo crotoxi­
na por acetilcolina.
Respecto al número de moléculas de acetilcolina que deben ser
ligadas para producir la disociación completa del complejo crg
toxina, los gráficos de Hill (Fig.VIII-l) así comola lineali­
dad de los de doble recíproca de fracción molar de complejo
disociado en función de [acetilcolinalz’ 3 (Fig.VIII-Z) sugie­
ren que la disociación del complejo crotoxina requiere la liga
dura de, al menos dos moléculas de acetilcolina a sitios que
exhiben cooperatividad positiva. Comoen el caso de la diso­
ciación en medio ácido, el tratamiento según Dixon sugiere que
esos gráficos son compatibles con un modelo de tres sitios.
Sin embargo, si bien K2 > K1 es K3 < K1,K2. En consecuencia,
puede suponerse que las especies doblemente y la triplemente
Ocupadaspor acetilcolina representan complejos disociados,
mientras las formas con un sólo sitio o ningún sitio ocupado
se encontrarian asociadas comocomplejo crotoxina, tal comose
presenta en la Fig. VIII-3.
La importancia de la disociación del complejo crotoxina promo­
vida por acetilcolina comomodelo para determinar la especifi­
cidad de blanco de la crotoxina se basa en las siguientes COn­
sideraciones: (1) la concentración de acetilcolina en el espa­
4
cio intersináptico (1 x 10-8M en reposo y 3 x 10- M en 1a unión
neuromuscular estimulada - Katz y Miledi (1973),(1977); Kuffler
y Yoshikami,1975)es suficiente para provocar cierta disocia­
ción del complejo crotoxina; (2) la ligadura de algunas molécu­
las de crotoxina B a la membranapresináptica resulta en un au­
mento de la liberación de acetilcolina (Hawgoody Santana de
Sa,1979), que a su vez producirá un mayor grado de disociación
del complejo, resultando así en 1a amplificación del efecto.
Numerosasevidencias de estudios electrofisiológicos apoyan es­
te argumento para la disociación del complejo crotoxina, a sa­
ber: (a) Usando preparación nervio - músculo aislada el aumento
de la frecuencia de estimulación del nervio resulta en una dis­
minución significativa del tiempo requerido para bloquear 1a
transmisión neuromuscular (Chang y Lee,1977; Chang y col.,1977);
(b) la reducción de la liberación de acetilcolina inducida expg
rimentalmente (p.ej. en medios con alto Mg2+y bajo Ca2+) reta;
dan significativamente la aparición del bloqueo (Changy Lee,
1977; Hawgoody Santana de Sa,1979); (c) la adición de toxina K
o toxina I (dendrotoxinas) del veneno de Dendroaspis polylepis
polvlepis (mambanegra), que aumentan la respuesta a la estimu­
 237

lación del nervio produciendo una liberación aumentada de ace­

tilcolina, potencia de acción bloqueante del complejo crotoxi­
na (Harvey y Karlsson,1982).
Por otra parte, el modelo puede ser apoyado por los siguientes
argumentos: (3) en el espacio intersináptico existe un gradien
te trans iente concentración de acetilcolina (Katz y Miledi,
1973) que favorecerá la disociación del c0mplejo en la vecin­
dad de la membranapresináptica, asegurando la ligadura de crg
toxina B al blanco; (4) Por otra parte, el complejo y las sub­
unidades resultantes de la disociación no se encontrarán en e­
quilibrio ya que la interacción de crotoxina B con la membrana
presináptica impediria la reformación del complejo con crotoxi
na A. Comose demostró previamente (ver Cap.VI), la crotoxina
A es incapaz de interactuar con crotoxina B si ésta se encuen­
tra ligada a interfases "in vitro". Es posible suponer que
"in vivo", concentraciones muybajas de acetilcolina podrian
producir una marcada disociación del complejo crotoxina, ya
que la existencia de condiciones alejadas del estado de equili­
brio pueden modificar considerablemente los grados de disocia­
ción calculados en condiciones de equilibrio (Weber,1965). Fi
nalmente, este modelo puede explicar los efectos miotóxicos ob
servados únicamente con preparaciones aisladas e incubadas en
presencia de concentraciones altasde crotoxina, equivalentes a
cantidades tóxicas de crotoxina B pura.
In vivo, se ha observado acción miotóxica solamente por efecto
local, provocado por injecciones repetidas de complejo crotoxi­
na en un mismo músculo, por ejemplo el Soleo del ratón, de acuer
do con los recientes resultados obtenidos por Gapalakrishnakone
y col.(1984).
 DISCUSION GENERAL Y

CONCLUSIONES

"Ii n’y a po¿nt de contaad¿ct¿on¿

danó ¿a Natune".
La Racheáouicaud
Réálexionó
 MODELO DEL MECANISMO DE ACCION DEL COMPLEJO CROTOXINA

La confección de un modelo implica una simplificación más o mg

nos drástica de un sistema real con el objeto de descubrir o
explicar el fenómenoexperimental observado. Si bien la dife­
rencia entre modelos descriptivos y explicativos no es siempre
clara, la explicación de un fenómeno va más allá de la mera
descripción, ya que circunscribe la aparición del fenómenoa
relaciones más elementales o leyes ya conocidas. El propósito
de esta simplificación (implícita en la construcción de un mo­
delo) es el de poner en evidencia los mecanismos e interaccio­
nes que se consideran (o bien -se conocen) responsables del
fenómeno en particular. De este modo, en 1a versión básica de
cualquier modelo, todos los detalles que no afectan directamen
te el fenómenoen estudio o que lo modifican cuantitativamente
(pero no cualitativamente) son dejados de lado. En general,
sólo una combinación de varios modelos para los fenómenos ob­
servados en el mismo sistema, puede conducir a una imagen más
o menos completa del proceso global. Esto implica la condición
de‘que en la combinación de modelos que representan los distin
tos eventos del fenómeno estos no sean mutuamente incompatibles.
Si bien esta condición es necesaria, no es suficiente en cuan­
to a la validez del modelo. La otra condición que debe ser te
nida en cuenta es el número de suposiciones (o parámetros) in­
cluídos en el modelo. Cuanto mayor sea el número de suposicig
nes incluidas en el modelo para representar las propiedades del
sistema real, menor es su validez. En efecto, si la evidencia
experimental de que se dispone para el sistema real es limita­
da, un modelo con un número grande de parámetros requiere el
 239

ajuste de los mismosa los datos experimentales y este procedi

miento es ambiguo.EBte es un punto de importancia crucial en
el diseño de modelos para sistemas biológicos. En tal sentido,
los modelos minimos serán más realistas que aquellos que im­
plican un número muy grande de suposiciones.

1) El modelo convencional:

El modelo más aceptado para el mecanismo de acción del com­

plejo crotoxina parte de las siguientes suposiciones:
I. La crotoxina es un complejo no covalente constituido por
dos subunidades: crotoxina A y crotoxina B. La interac­
ción entre las subunidades está estabiliZada por uniones
de tipo iónico.
La actividad fosfolipásica se encuentra en la subunidad
B y es esencial para la acción tóxica.
II. La formación del complejo con crotoxina A determina la
oclusión del sitio activo de la crotoxina B. Esto expli
ca por qué la formación del complejo resulta en inhibi­
ción de la actividad fosfolipásica de la subunidad B.
III.La potenciación de la toxicidad de crotoxina B por la
formación de un complejo con crotoXinazxse debe a que
esta última funcionaría como "acompañante" de la croto­
xina B impidiendo su ligadura sitios inespecíficos a tra
vés de la oclusión del sitio activo.
IV. El complejo debe disociarse para ejercer su acción tóxi­
ca. Comoresultado de la disociación, la crotoxina B,
con su sitio activo expuesto quedaria ligada a la membra
na blanco.
 240

La disociación del complejo en la región presináptica de

la unión neuromuscular sería debida a la presencia de un
receptor específico o "sitio de alta afinidad", capaz de
competir eficientemente con la subunidad A del complejo
por la ligadura de crotoxina B. Esto determina la espe­
cificidad de la neurotoxina por el tejido blanco.
VI. Una vez ligada la crotoxina B a la región presináptica,
Su actividad“enzimática sobre los fosfolípidos de la mem
brana provocaría el bloqueo de la unión neuromuscular.

2 V El modelo propuesto por el presente trabajo:

Las conclusiones obtenidas del estudio del mecanismode in­
teracción entre los componentes del complejo crotoxina (Cap.
VI y VII), de la estabilidad del complejo crotoXina y su di­
sociación en distintas condiciones experimentales (Cap. VI
y VIII); de la actividad enzimática de la crotoxina B pura
(Cap. V) y de la comparación con la actividad enzimática del
complejo con crotoxina A (Cap. VII) permiten proponer un nue
vo modelo para explicar la potenciación de la toxicidad de
la crotoxina B por crotoxina A así como para el mecanismo de
selección del blanco por esta neurotoxina. El modelo pro­
puesto se basa en las proposiciones siguientes:
I. La formación del complejo crotoxina no resulta en la o­
clusión, alteraciones de la accesibilidad o de la capaci
dad funcional del sitio activo de la crotoxina B.
II. La inhibición de la actividad enzimática de la crotoxina
B por la formación de un complejo con crotoxina A se ob­
serva sólo con fosfolïpido agregado en micelas o vesícu­
 241

las y es producido por la oclusión o enmascaramiento de

una región en la superficie de la crotoxina B, responsg
bles de la ligadura de la enzimaa interfases fosfolípi
do-agua.
III.Esta región específica de la crotoxina B, funcional y
topográficamente distinta del sitio activo se encontra­
ría en la región de interacción entre las subunidades A
y B y, para la interacción de crotoxina B con interfa­
ses fosfolípido-agua esta región debe encontrarse ex­
puesta.
IV. La interacción de crotoxina B con interfases fosfolípi­
do-agua y con crotoxina A son mutuamente excluyentes,
esto es que el complejo crotoxina es incapaz de ligarse
a interfases. Por la mismarazón, para que la subunii
dad B se ligue a interfases fosfolípido-agua, el complg
jo con crotoxina A debe necesariamente disociarse.
V. La disociación del complejo crotoxina en condiciones
fisiológicas ocurriría cerca de la membranablanco pro­
movidapor la presencia de acetilcolina, lo que sería
_suficiente para determinar la especificidad del comple­
jo crotoxina por uniones de ti;x>colinérgico.

COMPARACION DEL MODELO CONVENCIONAL CON EL PROPUESTO

Proposición I: La separación de las subunidades que forman el

complejo crotoxina se ha llevado a cabo por dos procedimientos
alternativos: (a) cromatografía en DEAE-celulosa ó CM-celulosa
en presencia de urea 6.0 M (Hendon y Fraenkel-Conrat,197l) y
 242

por cromatografía en CM-celulosa a pH 3.5 (Rubsamen y col.,

1971; Breithaupt y col.,1974). En nuestro trabajo hemosemplg
ado un procedimiento similar a1 descrito por Rubsamen y col.
(1971) y Breithaupt y col.(1974). Las propiedades fisicoquími
cas de ambos componentes coinciden con las descritas por Horst
y col.(1972) y Breithaupt y col.(1975).
Si bien no se ha realizado un estudio exhaustivo de las propig
dades de ambos componentes obtenidos en medio ácido y en pre­
sencia de urea, parecen tener propiedades similares en cuanto
(a) 1a adición de CAa CBresulta en la formación espontánea
de un complejo que presenta propiedades fisicoquïmicas simila­
res del complejo crotoxina nativo; (b) la actividad fosfolipá­
sica de la subunidad B sobre lipoprnteínas se inhibe y (c) la
toxicidad de la crotoxina B se potencia (Rubsameny col.,197l;
Breithaupt y col.,1974; Breithaupt,1976; Habermany Breithaupt,
1978; Hendony Fraenkel-Conrat,1973 - Cap.III).
La interacción entre las subunidades del complejo parece ser
fundamentalmenteelectrostática,cnmolo demuestra el incremento
de actividad fosfolipásica observado a pH 3.0 (Cap. VI). En
la formación del complejo crotoxina se produciría la libera­
ción de iones H+ de grupos básicos de la crotoxina B, lo cue
explica su menor punto isoeléctrico. Estos grupos formarían
puentes de H con carboxilatos de la crotoxina A, que se titu­
lan a valores de pH inferiores a 4.0 (Cap. VI).
El análisis de las curvas de disociación en función del pE su­
giere que la disociación completa requiere la protonación coo­
perativa de 2-3 grupos carboxilo. Por otra parte estudios es­
pectrofluorométricos (Hanley,1979; Canziani y col.,1984 - Cap.
VI) e hidrodinámicos (Paradies y Breithaupt,1975) coinciden en
mostrar que la disociación del complejo crotoxina se acompaña
de cambios conformacionales importantes. Respecto a la estabi­
lidad del complejo a pH 7.0 es muy elevada con una constante de
disociación Kd = 1.2 x 10-10M a 30°C (Cap. VI) que coincide con
resultados de otros autores (Paradies y Breithaupt,l975; Hanley
1979) y que representa un.AG;D = - 51.k J/mol.
Sin embargo, la adición de lecitinas de cadena corta al estado
de solución molecular (por debajo de la c.m.c.) parece ser ca­
paz de promover la disociación del complejo a pH 7.0, como lo
demuestran el incremento de la velocidad de inactivación de la
actividad fosfolipásica en el complejo en presencia pBPBy la
disminución de la recuperación del complejo luego de la croma­
tografía en Sephadex G-75 equilibrada con solución de D-PC (7:
0) (Cap.VII). En la disociación del complejo promovida por lg
citinas monoméricas, la presencia de las cadenas apolares es
de importancia decisiva, como lo prueba el hecho de que la fos
forilcolina (equivalente a la cabeza polar del fosfolípido) es
incapaz de producirlo hasta concentraciones del orden de 0.1 M.
Unaexplicación satisfactoria de este resultado es la existen­
cia de una región apolar en el área de interacción entre las
subunidades, de modoque la interacción con‘las cadenas apola­
res de lecitina ocurriría a expensas de una disminución de la
estabilidad del complejo. La existencia de una región apolar
entre las subunidades está apoyada por el apagamiento de la
fluorescencia, y desplazamiento del máximode emisión de los
residuos de triptofano que se observa comoconsecuencia de la
formación del complejo crotoxina (Cap.VI) y que puede interprg
tarse comoresultado de la remoción de los residuos de tripto­
fano de un medio polar a uno apolar (Hanley,1979 - Cap.VI).
Por otra parte, la disminución de entropía configuracional,
traslacional y rotacional de las subunidades debido a la forma
ción de un complejo, estaría más que compensada por el aumento
de entropía debido a la deshidratación de las subunidades, que
resultaría en la liberación de 230 moles de agua por mol de
complejo (datos de Paradies y Breithaupt,1975).

Proposición II: La proposición del modelo convencional se basa

en la observación de que si bien el bromuro de p-bromofenacilo
inactiva rápida y específicamente la crotoxina B por modifica­
ción de un residuo de histidina del sitio activo, no afecta a
la enzima en complejo con crotoxina A, de donde se concluyó
que el sitio activo de la fosfolipasa selencontraría ocluido
en el complejo crotoxina (Jeng y Fraenkel-Conrat;l978). Sin
embargo,esa diferencia de reactividad podría atribuirse a los
requerimientos estructurales del reactivo (Cap.VII) más que a
la oclusión del sitio activo. Por el contrario, la evidencia
experimental presentada en el Cap.V demuestra que la constante
de disociación de los complejos lecitina - crotoxina B obteni­
da de eXperimentos de protección frente a la inactivación por
pBPBes similar a la constante de disociación lecitina - com­
plejo crotoxina obtenida por experimentos de cromatografía en
condiciones de equilibrio (Cap;”VII) lo que constituye una fue;
te evidencia en favor de.1a libre accesibilidad del sitio act;
vo en el complejo crotoxina. Por otra parte, los estudios de
velocidad inicial de hidrólisis de dihexanoil lecitina al esta
do monomérico catalizada por crotoxina B pura (Cap.V) y complg
jo crotoXina (Cap.VII) demuestran que los parámetros KmaP y
Vmapson similares, lo que demuestra que en el complejo croto­
 245

xina, el sitio activo de la crotoxina B no solo es libremente

accesible sino que su eficiencia catalitica está conservada.
En consecuencia, la suposición de que la oclusión del sitio
activo es responsable de la inhibición de la actividad fosfo­
lipásica de la crotoxina B debe ser descartada, ya que no se
observa tal inhibición sobre sustrato monomérico(Cap.VII).
La inhibición de la actividad de fosfolipasa A2 de la crotoxi
na B debida a la formación del complejo crotoxina sólo es evi
denciable cuando se emplea fosfolipido agregado (micelas, ve­
sículas o lipoproteínas comosustratos - Cap.VII). En efecto,
los resultados del análisis cinético comparadode crotoxina B
y complejo crotoxina empleando dihexanoil lecitina comosus­
trato indica que la única diferencia observable es la veloci­
dad de hidrólisis en 1a región de alta concentración de mice­
las, resultando unas diez veces mayor con crotoxina B pura
(Cap.V) que con complejo crotoxina (Cap.VII), lo que ha sido
indicado también por Breithaupt (1976a).
Los estudios de velocidad de hidrólisis de vesículas de dimi­
ristoil lecitina con crotoxina B (Cap.V)y complejos crotoxi­
na (Cap.VII) muestran también una velocidad de reacción mayor
con crotoxina B que con el complejo crotoxina. Además, la vg
locidad de hidrólisis con crotoxina B pura es una función com
pleja de la temperatura. Comose muestra en la Fig.Vc6(Cap.
V), la velocidad aumenta la forma significativa cerca de la
temperatura de transición (Tc) resultando en una discontinui­
dad caracteristica. Este efecto no es debido a la acción de
la temperatura sobre la enzima sino a cambios termotrópicos
en el estado físico del fosfolïpido. Esta propiedad de la
crotoxina B, que comparte con otras fosfolipasas neurotóxicas
 246

(Strong y col.,l977) y no neurotoxicas (Kensil y Demás,1979),

demuestra que la velocidad de hidrólisis es fuertemente modulg
da por el estado fisico del fosfolipido, en forma similar a lo
que sucede con las enzimas asociadas a membranas (Sandermann,
1979), lo que sugiere una fuerte interacción de la enzima con
la interfase fosfolipido-agua. Por el contrario, el complejo
crotoxina se observa un incremento suave y monotónico de la ve
locidad de hidrólisis con la temperatura (Fig.VII-8) sin dis­
continuidades a la temperatura de transición del fosfolipido.
Finalmente, los estudios de ligadura directa a micelas mixtas
de D-didecanoil lecitina y miristoil lisolecitina muestran que,
en contraste con la crotoxina B (Fig.V-B), el complejo crotoxi
na parece incapaz de interactuar con estas micelas (Fig.VII-ll)
a pesar de la libre accesibilidad del sitio activo de la enzi­
y

ma (Cap.VII).
En consecuencia, puede postularsecflm lainteraCción con inter­
ses fosfolipido-agua depende de la presencia de una región es­
pecïfica independiente del sitio activo, expuesta en la croto­
xina B y oculta o enmascarada en el complejo crotoxina (CapAHI).
Prueba adicional de la existencia de esta región especifica en
la crotoxina B surge: (a) El estudio comparativo del efecto
del pH sobre la hidrólisis por crotoxina B de lecitinas monomÉ
ricas (Cap.V)y vesículas de dimiristoil lecitina. La repre­
sentación gráfica de velocidad de hidrólisis en función del
pH indica la existencia de un sólo pK crítico para la hidróli­
sis que podria corresponder a la deprotonación del residuo de
histidina del sitio activo (Fig.V-S). En cambio, la represen­
tación gráfica de velocidad de hidrólisis de vesículas (PC
14:0) en función del pH muestra la presencia de dos valores de
 247

pKcríticos: uno que probablemente representa la histidina del

sitio activo y un segundo pK (pH 8.8) que no corresponde a re­
siduos del sitio activo, ya que no se observa en la hidrólisis
de monómeros (Fig.V-7). Este segundo pK no se observa en la
representación gráfica de velocidad de hidrólisis en función
del pH con el complejo crotoxina (Fig.VII-8 y 9) y puede admi­
tirse que representa la ionización de algún grupo que gobierna
la conformación de la región responsable de la interacción con
interfases. Así, si se realiza un experimento de ligadura di­
recta de crotoxina B a micelas a pH 10.0 (por encima de ese
pK) no se observa ligadura de esa enzima a las micelas (Fig.V—
9), si bien la velocidad de hidrólisis de monómeros(Fig.V-5)
no es afectada a ese valor de pH. En otras palabras, la cro­
toxina B a pH 10,0 presentaría propiedades similares a las del
complejo crotoxina: es activa sobre monómerospero no es capaz
de ligarse a interfases fosfoleido-agua.
(b) Existen evidencias experimentales que demuestran que la
crotoxina inactivada con bromuro de p-bromofenacilo es capaz
de formar un complejo estable con crotoxina A y puede ligarse
a membranas (Jeng y Fraenkel-Conrat,1978).
El conjunto de evidencias indica en forma coherente que la
región específica responsable de la ligadura a interfases es
funcional y topográficamente distinta del sitio activo, ya que
pueden ser modificadas en forma diferencial.(PropueSta III)­
Por otra parte existe evidencia experimental que sugiere que
esa región especifica se encontraría ubicada en el área de in­
teracción entre las subunidades A y Bu En efecto, sólo se ob­
serva inhibición de la actividad fosfolipásica de la crotoxina
B por crotoxina a en el complejo preformado (Cap.VII), pero no
 248

se observa si se adiilona CAa una mezcla de CB vesículas (C5

pít.VI). El complejo crotoxina A - crotoxina B es incapaz de
ligarse a interfases (Fig.VII-10) y la crotoxina B ligada a in
terfases es incapaz de formar el complejo con crotoxina A (Cap.
VI), lo que indica que la interacción de la crotoxina B con in
terfases y la formación de complejos con crotoxina A son procg
sos mutuamenteexcluyentes. Esto es explicable admitiendo que
la región específica responsable de la interacción con interfa
ses debe encontrarse en (o estar parcialmente superpuesta con)
el área de contacto entre las subunidades. En conclusión, la
inhibición de la actividad fosfolipásica de la crotoxina B en
el complejo crotoxina se debería al enmascaramiento de esta re
gión y no del sitio activo. El resultado es que la crotoxina
B será incapaz de ligarse a interfases, que es condición nece­
saria para que se observe la "activación interfacial" (Fig.V-l)
caracteristica de la enzimalipolítica. Por el contrario, el
complejo crotoxina podria ligar monómerosen el sitio activo
por colisión con los agregados, pero al ser incapaz de anclar­
se a la interfase, la abandonarïa y el monómerosería hidroli­
zado a una velocidad mucho menor, (Propuesta IV).
Comoconsecuencia, el papel de "acompañante" o "guardián" atri
buido a la crotoxina A, debe ser reinterpretado. La crotoxina
A funcionaría como tal ocluyendo o enmascarando esa región de
la crotoxina B responsable de la ligadura a interfases y no el
sitio activo. Comoconsecuencia, el complejo crotoxina puede
pasar frente a numerosas interfases sin anclarse a las mismas.
Esta propiedad haría de la crotoxina A un acompañante signifi­
cativamente más eficiente que si sólo ocluyera al sitio activo
de la enzima, pudiendo ésta absorberse a diversas interfases
 (Cap.IV).
Existen numerosas evidencias experimentales que indican que pa
ra ejercer su acción tóxica el complejo crotoxina debe diso­
ciarse(Jeng,Hendon y Fraenkel-Conrat,1978)Jukmás la formación de
un complejo crotoxina unido en forma covalente por un reactivo
bifuncional (dimetil suberiamidato) determina la pérdida com­
pleta de su toxicidad, si bien la actividad fosfolipásica so­
bre lipoproteínas es similar a la del complejo nativo (Hendon
y Tu,l980).
Esta conclusión es absolutamente coherente con el modelo pro­
puesto, ya que como se ha indicado la formación de un comple­
jo crotoxina B interfase y con crotoxina A son procesos mutua
mente excluyentes. En consecuencia, si la crotoxina B se li­
ga a interfases la crotoxina A debe disociarse. La irreversi
bilidad del proceso de ligadura de la subunidad B a interfa­
ses determina la imposibilidad de revestirlo por la adición
de crotoxina A a través de la reformación del complejo croto­
xina.
Si la energía libre de interacción crotoxina B —interfase es
del mismo orden o más negativa que el AG°de formación del com
plejo, la crotoxina B será dificilmente desplazada de su inter
acción con la interfase por el lavado (Ver Cap-III, Fig.III-6)
La interpretación presentada es coherente con observaciones de
otros autores. En efecto, comose ha indicado (Cap. VI) la li
gadura de crotoxina B a interfases no depende de la presencia
de iones Ca2+. En preparación neuromuscular aislada (Chang y
Lee,1977) como en electroplacas de torpedo (Bon,1982) , se ha
indicado que la interacción de la toxina con la membranaestá
caracterizada por un bloqueo transiente de la liberación de
neurotransmisor y dependiente de la dosis e independiente de
la presencia de Ca2+ (Mebs,1980)previo a la parálisis irrever
sible. Una observación similar ha sido indicada en B-bungaro­
toxina (Strong y col.,1976) otra fosfolipasa A2 neurotóxica
que actúa a nivel presináptico.
Por otra parte, Williams y col.(1983) han demostrado que la a­
dición de crotoxina en ausencia de Ca2+ es capaz de inhibir
parcialmente la ligadura de toxina botulínica de tipo A a si­
naptosomas de cerebro de rata.
La disociación del complejo crotoxina es requisito previo para
su acción tóxica tanto para el modelo convencional, que supone
que la crotoxina A ocluye el sitio activo de la crotoxina B c9
mo para el modelo propuesto, que admite que la crotoxina A o­
cluye una región específica de la crotoxina B, responsable de
la interacción con interfases.
Para justificar la disociación del complejocrotoxina a nivel
de la membranapresináptica y, al mismotiempo explicar la es­
pecificidad de blanco del complejo crotoxina, el modelo conven
cional plantea la necesidad de proponer la existencia de "si­
tios de alta afinidad", que compitieran eficientemente con crg
toxina A por la ligadura de crotoxina B (Habermanny Breithaupt
1978) o de receptores específicos (Mebs,1980) para una de las
dos subunidades , tales que la ligadura al receptor resultara
en la disociación del complejo a nivel de la membranapresináp
tica. Esta hipótesis se reforzó notablemente por la demostra­
ción de que si se mezclan toxina botulínica con B-bungarotoxi­
na (una neurotoxina presináptica con actividad de fosfolipasa
A2) el tiempo requerido para producir la parálisis de la unión
 251

neuromuscular era mayor que los tiempos requeridos por estas

toxinas empleadas por separado. De esto se concluyó que ambas
toxinas competían por el mismo receptor. Sin embargo, traba­
jos recientes (Williams y col.,1983) demuestran en forma con­
*cluyente que la ligadura de toxina botulínica A radioligada
es inhibida por varias neurotoxinas presinápticas pero comorg
sultado de la actividad fosfolipásica de estas últimas y no
por efecto competitivo sobre un receptor específico. Además,
estos autores demuestran que una vez que la toxina botulínica
se liga a la membranano puede ser desplazada por s-bungaroto­
xina, por lo que difícilmente se trate del mismo"receptor".
Igualmente, el tratamiento previo de sinoptosomas con neuroto­
xinas presinápticas en las que se ha inhibido la actividad fos
folipásica, no impiden la ligadura de toxina botulínica radio­
ligada.
Por otra parte, los experimentos de Chang y Lee (1980) estudian
do el efecto de mezclas de neurotoxinas presinápticas sobre pre
paración neuromuscular aislada, no permiten demostrar la inhi­
bición mutua que debería esperarse si tuvieran un receptor
común. Por el contrario, llegan a la conclusión de que cada
fosfolipasa A2 neurotóxica debería tener un receptor específi­
co distinto. Pero debe notarse que se obtendría un resultado
similar si se supone que tales receptores no existen.
Las condiciones necesarias para postular la presencia de "si­
tios específicos" o "receptores" para un ligando son: (a) la
ligadura debe ser saturable; (b) si el ligando forma un complg
jo no covalente con el receptor, con una constante de disocia­
ción definida, debe ser disociado de su unión con el receptor
por el lavado; (c) empleando ligando marcado, éste debe ser
 252

desplazado de su cOmplejo con el receptor en presencia de un

exceso de ligando no marcado, con una curva de desplazamiento
caracteristica. Sin embargo, ninguna de estas propiedades han
podido ser demostradas para las subunidades del complejo crotg
xina. Por el contrario, experimentos efectuados con sistemas
modelo (Jeng y col.,l978) indican que la ligadura de crotoxina
B pura o en presencia de crotoxina A no es saturable y que.una
vez que la crotoxina B marcada se liga a maembranas no es des­
plazada por un exceso de crotoxina B nativa. La ligadura de
crotoxina B pura a electroplacas de Torpedo no es saturable
(Bony col.,1979), pero la subunidad A limita la ligadura ha­
ciéndola aparecer comosaturable. A pesar de ello,ni la-crotg
xina A se liga y ni la crotoxina B no puede ser separada del
sitio de ligadura por lavado.
La posibilidad de que existiera un receptor para la subunidad
A del complejo crotoxina puede ser descartada ya que,en prin­
cipio, no se ha observado ligadura de crotoxina A a terminales
colinérgicas (Chang y Su,1981; Harvey y Karlsson,1982). Ade­
más, la adición previa de crotoxina A no modifica la acción de
la crotoxina B pura ni del complejo nativo (Habermanny Breit­
haupt,l978; Hawgoody Santana de Sa,l979)
Finalmente, la hipótesis del receptor presináptico tampocopue
de explicar la aparición de miotoxicidad cuando se emplea en
dosis elevadas de crotoxina, ya que implicaría la existencia
de tal receptor también en la región postsináptica.
En conclusión, si bien la existencia de un "receptor" o "sitic
de alta afinidad" no puede ser descartada "a priori", la evi­
dencia experimental presentada no apoya esta hipótesis sino
más bien la hace cuestionable. Por otro lado, los experimen­
 253

tos realizados "in vitro" (Canziani,1984) han demostrado que

la acetilcolina es un agente desestabilizante del complejo crg
toxina, que además de ser efectivo, puede contribuir para "de­
terminar" el blanco de la crotoxina B. Los resultados obteni­
dos con preparaciones aisladas y la fisiología de la unión neu
romuscular apoyan la extrapolación de los resultados obtenidos
"in vitro" a los efectos observados "in vivo" (Cap.VIII). La
propuesta es adherente con los siguientes puntos: (1) la con­
centración de acetilcolina en el espacio sináptico'de la termi
nal en reposo ha sido estimada en el orden de 10- 8 M (Katz y
Miledi,l973), mientras que la concentración en el espacio si­
náptico de la terminal estimulada es de 3 x 10­ 4M (Kuffler y
Yoshikami, 1977). La concentración basal de acetilcolina se­
ria suficiente, de acuerdo a nuestros resultados (Cap.VIII y
Canziani y col.,1984), para ligar alguna molécula de crotoxina
B, la que por su acción sobre la membranapresináptica (Cap.
III) favorecerïa la liberación de acetilcolina por encima de
la concentración basal. Esto favorecerïa a su vez la disocia­
ción de más moléculas de crotoxina lo que provocaría un fenóme
no en cascada, autoacelerado. En este sentido, (2) el bloqueo
de la terminal va a depender directamente de la cantidad de
neurotransmisor liberado hasta que, comoresultado de la acti­
vidad fosfolipasa A2 sobre los lípidos de la membrana, la fun­
ción presináptica resulte incontrolable por los mecanismosprg
pios de la terminal nerviosa. Asi lo demuestran los efectos
observados en preparaciones aisladas: (a) el aumento de 1a frg
cuencia de estímulo del nervio ciátiooparecefavorecer el blo­
queo de la transmisión sináptica (Changy col.,1977 - Cap.III),
(b) concentraciones altas de Mg2+ (18 mM)y de bajo Ca2+ (0,5
mM)retardan el efecto tóxico de manera importante. Contraria
mente el argumento corrientemente empleado para explicar este
efecto, los iones Mg2+no inhiben competitivamente la activi­
dad fosfolipasa A2 de la crotoxina B (Ver Cap.IV; Breithaupt,
1976(a)), pero si inhiben la liberación de acetilcolina (Katz
y Miledi,1977) ; (c) la adición de toxinas de Dendroaspis
Ep (mambas) como 1a toxina K e I, o la dendrotoxina, más cono­
cida, que al igual que las aminopiridinas provocan un aumento
en la liberación evocada de acetilcolina, favorecen el blocueo
de la transmisión sináptica por crotoxina (Changy Su ,1980;
Harvey y Karlsson,1982). Por otro lado, la especificidad de
blanco que proporcionaria la acetilcolina comoagente desesta­
bilizador de complejo crotoxina está apoyada por los siguien­
tes argumentos, a saber: (l) existe un gradiente transciente
de concentración de acetilcolina entre el sitio de liberación
y las membranaspostsináptica y presináptica alejada de dicho
sitio (Katz y Miledi,1973), lo que favoreceria la disociación
del complejo en la vecindad de la membranapresináptica y la
ligadura de la CBen las inmediaciones de los sitios de libera
ción (ver Cap.III), (2) una vez ligada a interfases, la croto­
xina B no puede ser desplazada por crotoxina A (Canziani y coL
1983 - Cap.VI). Esta condición puede modificar considerable­
mente los grados de disociación calculados en condiciones de
equilibrio (Weber,1965) por lo que muy bajas concentraciones
de acetilcolina (lO-BM)pueden llegar a disociar el complejo
eficientemente, (c) el efecto miotóxico se observa únicamente
a muyaltas concentraciones de toxina, equivalentes a dosis
 255

neurotóxicas de crotoxina B pura, lo que aumentaría la proba­

bilidad de que la crotoxina B disociada del complejo se ligue
a la placa muscular, (Propuesta V).
En su filosofia científica, Newtonsostenía que el valor de
cada hipótesis se decide enteramente por comparación de sus
consecuencias con los hechos (Principia, 1668). El modelo
propuesto para el mecanismode acción del complejo crotoxina
no presenta, hasta el momento,objeciones experimentales y no
se han observado hechos contradictorios. Las evidencias expg
rimentales provenientes de distintas lineas de investigación
constituyen un fuerte apoyo en favor del modelo propuesto,que
permite la interpretación coherente aún de resultados aparen­
temente contradictorios. Por el contrario, el modeloclásico
parte de la suposición de que el sitio activo de la crotoxina
B está ocluido en el complejo crotoxina, lo que es inexacto y
requiere la existencia de "sitios especificos", fijos en la
membranapresináptica, proposición que es discutible a la luz
de los resultados publicados.
El presentado es un modelo mínimo para explicar el mecanismo
de acción tóxica de la crotoxina, ya que no requiere suposi­
ciones "a priori" o la postulación de entidades no demostra­
bles. La información requerida para determinar la especifici
dad del blanco está contenida en las propiedades fisicoquimi
cas de las dos subunidades A y B y su acción se pone de mani
fiesto en aquellos sitios cuyo entorno presenta las condicio­
nes adecuadas para provocar la disociación del complejo: la
placa terminal colinérgica.
La confección de un modelo como el propuesto, que permite ex­
 256

Plicar las propiedades conocidas o demostrables del complejo

crotoxina, basado únicamente en consideraciones experimenta­
les comprobablesha sido el objeto del presente trabajo.
"En nueótno empeño de concebin ¿a neai¿dad,no¿ panecemo¿ a
un ¿aiuaje que tnata de deácubnin ei mecahiómo ¿nuLóLbZe de
un nekoj, dei cual ue el mouLmiento de ¿aó agujaó, oye el
tic-tac, pena no Le eó po¿¿bie abnin La caja que lo contie­
ne. Si ¿e ¿nata de una penóana ¿ngen¿o¿a e inteligente, po­
dná imaginan y aún ¿onmuian un modelo que ¿ea capaz de ¿enho­
duc¿n Lo¿ e6ecto¿ obóenuadoA, pena nunca eótaaá ¿eguno de
que ¿u modeio ¿ea ei ún¿co que 206 puede explican g, mucho
meno¿, de que haya conótnuído nealmente un neioj".

A. E¿n¿te¿n y L. Ináeld
La Fíóiea, aventuna dei penóamienzo
"En nueótno empeño de conceb¿n ¿a nea€idad,no¿ panecemOA a
un ¿aiuaje que Inata de deócubnin ei mecab¿¿mo¿nvióibie de
un neioj, dei cua e ei movimiento de Laó agujaó, oye el
tic-tac, pena no ¿e ¿A peóibie abnia ¿a caja que lo contie­
ne. Si ¿e Inata de una penóona ¿ngen¿o¿a e ¿ntei¿gente, p0­
dná ¿magánan y aún ¿onmulan un modelo que ¿ea capaz de nenho­
duc¿n ¿OA eáecto¿ abóenvadOA, pena nunca eátaaá ¿eguno de
que ¿a modelo ¿ea el único que 205 puede explican'y, mucho
men04, de que haya con¿znu¿do neaimenze un neioj".

A. E¿nóte¿n y L. Infieid

La Fiááca, auentuna de¿ penóamáento

 257

ABREVIATURAS

CA crotoxina A
CA-CB complejo crotoxina
CB crotoxina B
c.m.c. concentración micelar crítica
DSS dodecil sulfato de sodio (SDS)
P fósforo elemental
PA2 fosfolipasa A2
pBPB bromuro de p-bromofenacilo
PC fosfatidilcolinas*
-P.P.T. potenciación post tetánica
(*)NOTASOBRENOMÉFCLATURA:
Las distintas clases de fosfoli­
pidos serán denominadas según la nomenclatura aprobadas
por la IUPAC-IUB(1967) basada en el sistema de numeración
estereoespecïfica (Hirschmann,l960)que establece: "Si el
glicerol se escribe según la proyección de Fischer con el
grupo OHdel carbono secundario hacia la izquierda (serie
L-), el átomo de carbono que queda hacia arriba se denomi­
na carbono 1. Para diferenciar esta numeración de la con­
vencional, deberá escribirse "sn" (por"stere05pecifically
numbered") delante del término glicerol, Separados por un
guión, de manera que una lecitina natural (serie L) debe
denominarse1,2-diacil-sE-glicero-l—fosforilcolina".
Los nombrestriviales, lecitinas,fosfotidiletanolaminas,
etc., pueden emplearse sólo comotérminos genéricos, cuan­
do ello resulte conveniente.
 APENDI CES.

"El defiecto de todaó Lam obnaó

u el de ¿en demaóiado Langa".
Vauvenanqueó
RéálexionA
 APENDICE A

Agregación de los fosfolípidos

Las lecitinas de cadena corta en medio acuoso forman solucio­

nes moleculares (monoméricas) en un rango de concentraciones
muyestrecho. El limite superior está determinado por la au­
toagregación del fosfolipido, dependiente de la concentración,
que se hace evidente por encima de la llamada "concentración
micelar critica" (c.m.c.). Esta se determina midiendoel va­
lor de una propiedad física (p.ej., presión osmótica, tensión
superficial, conductividad, etc.) en función de la concentra­
ción del fosfolípido y se toma comoc.m.c. al valor de concen
tración en el que las pendientes extrapoladas de la propie­
dad física empleada en el rango de concentración correspon­
diente a la solución monoméricay en la región de solución mi
celar se intersectan (Fig.A-1). Sin embargoes inexacto con­
siderar que existe una única concentración micelar crítica
(Tanford,1980). En efecto, la transición en las propiedades
fisicas (desde las que presenta la solución predominantemente
monoméricahasta las que presenta la solución micelar) ocurre
gradualmente dentro de cierto intervalo de concentración, ya
que la formación de micelas es un fenómeno progresivo, depen­
diente de la concentración y no una separación de fases (Fig.
A-l). En la concentración micelar critica, entre el 3 y el
5%del total del fosfolïpido se encuentra agregado en micelas.
De todas maneras, si el número de agregación promedio (ñ, nú­
mero de monómerospor micela) es suficientemente grande (p.ej.
m> 50), la transición en las propiedades fisicas de la solu­
ción ocurre en un rango de concentración muy estrecho, aseme­
jándose a una separación de fases.

JCCM..­
E/
. A Deteencia
Cambiode densidad
I

l Z

Cauductiyidad

T 'n superficie!
Presion osmótica

Conductividad
ewwmmm

l .
'Tension interfach
.I ’ v
l
o O O
Física
Propiedad
cada
de
Medida
Unidades
de l

n a En 1 l I ¡ l J

0 (12 0.4 0.5 0.a

Dodecilsulfatode-sodlo (g/100q)

Fíg.A-1: Variación de las propiedades físicas de una solución de molécg

las anfipátícas (DSS) en función de la concentración.

El factor determinante de la formación de micelas es el cam­

bio de energía libre de Gibbs asociado a la remoción de las
cadenas apolares del medio acuoso y el cambio de energía li­
bre total está moduladopor dos contribuciones opuestas, a sa
ber: (a) la tendencia al acercamiento de las cabezas polares
con la consiguiente reducción del área de interfase "aceite­
agua" y (b) las interacciones de repulsión entre las cabezas
'polares, que tienden a aumentar la separación entre ellas
(Allgyer y Wells,1979). Existirá un cierto valor del área de
interfase por molécula (área óptima = ao) para la cual esas
dos contribuciones a la energia libre total del sistema esta­
rán balanceadas y la energía libre por molécula será minima.

Termodinámica de la agregación: La termodinámica de equili­

brio requiere que el potencial quimico de todas las moléculas
en un sistema de estructuras agregadas (micelas) en equili­
brio con moléculas solubles (monómeros) debe ser el mismo. EE
to puede expresarse como:

ug + ln = constante (m= 1,2,3,...) (A-l)

m al: aula’u‘

donde xa es la fracción molar de moléculas incorporadas en mi

celas con un número de agregación ñ, y? es la energia libre
por molécula en la micela, k es la congtante de Boltzmann y
T es la temperatura absoluta (ñ = l corresponde a moléculas
aisladas o monómerosen solución).
Si se toma como estado de referencia la solución de monómero,
es

xa = m . le . exp (-ñ AGS/

m
RT) (A-Z)

donde x1 es la fracción'molar de monómeroAGS es la energía

de transferencna m
libre estándarAdeunmonómero a una micela con un número de a­
gregación promedio m. En ausencia de otras contribuciones,
los agregados con menor número de agregación están favoreci­
dos entrópicamente.
Energias de interacción: Respecto de la magnitud de las con­
tribuciones a la energia libre de Gibbs del sistema, puede de
cirse:
(a) La contribución atractiva puede representarse por una e­
nergía libre de Gibbs por unidad de área (tensión interfa
cial) y = 5 x 10-2 J.m-2, caracteristica de una interfase
aceite-agua. Entonces, la contribución "hidrofóbica" al
valor de uf será 1.a, donde a es el área por molécula me
dida a nivzl de la interfase.

(b) Las interacciones repulsivas son más difíciles de formu­

lar explicitamente, ya que dependende la naturaleza qui­
mica de la cabeza polar. Adoptaremos una expresión de la
forma C/a, donde C.es una constante que agrupa todas las
interacciones repulsivas, característica de cada amfïpata
y a es el área por molécula medida a nivel de las cabezas
polares.

La energía libre de Gibbs por molécula será

y; = y.a + C/a (A-3)

y se hace minima cuando

6a = y - C/a2 = 0 a = ao = szï (A-4)

O
d m n ra ue .
e a e q um(mínimo) = Zyao, donde ao (área óptima) es el
área a la cual la energia libre por molécula es mínima.
'En consecuencia, la energía libre por molécula puede expre­
sarse como2

u; = 2aoy + —g (a - a°)2 (A-S)

La ecuación (A-5) muestra que el valor de}¿2 tiene una va­

riación parabólica (de tipo elástico) alredZdor de un minimo.
De manera que si un anfipata puede agregarse dando lugar a
diversas estructuras en las que el área por molécula sea a =
aol la entropía favorecerá la estructura que tenga un número
de agregación más bajo (ver más arriba).

Formay tamaño de las micelas. Restricciones geométricas:

Las micelas contienen un centro apolar en estado "liquido",
en el cual se encuentran los metilos y la mayoria de los me­
tilenos (ver más adelante). El volúmende la región apolar
es predecible a partir de los datos de Reiss-Husson y Luzza­
ti (1964). En efecto, por encima de la temperatura de tran­
sición, es

vh = (27.4 + 26.9 . nc) 33 (A-G)

Comono puede haber espacios vacios dentro de 1a micela, al

menos una de las dimensiones está siempre limitada por la
longitud de cadena. Esta distancia 1 se obtiene multiplican
do el número de metilenos (nc) por la distancia entre átomos
de carbono de una cadena extendida (1.265 Á) más el radio de
van der Waals del metilo terminal (2.1 Á ) y la mitad de la
distancia del primer metileno no contenido en el centro hi­
 o
drofóbico ( 0.6 A). De modo que la longitud máXÏma (¿maxen
A) para una cadena apolar es:

lmax = (1.5 + 1.265 . nc) A (A-7)

(a) Micelas globulares: El radio R de la región apolar en u­

na micela esférica no puede ser mayor que l max , de modo
que el número máximo de monómeros por micela queda deter
minadopor las restricciones geométricas (Figura A-2).
En efecto, si vh es el volumen de 1a región apolar (Ecua
ción A-6) y a es el área por molécula a nivel de la in­
terfase,-estos valores pueden relacionarse con el número
de agregación m por la ecuación:

3 _ _ 2
4HR /3 vh — m — 4nR /a (A-8)

donde R = ïnmx. En consecuencia, vh/a = Vlmax/3.

Si el número de agregación.fuera mayor, la forma de la
micela deberá modificarse. La posibilidad más simple es
la formación de elipsoides de revolución con el semieje
menor = lmax, siendo más probables los elipsoides obla­
dos que los prolados. Cambios muy pequeños en la rela­
ción axial (a/b) resultan en incrementos significativos
en el número de agregación compatible. La formación de
elipsoides a partir de esferas determina un aumentodel
área de interfase, pero un incremento muchomayor del v9
lumen de la región apolar. Comoconsecuencia, el área
por molécula debe ser menor que en una micela esférica
 (Figura A-2). Resulta pues que micelas esféricas y elip
soidales representan una familia en la cual el aumento
progresivo del número de agregación ocurre con una dismi
nución del área por molécula.

MICELAS I I _3
c.m.c. = Concentracmn del monomeroN10 M

55'55“ °b‘°"° Amado premicelanua)

N6 5
MERCANGIO _

' ÑWUO
amoo
Y Miceoa
,
cïn'ndnca
¡r
interiOri'qudo‘ É Momntro U '‘

(1 MÍcelaestén'ca '
JS, :1; ¡c

la... \
o R=lSlc ‘J’
20A
l___l v‘%a WO

Fig.A-2: Esquemade la agregación de anfífilos según el parámetro geg

métrico (adimensional) P = Vfl/ao<1 en micelas esféricas
(P < 1/3); globulares (elipsoides de revolución 1/3 <P < 1/2)
y cilíndricas (P = 1/2). La transición de micelas globulares
a cilíndricas puede ocurrir por disminución de ao (p.ej. de­
bido a la adición de sales neutras).

Cualquier sistema que forme micelas globulares debe pre-.

sentar una distribución de tamaños (y en consecuencia,
de formas) de modo que el valor promedio del área por m9
lécula esté alrededor del valor óptimo ao.
Debe mencionarse que si bien los valores experimentales
de los números de agregación promedio en peso (mw) y prg
medio en número (fin) para la mayoría de los sistemas que
 formanmicelas globulares son similares, esto no requie­
re una distribución de tamaños demasiado estrecha. Así,
la desviación estándar de una distribución de Gauss pue­
de ser tan grande como5/4 sin producir diferencias sig­
nificativas con los valores determinados experimentalmen
te. Sin embargo, los sistemas que contienen micelas con
números de agregación muyelevados, suelen presentar una
función de distribución mpyamplia, con ñw significativa
mente mayor que mn (Tanford,1973), probablemente debido
a la aparición de micelas cilindricas.

(b) Micelas cilindricas: Las micelas cilindricas pueden pre

sentar números de agregación muyelevados, ya que la úni
ca restricción es termodinámica y no geométrica. Para g
sas estructuras puede despreciarse el efecto de los ex­
tremos y se obtiene comoresultado que el área por molé­
cula, muchomenor que en las micelas esféricas, es inde­
pendiente del número de agregación.
La relación entre el volumen vh y el área por molécula a
nivel de la interfase (a) es:

HR2 - L/vh = r'n = ZHR . L/a (A-9)

donde R = 1 max y L — longitud del cilindro. En consecuen

cia es vh/ a = lmax/2.

Teniendo en cuenta que los monómerosen la micela se encuen­

tran en equilibrio rápido con los monómerosen solución, es
necesario que la molécula difunda en dirección perpendicular
a la superficie, tanto hacia el interior de la micela como
fuera de ella. Esto significa que la superficie micelar es
muydinámica con frecuentes y significativas protrusiones de
los monómerosfuera del dominio apolar, determinadas por el
balance de la energia libre de Gibbs debida a interacciones
apolares (del orden de kT por grupo CH2expuesto) y la ener­
gía potencial debido a la carga de la región polar.
La escala de tiempo en la cual se producen esas protrusiones
puede ser calculada por el método de Smoluchowski (Aniansson,
1978) suponiendo que J monómeros se adicionan por unidad de
tiempo a x = 0 y se separan cuando alcanzan x = p (Figura
A=3). En el estado estacionario es (t) = n/J, donde n es el
número de monómeros entre x = 0 y x = p.
La ecuación de flujo adecuada es:

J = -D d—°- D/kT d—V. c (A-lO)

dx dx

donde D es la constante de difusión (5 x 10- 6 cm2.seg- 1 ,

Aniansson,1978); c(x) es el número de monómeros que se en­
cuentran a una distancia x del dominio apolar y V(x) es la
energia libre debido al potencial. Si no hay efectos de car
ga, la solución analítica es simple, ya que (l/kT)(dV/dx) se
rá la inversa de la longitud dl de un CH2proyectado hacia
la fase acuosa y se obtiene

(t) = dÏ/D [exp (p/d1)- 1 -(p/d1)1 (A-11)

Si p << dI, la ecuación (A-ll) se reduce a (t) = 1/2 pZ/D,

mientras que si p>>dl se obtiene (t) = dÏ/D . ep/dl y t au­
menta exponencialmente con p/dl.
La escala de tiempo se extiende desde el picoseg.(protrusión
de un CHZ)hasta el miliseg. (protrusión de 16 CHZ). Sin em
bargo, el tiempo promedio para retornar al nivel de minima
protrusión, suponiendo que la probabilidad de abandonar la
micela es pequeña, debe ser del orden de los picoseg.
Sobre esas consideraciones, la ecuación de distribución de”
la protrusión en el equilibrio es:

c(p) = c(0) ep/dl (A-12)

De manera que uno de cada tres monómeros protruye por más de

un CH2y uno de cada siete protruye por más de 2 CH2, etc.
La"protrusión promedio" seria de l CHZ.
Este efecto es importante cuando el monómerodebe reaccionar
con un reactivo que no penetra la región apolar (o una enzi­
ma incapaz de anclarse a la interfase). El monómerono debe
necesariamente abandonar la micela para que la reacción ocu­
rra, sino que basta una protrusión suficiente del mismopara
que quede expuesto al medio. Esto sucede con mucha mayor frg
cuencia que la disociación completa del monómero.
La protrusión de monómeroscon elevada frecuencia y gradovafiaMe
desde el dominio apolar tiene consecuencias interesantes, a
saber: (a) los monómerosque protruyen disminuyen el volumen
del dominio apolar, de modo que los que no lo hacen, con ca­
denas más extendidas pueden alcanzar la parte central del dg
minio apolar con un aumento del desorden y un incremento de
la entropía por monómerodel orden de k. La disminución de
la energia libre será del orden de kT, esto es, igual a la
energía de interacción apolar que limita la protrusión. De
este modo, el incremento de entropía probablemente amplifique
el fenómeno; (b) la protrusión de monómerosresulta en un ig
cremento del tamaño efectivo de las micelas y (c) este fenó­
meno, resultante del carácter dinámico de la superficie micg
lar determina que ésta presente un aspecto fuertemente ondu­
lado.

.g x:Pr 5

a dtm Ï
g MEDIO ACUOSO Ï
Il
>< Xzo _. INTERFASL

d En DOMINIOAPDLAR

1d1=longitud de un [HZ

Fig.A-3: Representación esquemática del estado estacionario cuando se

adicionan monómeros en la unidad de tiempo (x=0) y se sepa­
ran cuando (x=P). Explicación en el texto.
‘Vesículas: Las lecitinas de cadena larga (14 C o superiores)
forman espontáneamente en medio acuoso vesículas multilaming
res de gran tamaño, que resultan en dispersiones groseras en
las que el tamaño de los agregados es del orden de 108(Robin
son,l960,Bangham,l963). Si estas dispersiones groseras se
someten a irradiación ultrasónica, 1a suspensión resulta lím
pida y transparente, constituida fundamentalmentepor vesïcu
las unilaminares (Figura A-4), homogéneasque para lecitina
de yema de huevo tienen un radio de alrededor de 115 A y un
peso molecular de 2 x 106 (Huang y Thompson,1974). Las con­
centraciones micelares críticas para estas lecitinas está en
el orden de 10-lo My el monómeroen las vesículas se inter­
cambia lentamente con el monómerosoluble (Israelachvili y
col.,1976).
En efecto, los anfípatas con dos cadenas parafínicas no pue­
den formar micelas, si bien el área óptima ao es similar a
la de los análogos con una sola cadena. Esta consecuencia
resulta del hecho de que las cadenas deben encontrarse en es
tado fluido. En efecto, el valor de la tensión interfacial
(y, ecuación A-3) es independiente del número de cadenas apg
lares y si las cadenas están en estado "líquido", el coefi­
ciente C (ecuación A-3) debe permanecer constante. Si tanto
y como C permanecen constantes, las ecuaciones (A-3) y (A-4)
requieren que a = ao.
Sin embargo, suponiendo que las dos cadenas apolares son i­
dénticas, la relación Vh/a ha aumentado al doble y si la log
gitud de cadena es la misma, las restricciones geométricas
establecidas por las ecuaciones (A-8) y (A-9), no podrán ser
cumplimentadas.
Para una vesícula esférica de radio exterior R (Figura A-4),
la ecuación de "empaquetamiento geométrico" para las molécu­
las de la monocapa externa es

v g k
—h*—=-1c(1-¿+g‘—ï)
a R 3R
(A-13)

De modoque el el anfípata tuviera dos cadenas de 12 carbonos

(vh = 700 ¿3, 1C: 15 Á) y a = ao = 60 Áz, puede empaquetarse
en vesículas con un radio externo R = 62 Á. Esta estructura
tendrá el menor númerode agregación posible; la energía li­
bre por molécula será mínima (a = ao) y al mismo tiempo satig
fará las restricciones del empaquetamiento.
En conclusión, ciertos anfípatas no pueden empaquetarse en mi
celas porque para hacerlo sería necesaria la longitud de las
cadenas mayor de lo que estas pueden extenderse. Esta longi­
tud denominada "longitud crítica" (ic) es algo menor que la
longitud de la cadena completamente extendida. Reordenando
la ecuación (A-l3) para el radio exterior R de una vesícula
esférica se obtiene:

R: 1 [3 + V3(4 Vh/angc’J-H (A-14)

6[1 - vh/a¿]'
Si el área por molécula a debe ser igual al área óptima ao y
la longitud de la cadena apolar 1 no debe exceder ic, el ra­
dio R no puede ser menor que cierto valor, "radio crítico"
(Rc) dado por la ecuación (A-14) cuando a = ao y 1 = lc.
 VES/CULAS .I I ‘Ü
c.mc: Concentrauon de monomero-io N

Repulsïo'n entre
cabezas polares\

RECAM BlO LENTO

_ i
impuswn
aüm M/”
cadenas

. l
Atraccwfl
¡nterfacíal

Fig.A-4: Representación esquemática de la estructura de la vesícula uni

laminar formada por un anfífilo con dos cadenas apolares. Las
contribuciones repulsivas entre las cabezas polares y entre las
cadenas está balanceada por la atracción apolar que resulte en
una tensión interfacial de 5 x 10‘2 .m' - R representa el ra
dio crítico; Debenotarse que la restricción de empaquetamie;
to está determinada por la monocapaexterior, mientras que la;
moléculas de la monocapainterior se encuentran siempre con un
área = ao.‘ La baja c.m.c. resulta en tiempos de residencia pa
ra los monómeros T = 2-24 hs. ,comparado con micelas en T = 10­
seg. .

Si las vesículas tienen un radio exterior mayor que Rc, no.g

xistirán restricciones de empaquetamientosobre ninguna de
las moléculas, de modoque todas pueden adoptar Su configura
ción de minima energia con a = a0. Cuando RSRCes a = ao pg
ra todas las moléculas.
Debe notarse que las moléculas de la monocapainterior se en
cuentran en un estado de empaquetamiento favorable para cual
quier valor de R; sus cadenas simplemente ocupan el volumen
de la monocapa interna quedando su área a en el valor óptimo
ao. Esto implica que las restricciones de empaquetamientoa­
fectan solamente a las moléculas de la monocapaexterna (Is­
raelachvili y col.,1977).
La protrusión de monómerosen estas estructuras será menor
que en el caso de micelas de anfipatas con una sola cadena,
ya que las dos cadenas están unidas a una sola cabeza polar.
La segunda cadena aumenta la interacción apolar por CH2por
un factor del orden de 2/3 kT, de modoque la energia libre
que debe superarse para la protrusión es 5/3 kT por grupo
CH2. Si éste fuese el único factor capaz de limitar la pro­
trusión, el valor promedio sería 3/5 dl. Sin embargo, el ag
mento del desorden en la región apolar puede disminuir consi
derablemente la energía libre requerida para la protrusión.
Finalmente, de la ecuación (A-13) se obtiene que en el caso
límite R=l (p.ej., una bicapa; plana) es vh/a = l, donde l es
la mitad del espesor de la bicapa. Para bicapas planas no e­
xisten restricciones de empaquetamientopara anfïfilos de una
o dos cadenas parafïnicas. Sin embargo el número de agrega­
ción tendería a infinito y si bien esas estructuras serian
posibles desde el punto de vista geométrico resultan improba­
bles termodinámicamente, ya que entrópicamente están favore­
cidos los agregados con menor número de agregación.
 APENDICE B

Modelosgpara Za formación de Micelas de Dihezanoillecitina

El propósito de este estudio consistió en proponer un modelo

para la micelización del sustrato PC(6:0), que permitiera
predecir adecuadamentelas"anomalias cinéticas" observadas
en las representaciones gráficas de la velocidad inicial de
hidrólisis en función de la concentración del sustrato, tanto
con crotoxina B comocon el complejo crotoxina (ver capitulos
IV y VI).
Tausk y col.(l974)a,b,c) han estudiado exhaustivamente las
propiedades fisicas de PC(6:0), PC(7:0) y PC(8:0). Determina
ron las c.m.c. de estas lecitinas por medidas de tensión su­
perficial de soluciones con concentración de fosfolipido cre­
ciente (Tausk y col.,l974,a); los pesos micelares de PC(6:0)
y PC(7:0) por sedimentación y dispersión de la luz (Tausk y
col.,l974,b) y el peso micelar de PC(8:0) por dispersión de
la luz (Tausk y col,1974,c). Los resultados experimentales
obtenidos se presentan en la Tabla B-l, donde también se pre­
sentan a título comparativo los resultados obtenidos por
Swarbrick y Daruwala (1970) con alquibetaïnas homólogas.
Comose ha indicado previamente, la estructura con menor nú­
mero de agregación capaz de proveer un área por molécula a =
ao seria una esfera de radio igual a la longitud de cadena.
En el caso de anfïfilos de una sola cadena (p.ej.,las alqui­
betaInas), el modelo de micela esférica no admite un área =
 B-Z

ao y se han propuesto otras formas (discoides o torroides),

con la restricción de que la dimensión de uno de los ejes no
debe exceder la longitud de cadena. De este modose obtienen
resultados teóricos que concuerdan en forma satisfactoria con
los datos experimentales para la c.m.c., el númerode agrega­
ción promedio (ñ) y la dependencia de ñ con la concentración.
Los números de agregación ñ observados están distribuidos es­
trechamente alrededor del valor óptimo.

Tabla B-l: Comparaciónde los resultados experimentales obte­

nidos con anfifilos de una y dos cadenas alquíZicas

Anfífilo vh E 1 É -
m
(esfera) m '
(observado)
(¿3) (Á)

PC(6:0) 323.8 7.825 6 34-38

pc(7:0) 377.6 9.09 a 50-200 3
PC(8:0) 43104 10.355 11 600-2500 E
¡Cll-alquilbetaina 323.3 15.415 47 58
Cl3-alquilbetaina 377.1 17.945 64 87
CIS-alquilbetaína 430.9 20.475 83 130

E volumen de la región hidrofóbica calculado según la ecua­

ción (A-6)
longitud de la cadena calculada según la ecuación (A-7)
hblw
fuertemente dependiente de la concentración

El desarrollo de un modelo teórico para la formación de mice­

las de lecitinas de cadena corta presenta varios inconvenien­
tes, a saber (a) el número de agregación es considerablemente
mayor que el calculado para una micela esférica y (b) la dig
tribución de tamaños suele ser heterogénea y esta heteroge­
neidad es dependiente de la longitud de cadena (Tabla B-l).
Por otra parte, las cadenas son demasiado cortas comopara
formar una bicapa estable (Israelachvili y col.,1976).
En nuestro caso estudiamos especialmente las micelas de PC
(6:0), que presentan un número de agregación promedio ñ =
34-38 entre 10 y 50 mM(Tausk y col.,1974,a).
Los resultados obtenidos con los distintos modelos, a saber:
X1(fracción molar de monómeros), Xm(fracción molar de PC(6:0)
en micelas), números de agregación promedio en peso (mw)y
promedio en número (En) y la c.m.c. definida como el valor
de Xl + Xmcuando x; es 5% de x1 se compararon con los resul
tados experimentales de Tausk y col. (1974,a y 1974,b). Los
valores de fracción-molar se transformaron en molaridad em­
pleando el valor de 400 ml/mol para el volumen parcial molar
de PC(6:O)(Tausk y col.,1974,a. Allgyer y Wells,1979). Fi­
nalmente, estos valores se aplicaron a las ecuaciones de ve­
locidad inicial, considerando a todas las especies presentes
comosustratos de la enzima (Ver capitulo‘U­
Los modelos considerados fueron los siguientes:
(l) El modelo de separación de fases supone que m monómeros
M se asocian cooperativamente para formar una micela (mM)
de acuerdo con la ecuación:

mM g (Mm) (B-l)

siendo la ecuación de conservación: (Mt) = M + m(M)­

 El valor de ñ empleado fue 36 y la constante de asocia­
60
ción Km = (XMm)/X(M)mfue tomada igual a 1.35 x 10
(Johnson y col.,1981). Con este modelo se obtienen valg
res de AG° de micelización de -4.51 kcal/mol. y de AH°=

(2) El modelo basado en la ecuación (A-2)(Tanford,l974,a y

1974,b), que requiere el cálculo del valor de AG: en fun
ción de m. Una vez que esta función queda definïda, la
ecuación (A-2) puede ser empleada como función de distri
bución para determinar la cantidad de PC(6:0) incorpora­
da a micelas de distinto tamaño.
El valor de AG: puede subdividirse en dos componentes:
m

AG: = AU: + w_
m m m (B-Z)

donde AU: representa la contribución de la interacción

m
apolar y w_ la de las cabezas polares.
m
La contribución de AU: está dada por la expresión:
m

AU: = A + B . nC + C(AHm - D) (B-3)

Los términos A y B son independientes del tamaño y reprg

sentan las energías libres de transferencia de los meti­
los y de los metilenos, respectivamente, de la fase acug
sa al interior de la micela y nC = 8 es el número de me­
tilenos, de las cadenas apolares.
Los valores de A y B se obtuvieron de 1a representación
gráfica de RT ln x1 a la c.m.c. en función de nc para va
 rias lecitinas homólogas. La ordenada de este gráfico
(RT ln xl para nc= 0) da la contribución de los metilos
(A = -3.478 kcal/mol). En el tercer término de la ecua­
ción (B-3), C representa la energia libre de Gibbs por u
°-2
nidad de área en la interfase (29 cal.mol-l. A ), ABm
es el área por molécula a nivel de la interfase y D es'
O
.\ la porción del área cubierta por la cabeza polar (41 A2,
Taylor y col.,l973).
La contribución de Wase calculó de acuerdo con la expre­
sión:

_ 2
Wa - RT (E/ARm + F/ARm) (B-4)

donde ARm representa el área por molécula a nivel de la

cabeza polar. Los valores de E (1.0) y de F (32143) se
estimaron por ajuste de esta expresión sobre curvas de
(presión interfacial) en función del área de fosfatidil­
colinas en la interfase aceite-agua (Llerenas y Minigins,
1976).
Para aplicar la ecuación (A-2) es necesario calcular los
valores de AHmy ARmen función del tamaño de la micela,
lo que depende de qué forma geométrica se le asigne, ya
que las restricciones geométricas excluyen la forma esfé­
rica. Se las consideró comoelipsoides de revolución, ya
que otras formas geométricas son más dificiles de tratar
desde el punto de vista matemático, teniendo en cuenta
la falta de datos sobre la forma de estas micelas.- El mg
jor ajuste se obtuvo con elipsoides oblados, lo que con­
 cuerda con datos de viscosidad intrínseca (3 cm3/g, Tausk
y col.,1974 a).
Para m = 36, el volumen del dominio hidrofóbico es V =
(m . v) = 11656 ¿3. Tomando el valor de l = 7.8 Á (Tabla
B-l) como semieje menor b (Figura B-l) y la ecuación de
volumenpara el elipsoide es:

O
v = 4na2b/3, de donde a = J V.3/4Hb = 18.9 A (B-5)

Considerando la distancia de mayor aproximación de una m9

lécula de agua (1.5 Á) y el carácter ondulado de la super
ficie (1.5-2.5 Á), se elongaron los semiejes por un fac­
tor óhc = 3 Á. Con los semiejes elongados se calculó el
área total a nivel de la interfase:

= 4136 A (B-6)

o
de donde AHm = 4136/36 = 115 A2.
Para calcular ARm, los semiejes se elongaron por un fac­

tor ¿rc = 5 Á (promedio de las conformaciones de la cabe­

za polar, Allgyer y Wells, 1979) y se obtuvo un área to­
tal de 5097 ÁZ, de donde ARm= área total/36 = 141.6 32.
Definido Gá en función de m, se aplicó la ecuación (A-2)
en su forma logaritmica:

_ O _ .­
ln Xi = mAGñ / TR + m ln X1 + ln m (B-7)

Se sumaron todos los valores de xa para los cuales xñ >

- 50 para obtener la sumatoria HFme y calcular los númg
ros de agregación promedio en peso (mw), promedio en ng
mero (mn) y 1a c.m.c. (valor de x1 + Xm , tal que xm ­

0.05 xl) y se compararon con los datos experimentales.

Los resultados se presentan en la Tabla B-2.

Tabla B-2: Comparaciónde los resultados teóricos apli­

cando Za ecuación (A-Z) con los datos experi­
mentales obtenidos con PC(6:0)

Parámetro Valor calculado a- Datos experimenta

plicando la ecuación les (Tausk y col.
(B-7) 1974 a, 1974 b)

c.m.c 10.5 mM 9.8 HM

AGE -4634 cal(Ecuación B-7) RT ln x1 - RT ln X; =

nüc m
- 4795 cal.
Pesos núcelares entre 15 y 60 HM Dispersión de la luz:
16600-16500
Sedinentación:16200—
16900

Eh 36.8 35.88
Eh 35.88 34.5
uh / mh 1.04 1.03

La distribución de las distintas especies en función de

la concentración de PC(6:0) se presenta en la Figura B-2
(A). En la Figura B-3 puede observarse el acuerdo entre
el mwcalculado (34-37 monómeros) con el dato experimen­
 tal 34-38 monómeros(Tabla B-l). La distribución de ta­
maños es bastante estrecha y cambia poco con la concentra
ción en ese rango.

Fig.B-1: Esquemade una mícela de dihexanoillecítína, representada como

un elipsoide de revolución oblado. El semieje b se ha tomado
igual a lc y el semíeje a se ha calculado comose indica en el
texto. La línea de puntos representa 1a ondulación de la super
ficíe y corresponde th. La elongación de los semiejes por
rC para calcular el área se muestra a nivel de las cabezas
polares.

La relación EW/ En = 1.04 (Tabla B-2), lo que concuerda

con la aproximación de Tanford (1974 a) quien ha indica­
do que valores de ñw / fin mayores que 1.1 no pueden ob—
tenerse con elipsoides oblados. La distribución de tama
ños (Figura B-3) es bastante estrecha en el rango entre
15 y so mM.
 40- A
mlC.

n30_
z
É
520­
3
rí’
1o __ mm.

l l I

0 10 20 30 40 50
P060)hnM)

Fíg.B-2: Distribución de especies en función de la concentración PC(6:0),

"modelo de separación de fases: mon = monómeros; mic - mícelas.

(3) Es más preciso el tratamiento termodinámico desarrollado

por Israelachvili y col. (1976) en el cual el término
O O

AGE / RT en la ecuación (A-2) se reemplaza por AGm/ RT —

a/m para dar:

x1m= m [exp.(AG°° / RT — a/mnm (B-8)

donde a es una constante característica del anfífilo y

O
AGwes la energía de transferencia de un anfífilo a una
micela así como M se aproxima a w. Empleando los valores
 AG; /RT = 8.49 y a = 15.32 (Allgyer y Wells, 1979), se og
tiene que la dependencia de Xmcon fi es bastante amplia
(Figura B-4) y sólo se requiere conocer el valor de AG;
y Xl medïbles _ físicamente. Asi, para PC(6:0) a la c.m.
O

c., el valor de X1 exp.(AG0°/ RT) para PC(6:0) es, aprox;

madamente 0.88.

10 ­
25 0m"

¡1- fax.
¡2 - ' '.

‘3 " .. o
. ¡0.5mn I
‘10 " . .o'm‘. .

xE b . .0 l. .
c O
T ' o . .
16 - - o °.

17- ’ o 2

¡e l ' 'l 1 I l J
0 10 20 30 40 50 60
m

Fig.B-3: Distribución estadística de los númerosde agregación (m) en

micelas de dihexanoil lecítina para dos concentraciones tota­
les: 10.S y 25.0 mM.El cálculo de la distribución se efectuó
de acuerdo con el modelo de Tanford (ver explicación entá.texto).
(4) E1 modelo de agregación premicelar (Johnson y col.,l981)
es una extensión del modelo de separación de fases, que
incluye la presencia de pequeños agregados conteniendo n
monómeros (Mm)y de micelas que contienen m pequeños agrg
gados (Mnm), de acuerdo con la ecuación:
 nM (Mn) , Kn = x (Mn)/X(M)n (B-9)

m(nM) (Mnm) , K x (Mn)/X(Mn)m =

x (Mnm)/Kn x(M)n m (B-lO)

La ecuación de'conservación es: (Mt) = (H) + n(Fn) +

nm(Mnm).
Para este modelo se admite que el número de agregación de
las micelas es M= 36 y los valores de las constantes de
asociación se tomaron: Kn = 34.1 y Km= 2.33 x 1040 (John­
son y col.,1981).
Este modelo ha sido propuesto para explicar el calor de
dilución observado con soluciones diluïdas de PC (6:0).
Los resultados obtenidos (Johnson y col.,1981) no pueden
ajustarse por la formación de micelas, por interacción e­
lectrostática entre las cabezas polares o haciendo depen­
der el AH°del tamaño de las micelas. Tanto con los mode­
los (1) a (3) el cambio de entalpía para la inserción de
un monómeroen una micela es 1.37 kcal/mol (Ï 0.2).
La explicación más simple de este efecto es la existencia
de pequeños agregados de PC(6:0) a concentraciones bien
por debajo de la c.m.c., con un número de agregación m=
2-5 con un mejor ajuste para ñ = 2. Ningún otro modelo
permite predecir una concentración suficiente de agrega­
ción a concentraciones de PC (6:0) tan bajas. De acuerdo
con este modelo el cambiode entalpía para la transferen­
cia de un monómeroa una micela es 1.6 Ï 0.2 kcal/mol y
alrededor de un tercio de este efecto se produce en la
formación de agregados premicelares.
 La Figura B-4 presenta las concentraciones de monómero,di­
mero y micelas en función de la concentración total de PC
(6:0) calculadas empleando las constantes mencionadas más
arriba.

en .1l
8 A
MIC.
wO

—5
o
PC(6:O)(2M)

i_i_T._
­

O
0 10 zo 30 4o
PC(6:0)(mH)

Fig.B-4: Distribución de especies en función de la concentración de PC

(6:0), modelo de agregación premicelar; mon = monómeros; dim —
agregados premicelares (n = 2); mic = micelas. Explicación en
el texto.

Debe enfatizarse que a la c.m.c. el dimero representa cerca

de un 40 %de la concentración total de soluto y a 50 mM
algo más del 20 %. De este modo, tanto a bajas como a a1­
tas concentraciones de PC(6:0) el agregado premicelar debe
contribuir en forma significativa a las propiedades de
sistema.
 APENDICE C

Estado Físico de Zos fosfolípidos de cadena larga

El comportamiento de los fosfolipidos en agua o en membranas

biológicas se aprecia mejor considerando sus propiedades en
estado sólido (Chapman,1965). Esto se debe a la considera­
ble importancia de su comportamiento mesomórfico en la estrug
tura de las vesículas y membranasbiológicas.
Estudios de difracción de rayos x de lecitinas sintéticas
(Chapman, 1965) indican: (a) que las dos cadenas de ácido gra
so son paralelas y apuntan en la mismadirección (b) la con­
formación del residuo de glicerol parece ser "gauche-gauche“,
(c) el resto de colina existe en conformación "gauche" más eg
tendida y (d) la estructura está constituida por infinitas 15
minas bimoleculares de fosfolipido que contienen los residuos
de ácido graso hacia el interior y las cabezas polares hacia
el exterior (Parsons y Nyburg, 1966; Chapmany col., 1966),
tal como sucede con los jabones anhidros.
Puede tenerse una idea de la organización de las cabezas pola
res a través de la consideración de los puntos de fusión. Las
fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas y esfingomielinas
tienen puntos de fusión muy elevados (196-230°C) que no depen
den de la composición en ácidos grasos, lo que sugiere la e­
xistencia de una red iónica en 1a estructura cristalina. Los
ácidos fosfatidicos, fosfatidilgliceroles y cardiolipinas tie
nen puntos de fusión más bajos (no mayores de 71°C) y depen­
dientes de la composiciónen ácidos grasos, lo que sugiere
que las fuerzas de interacción entre las moléculas en el cris
tal son principalmente puentes de hidrógeno.

Mesomorfismotermotrópico de lecitinas y fosfatidiletanolámi­

nas. Entre la temperatura ambiente y el punto de fusión se
observan cambios de fase termotrópicos. A una temperatura
definida el espectro infrarrojo pierde toda la estructura fi­
na y se hace similar al de una parafina disuelta en clorofor­
mo (Byrne y Chapman,1964) Fig.C-1. A esta temperatura, el análi
sis térmico diferencial (Chapmany Collin,1965) muestra una tran
sición fuertemente endotérmica. Los estudios de difracción
de rayos x (Luzzati,1968) muestran una disminución drástica
de los espacios mayores a 2/3 de su longitud original. Estu­
dios de resonancia magnética de protones (Horwitz y col.J976)
muestran un estrechamiento de las lineas desde 18 gauss(a la
temperatura del nitrógeno líquido) a 0.09 gauss en el comien­
zo de la transición.
La conclusión de estos estudios es que a la temperatura de
transición (Tc) ocurre un cambio endotérmico como consecuen­
cia del cual las cadenas parafínicas cristalinas (todo-trans)
"funden" exhibiendo un alto grado de movilidad, Fia.C-2.
La demostración de que este cambio involucra sólo a las cade­
nas apolares puede efectuarse por estudios de difracción de
rayos x, determinando el valor de 1a distancia de los espa­
cios mayores para varios homólogos, que es proporcional a la
longitud de cadena. La extrapolación a longitud de cadena
cero representa el espacio ocupadopor la cabeza polar y las
cadenas apolares representan dominios de comportamiento inde­
pendiente.
 Frequencykm")
2500
3000 2¡00 ¡250
4000 2700, 2000 100 ' IIOO 900

¡zo'c

Fig.C-1:
Espectroscopía de infrarrojos de
una muestra de 1,2-di1auroi1-ggf
HO glicero-S-fosforiletanolamina en
función de la temperatura (Byrnes
y Chapman,1964).
'/.
Absorptíon

25

-I86

_ J. l l l l I l 1 l 1 l
4 6 8 IO IZ H

ÏEÏ
Woveleanh (Fm)

un
fifi

.58‘5’5‘5681
Ïï¿Egg
55fi555
55

EF GH

61 I

Fig.C-2: Representación esquemática de los espectros de difracción de

rayos X obtenidos por debajo (derecha y por encima (izquierda)
de 1a temperatura de transición (Tc).
La temperatura a la cual ocurre esta transición depende de la
composición en ácidos grasos: es menor si los ácidos grasos
contienen una doble ligadura "trans" y aún menor si la doble
ligadura es de configuración "cis".
Se observa una sola transición aún cuando las cadenas de áci­
do graso de la molécula de fosfolípido sean distintas, aunque
si la composición es muyheterogénea, la transición ocurre en
un rango de temperatura muy amplio.

Sistemas fosfolípido-agua y mesomorfismoliotrópico: En pre­

sencia de cantidades crecientes de agua los fosfolípidos pre­
sentan varias fases hidratadas (mesomorfismoliotrópico). Las
mesofases liotrópicas, a su vez, presentan mesomorfismotermg
trópico, de maneraque la fase particular obtenida es función
del contenido de agua y de la temperatura (Williams y Chapman
1970), Fiq.C-3.
Dervichian (1967) ha discutido las condiciones que gobiernan
la formación de mesofases liotrópicas. Cuando se examinan
fosfatidilcolinas en presencia de concentraciones crecientes
de agua, las distintas técnicas físicas muestran que la tempg
ratura de transición (Tc) cae hasta un valor límite, indepen­
diente de la concentración de agua. Cuandoel agua penetra
la estructura cristalina, lo hace a nivel de las cabezas pola
res, pero sólo puede hacerlo si las cadenas apolares se en­
cuentran en estado fluido, esto es, en o por encima de la tem
peratura de transición (Tc,punto de Krafft). Una vez que las
cabezas polares se han hidratado, si la temperatura desciende
por debajo de Tc, las cadenas apolares se ordenan en configu­
ración todo-trans, si bien el agua no es necesariamente expe­
La temperatura a 1a cual ocurre esta transición depende de la
composición en ácidos grasos: es menor si los ácidos grasos
contienen una doble ligadura "trans" y aún menor si la doble
ligadura es de configuración "cis".
Se observa una sola transición aún cuando las cadenas de áci­
do graso de la molécula de fosfolipido sean distintas, aunque
si la composición es muyheterogénea, la transición ocurre en
un rango de temperatura muy amplio.

Sistemas fosfolipido-agua y mesomorfismoliotrópigg: En pre­

sencia de cantidades crecientes de agua los fosfolipidos pre­
sentan varias fases hidratadas (mesomorfismoliotrópico). Las
mesofases liotrópicas, a su vez, presentan mesomorfismotermo
trópico, de manera que la fase particular obtenida es función
del contenido de agua y de la temperatura (Williams y Chapman
1970), Fig.C-3.
Dervichian (1967) ha discutido las condiciones que gobiernan
la formación de mesofases liotrópicas. Cuando se examinan
fosfatidilcolinas en presencia de concentraciones crecientes
de agua, las distintas técnicas fisicas muestran que la temps
ratura de transición (Tc) cae hasta un valor limite, indepen­
diente de la concentración de agua. Cuandoel agua penetra
la estructura cristalina, lo hace a nivel de las cabezas pola
res, pero sólo puede hacerlo si las cadenas apolares se en­
cuentran en estado fluido, esto es, en o por encima de la tem
peratura de transición (Tc,punto de Krafft). Una vez que las
cabezas polares se han hidratado, si la temperatura desciende
por debajo de Tc, las cadenas apolares se ordenan en Configu­
ración todo-trans, si bien el agua no es necesariamente expe­
 Endo

C=07
ao

260 280 300 320 340 360 380

Fig.C-3: Efecto de la concentración relativa de lípido/agua sobre la

temperatura de transición (T ) gel-líquido cristalino de 1,2
diestearoilfgnfglicero-B-fos orilcolina. Se obServauna dig
minución de la temperatura de transición (el pico de absor­
ción de calor a la derecha) desde O hasta 0,25 (fracción en
peso) de agua. A partir dé 0,25 para fracciones en peso cre­
ciente de agua, la Tc se mantiene a la mismatemperatura (el
pico de absorción a 1a izquierda) corresponde a la formación
de hielo.
lida. Las fases liotrópicas que contienen cadenas parafíni­
cas cristalinas se denominan gg_; los que pueden o no ser me­
taestables. Si lo son, se transforman luego de un cierto pe­
ríodo de tiempo en una suspensión de microcristales de fosfo­
lípido en agua: fase "coagel". La fase coagel es estable y
su estructura es independiente de la historia térmica de la
muestra (Vincent y Skoulios,l966).
Sólo por encima de 1a temperatura de transición gel-liquido­
cristalino las lecitinas en medio acuoso forman espontáneamen
te "figuras de mielina" y pueden dispersarse en vesículas uni
laminares por sonicación.
La estructura de las mesofases liotrópicas ha sido descrita
para distintos fosfoleidos (Para revisión ver Luzzati,l968).
La fase gel presenta una estructura de láminas, con bicapas
lipïdicas en las cuales las cadenas parafínicas inclinadas se
encuentran ordenadas en una matriz cristalina.
La fase laminar presenta capas alternadas de fosfoleido con
cadenas apolares en estado fluido y agua.
Las fases hexagonales consisten en ensambles bidimensionales
de cilindros. En la hexagonal I los cilindros contienen las
cadenas apolares fluídas y están recubiertos por las cabezas
polares e incluídos en una matriz apolar líquida.
La secuencia en que aparecen estas mesofases en orden de con­
centración creciente de agua es: HexagonalII-laminar-hexago­
nal I-solución micelar isotrópica. Si bien alguna de estas
fases puede estar ausente, nunca se ha observado la inversión
de esta secuencia.
El rango de concentración dentro del cual se encuentra una me
sofase dependede la estructura del fosfolipido. Conleciti­
nas puras de cadena larga, la fase laminar se obtiene a cual­
quier concentración; al aumentar la concentración de agua se
llega a una hidratación limite y 1a fase laminar permanece en
equilibrio con el solvente en exceso. No se observan fases
hexagonal I ni solución micelar isotrópica. En cambio en las
lisolecitinas, en las que predomina la masa de la región po­
lar, la fase laminar se observa sólo a muyaltas concentracig
nes de fosfolipido que corresponden a la solución micelar iso
trópica.
Si bien los fosfolipidos naturales son una mezcla de numero­
sas especies químicas con diferente composición en ácidos gra
sos, en general éstas son perfectamente miscibles en el rango
de concentraciones de una fase del diagrama. A la temperatu­
ra Tc coexisten las fases gel y liquido-cristalinas en equili
brio y, si se trata de una mezcla de especies químicas, puede
ocurrir segregación de las mismas.
 ¿EPNDICE D

D.1 Efecto del pH sobre Za velocidad de la reacción catalizada

por crotoxina B.

El efecto del pH sobre 1a actividad de enzimas se debe a cam­

bios en el estado de ionización de los componentesdel siste­
ma: la enzima libre, el sustrato o el complejo enzima-sustrato
En el caso particular de 1a crotoxina B, las lecitinas son
zwitteriónicas (carga neta cero) en el intervalo de pH entre 3
y 12, de modoque las modificaciones en la velocidad de reac­
ción observadas pueden atribuirse a cambios en el estado de ig
nización de 1a enzima. Además, por las razones mencionadas en
el Cap.V, la cinética se asimilará a una reacción de un solo
sustrato.
La crotoxina B, comocualquier otra enzima puede existir en nu
merosos estados de ionización y 1a distribución de la enzima
en los distintos estados depende del pH y de las constantes de
disociación de los grupos ionizables presentes en su estructu­
ra. Sin embargo, es probable que sólo una o unas pocas formas
de la enzima sean catalíticamente activas.
En primera aproximación, puede aceptarse que la ionización de
los grupos Situados en/o vecinos al sitio activo es lo que en
mayor medida afectará la actividad. En consecuencia, los efeg
tos del pH sobre 1a velocidad de reacción se discuten sobre la
base de la ionización de ácidos dibásicos o anfolitos simples,
si bien es indudable que se trata de una sobresimplificación.
La suposición básica de que parte este tratamiento (Dixon y
Webb,1971; Webb,19 )es que los procesos de ionización ocurren
muy rápidamente en comparación con los de formación y descompg
sición del complejo enzima-sustrato, de modoque las distintas
formas iónicas de cada una de las especies presentes en el sis­
tema se encuentran siempre en equilibrio. No se hará ninguna
suposición a priori sobre cuáles son los grupos ionizables de
1a enzima que afectan la actividad ni sobre cuál es exactamente
la forma iónica activa del complejo enzima-sustrato, de manera
que representaremos este último comoESn, donde n es la carga
negativa neta del complejo en su forma activa.
Si la actividad enzimática decae a medida que se aleja del pH
óptimo hacia el lado ácido únicamente, podría plantearse un e­
quilibrio con dos especies:
n-l + n
BS :H +ES (D-l)

de manera que el estado en que se encuentra el complejo ES de­

pende del pH y de la constante de disociación
1
K = [es“1[H+1/[Esn' l (D-2)

Si éstas son las únicas especies presentes, la ecuación de con

servación es:

[Est] = [Esn’l] + [ESn] (13-3)

Es posible obtener las funciones de pH f1 y f2 que se definen

a continuación:

[Est] = [Esn‘11(1 + K/[H+]) ={Es“'11. f1 (D-4.a)

[Est] = lESn] (1 + [11+]/K) = [Esï‘] . f2 (D-4.b)

de manera que 1a concentración de cualquiera de las especies

iónicas puede calcularse dividiendo la concentración total de
complejo ES por la función de pH apropiada.
Cada una de las dos funciones de pH definidas en las ecuaciones
(D-4.a) y (D-4.b) contiene dos términos y, a medida que el pH
aumente, cada uno de estos términos se hará dominante con res­
pecto a1 otro. Entre esas dos regiones de predominio de uno de
185 términos, existe un intervalo de pH en el cual ambos térmi­
nos contribuyen simultáneamente al valor de la función. Si se
representa gráficamente, p.ej. -log f2(pf2) definido por 1a e­
cuación (D-4.b) en función del pH se obtendrán dos rectas co­
rrespondientes a las regiones en que domina uno de los términos
de f2, unidas por una región curva, correspondiente al interva­
lo de pH en el cual los dos términos contribuyen. A valores de
pH bajos ([H+] < K) es pf2 = -lóg [H+]/K = pH - pK y la repre­
sentación gráfica de pf en función de pH será una recta de pen­
diente +1 (la pendiente es igual al exponente al que está eleva
da H+ en el término dominante), lo que significa que pf aumenta
en una unidad por cada unidad de incremento de pH. A valores
de pH elevados ([H+].< K) pf2 se hace independiente del pH
(pendiente cero). Es fácil demostrar que la intersección de las
porciones rectas corresponde al pK y que cada pK produce un cam
bio de pendiente de una unidad en el gráfico.
Para estudiar el efecto del pH sobre la velocidad de reacción,
deben determinarse las velocidades iniciales a distintos valo­
res de pH, empleandoconcentraciones de sustrato suficientemen­
te elevadas para eliminar posibles efectos sobre el Km. En es­
tas condiciones [ES]5= [Et] y vo z Vm= kcat . [Et]
Si la velocidad Vmvaria con el pH, siendo [Et] constante, la
variación sería aparentemente debida a cambios en kcat. Pero
la variación de kc at con el pH se debe a que sólo una forma
iónica de ES se descompone en productos de la reacción (o al
menos una de ellas lo hace a una velocidad mucho mayor que las
otras) y la fracción de {ES](=[EQ) que se encuentra en ese es­
tado de ionización depende del pH. En consecuencia, puede con
siderarse que kcat tiene dos componentes, a saber: (a) la cons
tante de velocidad característica (Ï cat ) para la descomposi­
ción de la forma iónica activa de ES, independiente del pH y
(b) la función de pH adecuada que determina la concentración
de esta especie para cualquier valor de pH.
Si sólo la especie ESn es catalíticamente activa (ESnul inacti
va), la función de pH apropiada es f2 (ecuación D-4.b) y se
tiene:
kcat =ï cat/f2 (0-5)
de donde, siendo [ES]==[Et], resulta

Vm= kcat.[Et]/f2 (D-6)

y tomando logaritmos

log Vm= log kcat + loqlEtl+ pfz (D-7)

En la ecuación (D-7) los dos primeros términos del segundo

miembro son independientes del pH de modo que la representa­
ción gráfica de log Vmen función del pH será superponible con
91 gráfico de sz en función del pH, presentando segmentos reg
tos con pendientes de 1 y cero y la inflexión representará el
pK del grupo ionizable que afecta la actividad, ya sea porque
forma parte del sitio activo o está de alguna forma involucra­
do en el proceso catalitico.
Si 1a actividad enzimática decrece tanto del lado ácido como
del lado alcalino del pHóptimo (p.ej. la actividad de crotoxi
na B frente a vesículas de PC (14:0), Pueden aceptarse 105 e'
quilibrios:

K K
¡1-1 1 2 n+1
ES “AM Es“ «.14 Es (D-a)

donde el complejo presenta dos ionizaciones sucesivas con cong

tantes de disociación Kl y K20 La ecuación de conservación es:

[ESt] = ÍESn-ll + [ESn] + [ESn+1] (D-9)

y los valores de las constantes de disociación son:

K1 = [ES“][H+]/[Esn’ll y K2 = [ESn+1]ÍH+]/ÍESn] =
= [Esn+11[H+]2/[Esn'll (D-1o)

Las funciones de pH que se obtienen son:

[Est] = [Esn'1](1 + Kl/[H+] + KlKZ/[H+]2) =

= [Esn'll f1 (D-11.a)

[Est] = [ESD] (1 + [11+]/K1 + KZ/[H+]) = [ESn] f2 (D-11.b)

[Est] = [ESn+1](1 + [H+]/K2 + [H+]2/K1K2) =

= [ESn+l] f3 (D-11.c)

Las tres funciones de pHpara un sistema que existe en tres

estados de ionización, contienen tres términos. Si los valo­
res de Kl y K2 están suficientemente separadas, para cada tér­
mino hay un rango de pH en el cual los otros dos son compara­
tivamente insignificantes. Entre estos intervalos, existen
rangos estrechos de pH en los cuales dos de los términos con­
tribuyen simultáneamente al valor de la función, siendo el ter­
cero despreciable.
Del mismomodoque indicó previamente, 1a representación gráfi­
ca de pf2 en función del pH presentará una porción recta de pen
diente 1.0 a valores de pH bajos donde [H+]_> K1 Y sz =
-log H+/K1 = pH - pKl. A valores de pH intermedios pf2 es in­
dependiente del pH, mientras que a valores de pH elevados([H+k
K1) es pf2 = log Kz/[H+]= pK2 - pH y 1a pendiente será -1.
Por las razones mencionadas anteriormente, la representación
gráfica de log Vmen función de pH será similar a la de pf2 en
función de pH (ecuaciones D-5 y D-7).
Suponiendo que en el equilibrio presentado por la ecuación
1
(D-8) las formas ESn Y ESn+ se descomP onen en productos de la
reacción a la misma velocidad (sólo ESn­1 es inactivo), el gru
po ionizable cuya constante de disociación es K2 no afectará
la velocidad de la reacción.
Considerando que la concentración de sustrato es saturante y
[Est] 2 [Et], se tiene:
N [E 1 [E l N
_ t N t _ 1 _¿
m cat cat
V —k . f2
——+ k f3
——— kcat [Et<É—2 + f3 ) (D-12)

Además, s1. se tiene

.
en cuenta que cuando [H+ les del mismoor­
.

den de magnitud que-K2([H+}<K1), ESn y ESn+1 existen simultá­

neamente, pf2 se aproxima a (1 + Kz/[H+]) y pf3 se aproxima a
(l +[H+]/K2). Sustituyendo en la ecuación (D-12) se obtiene:

_ N l 1 _
Vm_ kcatlEt] + + - kcat‘lEt] (D-13)
1 +[E—]
K
2
lo que demuestra que la ionización del grupo de constante de
disociación K2 no tendrá efecto sobre la velocidad de reacción.
En efecto, haciendo (ESn + ESn+1)= [ES*], el sistema se reduce
al descrito por la ecuación (D-l) y 1a curva de velocidad en
función del pH está únicamente gobernada por K1.

D.2 Efecto del pH sobre la disociación del complejo crotozina.

Si un sistema presenta tres ionizaciones sucesivas, de acuer­

do con el esquema:

K ­
Cn‘3 ¿1 cn“2 + H+ K1 = [Cn-2][H+]/[Cn 3] (D-14.a)
n-2 K2". n-1 + n-l + n-2

__ K _ n + n-l __
Cn l 3 , Cn + H+ K3 - [C ][H ]/[C ] (D 14.c)

La ecuación de conservación es:

[Ctotall = [cn'31 + lcn‘zl + [Cn-1] + [cn]

La fracción molar de cada especie es[Cn-3]/[Ctota1]¡[Cn-zl/

-1 n
[CtotallflCn l/Íctotal]y [C l/[Ctotall

[Cn-3] = [Cn-3]
[c total] [cn‘31 + [Cn-21 + lcn'll +[Cn]

Los términos [Cn-2], [Cn-1] y [Cn] pueden expresarse en fun­

ción de [Cn-31empleando las relaciones (D-14.a, b y C)

-2 - -1 -3 K 1K 2
lc" 1=Icn31—
IH+1
:[cln 1=lc“1T:
[H1
 — K1K2K3
[Cn] - —+—ï­
l H l

Sustituyendo

¿“’31 = 1 = 1
¡ctotall 1 + fi + K1K2 K11‘2K3 an-3
lH+l [1912 “¡+1 3

Por un procedimiento similar:

[cn'zj = 1 = 1
+ K K K f
[ctotal] 1+ + Í3 cn'2
K1 [a r [H1

n-l
[C ] = 1 = 1
[C
total.] 1+ KÍ+|H|+|H|
+ + 2 f _
Cnl
[H 1 K2 ¡(le

[cn] = 1 = 1
[C
total1 +
1+[H]+[HL+ 2 + 3
+ [H] f _
Cnl
K3 KZK3 K1K2K3

De modo que

- [C l
X n3 = 1 y [Cn 3] = total =
cn f C n-3 f C n-3
 = l Ctotall
+ K K K
1+ IH—J+ 2 + 33
K1 l H l [H l

_ 1
x n-l ——— [Cn-l l­_ [Ctotal]
C f c n-l f c n-l

= I Ctotall
K + + 2
1 + 3 + [H 1 + 15-J———
[H 1 K2 KlKZ

x=l =
C” f"n
C 1 + [3+1 + _E_J__
[+ 2 + .L__l—_
H+ 3
K3 K2K3 K1K2K3

De manera que la concentración de cada especie iónica se obtig

ne dividiendo la concentración total por la función de pHaprg
piada, expresada en términos de [H+]y las constantes de diso­
ciación.
Debe notarse que si los valores de pK1 (-log K1); pK2 (-log K2)
Y pK3 (-log K3) se encuentran suficientemente separados en la
ecuación de cualquiera de las funciones fcn_3; an_2; fcn_1 Y
fcnr habrá intervalos de pH en los cuales uno de los términos
será significativamente mayor que todos los otros. En conse­
cuencia, la representación gráfica de fracción molar en fun­
ción de pH consistirá en porciones lineales, que corresponden
a los intervalos de pH mencionados, con pendientes enteras e
iguales al exponente al que se encuentra elevada [H+] en el
término dominante
Por ejemplo en la representación gráfica de - log fracción mo­
lar de [Cn-3] en función de pH, a valores de pH muy bajos, el
término dominante es 1 A) K1 /[H+], Kl K2 /[H+]2 , K1K2 K3 /[H+]3
y en el intervalo de pH en que esto suceda se obtendrá una reg
ta paralela al eje de abscisas (pendiente cero), indicando que
[Cn-3 ]es independiente del pH en ese intervalo (log 1 = 0).
A medida que el pH aumenta (K1 > [H+] > K2K3) el término domi­
+ n-3 +
nante será Kl/[H ] y -log [C ]/[Ctotal] = log[H ]—log Kl =
—pH+ pKl. La representación gráfica será una recta de pen­
diente —1y la inflexión entre las porciones lineales de pen­
diente 0 y pendiente —1corresponde a pKl. Luego, el término
. + 2 + 11-3
dominante será KlKZ/[H ] ,(K1K2>[H1>K3)ay “loglc l/lctotal]

2.log[H+] - log K1 - log K2 = —2pH + pK1 + pK2. La repre­

sentación gráfica en ese intervalo será una recta de pendiente
-2. La inflexión entre las porciones lineales de pendientes
—l y —2 se produce cuando

—pH + pKl = -2 pH + pK1 + pK2 .1 pH = pKz.

Finalmente, cuando [H+]< K1,K2,K3, el término dominante será

K1K2K3/[H+]3 y -1og[c“‘3]/[ctotal] = 3 log [H+]- log K1 ­
log K2 - log K3 = —3 pH + pK1 + pK2 + pK3.

Si los valores de pKl, pK2 y pK3 no están muy separados, para

cualquier intervalo de pH habrá más de un término dominante en
la ecuación de f n _3 . En consecuencia, la representación grg
C
fica de —log[cn'31/[c total] en función de pH no presentará re
giones lineales o si las presenta, tendrán pendientes no ente­
ras. Las inflexiones representarán combinacionesde dos o tres
valores de pK. En todo caso, habrá un intervalo de pH en el
 , . . +
cual el termino dominante en fcn_3 es 1 ([H h»K1,K2,K3) que en
la representación gráfica de - log([Cn-3]/[Ctotaleerá una reg
ta de pendiente cero. Si luego los términos dominantes son
K
1 n-3 _ _ _ +
l + [H+], resultará -log([C lllctotalv- pH log ([H 1+
K1) y la pendiente será variable, mayor que —l. Del mismo mo­
Kl Kle K1
do, si los términos dominantes son ——: +
[H] [H]--;-ï = ——:—
[H] < 1 +
K K
2 n-3 2
[H+] )7‘ 109([C 1/[Ctotalv= - pH - log (1 +[H+])+ pK1 y la
K

pendiente será - Il + 109 (1 + 2

IH+1 )]
En este caso, el análisis gráfico no es posible. Sin embargo,
podria haber regiones lineales en el caso de que la disocia­
ción fuese cooperativa; comoen el ejemplo indicado en el Cap.
VI.
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