Chapitre IV

IV.3. ROBUSTESSE

IV.3.1. INTRODUCTION

La robustesse d’une procédure analytique est la mesure de sa capacité à rester non

affectée par des petites variations délibérées des conditions opératoires de la procédure. Elle
fournit une indication sur la fiabilité durant l’usage normal d’une méthode analytique [56, 59,
61, 62, 64, 65].
Le test de robustesse est important en vue d’identifier les facteurs opératoires qui ne
sont pas nécessairement étudiés en phase de développement de la méthode, mais qui
pourraient avoir une influence sur les résultats, et par conséquent d’anticiper les problèmes
pouvant survenir au moment de l’application de la méthode, par exemple lors de l’analyse de
routine ou lors d’une étude collaborative [59, 64, 65]. Si les mesures sont sensibles aux
variations des conditions analytiques, il serait indispensable de maintenir constantes ces
conditions ou d’introduire des précautions dans la description de la méthode.
Généralement lorsqu’un test de robustesse est effectué, ce sont les réponses
qualitatives, par exemple les critères d’évaluation de la performance chromatographique, qui
sont souvent prises en compte pour juger de la stabilité de la procédure analytique.
Cependant, il est tout aussi important de considérer les réponses quantitatives, par exemple la
détermination d’une substance dans un échantillon, étant donné qu’elles constituent le but
d’une méthode analytique.
L’objectif poursuivi dans ce travail est de tester la robustesse de la méthode de
chromatographie liquide à haute performance (CLHP) que nous avons développée et validée
pour la détermination du R-timolol dans le maléate de S-timolol. Nous évaluerons la
robustesse des conditions analytiques de la méthode de CLHP en nous basant sur les réponses
qualitatives mais aussi et surtout sur les réponses quantitatives.

IV.3.2. PRÉPARATION DES SOLUTIONS

Rappelons que la dissolution des échantillons et la dilution des solutions sont

effectuées dans un mélange de solvants composé de 2-propanol et de diéthylamine (99/1, v/v).

113
 Chapitre IV

IV.3.2.1. SOLUTION UTILISEE POUR LE TEST D’ADEQUATION

Le test d’adéquation du système de CLHP, en anglais « System Suitability Test »

(« SST ») est un test qui permet à l’analyste d’apporter un jugement sur le fonctionnement
d’un équipement utilisé pour effectuer les mesures analytiques [63]. Dans le cas d’un
fonctionnement incorrect, il y a lieu d’apporter une solution appropriée. Selon ICH [243], ce
test fait partie intégrante des procédures analytiques. Dans le cadre d’un test de robustesse, le
SST permet d’examiner l’adéquation d’une procédure analytique en fonction des variations
des facteurs opératoires délibérément introduites dans cette procédure. Dans la suite de ce
travail, nous utiliserons le terme SST pour désigner le test d’adéquation du système.
Des solutions mères (à 1 mg/mL) de dimère de timolol (composé N°1), de R-timolol
(composé N°2), d’isotimolol (composé N°3), de S-timolol (composé N°4) et de
dimorpholinothiadiazole (DMTDZ) (composé N°5) ont été préparées séparément.
Une solution de référence du mélange des cinq composés a été préparée par dilution de
chacune des solutions mères en vue d’obtenir des concentrations de 10 µg/mL.
Cette solution a servi pour le SST qui a consisté en la détermination des résolutions
aussi bien entre les pics consécutifs (Rs 1-2, Rs 2-3, Rs 3-4, Rs 4-5) qu’entre ceux des
énantiomères du timolol (Rs 2-4). Le SST a été effectué au début de chacune des conditions
expérimentales générées par le plan d’expériences avant de procéder à l’analyse des
échantillons à examiner.

IV.3.2.2. SOLUTIONS UTILISÉES POUR LA DÉTERMINATION QUANTITATIVE

IV.3.2.2.1. Solution de référence

Une solution mère contenant 1,5 mg/mL de maléate de R-timolol substance chimique
de référence (SCR) a été préparée. Cette solution a été ensuite diluée cent fois pour obtenir
une solution de référence contenant 0,015 mg/mL de maléate de R-timolol correspondant à
1,0 %.
D’autre part, une solution mère contenant 1,5 mg/mL de maléate de S-timolol a été
préparée, puis ensuite diluée 250 fois en vue d’obtenir une solution contenant 0,006 mg/mL
de maléate de S-timolol correspondant à 0,4 %.

114
 Chapitre IV

Les solutions de référence à 1,0 % et à 0,4 % ont été utilisées pour déterminer
respectivement, le maléate de R-timolol et les autres impuretés dans les différents échantillons
de maléate de S-timolol.
Les solutions mères ont été passées au bain à ultrasons pendant environ 15 min. en vue
d’assurer une dissolution complète des substances.

IV.3.2.2.2. Solutions à analyser

Plusieurs solutions des échantillons à examiner de maléate de S-timolol ont été

préparées dans des ballons jaugés volumétriques de 10 mL en dissolvant une quantité
exactement pesée de 15 mg d’échantillon de maléate de S-timolol. Ces solutions ont été
placées au bain à ultrasons pour assurer une dissolution complète des substances. Trois
nouvelles solutions indépendantes (n = 3 répétitions) ont été préparées par échantillon et par
expérience. Chaque solution d’échantillon a été analysée dans les conditions de répétabilité.

IV.3.3. RESULTATS ET DISCUSSION

La littérature définit huit étapes pour la réalisation du test de robustesse [58]. Celles-ci
sont reprises ci après:
1. identification des facteurs opératoires à tester,
2. définition des différents niveaux pour ces facteurs,
3. sélection du plan expérimental,
4. définition du protocole expérimental,
5. définition des réponses à déterminer ou à étudier selon le cas,
6. exécution des expériences auxquelles sont associées la détermination ou l’étude
des réponses sélectionnées,
7. analyse statistique et/ou graphique des effets des facteurs,
8. conclusions pertinentes sur la base des résultats des analyses statistiques et
éventuellement amélioration de la procédure analytique si nécessaire.

115
 Chapitre IV

IV.3.3.1. IDENTIFICATION ET SELECTION DES FACTEURS

Lors d’une étude de robustesse, le choix des facteurs opératoires doit être
judicieusement effectué, d’autant plus qu’il dépend de l’objectif poursuivi par l’analyste.
Etant donné que dans ce travail nous envisageons de mener une étude collaborative dans
laquelle la méthode de CLHP développée et validée sera appliquée, nous avons estimé
pertinent d’examiner si le test de robustesse permet effectivement de simuler les variations
susceptibles de survenir lors de cette étude collaborative, car en théorie cela est envisageable.
De ce fait, il nous a semblé important que la sélection des facteurs à étudier puisse refléter les
changements potentiels ou probables observés lors d’une étude collaborative. Ainsi par
exemple, différents équipements de CLHP ou des colonnes de différents âges peuvent être
utilisés dans une étude collaborative tout comme différents volumes de solvants peuvent être
prélevés pour la préparation de la phase mobile. De plus, la longueur d’onde d’un détecteur,
même bien fixée, pourrait fournir des valeurs différentes d’un laboratoire à un autre.
Deux facteurs qualitatifs [64] ont été sélectionnés (Tableau IV.12) : le type
d’équipement de CLHP et l’âge de la colonne chirale Chiralcel OD-H. Deux systèmes de
CLHP provenant de différents fabricants, Shimadzu (A) et Agilent (B), ont été utilisés. Les
codes -1 et +1 (voir plus loin) leur ont été arbitrairement attribués. La même codification a été
attribuée au facteur âge de la colonne. Ainsi, une colonne nouvelle est codée -1 et une
ancienne +1. Avant de progresser plus loin dans ce travail, il nous a semblé important
d’expliquer le choix du critère de classification de ce facteur basé sur l’âge ou mieux sur la
perte d’efficacité de séparation chromatographique souvent liée à la durée d’utilisation. Nous
avons défini une nouvelle colonne comme étant celle pour laquelle la résolution de la paire
critique Rs2-3 observée dans les conditions nominales de CLHP est supérieure à 1,25, alors
que pour une colonne ancienne, la résolution Rs2-3 est inférieure à cette valeur. Rappelons
que la paire critique définie en phase d’optimisation est constituée des pics correspondant au
R-timolol et à l’isotimolol. Avant de commencer les expériences, les deux colonnes utilisées
ont d’abord été testées pour confirmer cette classification. Celle dont le numéro de lot est
ODH0CE-BC081 a été trouvée nouvelle (Rs2-3 = 1,7) alors que celle dont le numéro de lot
est ODH0CE-IB031 a été considérée comme ancienne (Rs2-3 observée = 1,1). A côté du
facteur âge de la colonne, la variabilité de lot à lot est aussi prise en compte par ce facteur.

116
 Chapitre IV

Parmi les facteurs quantitatifs, cinq [64] ont été considérés (Tableau IV.12) à savoir
les proportions du 2-propanol et de la diéthylamine (DEA) dans la phase mobile, le débit de la
phase mobile, la détection de la longueur d’onde et la température de la colonne.

Tableau IV.12. – Domaine expérimental

Niveau Niveau
Unités Limites Nominal
(-1) (+1)

Facteurs qualitatifs

A. - Type d’équipement de CLHP Shimadzu Agilent Shimadzu

B. - Age de la colonne Ancienne Nouvelle Nouvelle

Facteurs quantitatifs

C. - Pourcentage du 2-propanol
% ± 0,5 3,0 4,0 3,5
dans la phase mobile
D. - Pourcentage de la DEA
% ± 0,05 0,05 0,15 0,10
dans la phase mobile
E. – Débit de la phase mobile mL/min ± 0,1 0,9 1,1 1,0

F. - Longueur d’onde nm ±5 292 302 297

G. - Température de la colonne °C -3 ; +7 20 30 23

IV.3.3.2. DEFINITION DES NIVEAUX DES FACTEURS

Les niveaux des facteurs sont indiqués dans le tableau IV.12. En général pour les
facteurs quantitatifs (pourcentages de 2-propanol et de DEA dans la phase mobile, longueur
d’onde du détecteur et débit de la phase mobile), les niveaux extrêmes sont situés
symétriquement autour du niveau nominal. Par contre, pour la température de la colonne, les
extrêmes ont été situés asymétriquement autour du niveau nominal étant donné qu’ils
représentent mieux la réalité.

117
 Chapitre IV

IV.3.3.3. SELECTION DU PLAN EXPERIMENTAL

Bien que plusieurs plans expérimentaux soient décrits pour le test de robustesse des
procédures analytiques, les plans de Plackett-Burman sont fréquemment utilisés. Un plan
expérimental de Plackett-Burman à deux niveaux [59, 71] a été élaboré pour sept facteurs.
Huit conditions expérimentales ont été ainsi générées, telles que présentées dans le tableau
IV.13.

Tableau IV.13. – Plan expérimental

Facteurs
Expériences
A B C D E F G
1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1

2 -1 +1 +1 +1 -1 +1 -1

3 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1

4 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1

5 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1

6 +1 -1 +1 -1 -1 +1 +1

7 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1

8 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

IV.3.3.4. PROTOCOLE EXPERIMENTAL

Un protocole expérimental a été défini pour l’exécution des expériences du test de

robustesse. Le protocole expérimental schématisé dans la figure IV.13.A a été calqué sur celui
couramment appliqué dans des études collaboratives, les laboratoires étant remplacés ici par
les expériences et les jours par les séries. Cependant, en pratique, nous avons réalisé les

118
 Chapitre IV

expériences en suivant le protocole expérimental présenté dans la figure IV.13.B, c’est-à-dire

pour chaque série, trois préparations indépendantes (n = 3 répétitions) de chaque échantillon
de maléate de S-timolol ont été analysées et ce, en appliquant les huit conditions
expérimentales.

A
xi = (i = 1...r )
Expérience 1 Expérience 8

xij = ( j = 1...c) Série 1 Série 2 Série 3

xijk = (k = 1...g ) Rép. 1 Rép. 2 Rép. 3

B
xi = (i = 1...r )
Série 1 Série 3

xij = ( j = 1...c) Rép. 1 Rép. 2 Rép. 3

xijk = (k = 1...g ) Expérience 1 Expérience 8

Figure IV.13. – Protocole expérimental du test de robustesse en comparaison avec ceux

communément appliqués lors des études inter-laboratoires (c = 3 séries, g = 3 répétitions et
r= 8 expériences) (A). Protocole expérimental appliqué dans le cas de l’étude présente (r = 3
séries, c = 3 répétitions et g = 8 expériences) (B).

119
 Chapitre IV

Avant l’exécution de chaque expérience, le système de CLHP a été équilibré avec la

phase mobile correspondante pendant 3 heures minimum. Suite à la durée de l’exécution des
expériences, il nous a fallu deux jours pour réaliser une série.
Comme l’indique la figure IV.14., l’exécution des expériences commence toujours par
le test d’adéquation du système de CLHP en analysant la solution du mélange prévue à cet
effet, suivie de l’analyse des solutions de référence pour la quantification et celles des
échantillons à examiner (n = 3 répétitions).

Solutions Réponses Réponses Type de

à analyser mesurées calculées réponses

Rs 2-4
tR, Réponses
Solution de Rs 2-3
w½ qualitatives
mélange Autres Rs

Solution de
référence à Aire de pic
1 % de du
R-timolol R-timolol Réponses
Teneur du
quantitatives
R-timolol
Solution à 1
Expériences examiner de Aire de pic
(1, 2…8) maléate de du
S-timolol R-timolol

Solution de Aire de pic

référence à du
0,4 % de S-timolol Réponses
Teneur des
S-timolol quantitatives
autres
impuretés 2
Solution à Aire de pic
examiner de des autres
maléate de impuretés
S-timolol

Figure IV.14. – Représentation schématique de l’exécution du test de robustesse

Légende : tR = temps de rétention des pics ; w½ = largeur du pic à mi-hauteur ; Rs =
résolution ; Rs2-4 = résolution de la paire énantiomérique ; Rs2-3 = résolution de la paire
critique.

120
 Chapitre IV

L’ensemble des analyses a été répété trois fois, constituant ainsi trois séries. Le plan
expérimental a été exécuté de façon aléatoire et en parallèle sur les deux équipements et les
deux colonnes.

IV.3.3.5. IDENTIFICATION ET SELECTION DES REPONSES

Généralement, ce sont les réponses qualitatives qui sont prises en compte pour juger
de la robustesse des conditions opératoires d’une procédure analytique. Dans cette étude, nous
avons considéré aussi bien les réponses quantitatives que les qualitatives. Les premières se
rapportent aux teneurs des impuretés dans les échantillons de maléate de S-timolol et les
deuxièmes à la qualité de la séparation chromatographique évaluée en calculant les
résolutions entre les pics consécutifs et entre ceux des énantiomères du timolol.

IV.3.3.6. RESULTATS D’EXECUTION DES EXPERIENCES

IV.3.3.6.1. Adéquation du système de CLHP et réponses qualitatives

La figure IV.15 montre un chromatogramme typique d’une solution de référence pour

le SST obtenu dans les conditions expérimentales nominales. Les valeurs de la résolution sont
de 1,7 pour la paire critique et de 5,6 pour la paire énantiomérique. Par rapport aux exigences
de la séparation énantiomérique [209], nous pouvons confirmer que le système analytique est
satisfaisant pour le test qualitatif en rapport avec la performance étant donné que la résolution
de la paire énantiomérique est supérieure à 4,0.

121
 Chapitre IV

mAU

A
2

1 3 4

0 5 10 15 20

Temps (min)

Figure IV.15. – Chromatogramme typique d’une solution de mélange

des cinq composés dans les conditions nominales
Légende: Dimère de timolol (1), R-timolol (2), isotimolol (3), S-timolol (4),
dimorpholinothiadiazole (5).

Après l’exécution des différentes conditions expérimentales, nous avons constaté que
les valeurs de résolution pour toutes les expériences étaient au dessus de 1,25 excepté celle de
la résolution entre le R-timolol (pic 2) et l’isotimolol (pic 3). En effet, seulement deux
conditions expérimentales étaient satisfaisantes pour cette paire (expériences 1 et 6) (Tableau
IV.14). Pour la paire énantiomérique, seule une valeur était considérablement en dessous de
4,0 (expérience 7). Par conséquent, quelles que soient les variations introduites au niveau des
facteurs opératoires et en considérant le domaine expérimental examiné, la résolution
énantiomérique (Rs2-4) demeure dans la majorité des cas, un excellent indicateur de
l’adéquation du système de CLHP envers la séparation énantiomérique du timolol. Ainsi, en
se basant sur cette résolution, les différentes conditions expérimentales ont permis d’obtenir
une énantioséparation suffisante des pics du timolol et conviennent donc pour le test de pureté

122
 Chapitre IV

énantiomérique. En revanche, sur la base de la résolution de la paire critique (Rs2-3), la

quantification de R-timolol pourrait être affectée dans un échantillon de maléate de S-timolol
contenant une importante teneur en isotimolol. En vérifiant la pureté les lots d’échantillons
concernés dans ce travail (N° A5800 et A5799) cette situation ne s’est pas présentée (figure
IV.16).

Tableau IV.13. – Performances chromatographiques : résolution (Rs) entre les pics

consécutifs et entre la paire des pics énantiomériques (n = 3)

Paramètres de performance chromatographique

Expériences
Rs 1-2 Rs 2-3 Rs 3-4 Rs 4-5 Rs 2-4
1 2,71 1,28 4,55 3,45 5,82
2 1,64 0,83 3,54 5,00 4,31
3 2,09 0,89 3,10 4,48 3,98
4 3,02 0,40 3,30 1,40 3,92
5 2,38 0,87 3,92 2,57 4,94
6 1,49 1,25 3,51 6,20 4,93
7 1,85 0,59 2,76 3,74 3,45
8 3,18 0,78 3,72 1,89 4,46

IV.3.3.6.2. Réponses quantitatives

Le rapport présenté dans la partie IV.3.2 indique que seul le R-timolol était retrouvé
comme impureté dans les deux lots d’échantillons examinés, ce qui, par ailleurs, est confirmé
par les chromatogrammes présentés dans la figure IV.16.

123
 Chapitre IV

A
mAU
B

2
4

7
6

0 5 10 15 20
Temps (min)

B
mAU

4
2
7

0 5 10 15 20

Temps (min)

Figure IV.16. – Chromatogrammes typiques des solutions de maléate de S-timolol lots

N° A5800 (A) et N° A5799 (B) obtenus dans les conditions nominales
Légende: Dimère de timolol (1), R-timolol (2), isotimolol (3), S-timolol (4),
dimorpholinothiadiazole (5), impuretés non identifiées (6) et front de solvant (7).

124
 Chapitre IV

Par conséquent, la teneur de cette impureté a été déterminée par comparaison de l’aire
de pic normalisée correspondant au R-timolol obtenue avec la solution à examiner de S-
timolol (ANE) par rapport à celle obtenue avec la solution de référence (ANR) en utilisant
l’équation suivante :

A⋅N⋅E
Teneur en R − timolol (%) = ×1% (IV.5)
A⋅N⋅R

L’aire du pic a été normalisée (AN) comme suit :

AN = Aire de pic mesurée X 15,0 / masse pesée (en mg) (IV.6)

Comme le montre le tableau IV.14, les teneurs individuelles sont comprises entre 0,45 % et
0,65 % pour le lot N°A5800 (tableau IV.14.A) avec une moyenne générale de 0,53 % (CV =
3,9 %) et entre 0,25 % et 0,33 % pour le lot N°A5799 (tableau IV.14.B) avec une moyenne
générale de 0,28 % (CV = 4,9 %). Remarquons que ces valeurs sont toujours inférieures à 1,0
% qui est la teneur maximum de l’impureté chirale mentionnée dans la monographie du
maléate de S-timolol [209]. Ces valeurs sont distribuées autour des valeurs moyennes
obtenues dans les conditions nominales qui sont respectivement de 0,53 % et de 0,27% pour
les lots N°A5800 et N°A5799.

125
 Chapitre IV

Tableau IV.14.A. – Teneur du R–timolol (%) dans l’échantillon de maléate de

S-timolol, lot N°A5800

Série 1 Série 2 Série 3 Moyenne (par

Expériences Moyenne Moyenne Moyenne expérience
Rép. Rép. Rép.
(CV) (CV) (CV) (CV)
0,62* 0,51 0,48*
0,58 0,51 0,51 0,53
1 0,55 0,52 0,53
(6,1 %) (1,3 %) (4,9 %) (8,1 %)
0,59* 0,50 0,52
0,55 0,52 0,51
0,54 0,53 0,52 0,53
2 0,53 0,53 0,53
(1,7 %) (0,9 %) (1,5 %) (1,9 %)
0,55 0,53 0,53
0,56 0,52 0,53
0,56 0,53 0,52 0,54
3 0,56 0,54 0,51
(0,5 %) (2,4 %) (1,9 %) (3,8 %)
0,57 0,54 0,52
0,54 0,53 0,54
0,54 0,53 0,54 0,54
4 0,53 0,54 0,55
(1,5 %) (1,0 %) (1,9 %) (1,4 %)
0,54 0,53 0,53
0,55 0,53 0,54
0,55 0,52 0,53 0,53
5 0,54 0,54 0,55
(2,0 %) (4,5 %) (3,0 %) (4,0 %)
0,56 0,49* 0,51
0,53 0,52 0,51
0,53 0,52 0,52 0,52
6 0,54 0,52 0,54
(0,4 %) (0,3 %) (1,4 %) (1,6 %)
0,53 0,52 0,52
0,54 0,53 0,53
0,55 0,55 0,52 0,54
7 0,55 0,53 0,52
(1,0 %) (6,6 %) (1,1 %) (4,4 %)
0,55 0,59* 0,52
0,55 0,54 0,53
0,54 0,54 0,53 0,54
8 0,54 0,54 0,52
(1,2 %) (0,9 %) (1,2 %) (1,7 %)
0,53 0,55 0,52
Moyenne par
0,55 (3,6 %) 0,53 (3,5 %) 0,52 (2,6 %)
série (CV)

Légende : * Valeurs suspectées d’être aberrantes; CV = coefficient de variation ; Rép. = Répétitions

indépendantes

126
 Chapitre IV

Tableau IV.14.B. – Teneur du R-timolol (%) dans l’échantillon de maléate de

S-timolol, lot N°A5799

Série 1 Série 2 Série 3 Moyenne (par

Expériences Moyenne Moyenne Moyenne expérience
Rép. Rép. Rép.
(CV) (CV) (CV) (CV)
0,31* 0,28 0,28 0,26
0,27 0,27 0,27
1 0,26 (9,2 %) 0,27 0,27
(3,8 %) (2,0 %) (5,4 %)
0,26 0,26 0,27
0,30 0,27 0,26
0,29 0,26 0,28 0,28
2 0,28 0,25* 0,29
(4,2 %) (4,2 %) (5,9 %) (5,8 %)
0,28 0,26 0,28
0,32* 0,30 0,30
0,29 0,29 0,29 0,29
3 0,28 0,27 0,28
(11,1 %) (3,9 %) (4,0 %) (6,2 %)
0,26 0,29 0,28
0,29 0,28 0,29
0,28 0,28 0,29 0,28
4 0,28 0,27 0,30
(5,9 %) (1,8 %) (1,8 %) (4,5 %)
0,29 0,29 0,30
0,30 0,28 0,30
0,28 0,28 0,29 0,28
5 0,28 0,27 0,29
(6,5 %) (2,5 %) (2,4 %) (4,4 %)
0,26 0,29 0,29
0,28 0,27 0,28
0,27 0,27 0,28 0,27
6 0,28 0,27 0,28
(5,6 %) (0,7 %) (1,6 %) (3,4 %)
0,25* 0,27 0,27
0,29 0,27 0,28
0,29 0,29 0,28 0,29
7 0,30 0,29 0,28
(5,3 %) (3,1 %) (2,3 %) (3,4 %)
0,27 0,29 0,29
0,29 0,29 0,27
0,28 0,29 0,28 0,28
8 0,28 0,28 0,27
(3,6 %) (1,1 %) (6,4 %) (4,0 %)
0,27 0,29 0,30
Moyenne par
0,28 (6,1 %) 0,28 (4,1 %) 0,28 (4,3 %)
série (CV)

Légende : * Valeurs suspectées d’être aberrantes; CV = coefficient de variation ; Rép. = Répétitions

indépendantes

127
 Chapitre IV

IV.3.3.7. EVALUATION STATISTIQUE DES EFFETS DES FACTEURS

L’effet de chaque facteur X a été calculé en utilisant l’équation suivante :

Ex =
∑ Y (i) − ∑ Y ( j ) (IV.7)
ni nj

avec ∑Y(i) et ∑Y(j) les sommes des réponses lorsque le facteur X est respectivement aux

niveaux + 1 et – 1, ni et nj le nombre d’expériences du plan ayant le facteur X respectivement

aux niveaux + 1 et – 1.
La signification des effets de chaque facteur a été statistiquement évaluée par
comparaison avec le seuil critique (effet critique ou Ecritique) dérivé à partir de la loi t de
Student [5, 6, 18] :

Ecritique = tcritique . (ET)est (IV.8)

avec (ET)est l’erreur type estimée sur un effet et tcritique la valeur du t de Student s’y rapportant.
Un effet est considéré comme significatif si sa valeur absolue est plus grande que celle de
l’effet critique (où la p-value correspondante est inférieure à 0,05). L’erreur type (ET) est
estimée à partir des expériences additionnelles des répétitions dans les conditions nominales
des facteurs [64, 65, 244].
Au vu des résultats des calculs statistiques (Tableau IV.15), nous constatons que les
deux facteurs qualitatifs présentent des effets significatifs sur toutes les réponses qualitatives à
l’exception de la résolution énantiomérique (Rs2-4) pour laquelle aucun effet significatif n’a
été noté avec le facteur équipement de CLHP. En effet, lorsque le type d’équipement de
CLHP est changé (Agilent au lieu de Shimadzu), une faible diminution de la résolution de la
paire critique (Rs2-3) a été observée. Cependant, pour la Rs2-4, elle n’est pas significative.
Par contre, lorsque une nouvelle colonne a été utilisée, une augmentation est observée
pour ces deux résolutions (Rs 2-3 et Rs 2-4), ce qui était logiquement espéré.

128
 Chapitre IV

Tableau IV.15. – Effets des facteurs étudiés*

Réponses qualitatives Réponses quantitatives

Rs 2-3 Rs 2-4 Lot N° A5800 Lot N° A5799

Facteurs qualitatifs

Type d’équipement de CLHP 0,0130 0,1208 0,2761 0,2988

Age de la colonne < 0,0001 < 0,0001 0,5848 0,2262

Facteurs quantitatifs

Fraction de 2-propanol 0,1317 < 0,0001 0,5848 0,8620

Fraction de DEA 0,6287 0,4909 0,6619 0,4875
Débit 0,7877 0,4353 0,5848 0,3860
Longueur d’onde 0,1446 0,2547 0,8268 0,2988
Température de la colonne < 0,0001 < 0,0001 0,1921 0,0069
* Les valeurs significatives au seuil de 5% sont en gras.

Pour les facteurs quantitatifs, la température de la colonne a montré un effet

significatif sur les deux résolutions alors que le 2-propanol a un effet significatif uniquement
sur la résolution énantiomérique (Rs2-4) ce qui, d’un point de vue chromatographique n’est
pas illogique.
Lorsque la température de la colonne augmente, les valeurs des deux résolutions
diminuent. D’autre part, lorsque la proportion du 2-propanol augmente, seule la résolution
énantiomérique (Rs2-4) diminue, alors que celle de la paire critique (Rs2-3) demeure plutôt
constante. Des comportements similaires, notamment pour la Rs2-4, ont été déjà révélés en
phase d’optimisation de la méthode de CLHP. En conséquence, il était important de s’assurer
que quelles que soient les influences de ces deux facteurs opératoires, la quantification du R-
timolol dans les échantillons analysés ne serait pas affectée.
Un examen des résultats des effets de ces facteurs sur les réponses quantitatives
(Tableau IV.15) indique qu’aucun facteur n’affecte la détermination du R-timolol excepté le
facteur température de la colonne pour lequel un effet significatif a été noté pour le lot A5799.

129
 Chapitre IV

Cet effet n’a pas été observé pour le lot A5800 et peut être considéré comme un effet
aléatoire. Il est probable que dans 5 % de cas cet effet puisse survenir.
Comme mentionné auparavant, la robustesse de la quantification du R-timolol est due
aussi à l’absence de l’isotimolol dans les échantillons analysés.

IV.3.4. CONCLUSION

Nous avons démontré que la méthode de CLHP optimisée et validée pour la

détermination du R-timolol et des autres impuretés du timolol dans les échantillons de
maléate de S-timolol demeurent non affectée par les variations délibérées des facteurs
qualitatifs et quantitatifs.
Bien que quelques effets significatifs des facteurs opératoires ont été observés sur les
critères de performances chromatographiques, ces facteurs n’avaient aucune influence
significative sur la quantification du R-timolol, ce qui a démontré la robustesse de la méthode
de CLHP. Toutefois, il serait utile de prendre en compte les problèmes potentiels qui
pourraient survenir lors de l’analyse d’un échantillon contenant de l’isotimolol.
En effet, quelques effets des facteurs ont été observés sur les réponses qualitatives
mais ils n’ont pas affecté la quantification du R-timolol dans les deux échantillons analysés.

130