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CONTENU

Jochen Lang
Pr UB1
jochen.lang@u-bordeaux1.fr

UMR CNRS 5248


Cellules beta-pancréatique et homéostasie glucose
- Transport vésiculaire/exocytose/fusion membranaire
- Signalisation induit par le glucose
- Biosenseurs hybrides (coll. Micro-électronique et diabétologie)

Biologie cellulaire et moléculaire, Biochimie, Electrophysiologie

TD: Pier Scotti


CONTENU

 INTRODUCTION ET RAPPEL
 Rôles des Membranes
 Pliage et destruction de protéines
 Le concept de chaperonnes moléculaires
 le système DnaJ/DnaK (« les petites »)
 le système GroEL/GroES (« les grandes »)
 conclusions
PLIAGE DE PROTEINES I

• « protein folding is a vital biological process as it


adds functional flesh to the bare bones of genes »
(U. Hartl, MPI, Martinsried)

• Structure = Fonction

• Pourquoi un protéine se replie


• Et dans quel environnement?
PLIAGE DE PROTEINES II
PLIAGE DE PROTEINES III
Exemple Ribonucléase
Structures largement feuilles b
L’intérieur: des résidus hydrophobes densement arrangés
L’eau entoure les R polaires à la surface
Coupé en deux
Coupé en deux au milieu
Vue « cartoon » Vue extérieur
au milieu Avec eau

synaptotagmin

Bleu: R polaires
Violet: R hydrophobes
Vert: Eau
PLIAGE DE PROTEINES IV
Propriétés d’acides aminés

From Livingstone, C. D. and Barton, G. J. (1993),


"Protein Sequence Alignments: A Strategy for the Hierarchical Analysis of Residue Conservation",
Comp. Appl. Bio. Sci., 9, 745-756.

http://www.russelllab.org/aas/
PLIAGE DE PROTEINES IV
Rappel structure: Hélice a 1
# « squelette » polypeptide
autour d’une axe imaginaire
H (+)
N
# chaînes latérales (R)
vers l’extérieur R
Ca
# 1.5 A entre acides aminés,
C carbonyl
# un tour O
=5.4 ANGSTROEM (0.54 nm)
= 3.6 Acides Aminés
(donc 3 à 4 acides aminés)

f = -60 j = -50

# stabilisée
par liaison hydrogène entre
hydrogène du N et O du carbonyl;
chaque liaison peptidique participe
(sauf extrémités)

# en générale au moins 8 AA
PLIAGE DE PROTEINES IV
Rappel structure: Hélice a 2
H # - O; +, H
+ N NH
Dipôle de la liaison
+ C peptidique s’étend à
travers de la hélice

C # Les 4 AA des deux


Oa
extrémités de l’hélice ne
participent pas aux
NH liaisons hydrogènes
 déstabilisation

# Contrepoids par AA
N-ter
- avec R chargés (à charge
contraire; négative au
amino terminus, positive
+ C-ter au carboxy terminus)

- 8
O
PLIAGE DE PROTEINES IV
Rappel structure: Hélice a 3

FACTEURS DE STABILITE INSTABILITE:

Interactions entre Rs trois (ou quatre) AA à part

attraction électrique Répulsion


Volume de R (adapté) R grande

trop de Pro ou Gly


dipôle

Interactions entre AA aux extrémités


PLIAGE DE PROTEINES IV
Rappel structure: Feuillet b
FACTEURS DE STABILITE
protéine entière

pH
Liaison de ligand (inclus ioniques)
Ponts disulfures
Résidus intérieurs
FACTEURS DE STABILITE
protéine entière
Exemple: collagène

Source Temp. de fusion Température du corps

Peau de veau 39 37

Peau de requin 29 24-28

Peau de morue 16 10-14

La plupart des protéines sont seulement marginalement stables

Analyse thermodynamique:
État natif d’une protéine seulement 5 - 10 kcal/mol plus stable que la forme deplié
= force d’une seule liaison hydrogène!

Raisons:
* Flexibilité permet changement conformationel = fonction
* Pliage et dépliage lors du transport à travers de membranes
* Désassemblage des complexes/dégradation (régulation)
PLIAGE ET ESPACE

Structure:
Problème de
volume Albumine de sérum humaine, 585 AA, Mr 64.5 kDa

myoglobine:
Différents modes de présentation
ruban/»mesh»/surface/ruban +R/espace

Fraction d’occupation: 0.75


Proche du max théoriquement possible (cristal)
PLIAGE DE PROTEINES V

• Pliage: structure 3D
• Optimalisation de l’espace
• Interactions spécifiques avec autres
protéines

• « Dépliage », Agrégation:
• Exposition de séquences hydrophobes!
PLIAGE DE PROTEINES
• etape nécessaire :
• apres synthèse
• transduction sec a qques minutes
(ca. 50 msec/AA E. coli, 0.5 sec/AA eukaryote)
• collapse hydrophobe qques millisecondes
• - transport a travers de membranes en forme élongée

• domaine: 30-200 AA; contiguë ou pas (feuillet b)


• rôle des interactions faibles (liaisons hydrogènes)
• les protéines sont seulement marginalement stable! (ex collagène)

• les protéines vivent dans un environnement dangereux:


• -protéases
• - dense! (34%)
• # mouvement brownienne
• # Ka entre macromolécules
• - polysomes ! (rapprochement de séquences similaires)
PLIAGE DE PROTEINES
paradoxe de Levinthal a
Peptide de 100 acides aminés
Synthèse en 5 s à 37 C

10 conformations/acides aminés
=10100 conformations

Vibrations moléculaire=1013 s

1077 années

1 ms de la vie
d’une peptide
PLIAGE DE PROTEINES
paradoxe de Levinthal: inter- vs intra moleculaire
CONTENU

• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Rôles des Membranes
• Pliage et destruction de protéines
• Le concept de chaperonnes moléculaires
• le système DnaJ/DnaK (« les petites »)
• le système GroEL/GroES (« les grandes »)
• conclusions
REPLIAGE DE PROTEINES
les membranes (a)
Insertion
membranaire

Chaperonnes:
Habituellement soluble/cytosolique

Ca. 40% des protéines sont


membranaires
Qui les stabilise et les aide à se plier?
REPLIAGE DE PROTEINES VIIb
les membranes b

Un environnement particulièr

cytosol membrane
Gradient pH non oui
Champ électr. Non oui
Protéine/solvant 17% 35%
Mol solvant/prot 15 4
Pression non oui

DG liaison H ~0 +5

très stable!

Bleu = eau Orange = « têtes polaires Vert = chaînes acyl


REPLIAGE DE PROTEINES VII c
les membranes c
Membranes et interfaces
REPLIAGE DE PROTEINES VII d
les membranes d- stabilisation
Stabilisé par
boucles
Stabilisé par
polaires/eau

Avec ligands
Pression latérale

van der Waals

Effets
hydrophobes
REPLIAGE DE PROTEINES
protéines membranaires
“Hydrophobic Mismatch”
Interactions entre membranes et protéines
REPLIAGE DE PROTEINES
protéines membranaires

Changements conformationnels

Sous-domaine et triage de protéines

Radeaux et organisation latérale


REPLIAGE DE PROTEINES
protéines membranaires

Epaisseur de la membrane

« Protein tilt »
ou
Angle d’insertion
CONTENU

• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Rôles des Membranes
• Pliage et destruction de protéines
• Le concept de chaperonnes moléculaires
• le système DnaJ/DnaK (« les petites »)
• le système GroEL/GroES (« les grandes »)
• conclusions
PLIAGE DE PROTEINES
• Mécanismes « protidiques »: chaperonnes,
chaperonines (« chaperonnes à chambre »)

• Mécanismes due à l’architecture cellulaire


• Procaryote: plustot post-transductionnelle
• Eucaryote: plustot co-transductionnelle
protéines plus complexes, plus longues
E. coli: moyenne 35 kDa; 90% <500 aa
levure: moyenne 53 kDa; 60% < 500 aa
• Domaines protidiques: 50-300 AA (archae, pro, eu)
plus de protéines à multiples domaines chez les eucaryotes
• Co-transductionelle: pliage d’une domaine afin la fin de la synthèse de la
prochaine domaine
• Conséquence: par exemple production actine recombinante
2 domaines (tête/queue)
pliage incorrecte dans E. coli
PLIAGE DE PROTEINES IX
survivre dans un espace fortement peuplé et dangereux

Hetero-oligomere oligomere

« arrays pathologiques »
plaques

Pliage avec protéines


« non-chaperonnes »
pliée

Liaison avec
chaperonnes Partiellement
pliée

« aggregats »

Solutions concentrés (34%)


Optimisation d’espace Chaine non-pliée
Mouvement brownien réduit Protéines solubles
Interactions « non-spécifiques » Protéines membranaires
PLIAGE DE PROTEINES IXb
l’agrégation intracellulaire

MTOC

Russell Aggresomes
Maladies hépatiques neurodégénératives
PLIAGE DE PROTEINES IXb
l’agrégation intracellulaire

Movie aggresome
PLIAGE DE PROTEINES IXb
l’agrégation intracellulaire
PLIAGE DE PROTEINES IXb
l’agrégation intracellulaire

Michele Vendruscolo, Proteome folding and aggregation , Current Opinion in Structural Biology Volume 22, Issue 2 2012 138 - 143
CONTENU

• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Rôles des Membranes
• Pliage et destruction de protéines
• Le concept de chaperonnes moléculaires
• le système DnaJ/DnaK (« les petites »)
• le système GroEL/GroES (« les grandes »)
• conclusions
PLIAGE DE PROTEINES XI
les concepts des chaperonnes (b)
• 1911 Chick et Martin : différence entre dénaturation et agrégation
• 1929 Wu : dénaturation : dépliement de proteines (hypothèse), liaisons faibles
• 1945 Anson : preuve expérimentale (hémoglobine)

• repliement in-vitro : ARNase possible (Dogme d’Anfinsen, 1961)
PLIAGE DE PROTEINES XI
ANFINSEN

Toute l’information nécessaire contenu das la protéine


PLIAGE DE PROTEINES XI
ANFINSEN

Forme native = forme la plus stable


PLIAGE DE PROTEINES XI
les concepts des chaperonnes (b)
• 1911 Chick et Martin : différence entre dénaturation et agrégation
• 1929 Wu : dénaturation : dépliement de proteines (hypothèse), liaisons faibles
• 1945 Anson : preuve expérimentale (hémoglobine)

• repliement in-vitro : ARNase possible (Dogme d’Anfinsen, 1961)
• très lente : ca 20 min pour protéine monomérique simple ; in vivo rapide
• paradoxe de Levinthal

• certaines protéines trouvent spontanément leur forme, d’ autres pas
• définition de facteurs : repliement de la ARNase, influenza HA etc avec
microsomes (ER)

• Rôles des ponts disulfures (PDI, ER)


• sucres N-linked oligosaccharides (hCG; biotech, bacteria)
PLIAGE DE PROTEINES X
les concepts des chaperonnes (a)
1978 Laskey « Chaperonnes » nucleoplasmine/histones/ADN
=nucleosomes

1989 Ellis “chaperonnes moléculaires”

Conclusions:
Repliement nécessaire
Chaque protéine peut théoriquement trouver sa bonne forme
mais après combien de temps ???

Chaperonnes:
augmentent efficacité (unité de travail/temps) VITESSE
ne donne pas la forme (pas d’information stérique!)

Seulement quelques protéines nécessitent chaperonnes ?


Tous les protéines nécessitent les chaperonnes ?
Peptides courtes =exception
PLIAGE DE PROTEINES XII
les chaperonnes - classification

• Famille large, partiellement connue seulement


(hsp10,40,60,70,90,100; BiP, calnexine, calréticuline; PDI; proline-isomérase etc.)

• Classification approximative (!)


• « les petits »: <200 kDa
• Hsp70,(DnaK), Hsp40 (DnaJ) Hsp=heat shock protein
rôle du choc thermique

• « les grandes » > 800 kDa (chaperonines, « à chambre »)


• GroEL/GroES (Hsp60/Hsp10)
• TCP-1 (tail-less complex polypeptide 1)
PLIAGE DE PROTEINES XIII

Repliement spontané

Chaperonnes Protéine native

Agrégation

Dégradation
PLIAGE DE PROTEINES XIII
vue générale du système

Plusieurs chaperonnes: Hsp70 et apparentées levure:


DDnaK pas létale ca. 2% de protéines cellulaires
Dtig (TF) pas létale •t 1/2 liaison ca. 15 sec
DDnaK/Dtig (TF) létale synthétique •Peptide naissant liée à un hsp pendant sa synthèse
Substance testée: luciférase
PLIAGE DE PROTEINES XIII
vue générale du système
Rôles biologiques de chaperonnes:
Assistance au pliage (substrats)

Guidage à travers des membranes biologiques


(cis et trans)

Désassemblage des oligomères

Faciliter la dégradation

Control de l’activité de complexes protidiques


• Cdk: progression vers G1
• eIF2a-kinase: initiation de la translation
• Raf-1: MAP-kinase (traduction de signaux)
• NOS: production NO (traduction de signaux)
CONTENU

• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Rôles des Membranes
• Pliage et destruction de protéines
• Le concept de chaperonnes moléculaires
• le système DnaJ/DnaK (« les petites »)
• le système GroEL/GroES (« les grandes »)
• conclusions
PLIAGE DE PROTEINES XIV
le système DnaJ/DnaK (« pétites »)

Trois composants:
PLIAGE DE PROTEINES XV
le cycle DnaK/DnaJ
Peptide à plier

relargage

ADP: haute affinité


ATP: basse affinité

DnaJ stimule ATPase


GrpE stimule échange
(ca 5000x)

pliage
PLIAGE DE PROTEINES XVb
comment DnaK prend en charge une protéine

DnaK

Le substrat
PLIAGE DE PROTEINES XVI
la famille DnaJ

PROTEINES AVEC DOMAIN J ET LEURS FONCTIONS


Auxilin clathrin uncoating
Sec63p translocation
DNA tumor virus T antigen réplication
Csp exocytosis
TID56 suppression de tumeurs
Mdj2p import mitochondriale
Hsj1 fonction des neurones
PLIAGE DE PROTEINES XVI
comment tester pour activer chaperone?

- Activité Luciférase

- Sensibilité protéolyse
PLIAGE DE PROTEINES XVII
« les grandes »

« TIM barrel »: pliage des enzymes


PLIAGE DE PROTEINES XVIII a
qui passe par ou? (a)

Différence de taille:
Label radioactive pour peptide Hsp70: 10 to 50
nouvellement synthétisé GroEL: 20 to 80
Imminoprécipitation avec anti GroEL pI vers 6 (pourquoi?)
PLIAGE DE PROTEINES XVIII a
qui passe par ou? (a)

Distribution génome E. Coli (jaune)


Protéine exprimé au cours de 15s à 30°C (bleu)
Liaison à GroEL à l’intérieur d’E. coli à 37°C (verte)
Liaison à DnaK à 40°C (rouge)
CONTENU

• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Rôles des Membranes
• Pliage et destruction de protéines
• Le concept de chaperonnes moléculaires
• le système DnaJ/DnaK (« les petites »)
• le système GroEL/GroES (« les grandes »),
Rubisco
• conclusions
PLIAGE DE PROTEINES XIX
système GroEL - GroES
GroEL: 2 heptamères (2x7x60 kDa); 2x7 sites de liaison ATP; hsp60
GroES: 10 kDa
14 nm
18 nm

ATP
PLIAGE DE PROTEINES XIX
système GroEL - GroES
GroEL (ADP) GroEL-GroES (ATP)

hydrophobe peptide
Force: ca 500 pN
PLIAGE DE PROTEINES XIX
système GroEL – GroES
les poches hydrophobes

GroES

GroEL
PLIAGE DE PROTEINES XX
dynamique de GroEL - GroES
GroEL

GroEL/ATP-GroES
GroEL GroEL/ATP-GroES

Changement de forme
•Agrandissement chambre réaction
• Cacher points hydrophobes
•. Chambre devient hydrophile
PLIAGE DE PROTEINES XXI
le cycle GroEL - GroES

Encapsulation
Pliage
« actif »

Haute affinité Encapsulation


pliage
Plages hydrophobes
Haute affinité vers non-pliée: « unfoldase »
T ca. 20s; éjection ca. 15 s; coopérativité cis/trans T, ATP; D, ADP
Coût de l’opération: ca. 350 kcal/mol; 10% synthèse
CONTENU

• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Rôles des Membranes
• Pliage et destruction de protéines
• Le concept de chaperonnes moléculaires
• le système DnaJ/DnaK (« les petites »)
• le système GroEL/GroES (« les grandes »)
• conclusions
PLIAGE DE PROTEINES XXII
les arrangements
PLIAGE DE PROTEINES XXIII
résumé
PLIAGE DE PROTEINES XXIV
pliage et destruction – »les agents doubles »
Pliage Dégradation

geldamycine

interactions: domaines TPR (tetratricopeptide repeats)


PLIAGE DE PROTEINES XXIV
autres chaperonnes
Autres chaperonnes :
HSP90 dimère de ca. 180 kDa
lie ATP, agit souvent avec autres chaperonnes
réagit avec quelques protéines spécifiques,
p.e; CFTR; eIF2alpha kinase
rôle ? Tampon de variation génétique?

HSP100 « ring-like », mais plus petit que HSP60


rôle dans les prions de la levure

Calnexin, calreticulin, PDI, PPI/TF

Co-chaperonne:
Csp?, auxilin (« uncoating »), BAG-1 (anti-apoptotique) etc…

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