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Travaux Dirigés

Exercice 1
On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique,
la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine
polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-).
Les pH isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de
la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C.
On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en
amenant progressivement le pH à 7.
Question :
1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ?
(On considérera que les interactions acide aminé-résine
sont uniquement d'ordre électrostatiques).
1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions.
Une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate
(-SO3-) est chargée négativement et est donc une résine échangeuse
de cations.

Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi),


l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique).

Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi),


l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique).
Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids aminés, à pH = 2 et à pH = 7.

acide aminé : pHi : charge à pH = 2 : charge à pH = 7 :

Acide L-Glutamique (Glu) 3,22 + -


L-Leucine (Leu) 5,98 + -
L-Lysine (Lys) 9,74 + +

Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement,


et seront retenus lors du passage sur la colonne.
A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé
à la colonne. Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).
Exercice 2

La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur


de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par
des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH).

Questions :
1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés
négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que
le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76).

2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c


(pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont
retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que
les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement
d'ordre électrostatiques).
Correction

1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76)


chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9.

Le pH est donné par la relation suivante :

À pH = 7 : = pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24 donc = 173,78


:
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), on en déduit que (A) +
173,78(A) = 100

(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(174,78)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) =
99,425
2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme
basique, chargée négativement (-CH2-COO-).

Protéine : pHi : Charge à ph = 7 :

Ovalbumine 4,6 négative


Cytochrome c 10,65 positive
Lysozyme 11 positive

Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement,


ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme
seront retenus.
Exercice 3

Pour effectuer une filtration, on utilise une cuve séparée


en 2 compartiments A et B par une membrane. Dans le
compartiment A, on place une solution de glucose à 10 mmol/litre.
Dans le compartiment B on place de l'eau distillée.
1) Schématiser le dispositif expérimental et légender.
2) Le glucose est-il une molécule hydrophile ou hydrophobe? Justifier.
3) Donner la concentration à l'équilibre dans le compartiment A
et dans le compartiment B. Justifier.
4) Comment peut-on épuiser le glucose présent
dans le compartiment A par dialyse ?
Dans une deuxième expérience, en introduit dans le compartiment A,
une solution de glucose à 10 mmol/litre. Dans le
compartiment B on place une solution de glucose à 20 mmol/litre.
5) Dans quel sens le flux de glucose va-t-il se diriger? Justifier.
6) Donner la concentration à l'équilibre dans le compartiment A et
dans le compartiment B. Justifier.
Solution

2) Le glucose est une molécule hydrophile car elle est polaire (groupement hydroxyle
-OH), elle est capable de créer des liaisons hydrogènes avec l'eau.
3) A l'équilibre le compartiment A et dans le compartiment B ont 5 mmol/L. Le
gradient de la concentration du glucose va permettre le passage de cette molécule
vers le compartiment B jusqu’à l’équilibre c-à-d, des concentrations égales dans les
2 compartiments A et B
[GA] = [GB] et [GA] + [GB] = 10 mM ⴬2 [GA] = 10 m ⴬[GA] = 10/2 = 5 mM
4) En renouvelant continuellement la solution
du compartiment B.
5) Du compartiment B vers le A car les
molécules suivent leur gradient de
concentration qui est élevée dans B et faible
dans A.
6) 15 mmol/L [C = (20 + 10)/2 = 15 mmol/L]
Exercice 4
Un mélange de macromolécules a été séparé par
chromatographie d’exclusion-inclusion.
L’élution a permis de récupérer
des fractions de 2 ml de volume chacune et le
contenu de ces fractions a été suivi par densité
optique à une même longueur d’ondes. Le
résultat est mentionné dans le profil ci-après :
1) Schématiser le dispositif expérimental de cette chromatographie.
2) Déterminer le volume mort.
3) Combien de macromolécules différentes contenait le mélange ?
4) Quelle est la macromolécule la plus abondante dans le mélange ?
Justifier votre réponse.
1-
2) Le volume mort correspond au liquide en dehors des
grains du gel de la résine. Il correspond au volume du pic
de la première molécule exclue. Il est de 2 ml.

3) Les 3 pics correspondent à 3 macromolécules


différentes.

4) La molécule contenue dans la dernière fraction est la


plus abondante car la surface de son pic est la plus
importante.
Exercice 5

Une chromatographie d’un mélange réactionnel a été


effectuée sur couche mince.
Après avoir tracé une ligne de dépôts à 2 cm du bord
inférieure de la plaque et déposé un échantillon grâce à
un capillaire et après une heure d’élution dans un bécher
couvert par un verre de montre et contenant l’éluant, ce
dernier a présenté un front de migration à 9 cm de la
ligne de dépôt.
La révélation a été réalisée sous UV et a montré 3 taches
a, b et c, distantes de la ligne de dépôt de respectivement
2, 5 et 7 cm.
1) Faire un schéma du montage chromatographique sachant
que le bord inférieur de la plaque touche le fond du bécher.

2) Quel doit être la hauteur maximale de l’éluant dans le bécher


et pourquoi ?

3) Positionner sur la plaque rectangulaire de 3 x 10 cm, le


niveau du front de migration et les taches obtenues après
révélation et calculer leurs Rf.

4) Classer les produits a, b et c par ordre de polarité croissante.

5) Pour permettre au produit a de migrer plus loin, a-t-on intérêt


à utiliser un solvant de polarité supérieure ou inférieure
au 1er éluant utilisé ? justifier votre réponse.

6) La tache b est soupçonnée contenir plus d’un produit.


Comment pourrait-on séparer ce mélange ?
Solution

2) La hauteur maximale de l’éluant dans le bécher doit être


inférieure à 2 cm pour qu’il ne touche pas l’échantillon déposé.
Rf = Hauteur de migration du soluté / Hauteur du front de migration

Rf (a) = 2/9 = 0,22 ; Rf (b) = 5/9 = 0,55 ; Rf (c) = 7/9 = 0,77


4) Classement par ordre de polarité croissante : c < b < a
(Plus un composé est polaire, plus il s’accroche au
support, moins il migre avec l’éluant).

5) La polarité du solvant doit être supérieure à celle de


l’éluant ; le solvant polaire va mieux attirer le soluté et
permettre son décrochage du support et sa migration
rapide vers le haut.

6) Pour dévoiler la composition exacte de la tache b, on


peut procéder par une chromatographie de la seconde
dimension (chromatographie bidimensionnelle).
Exercice 6
Trois échantillons ont été séparés par la chromatographie en couche mince (CCM) en
utilisant plusieurs solvants (éluant) avec des polarités croissantes.

1) Interpréter les résultats des chromatogrammes ci-dessous.


2) Quel est l’éluant le plus polaire dans le solvant ? Justifier votre réponse.
Solution

1) L’éluant est composé de l’hexane seul ou mélangé avec des


proportions croissantes de l’acétate d’éthyle. Ce dernier apporte
plus de polarité au solvant, ce qui explique une migration de plus
en plus prononcée vers le haut. En présence de l’hexane
seul, il n’est pas possible de mobiliser les échantillons déposés
(solvant non polaire). L’échantillon 1 est composé d’une seul
espèce moléculaire, le deuxième comporte un composé moins
polaire (celui du haut) et un plus polaire (celui du bas). Le 3ème
dépôt comporte un seul soluté.

2) L’éluant le plus polaire est celui composé par 70%


d’hexane et 30% d’acétate d’éthyle. Ce dernier est un acide
qui lui confère une polarité élevée.
Exercice 7
Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine P
par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel
se situe entre 40000 et 400000 de MM.

L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons)
et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :

MM (Da) Ve (ml)
Dextran 2000000 45
Fibrinogène 340000 60
Catalase 230000 75
Lactoglobuline 19000 132

1 - Rappeler à quoi correspond le Dalton.


2 - La protéine P montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml.
Déterminer sa MM.
Solution

1 - LeDalton est une unité de masse atomique et correspond à


1,66 . 10-27 kg. La masse moléculaire d'un composé s'exprimera
soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter
que l'abréviation de dalton s'écrit avec un D majuscule : Da et
que le kilodalton s'écrit kDa.

2 - Afin
de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine
p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer la représentation du
log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous
représente le tracé de log (MM) = f(Ve) pour les composés
suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline.
2 - Afin
de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine
p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer la représentation du
log (masse moléculaire) = f(Ve).

Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la


masse moléculaire :

MM
Ve (ml) log MM
(Da)
Dextran 2000000 45 6,3
Fibrinogène 340000 60 5,53
Catalase 230000 75 5,36
Lactoglobuline 19000 132 4,28
Le schéma ci-dessous représente le tracé de log (MM) = f(Ve) pour les composés
suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline.

Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un
log MM = 4,93, soit une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la
protéine p.
Il est très important de noter que :

- 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire


le volume d'élution des substances exclues (ici, le dextran).

- 132 ml représente le volume d'exclusion des protéines totalement


incluses.

- la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants


au fibrinogène et à la catalase, car le dextran est un composé totalement
exclu, alors que la lactoglobuline est une protéine totalement incluse dans
le gel.
Exercice 8
• Une solution protéique à pH = 7 est composée
de 3 protéines, A, B et C.
• B et C sont des monomères alors que A est
composée de 2 sous unités A1 et A2 de même
masse moléculaire. A et C ont le même pHi 4,2
Celui de B est de 8,3.
• A, B et C ont la même masse moléculaire mais
des propriétés antigéniques différentes .
• Quels sera l’ordre d’élution des protéines de la
solution lorsqu’elle est soumis à:
• 1- une chromatographie échangeuse d’anions?
• 2-une chromatographie d’exclusion (limite
d’exclusion 300 000) ?
• 3- une chromatographie d’exclusion après
traitement des 3 protéines par l’urée 8M
(dissocier les liaisons faibles)?
Représenter le profil ces protéines quand on
procède à:
4- une électrophorèse sur gel en présence de
SDS
5- une électrophorèse sur gel se présence de
SDS de la solution préalablement traitée au il
de migration β mercaptoéthanol (dissocier les
ponts des sulfures)
6 Citer la ou les techniques qui permettent de
séparer le plus efficacement les 3 protéines en
même temps. Justifier la réponse.
Exercice 9 : Spectroscopie
1)

2)
Solution
1)
2)
Exercice 10 (Extraction):
L’extraction de l’huile essentielle de lavande s’effectue à
l’aide d’un montage à l’entraînement à la vapeur (ou
hydrodistillation) représenté ci-dessous.
1) Compléter le schéma ci-dessous en utilisant les termes
suivants :
Chauffe-ballon / Ballon à fond rond / Réfrigérant à eau / Arrivée
d’eau froide / Sortie d’eau tiède / Support élévateur / Erlenmeyer.

2) Quel est le rôle de la vapeur d’eau ? Celui du réfrigérant à eau ?


3) Afin de récupérer l’huile essentielle du distillat, on effectue une extraction
par solvant. On introduit dans une ampoule à décanter le distillat, 10 ml
d’eau salée et 10 ml du solvant extracteur. On bouche et après agitation, on
laisse décanter.
Quel est l’intérêt d’ajouter de l’eau salée ?
4) A l’aide des données du tableau ci-dessous, quel solvant extracteur peut-
on choisir ? Justifier.
Exercice 11 :
L'hémoglobine est un pigment de coloration rouge contenu dans les
globules rouges qui peut être modélisée par une
sphère. On se propose d'étudier la sédimentation de l'hémoglobine
contenue dans le sang par décantation puis par
centrifugation.

On donne :
- r : rayon de la molécule d'hémoglobine ; r = 5,00 10-9 m
- ρ sa masse volumique=1,35 103 kg m-3
- ρs : masse volumique du sang = 1,05 103 kg m-3
- η : viscosité du sang = 4,0 10-3 Pa s
- g : accélération de la pesanteur = 9,81 ms-2
- a : accélération de la rotation
- Volume d'une sphère v= 4/3 π r3
- Loi de Stokes : la force de frottement sur une particule sphérique de rayon
r en mouvement dans un liquide de
viscosité η s'écrit f = - 6πrη v (v : vitesse de la particule)
1) Donner sous la forme d’un schéma, les forces qui s’exercent
sur la molécule au cours d’une décantation.
2) Ecrire l’expression de vitesse de sédimentation de la
molécule et calculer sa valeur v1.
3) Quelle serait la durée t1 (en années) nécessaire pour que la
molécule sédimente sur une distance de 1 mm ?
4) L’hémoglobine a été sédimentée également par
centrifugation dans une centrifugeuse ayant une distance entre
l’axe du rotor et le milieu du tube, R = 6 cm. Déterminer
l’accélération sachant que la vitesse angulaire ω est de 1,57
103 rad/s.
5) Calculer l’amplification de l’accélération (Z) en nombre de g.
6) Quelle serait la durée de centrifugation t2 (en heures)
nécessaire pour que la molécule sédimente sur une distance
de 1 mm ?
7) Conclure quant au temps de la sédimentation par la seule
force de la pesanteur et celui de la centrifugation.
Solution
1)

2)

3) V= d/t donc t= d/v

4)
5) Z= a/g

6)

T2= d/V2

7)
T1/T2

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