C. Difficile Toxin A &B

NUEVO SANATORIO DURANGO S.A. DE C.V.
MANUAL DE POLITICAS Y CLAVE

PRT-NSD-LAB-37
PROCEDIMIENTOS
F. de
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS C. difficile elaboración:
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
LABORATORIO Hoja: 2 de 7
SISTEMA DE GESTIÓN DE CALIDAD ISO-9001-2008/NMX-CC-9001-IMNC-2008
OBJETIVO:
Contar con un procedimiento técnico para la detección de anticuerpos C. difficile Toxin A &B
empleando el ensayo inmunoenzimatico automatizado en el sitema VIDAS.
ALCANCE:
Este método inicia desde la toma de muestra a los pacientes en el Laboratorio, hasta la entrega
de los resultados, asegurando la calidad de los mismos.
REFERENCIAS:
Inserto de la prueba C. difficile Toxin A &B para equipo VIDAS.
Manual de operación del equipo VIDAS.
RESPONSABILIDADES:
• Del Jefe de Laboratorio:
Supervisar el procesamiento de los especímenes biológicos en todas sus fases; Preanatítica,
Analítica y Postanalítica. Proveer de los insumos necesarios para el adecuado procesamiento
de la prueba de laboratorio de detección de anticuerpos C. difficile Toxin A &B
• Del Químico y del Técnico Laboratorista
Procesar y reportar en tiempo y forma el estudio de laboratorio de detección de anticuerpos C.
difficile Toxin A &B
Procesar y validar el control de calidad interno y cuando aplique el control de calidad externo.
• Del Flebotomista
Realizar la toma de muestra de forma eficiente.
Observar las metodologías vigentes.
NOMBRE / PUESTO / FIRMA

ELABORÓ: REVISÓ: AUTORIZÓ:
QBP. Octavio Novoa Farias Ing. Ma. Elena Aguilar John Dra. Irene Borges Carrete
Jefe Técnico de Laboratorio Coordinador de Procesos Director Médico
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PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
PROCEDIMIENTO:
INSTRUMENTACION:
VIDAS®
FUNDAMENTO:
En principio del ensayo combina el método inmunoenzimatico tipo sándwich en dos etapas con
una detección final por fluorescencia (ELFA).
El cono (SPR®) sirve a la vez de fase sólida y de sistema de pipeteo. Los reactivos para el
ensayo están listos para su empleo y predistribuidos en cartuchos sellados.
El equipo realizar las iv etapas del ensayo de forma automática. Los reactivos experimentar un
ciclo de aspiración/expulsión del cono. Tras cada etapa, los elementos que quedan libres son
eliminados por lavado:
-la fijación específica de la toxina A y/o la toxina B presente en la línea bajo muestra con los
anticuerpos de la toxina A (policlonales de conejo) ul de y los anticuerpos de la antitoxina
B( monoclonales de raton) que recubren el interior del cono.
- La formación de un complejo biotinilado de la toxina A y los anticuerpos de la Antitoxina A
(monoclonal de ratón) conjugado con biotina y un complejo biotinilado de la toxina B y los
anticuerpos de la antitoxina B(monoclonal de ratón) conjugado con biotina.
- La presencia de biotina se detecta gracias a la incubación con la estreptavidina con fosfatasa
alcalina.
- Deteción: la fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis del sustrato( 4- Metil-umbeliferil-fosfato) en
un producto fluorescente(4- Metil-umbeliferilona). La intensidad de la fluorescencia se mide a
450 nm.
La intensidad de la fluorescencia aumenta según la cantidad de toxinas A y B en la muestra.
Al terminar el ensayo VIDAS Clostridium difficile toxina A y B, el equipo analiza
automáticamente los resultados y proporciona un Valor de test y se imprime un resultado de
cada muestra.
TOMA DE MUESTRAS:
Tipo de muestra, su recogida y conservación:

Se deben recoger muestras de heces según los procedimientos habituales del laboratorio. Se
conservan a 2-8 de grados centígrados hasta que se vayan a procesar.
Transportar las muestras al laboratorio tan rápido como sea posible, tras su recogida. Las
muestras de heces pueden conservarse a hasta tres días (a partir de su recogida) a 2-8 ºC
antes de procesarlas, sin importantes pérdidas al detectar toxina a y B de clostridium Dificile.
No se recomienda conservarlas a 2-8 ºC durante más tiempo. Se puede conservar la muestra
congelada a -25 ± 6 ºC durante un mes hubo a una temperatura de -70ºC (o más baja). Evitar
sitios de congelación y descongelación sucesivos.

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PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
Un escobillón rectal no proporcionará suficiente muestra para el ensayo y por lo tanto resulta
inaceptable. Evitar recipientes que pudieran contener detergentes, conservantes o medios, ya
que pudieran interferir con los resultados del ensayo VIDAS Clostridium difficile toxina A y B.
Calibrador, controles y preparación de la muestra para el ensayo CDAB:

Muestras:
Importante: resulta crítico que las muestras de heces esten mezcladas perfectamente antes de
comenzar su procesado. La carencia de homogeneidad de dicha muestran pudiera arrojar
resultados incorrectos. La mezcla cuidadosa de las muestras de heces es esencial para
prevenir este problema. La muestra diluida debe ser homogénea tras su mezcla, lo que
ayudara a garantizar que los resultados sean válidos.
Heces líquidas:
Mediante una pipeta de transferencia, agregar 200 µL de las heces líquidas bien
homogeneizadas el tubo de centrifuga;
Pipetear 1000µL de diluyente de la muestra (R1) en un tubo de centrifuga bien.
3. Homogeneizar en una mezcladora tipo vortex hasta que la muestra este homogénea.
Resulta esencial que todas las partes de la muestra estén mezcladas de forma uniforme con el
diluyente de la muestra (R 1);
4. Centrifugar durante cinco minutos a 2-25ºC a un mínimo de 12000;
5. Se necesita un mínimo de 300µl de sobrenadante para procesarlo con el ensayo VIDAS
Clostridium difficile toxin A y B.
Heces semisólidas o solidas:

1. Con el fin de garantizar la transferencia de 200 mg de heces semisólidas o solidas,
poner 200 µL de agua destilada en un tubo de centrifuga limpio, este tubo se usara
como “tubo calibrado.”
2. Con un calibrador de madera, transferir una cantidad de heces (200 mg) equivalente al
volumen en el tubo calibrado en un nuevo tubo de centrifuga limpio identificado como
tubo de muestra (ver a continuación):
Nota: eliminar el tubo calibrado tras transferir cada una de las muestras de heces solidas o
semisólidas.
3. Agregar 100 µL de diluyente de la muestra (R1) al tubo de la muestra.
4. Homogeneizar con una mezcladora tipo vortex hasta que toda la muestra este
homogénea. resulta esencial que todas las partes de la muestra estén mezcladas de
forma uniforme con el diluyente de la muestra (R1):
5. Centrifugar durante 5 minutos a 2-25º C a un mínimo de 12.000 g;
6. Se necesita un mínimo de 300 µL del sobrenadante para procesarlo con el ensayo

VIDAS C. difficile Toxin A &B.
Nota:

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PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
− Si hubiera partículas de material lipidico en la superficie del sobrenadante tras la

centrifugación, recoger la muestra de la capa superficial;
− Cuando las heces semisólidas sean más liquidas que solidas, se puede realizar la
preparación de la muestra según las instrucciones indicadas para heces liquidas (ver
arriba).
CONTROL DE CALIDAD:
a) CONTROLES: Se incluyen dos controles positivos y un control negativo en cada kit de

VIDAS C difficile toxin A&B. deben realizarse dichos controles en el momento de abrir un nuevo
kit con el fin de garantizar la ausencia de alteración de los reactivos. También se deben
analizar los controles positivos y negativos con cada calibración. Además, cada laboratorio
podrá realizar sus propios controles sobre el ensayo según lo especificado en las directrices
reguladoras del laboratorio. En este caso, se deben procesar los controles igual que las
muestras de los pacientes y pipetearlos directamente en los pocillos de muestra de los
cartuchos de los reactivos VIDAS C difficile toxin A&B.El equipo solo podrá analizar los valores
de control del kit que estén identificados como C1, C2 y C3.No se podrán validar los resultados
de la muestra si los valores de control se desviasen de los valores esperados.
Nota:
Es responsabilidad del usuario garantizar que el control de calidad se realiza conforme a la
legislación local en vigor.
b) PROGRAMACION DEL CONTROL: la calibración, con ayuda del calibrador incluido en la

caja, debe efectuarse cuando se abra un nuevo lote, después de introducir las especificaciones
del lote patrón. Se debe efectuar una recalibración cada 14 días. Esta operación le permite al
sistema ajustar los datos de la curva de calibración a las posibles variaciones menores en la
señal de ensayo a lo largo de la vida útil del kit.
El estándar, identificado por S1, se analizara por duplicado (ver manual de utilización). El valor
del estándar, debe estar comprendido en los limites RFV “Relative Fluorescence Value” fijados.
Si este no fuera el caso: repetir la calibración.
c) LIMITES: Los intervalos asignados a estos controles estan basados en pruebas repetidas
de muestras representativas de este producto realizadas en colaboración con los laboratorios
que siguen los protocolos establecidos. Todos los valores se han asignado usando el/los
instrumentos y reactivos de los fabricantes de esos instrumentos disponibles en el momento
de realizar las pruebas. Los valores previstos pueden variar ligeramente con el uso de
diferentes reactivos y/o metodologias. Consulte la tabla adjunta del inserto para ver los valores
obtenidos en los sistemas especfficos. Los valores indicados son especificos para este lote de
control exclusivamente.
d) INDICACIONES DE SEGURIDAD: Contiene componentes de origen humano. Ningún
método de análisis actualmente conocido puede garantizar de forma absoluta que estos
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PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
productos no contienen ningun agente patógeno transmisible. Se recomienda manipularlos

con las precauciones de uso relativas a los productos potencialmente infecciosos (consultar
Manual de Bioseguridad en el laboratorio -OMS- ginebra, ultima edición). Contiene
componentes de origen animal, puesto que el control sobre la procedencia y/o estado sanitario
de los animales no puede garantizar de forma absoluta que estos productos no contengan
ningún agente patógeno transmisible, se recomienda manipularlos con las precauciones de
uso relativas a los productos potencialmente infecciosos (no ingerir, no inhalar).
e) ACCIONES CORRECTIVAS: El valor de calibrador debe estar comprendido dentro de los
limites de RFV (Valor Relativo de Fluorescencia) fijados.- En caso contrario, volver a efectuar
la calibración.
REACTIVOS Y ESTANDARES
Composición de los reactivos del equipo (60 pruebas)

60 cartuchos CDAB STR Listos para su uso
60 conos CDAB SPR Listos para su uso
2 x 30 Anticuerpos policlonales de conejo anti-toxina A y
monoclonales de ratón anti-toxina B de C. difficile.
1 Diluyente de R1 Listo al empleo. Tampón TRIS 0.05 mmol/l(pH
muestra 7.2)+ Suero de ternera fetal 50%
(1x61 ml)(liquido) +detergente+conservantes.
Control positivo C1 Dilución recombinante de toxina A de C. difficile en
TOXINA A TRIS tamponada 0.05 mol/l(ph 7.2)+ BSA 5% +
(1X4 ml) (liquido) conservantes
Control negativo C2 Tampón TRIS salino 0.05 mol/L(pH 7.2)+BSA 5%
+conservantes. Se indica el rango de valores de la
1 x 4 ml (liquido) prueba en la tarjeta MLE tras la indicación
siguiente:”Control 2(-) Test Value Range”
Control positivo C3 Dilución recombinante de toxina B de C. difficile en
TOXINA B TRIS tamponada 0.05 mol/l(ph 7.2)+ BSA 5% +
(1X4 ml) (liquido) conservantes
Calibrador S1 Dilución recombinante de toxina A de C. difficile en
CMVG TRIS tamponada 0.05 mol/l(ph 7.2)+ BSA 5% +
1 x 2 ml (liquido) conservantes
1 Tarjeta MLE Ficha de especificaciones con los datos de
(Master Lot Entry) fabricación necesarios para la calibración de la
prueba.
1 Ficha
*Se ha comprobado la ausencia de antigeno HBs, de anticuerpos anti-VIH1 y anti VHC. No
obstante, puesto que ninguna prueba puede aportar una garantía absoluta, este producto debe
ser manipulado con las precauciones de uso relativas a los productos potencialmente
infecciosos.
Precauciones de empleo de los Reactivos:

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PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
a) Este equipo contiene compuestos de origen humano. Ningún método de análisis

actualmente conocido puede garantizar de forma absoluta que estos productos no
contienen ningún agente patógeno transmisible. Se recomienda manipularse con las
precauciones habituales de los productos potencialmente infecciosos (consultar el
manual de Bioseguridad en el Laboratorio -OMS- Ginebra, ultima edición).
b) No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del
equipo.
c) No mezclar los reactivos (o consumibles) de lotes diferentes.
d) No utilizar los conos cuya bolsa este perforada.
e) No utilizar cartuchos visiblemente alterados (hoja de aluminio o de plástico dañada)
f) La eliminación de los reactivos utilizados o no empleados, así como de otros materiales
desechables contaminados deben seguir los procedimientos para productos
infecciosos o potencialmente infecciosos.
g) Los guantes no deben tener talco, ya que puede producir resultados falsos con ciertos
test inmunoenzimaticos.
h) Los reactivos del equipo contienen un conservante (azida de sodio), susceptible de
reaccionar con las tuberías de plomo o de cobre formando azidas metálicas explosivas.
Se recomienda enjuagar con agua.
i) El substrato (pocillo 10 del cartucho) contiene un agente irritante (dietanolamina). Tener
en cuenta la fase de riesgo “R” y los consejos de prudencia “S” citados.
j) Las salpicaduras deben ser tratadas con un liquido detergente o una solución de lejía
con al menos 0.5% de hipoclorito de sodo. Ver manual de usuario para eliminar las
proyecciones sobre o en el interior del VIDAS. No someter a autoclave el producto con
lejía.
k) Los elementos del modulo VIDAS deben ser regularmente limpiados y
descontaminados (ver manual de usuario).
Conservación del kit:

• Conservar el kit VIDAS C. difficile Toxin A &B entre 2-8ºC
• No congelar los reactivos.
• Dejar de 2-8ºC los reactivos no utilizados.
• Cuando se habré un kit, verificar la integridad y el correcto cierre del (de las) bolsa (s)
de los conos. En caso contrario, no utilizar los conos.
• Después de cada utilización, cerrar bien la bolsa con su deshidratante para mantener la
estabilidad de los conos y poner al equipo a 2-8ºC.
• Todos los compuestos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta
del envase, si se conserva si se conserva en las condiciones recomendadas.
PREPARACION DE REACTIVOS
Entrada de datos del lote patrón
Nota: al emplear el ensayo por primera vez, es imperativo introducir los datos del protocolo de
VIDAD PTC (código de barras al final de la ficha técnica) antes de realizar la lectura de la
tarjeta MLE. Si se hubiera leído la tarjeta MLE antes de los datos de protocolo de VIDAS PTC,
volver a leer la tarjeta MLE.
Antes de usar cada nuevo lote de reactivos se deben introducir en el equipo (VIDAS o mini
VIDAS) las especificaciones (o datos maestros de la curva de calibración de fábrica)
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PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
empleando la tarjeta de lote patrón MLE (hoja de especificaciones) incluida en cada kid. Si no
se realiza esta operación antes del inicio de las determinaciones, el equipo no podrá imprimir
los resultados. Los datos del lote patrón se introducen solo una vez para cada lote.
Se pueden introducir los datos de forma automática mediante el uso de la tarjeta MLE o
manualmente.
Calibración
La calibración, con la ayuda del calibrador incluido en la caja, debe efectuarse cuando se abra
un nuevo lote, después de introducir las especificaciones del lote patrón.se debe efectuar una
re calibración cada 14 días. Esta operación le permite al sistema ajustar los datos de la curva
de calibración a las posibles variaciones menores en la señal de ensayo a lo largo de la vida útil
del kit.
E estándar, identificado por S1, se analizara por duplicado (ver manual de utilización). El valor
del estándar, debe estar comprendido en los limites RFV “Relative Fluorescence Value” fijados.
Si este no fuera el caso: repetir la calibración.
b) PROCEDIMIENTO DEL PROCESO:
1. Sacar únicamente los reactivos necesarios del refrigerador.
2. Utilizar un cartucho CDAB y un cono CDAB del kit para cada muestra, control o
calibrador a analizar. Verificar que la bolsa de conservación ha sido cerrada tras retirar
los conos necesarios.
3. Teclear o seleccionar “CDAB” para introducir el código de ensayo CDAB. Se debe

identificar el calibrador por “S1, y realizar el ensayo por duplicado. Si resulta necesario
probar los controles positivos, se deben identificar por “C1” y”C3”. Si debe probar el
control negativo, debe identificarse por C2.
4. De calibrador, el sobrenadante de la muestra procesada o el control en el pocillo de

muestra.
5. Colocar en el sistema los conos y cartuchos. Verificar la concordancia de las etiquetas

de color y el código de ensayo con los conos y los cartuchos de los reactivos.
6. Iniciar el análisis según el Manual de Utilización VIDA. Todas las etapas son realizadas
automáticamente por el sistema. Los resultados se obtienen en aproximadamente 75
minutos.
7. Al finalizar el análisis, retirar los códigos y los cartuchos del sistema.
8. Eliminar los conos y cartuchos utilizados en un receptáculo adecuado.
9. Iniciar el análisis (ver manual de usuario).

10. Al terminar el análisis, retirar los conos y los cartuchos del instrumento, desechando en
un recipiente adecuado.
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PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
c )RESULTADOS DERIVADOS: El aparato realiza dos medidas de fluorescencia en el pocillo

óptico para cada muestra analizada. La primera lectura tiene en cuenta el ruido de fondo
debido a la cubeta de substrato con el cono. La segunda lectura se efectúa después de la
incubación del substrato con el enzima presente en el interior del codo. Se calcula el RFV
(Valor de Fluorescencia Relativa) al restar la lectura de fondo del resultado final. Este cálculo
aparece en la hoja de resultados.
El valor del test para cada muestra es interpretado por el sistema VIDAS de la manera
siguiente:
Valor del test =RFV paciente/calibrador RFV
d) INTERVALOS DE REFERENCIA:
Dicho valor del test así como su interpretación aparecen en la hoja de resultados. La
interpretación según el valor del test es como sigue:
Valor del test Resultado
<0,13 Negativo
>_0,13 a<0,37 Dudoso
_>0,37 Positivo
REPORTE DE RESULTADOS
El valor obtenido se reporta en el formato correspondiente.

Una vez obtenidos los resultados se procede de la siguiente manera:
1. Verificar el resultado.
2. Anotar el resultado en la bitácora de resultados correspondientes y firmar la hoja de
resultados.
3. Verificar la hora de entrega del resultado y entregarlo al personal de recepción para
su captura.
4. El personal de recepción entregara el resultado capturado al químico responsable
para su revisión, así como para ser firmado y devolverlo al personal de recepción.
5. El resultado se entregara al Doctor o al paciente.
VALORES DE ALERTA
No aplica
DIAGRAMA DE FLUJO
No aplica.
LlMITACIONES
1. No deben emplearse diluyentes de muestra que no sea el de VIDAS C difficile toxin
A&B.

PRT-NSD-LAB-37
PROCEDIMIENTOS
F. de
F. de revisión:
Toxin A &B
No. De revisión:
2. Deposiciones de meconio pueden interferir con el ensayo VIDAS C difficile toxin A&B –
no analizar muestras de bebes con una edad inferior a los dos años.
3. Muestras de heces que parecen contener una alta cantidad de grasa no han sido
evaluadas de forma exhaustiva evitar analizar este material con el VIDAS C difficile
toxin A&B.
4. Debido a la heterogeneidad de la muestra, la mezcla cuidadosa de las muestras de

heces resulta esencial para evitar resultados discrepantes. Las muestras que dan
resultados contradictorios a la información clínica disponible deben analizarse de nuevo
con muestras frescas.
5. Los niveles de toxina pueden variar entre la muestra de uno y otro paciente.
6. Un único resultado negativo VIDAS C difficile toxin A&B no puede excluir la posibilidad
de colitis o diarrea asociadas a C difficile. Podría deberse a su recogida manipulación o
conservación inadecuados. Siempre evaluar los resultados del ensayo VIDAS C difficile
toxin A&B conjuntamente con los signos clínicos y el historial del paciente al
diagnosticar una enfermedad asociada a C difficile .
7. Un único resultado positivo VIDAS C difficile toxin A&B no puede emplearse para
diagnosticar colitis o diarrea asociadas a C difficile siempre evaluar los resultado del
ensayo VIDAS C difficile toxin A&B conjuntamente con los signos clínicos y el historial
del paciente al diagnosticar una enfermedad asociada a C difficile.


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MANUAL DE POLITICAS Y CLAVE

NOMBRE / PUESTO / FIRMA

Tipo de muestra, su recogida y conservación:

NOMBRE / PUESTO / FIRMA

Calibrador, controles y preparación de la muestra para el ensayo CDAB:

Heces semisólidas o solidas:

5. Centrifugar durante 5 minutos a 2-25º C a un mínimo de 12.000 g;

6. Se necesita un mínimo de 300 µL del sobrenadante para procesarlo con el ensayo

NOMBRE / PUESTO / FIRMA

− Si hubiera partículas de material lipidico en la superficie del sobrenadante tras la

a) CONTROLES: Se incluyen dos controles positivos y un control negativo en cada kit de

b) PROGRAMACION DEL CONTROL: la calibración, con ayuda del calibrador incluido en la

productos no contienen ningun agente patógeno transmisible. Se recomienda manipularlos

Composición de los reactivos del equipo (60 pruebas)

Precauciones de empleo de los Reactivos:

a) Este equipo contiene compuestos de origen humano. Ningún método de análisis

Conservación del kit:

b) PROCEDIMIENTO DEL PROCESO:

1. Sacar únicamente los reactivos necesarios del refrigerador.

3. Teclear o seleccionar “CDAB” para introducir el código de ensayo CDAB. Se debe

4. De calibrador, el sobrenadante de la muestra procesada o el control en el pocillo de

5. Colocar en el sistema los conos y cartuchos. Verificar la concordancia de las etiquetas

7. Al finalizar el análisis, retirar los códigos y los cartuchos del sistema.

8. Eliminar los conos y cartuchos utilizados en un receptáculo adecuado.

9. Iniciar el análisis (ver manual de usuario).

c )RESULTADOS DERIVADOS: El aparato realiza dos medidas de fluorescencia en el pocillo

El valor obtenido se reporta en el formato correspondiente.

NOMBRE / PUESTO / FIRMA

4. Debido a la heterogeneidad de la muestra, la mezcla cuidadosa de las muestras de

NOMBRE / PUESTO / FIRMA

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