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PRACTICA Nº 1

ANTIGENOS FEBRILES

1.- REACTIVOS:
Tifico “O” Somatico
Tifoidea
Tifico “H” flagelar
Paratifico “A Paratifoidea
Paratifico “B”
Brucella abortus Brucelosis

2.- MATERIALES:

 Micro pipeta automática

 Suero
 Lamina excavada
 Reactivos

3.- PROCEDIMIENTO:
Determinación cualitativa y cuantitativa

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Cualitativacuando se observa la aglutinación (obs. Macroscópica)

Cuantitativa cuando se hacen diluciones: 1/20; 1/40; 1/80; 1/160;

1/320
Nota:
siempre se realiza
en primer lugar la
determinación
cualitativa y
después la
cuantitativa

4.- LECTURA:

 Donde se desarrolle la mayor dilución o más alta que se

observe.

 En el caso de tifoidea los valores para un cuadro

infeccioso son: “O” 1/80
“H” 1/160

ul ml Dilución
80 0.08 1/20
40 0.04 1/40
20 0.02 1/80
10 0.01 1/160
5 0.005 1/320

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Figura 1: Toma de muestra con la

micropipeta.

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Figura 2: Colocando muestra en laminas excavadas.

PRACTICA Nº 02

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS

1.- OBJETIVOS:
 Demostrar el catabolismo de la glucosa mediante
al obtención de alcohol
 Determinar la cantidad de alcohol producido en la
muestra
 Comprender el fundamento de combitest

2.- PROCEDIMIENTO:

 Conectar el matraz de cocción al matraz colector y someter a

ebullición el contenido del matraz de cocción por 5 minutos.

 Si el contenido del matraz colector se torna medio verdoso,

suspender la ebullición aunque no hayan transcurrido los 5
minutos.

 Enfriar el contenido del matraz colector con chorro de agua

 Agregarle 10,0 ml.de IK y mezclar.

 Titular con Na3S2O3 hasta viraje a color verdoso, agregar 1.0

ml de solución de almidon a 1% agotar .según agregando
tiosulfato de sodio hasta que el contenido se torne de color
celeste transparente .Detener la titilación
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 Anotar el gasto de tiosulfato de sodio

 Aparte realizar los cálculos para determinar la cantidad de

alcohol producido

 Verificar en el matraz de cocción la formación de precipitado

rojo ladrillo que indica la presencia de un azúcar reductor
(dextrosa)

FUNDAMENTO:

Se produce oxidación del alcohol (etanol) hasta acido

acetico por accion del dicromato de potasio: el exceso de
dicromato al actuar sobre ioduro potasico deja el iodo en
libertad el cual se valora con una solución de tiosulfato
sodico, empleando al solución de almidón como indicador

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CUESTIONARIO

1.- Determinación de lípidos totales en suelo

En la determinación de Grasas y Aceites, están incluidos no solo

los hidrocarburos del petróleo (HTP) sino también compuestos
orgánicos de otras fuentes (vegetales, animales). A los fines del
trabajo, estos hidrocarburos son interferencias, dado que los analitos
de interés son los hidrocarburos del petróleo (HTP).

Estas interferencias fueron eliminadas aplicándoles a cada una de las

muestras el tratamiento que establece el método 418.1 de la EPA.

El tratamiento consiste en agregarle a una alícuota de extracto una

cantidad determinada de Silica Gel particulada (Merck),
posteriormente agitarla durante 15 minutos (con agitadores
magnéticos); luego filtrar para retener la Silica Gel, colocar una
alícuota del filtrado en la celda y realizar la lectura en el equipo IR a
la misma frecuencia que para G&A (2939,7cm-1).

Previamente la Silica debió ser activada y luego desactivada, para

que contenga una humedad comprendida entre un 1 a 2% de su
peso. Para ello, se la dispuso inicialmente en estufa a 130ºC, y luego
se le agregó una cantidad de agua igual al 2% de su peso.

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De acuerdo con el método, para una alícuota de 10 mL de extracto

corresponde agregar 3 gr de Silica Gel, agitar y filtrar con papeles de
filtro banda negra (Whatman Nº 40).

La celda utilizada para la lectura fue la misma que en el punto

anterior.

La medida de HTP corresponde a la lectura del extracto en el equipo

IR una vez eliminadas las interferencias; para ello se tomo una
alícuota de aproximadamente 5 mL del extracto, se la colocó en la
celda de 10 mm y se realizó la lectura en el equipo IR a la misma
frecuencia de lectura utilizada para G&A. Posteriormente, se debió
introducir el valor en la curva de calibración. El valor obtenido se llevó
a unidades de concentración referidas al suelo (mg HTP/ Kg de suelo
seco).

2. Determinación del contenido de carotenoides totales en el

alimento:

- Pesar aproximadamente 1g de muestra fresca de zanahoria

previamente pelada y cortada en trozos pequeños.

- Homogenizar en una licuadora con 60 ml de acetona por unos 3

minutos.

- Decantar y agregar más acetona para realizar una extracción.

Repetir el proceso hasta extraer completamente los pigmentos.

- Filtrar y lavar el residuo que queda en el papel de filtro con

unos 20-30 ml de acetona.

- Concentrar en campana con un baño de María (o en plancha

eléctrica) hasta pequeño volumen.

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- Agregar 60 ml de éter de petróleo.

- A la solución etérea que contiene los carotenoides agregar una

pequeña cantidad de Na2SO4 anhidro. Dejar la solución con el
agente desecante unos 15 minutos, agitar ocasionalmente.

- Transferir cuantitativamente la solución etérea a un matraz

aforado de 100 ml y llevar a volumen con éter de petróleo.

- Tomar con una pipeta 2 ml de esta solución (o un volumen que

pueda medirse la intensidad de color) y transferir a un tubo.

- Agregar 8 ml de éter de petróleo y medir la absorbancia a la

longitud de onda de máxima absorción encontrada
previamente.

D. Cálculos:

- Determinar por medio de la curva estándar la cantidad de

carotenoides totales presentes en la muestra. Expresarlos como
mg de beta-carotenos/100 g de muestra.

- Calcular la cantidad de carotenoides totales expresados como

beta-caroteno utilizando la constante.

- Comparar ambos resultados.

3.- Determinación cuantitativa de acido úrico en sangre y

orina

Método enzimático colorimétrico para la determinación

de ácido úrico en Suero y orina

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FUNDAMENTOS DEL MÉTODO:

El ácido úrico presente en la muestra es oxidado

enzimaticamente por acción de la uricasa y transformado en
alantoina y peróxido de hidrogeno. El peróxido de hidrogeno formado
reacciona con el ácido 3-5-dicloro-2 hidroxibenceno sulfónico y la 4-
Aminofenazona, formando un complejo de quinoneimina de color rojo.
La intensidad de color medida fotocolorimetricamente a 510 nm
permite cuantificar el ácido úrico presente en las muestras.

REACTIVOS PROVISTOS:

Estos reactivos son para USO IN VITRO.

 Reactivo 4AF : Solución de 4AF 15 mmol/l . Buffer fosfato 1
mol/l , pH 7.50
 Reactivo 3-5-DC-2HBS: Solución de 3-5-DC-2HBS 10 mmol/l
 Enzima 1: Solución de UOD (5 U/ml),
 Enzima 2: Solución de POD (100 U/ml),
 Standard : Solución de Ácido Úrico 100 mg/l (595 mmol/l)

ESTABILIDAD:
Los reactivos son estables hasta la fecha de vencimiento indicada en
la caja, cuando se guardan a 2-8 ºC. Se recomienda no exponer los
mismos a temperaturas elevadas durante tiempos prolongados.

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO:

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1. En una probeta de capacidad adecuada colocar agua destilada

(aproximadamente la mitad del volumen final a preparar).
2. Agregar la cantidad correspondiente de reactivo
4-AF y reactivo 3-5 DC-2HBS.
3. Llevar con agua destilada a volumen final.
4. Agregar la cantidad correspondiente de reactivo de enzima 1 y
enzima 2, homogeneizando suavemente los mismos.
5. Mezclar.
6. Guardar inmediatamente en frasco color caramelo, en heladera (2-
10 °C), debiendo
Desecharse si presenta coloración rosada muy intensa
(contaminación con oxidantes).
Este reactivo de trabajo tiene una estabilidad de 4 semanas, y debe
prepararse respetando las siguientes proporciones en volumen:

Estas cantidades se modifican de acuerdo al volumen final que se

desea preparar, respetando la proporción entre las partes.

MUESTRA:
Suero fresco libre de hemólisis. El mismo debe obtenerse separando
el coágulo lo antes posible (Dentro de las dos (2) horas de la
recolección). El suero puede conservarse hasta cinco (5) días en
Refrigerador (2-8 °C) y hasta seis (6) meses en congelador.
También se puede usar plasma heparinizado o plasma EDTA. La
determinación también puede realizarse en orina, debiendo diluirse la
misma 1:10 ( 1+10), con solución de hidróxido de sodio 0,01 mol/l. Si
el test se realiza en orina de 24 hs es conveniente calentar
brevemente a 60 °C para redisolver los cristales de urato.

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TÉCNICA OPERATORIA :

Dejar que el reactivo tome temperatura ambiente y pipetear:

Después del tiempo de incubación recomendado el color de la

reacción es estable al menos durante veinte (20) minutos más.

CALCULO DE RESULTADOS :

VALORES DE REFERENCIA:
En suero:
Hombres 35-60 mg/l
Mujeres 25-50 mg/l

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En orina:
240-570 mg/l
En orina de 24 horas:
250-750 mg

4. Prueba de tolerancia a la vitamina A y absorción de

carotenos.

La vitamina A pertenece al grupo de las vitaminas liposolubles

(A, D, E y K) y existe en tres formas metabólicas activas: retinol,
retinal y ácido retinoico, además de sus precursores provitamínicos
conocidos como carotenoides. La deficiencia de vitamina A (DVA)
ocasiona serios trastornos en el organismo, principalmente en la
vista, piel, huesos y el sistema inmune, siendo la población más
vulnerables los niños, mujeres y ancianos.

Los métodos más comúnmente empleados para determinación

de vitamina A (retinol) es el espectrofotométrico de inactivación con
radiación UV y la cromatografía líquida de alta resolución en fase
reversa (CLAR).

Determinación de Alfa-Tocoferol y Retinol

Se determinó a través de cromatografía líquida de alta

eficiencia, conocida como cromatografía líquida de fase reversa
(HPLC), y estandarizado para vitamina A y vitamina E .Este método
consiste en la partición de la muestra de suero en una fase
estacionaria hidrofóbica (frecuentemente cadena C-18 enlazadas
covalentemente a partículas de sílice) y una fase móvil polar. El
tiempo en el cual los compuestos de la muestra fluyen dependen de
su polaridad. La detección de los componentes separados por HPLC
se realizó espectrofotométricamente, (rango UV para retinol y retinil
acetato). La cuantificación de los componentes se logró por
comparación de las alturas de los picos con las de los estándares de
las curvas (analítico y estándar interno). La adición de un estándar

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interno (all trans retinil acetato) ayuda a la corrección por pérdidas

durante la extracción y análisis.

Los carotenoides son el grupo de pigmentos vegetales

responsables de la gama de coloración de frutas, verduras y flores
que va del amarillo al rojo. El organismo humano transforma uno de
ellos, el ß-caroteno, en vitamina A, que constituye un nutriente clave.
A la carencia de esta vitamina se atribuyen los trastornos coronarios,
ciertos tipos de cáncer y una afección degenerativa de la mácula
lútea del ojo que puede conducir a la ceguera. Las investigaciones
también indican que la ingesta regular de ß-caroteno puede ser
beneficiosa para el sistema inmunológico y es susceptible de reducir
el deterioro de la piel producido por los rayos solares.

Los mecanismos de absorción de las vitaminas liposolubles no se

conocen, el intestino puede cambiar el beta caroteno a vitamina A,
que luego se transporta por quilomicrones y se almacena en el
hígado.

Pigmentos Naturales: Carotenoides Totales.

A. Fundamento:
El método se fundamenta en la medición de la absorbancia de un
extracto de los carotenoides presentes en el alimento y luego
mediante el uso de una curva de calibración o la aplicación se
calcula el contenido de carotenoides en la muestra.

B. Reactivos:

- Éter de petróleo
- Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
- Solución concentrada de beta-caroteno en alcohol isopropilico

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- Solución diluida de beta-caroteno (10 ml de solución

concentrada + éter de petróleo en cantidad suficiente para 100
ml)
- Acetona.

C. PROCEDIMIENTO:

1. Curva patrón:

- Tomar 5 tubos de ensayo y enumerar del 1 al 5. Colocar en

cada uno de ellos las cantidades de reactivos que se especifican
a continuación:

- Agitar con cuidado los tubos y determinar la absorbancia de

cada solución a la longitud de onda máxima.

- Construir la curva de calibración trazando un grafico de la

absorbancia correspondiente contra la concentración de beta-
caroteno contenida en cada una de las soluciones patrón.

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