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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE


SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA


FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUE

Projet de Fin d’Etudes


En vue de l’obtention du diplôme de

Licence
Domaine : Sciences de la nature et de la vie
Filière : Biologie
Spécialité : Biochimie fondamentale et appliquée

Thème

Méthodes d’extraction et de dosage de différentes


vitamines

Encadreur : Mme SAYAH Z. Présenté par :


KARBOUE SARA
Examinateur :Melle HADJAJ S. NESRALLAH MARIA

Année universitaire 2013/2014


Remerciements

Tout d’abord, nous remercions mon dieu  Tout puissants de nous avoir accordé
la force, le courage et les moyens à fin de pouvoir accomplir ce modeste travail 

Au terme de ce travail, nous tenons à exprimer notre profonde gratitude et à remercier :

Mme SAYAH Zineb Maitre assistant B, à l’université Kasdi Merbah -Ouargla pour son
aide, ses orientations, ses conseils et ses corrections sérieux pour ce travail.

Nous tenons à remercier Melle HADJAJ Soumia Maitre assistant B à l’université Kasdi
Merbah-Ouargla a accepté d’examiner notre travail.

Nous remercions également les personnels de la bibliothèque.

Enfin, nous remercions tous les enseignants, nous leurs adressons nos sincères
remerciements pour leurs patience et pour tout ce qu’il nous avons offert comme
enseignements et conseils durant ce long cycle de formation et tous ceux qui ont
participé de prés ou de loin pour la réalisation de ce travail.
Dédicace

A mes parents,

Pour votre soutien tout au long de mes études. Je ne serai jamais arrivée jusque là sans
vous. Vous avez toujours été là et m’avez toujours soutenue dans les moments difficiles.

A mes grandes mères,

Pour votre conseils pendant tous mes moments difficiles, j’espère que mon dieu lui
donnent la bonne santé

A mon cher Charaf,

Pour sa fidélité pendant toutes les moments que nous passerons ensemble, vraiment que
c’est le secret de ma vie.

A mes frères,

Je veux les dire que je vous aime beaucoup et j’espère que vous trouverez vos bonheurs
dans les années à venir.

A mes amies intimes,

Merci pour tous ces moments que nous avons passé ensemble, pour nos éclats de rire et
notre complicité. Je profite de cette occasion pour vous dire que je vous aime beaucoup
et j’espère que vous trouverez vos bonheurs dans les années à venir.

A Sally ma chère,

Je veux te dire que je t’aime beaucoup et je te considère ma grande sœur, j’espère que
tu trouveras le bonheur et la bonne chance pendant toute la vie.
Dédicace

A mes Parents,

A qui je dédie ce travail, ces 16 ans d’étude et toutes celles avant.

Merci de m’avoir soutenue, encouragée et aimée. Tout ça n’aurait pas été possible sans
vous, je ne pourrai jamais assez vous remercier.

Plus particulièrement, à ma cher maman, pour ton soutien et ton aide jour et nuit, ton
implication dans mes études et dans ma thèse et pour tout le reste.

A mon cher Aboubakeur

Mon fiancé et L’amour de ma vie, qui me soutient, Je te remercie pour tout le bonheur et l
la fidellité que tu m’apportes jour après jour, ta présence, les sacrifices accomplis, ta
patience, ton soutien moral et tes attentions de tous les jours.

A tous mes frères

De Malika jusqu’ à Ismail surtout ma sœur Noura , Pour tous nos moments de complicités
partagés et à venir

A tous mes amis

Maria, Hadjira spécialement, Pour tous les moments passés avec vous

Aux amis de toujours,

Pour votre présence malgré les années et les kilomètres


Liste des tableaux

N° Titre Page
1 Classe des vitamines (ANONYME., 2011). 3
2 Les milieux de culture (ROUGEREAU ., 1984). 25
3 les constituants de milieu de base (ROUGEREAU., 1984). 26
Liste des figures

N° Titre Page

1 Protocole d’extraction de la vitamine C (HALZHAUER., 1986). 10

2 Schéma principal de la chromatographie en phase liquide à haute 13


performance (PENCHEV., 2010).

3 Analyse des tocophérols et tocotriénols par HPLC normale avec détecteur 16


de fluorescence (CUVELIER., 2003).

4 Chromatogramme obtenue pour la détermination de l’acide pantothénique 20


libre dans l’avocat (a),la carotte (b), les épinards(c),le foie de porc(c) , les
haricots verts(d),le lait en poudre(f),les lentille(g) et la levure (h) (PAKIN.,
2004) .

5 Séparation de l’acide L-ascorbique (2) et de la DL-homocystéine en exée 22


par chromatographique liquide haute pression (DIOP., 1987).
Sommaire

INTRODUCTION 1
CHAPITRE I : Aperçu sur les vitamines
I.1.- Définition 3
I.2.- Classification 3
I. 3.- Intérêt biologique 4
I.4.- Propriétés physico-chimiques 4
CHAPITRE II : Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines
II.1.- Introduction 7
II.2.- Méthodes d’extraction des vitamines 7
II.2.1.- Extraction des vitamines hydrosolubles 7
II.2.1.1.- Principe 7
II.2.1.2.- Extraction de la Thiamine (B1) 8
II.2.1.3.- Extraction de la Riboflavine (B2) 8
II.2.1.4.-Extraction de la vitamine pp (B3) 8
II.2.1.5.- Extraction de l’acide pantothénique (B5) 8
II.2.1.6.- Extraction de la vitamine (B6) 8
II.2.1.7.- Extraction de la biotine (B8) 9
II.2.1.8.- Extraction de l’acide folique (B9) 9
II.2.1.9.- Extraction de la vitamine (B12) 9
II.2.1.10.- Extraction de la vitamine (C) 9
II.2.2.- Extraction des vitamines liposolubles 11
II.2.2.1.- Extraction de la vitamine (A) 11
II.2.2.1.1.- Principe 11
II.2.2.1.2.- Méthode d’extraction 11
II.2.2.2.- Extraction de la vitamine (D2) ou (D3) 12
II.2.2.2.1.- Principe 12
II.2.2.2.2.- Méthode d’extraction 12
II.2.2.3.- Extraction de la vitamine (E) 12
II.2.2.3.1.- Principe 12
II.2.2.3.2.-Méthode d’extraction 12
II.3.-Méthodes de dosage des vitamines 13
II.3.1.-Dosage des vitamines liposolubles 13
II.3.1.1.- Dosage chromatographique liquide haute pression 13
II.3.1.1.1.- Principe 13
II.3.1.1.2.- Dosage du carotène 14
II.3.1.1.3.- Dosage de la vitamine (A) 15
II.3.1.1.4.- Dosage des vitamines (D2), (D 3) et de leurs métabolites 15
II.3.1.1.5.- Dosage de la vitamine (E) 15
II.3.1.2.- Dosage calorimétrique 17
II.3.1.2.1.- Principe 17
II.3.1.2.2.- Dosage des caroténoïdes 17
II.3.1.2.3.- Dosage de la vitamine (A) 17
II.3.1.3.-Dosage colorimétrique 18
II.3.1.3.1.- Dosage de la vitamine (E) 18
II.3.2.- Dosage des vitamines hydrosolubles 18
II.3.2.1.- Dosage chromatographique liquide haute pression 18
II.3.2.1.1.- Dosage de la vitamine (B1) 18
II.3.2.1.2.- Dosage de la riboflavine (B2) 18
II.3.2.1.3.- Dosage de la vitamine PP ou niacine (B3) 19
II.3.2.1.4.-Dosage de l’acide pantothénique ou vitamine (B5) 19
II.3.2.1.5.- Dosage de la vitamine (B6) 20
II.3.2.1.6.- Dosage de la vitamine (B12) 21
II.3.2.1.7.- Dosage de la vitamine C 21
II.3.2.2.- Dosage fluorimétrique 22
II.3.2.2.1- Principe 22
II.3.2.2.2.- Dosage de la Riboflavine (B2) 22
II.3.2.2.3.-Dosage de l’acide ascorbique (C) 22
II.3.2.3.- Dosage microbiologique 23
II.3.2.3.1.- Principe 23
II.3.2.3.2.-Dosage de la vitamine (B1) 24
II.3.2.3.3.-Dosage de la vitamine PP ou Niacine (B3) 24
II.3.2.3.4.- Dosage de l’acide pantothénique ou vitamine (B5) 25
II.3.2.3.5.- Dosage de la vitamine (B6) 26
II.3.2.3.6.- Dosage de la biotine (B8) 27
II.3.2.3.7.- Dosage de l’acide folique (B9) 27
II.3.2.3.8.- Dosage de la vitamine (B12) 29
II.3.2.4.- Dosage colorimétrique 30
II.3.2.4.1.- Dosage de la vitamine (B1) 30
CONCLUSION 32
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 34
Introduction
Introduction

INTRODUCTION

Les aliments permet la vie des êtres vivants c’est par ces intermédiaires que les
organismes humaines se développent grâce aux nutriments apportées par l’alimentation.
C’est en 1914 que Funk démontra l’implication d’un complexe aminé (identifié plus
tard comme étant la thiamine) dans la guérison d’une pathologie nerveuse, le béri-béri,
et utilisa pour définir ce complexe le terme de vitamine (amine nécessaire à la vie).
Sous cette appellation sera regroupé par la suite un ensemble de substances
indispensables, à faibles doses, au bon fonctionnement de l’organisme humain,
substances que ce dernier est incapable de synthétiser et qu’il ne peut trouver que dans
les aliments (PAKIN., 2004). Les connaissances sur les vitamines ont beaucoup
progressé lors des dernières années et elles ont considérées comme des sources
nutritives, via l’organisme vivant en activant les réactions enzymatiques dans le
métabolisme. Les vitamines ne peuvent plus être considérées comme étant uniquement
nécessaire comme des activant des réactions enzymatiques puisque de très nombreuses
données biochimiques et expérimentales sont en faveur de leurs rôles biologiques tels
qu’elles participent dans la croissance (maturation de certaines cellules et tissus),
stabilisation des membranes et coagulation du sang…etc .

Plusieurs méthodes d’extraction ont été découverte ;ces derniers ont une
importance dans différentes domaines de point de vue alimentaire comme des additifs
alimentaires et aussi dans l’industrie des huiles alimentaires, pharmaceutique dans
l’industrie des médicaments (vitamine C ,levure de bière…..) ,cosmétique telle que les
vitamines rentrent dans l’industrie des huiles et les crèmes.

Le dosage des vitamines est nécessaire pour évaluer leurs taux dans les aliments et pour
le diagnostic des maladies (maladie de rachitisme résulte de carence en vitamine D).

Ce travail porte sur les principales méthodes d’extraction et de dosage des


vitamines, il se résume dans deux chapitres :

Le premier chapitre représente une aperçue sue les vitamines (leurs classification,
leurs propriétés physico-chimiques, et leurs intérêt biologique).

Le deuxième chapitre s’intéresse sur les méthodes d’extraction et de dosage pour


chaque classe des vitamines.

1
CHAPITRE.-I
Aperçu sur les vitamines
Chapitre I Aperçu sur les vitamines

I.1.- Définition

Les vitamines sont des substances organiques, sans valeur énergétique propre,
qui sont nécessaires à l'organisme et que l'homme ne peut synthétiser en quantité
suffisante. Elles doivent être fournies par l’alimentation. Treize substances répondent à
cette définition. Il s'agit d'un groupe de molécules chimiquement très hétérogènes. Ce
sont des substances de faible poids moléculaire (ANONYME., 2011). Elles sont
présentes dans les produits d’origine végétale (fruits, légumes, céréales ………) et
animale (viandes, poissons, œufs, produits laitiers ……).

I.2.- Classification

Les propriétés chimiques et physiologiques des vitamines sont très variées,


jusqu’ à présent nous avons connaissance de 13 vitamines. Les vitamines sont classées
en deux groupes sur base de leurs propriétés de solubilité, les vitamines liposolubles et
les vitamines hydrosolubles (Tableau 1)

Tableau 1- Classe des vitamines (ANONYME., 2011).

Classe des vitamines Nom chimique Abréviation

Rétinol Vitamine A
Calciférol Vitamine D
Vitamines liposolubles Tocophérol Vitamine E
Phytoménadione Vitamine K1
phylloquinone
Thiamine Vitamine B1
Riboflavine Vitamine B2
Acide pantothénique Vitamine B5
Pyridoxine Vitamine B6
Vitamines hydrosolubles Niacine Vitamine PP ou B3
Acide folique Vitamine B9
Cobalamine Vitamine B12

Acide ascorbique Vitamine C


Biotine Vitamine H ou B8

3
Chapitre I Aperçu sur les vitamines

I.3.- Intérêt biologique

Les vitamines sont des composés indispensables à la vie jouent plusieurs rôles
qui sont :

 Puissant antioxydant qui protège les acides gras essentielles, les vitamines A et C et
les membranes cellulaires (vitamine E) (CHARLES et al ., 2008).

 Facteur de croissance. Entre dans la constitution de coenzyme transporteur


d’hydrogène (vitamine B2) (CHARLES et al ., 2008).

 Transport de protons et d’électrons (vitamine C) (ANONYME., 2011).

 Stabilisation des membranes (ANONYME., 2011).

 Favorisent la formation de mucopolysaccharides-sulfates (vitamine A) (CHARLES et


al., 2008).

 Augmentent l’absorption intestinale du calcium et du phosphore et la réabsorption


tubulaire du calcium (vitamine D) (CHARLES et al ., 2008).

 Nécessaire à la synthèse des facteurs II, VII, IX et X du complexe prothrombique qui


intervient dans la coagulation du sang. Vitamine anti- hémorragique (vitamine K)
(CHARLES et al ., 2008).

I.4.- Propriétés physico-chimiques

La connaissance des propriétés chimiques et physiques des vitamines, comme


celle de leur constitution permet souvent de mieux comprendre leur rôle physiologique,
la manière dont on les dose dans les milieux naturels et leur comportement dans les
produits alimentaires, parmi ces propriétés on a :

 La thiamine présente un caractère d’instabilité assez exceptionnel dans le groupe des

vitamines B (RANDOIN et al ., 1964).

 La vitamine A présente dans l’ultra violet une absorption caractéristique, avec un

coefficient d’absorption très élevé (RANDOIN et al., 1964).

 Les vitamines liposolubles, sont solubles dans les graisses (DIOP., 1987), pouvant
être stockées par l’organisme (A, D, E, k) (PAKIN., 2004).

4
Chapitre I Aperçu sur les vitamines

 Les vitamines hydrosolubles, sont solubles dans l’eau (DIOP, 1987), rapidement
éliminée par l’organisme (B1, B2, B3, B5, B6, B8, B9, B12 et C) (PAKIN., 2004).
 L’acide pantothénique et ses combinaisons salines résistent bien à la chaleur humide
mais un chauffage prolongé à sec peut les détruire (RANDOIN et al., 1964).

5
CHAPITRE.-II
Méthodes d’extraction
et de dosage des vitamines
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.1.- Introduction

Les techniques générales de dosage des vitamines peuvent être utilisées pour les
liquides biologiques, les tissus animaux ou végétaux. Les principes généraux sont les
mêmes, mais les méthodes d’extraction différent selon la matière première à analyser
(ROUGEREAU., 1984).

La méthode d’extraction choisie dépend du résultat requis, de la nature de la


matrice, de la présence naturelle ou sous forme synthétique des vitamines, des
composants interférents, de la résistance de la vitamine à l’égard de la chaleur et des
valeurs extrêmes de pH. Elle dépend également de la sélectivité et de la spécificité de la
méthode d’analyse utilisée. Pour la réussite de la détermination, il est essentiel que les
vitamines soient extraites quantitativement de la matrice sous une forme qui peut être
déterminé précisément au moyen de la technique utilisé. Une procédure d’extraction
efficace homogénéisé et concentre l’échantillon, isole l’analyte de sa liaison avec la
protéine, élimine autant que possible les substances interférentes connues et détruit
l’activité enzymatique. Depuis plusieurs décennies, le dosage des vitamines s’est
appuyé sur l’évolution des diverses technologies, pour les vitamines liposolubles on a
utilisé le technique fluorimétrique, spectrophotométrique et calorimétriques. A présent
on utilise les techniques de chromatographie liquide haute pression. En ce qui concerne
les vitamines hydrosolubles, les techniques de dosage par voie microbiologique sont
largement utilisées. Cependant pour certaines vitamines, on a pu utiliser des techniques
calorimétriques, comme par exemple pour la vitamine C (ROUGEREAU., 1984).

II.2.- Méthodes d’extraction des vitamines

II.2.1.- Extraction des vitamines hydrosolubles

II.2.1.1.- Principe

On broie l’échantillon préalablement déshydraté, afin d’obtenir un ensemble, le


plus fin possible. On ajoute entre 5 et 20 fois son poids d’eau. On ajuste le pH à 4,5 et
on délipide avec un mélange d’éther sulfurique et d’éther de pétrole. On filtre ensuite, et
on neutralise pour obtenir un pH de 6,9. L’extraction par voie enzymatique se fait soit
avec des enzymes amylolytiques ou protéolytique. On incube à 50 °C pendant 4 ou 5 h,
et l’on détruit les enzymes en passant le mélange au bain-marie. On ajuste ensuite le
pH à 4,5 (ROUGEREAU., 1984).

7
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.2.1.2.- Extraction de la Thiamine (B1)

L’extraction se réalise par voie enzymatique avec l’amylase, ou la diastase du


malt. Le pH de la suspension doit se situer entre pH : 6,5- 6 (ROUGEREAU., 1984).

II.2.1.3.- Extraction de la Riboflavine (B2)

On mélange le broyat d’aliment dans dix fois son poids de HCL 0,1N. On ajoute
un mélange urée-méthionine, et l’on ramène à pH 4,5. On attaque par voie enzymatique
par un mélange de takadiastase et de Pajanine. On laisse monter 5 à 6 h, à 45 °C. On
filtre et on délipide ensuite (ROUGEREAU., 1984).

II.2.1.4.-Extraction de la vitamine pp (B3)

L’extraction se fait par voie chimique en suspendant le broyat d’aliment dans dix
fois son pois d’HCL M. On porte à l’autoclave à 120°C pendant 20 min. On ramène le
pH à 4,5 (ROUGEREAU., 1984).

II.2.1.5.- Extraction de l’acide pantothénique (B5)

L’échantillon a été pesé dans un flacon de 100 ml. 25 ml d’eau distillée ont été
ajoutés. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 5 min. Il a été ensuite transvasé
quantitativement dans une fiole jaugée de 50 ml, ajusté à 50 ml avec de l’eau distillée et
centrifugé à 10 000 g pendant 10 min. Le surnageant a été filtré sur membrane d’acétate
de cellulose (0,45 μm) avant d’être purifié. Il a été ensuite transvasé quantitativement
dans une fiole jaugée de 50 ml, ajusté à 50 ml avec de l’eau distillée et centrifugé à 10
000 g pendant 10 min. Le surnageant a été filtré sur membrane d’acétate de cellulose
(0,45 μm) avant d’être purifié (PAKIN., 2004).

II.2.1.6.- Extraction de la vitamine (B6)

L’extraction se fait également par voie chimique. Pour les tissus animaux, au
broyat d’aliment, on ajoute de l’acide sulfurique 0,55 M, et l’on porte pendant 5h à 8h le
mélange à 125°C .Pour les tissus végétaux, peut remplacer l’acide sulfurique par de
l’acide chlorhydrique 2 M , ou par une solution d’acide sulfurique 0,44 M
(ROUGEREAU ., 1984).

8
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.2.1.7.- Extraction de la biotine (B8)

On réalise une hydrolyse avec de l’acide chlorydrique ou de l’acide sulfurique 4


à 6 M. On porte ce mélange pendant 2h à 120°C. On neutralise par de la soude et l’on
ajuste le pH à 4,5 (ROUGEREAU., 1984).

II.2.1.8.- Extraction de l’acide folique (B9)

Cette extraction se réalise par voie enzymatique. On procède à l’hydrolyse sous


toluéne à 37 °C, pendant 20 heures à pH 4,5 avec des reins de chien. On amène ensuite
le pH à 7, et l’on incube pendant 8 heures avec des pancréas de poulet (ROUGEREAU.,
1984).

II.2.1.9.- Extraction de la vitamine (B12)

Nous proposons l’extraction chimique à froid. On ajoute au broyat de l’alcool et


de l’acétone; on laisse 12h le broyat avec l’acétone à 60, pH : 1,5. On évapore et on
filtre. On ajoute alors une solution d’éthanol à 60. On peut améliorer le rendement
en broyant les solutions acétoniques et les solutions éthanolique au thurax pendant 15
min à 1000 t/min (ROUGEREAU., 1984).

II.2.1.10.- Extraction de la vitamine (C)

L'échantillon d'algue est pesé et mis dans une solution aqueuse d'acétique glacial
à 5% et de thiourée à 1%. Ce mélange est placé à l'étuve pendant 20 heures à 60°, puis
on ajoute 50 ml d'acide oxalique à 2%. Le mélange est alors filtré et son pH réajusté. À
4,5 par addition de NaOH N. Enfin, cette solution est lavée en ampoule à décanter par
son volume d'éther de pétrole, deux fois. La phase organique jaune pâle, est rejetée. La
phase aqueuse est gardée (figure 1) (HOLZHAUER., 1986).

9
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

Prise d’essai 5 g

50 ml d’une solution
50 ml aqueuse aqueuse
d’une solution
d’acided’acide
acétique glacial glacial
acétique 5 et de5 et de
thiourée à 1 . thiourée à 1 .

Stabilisation

Extraction solide-liquide/macération en

Solution acide oxalique

Réajustement du pH à 4,5

Lavage par 2 fois – extraction L/L à l’éther de pétrole

Fraction aqueuse recueillie

Figure 1- Protocole d’extraction de la vitamine C (HALZHAUER., 1986).

10
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.2.2.- Extraction des vitamines liposolubles

Bien qu’un certain nombre d’auteur ait pu extraire deux ou trois vitamines
liposolubles en même temps, il nous apparait cependant que pour obtenir un meilleur
rendement il faille extraire séparément chacune d’elles (ROUGEREA., 1984).

Chaque fois que cela a été possible, l'extraction a été précédée d'une
saponification spécifique. Ces vitamines étant solubles dans les solvants organiques,
une concentration de l'extrait à l'évaporateur rotatif était toujours envisageable, donc il
est possible de descendre très bas la limite de détection (HOLTZHAUER., 1986).

II.2.2.1.- Extraction de la vitamine (A)

II.2.2.1.1.- Principe

L’extraction de la vitamine A se fait par le broyage d’aliment puis l’addition


d’une solution de NaOH à 50, le mélange tiédit au bain-marie après l’addition
d’alcool éthylique et d’une solution d’hydroquinone, le mélange porté au bain-marie
90°C, on fait la décantation après l’addition d’eau et l’éther éthylique en premier fois,
l’éther de pétrole en deuxième fois avec l’agitation. L’extraction de ce mélange
s’effectue 1 ou 2 fois avec l’éther de pétrole suivi par un lavage de la phase éthérée 3
fois avec l’eau. Ensuite la filtration, l’évaporation et la concentration de cet extrait.

II.2.2.1.2.- Méthode d’extraction

On pèse 5 à 10 g d’aliment préalablement broyé dans un ballon d’un litre. On


ajoute 20ml d’une solution de NaOH à 50, et l’on tiédit ce mélange au bain-marie. On
ajoute ensuite 100 ml d’alcool éthylique et 2 ml d’une solution d’hydroquinone, obtenue
en dissolvant 20 g dans 100 ml d’alcool pur. On porte au bain-marie 90°C pendant 30
minutes. On verse alors le contenu du ballon dans une ampoule à décanter, et l’on ajoute
100 ml d’eau. On ajoute alors 50 ml d’éther éthylique, et l’on agite. On ajoute ensuite
50 ml d’éther de pétrole. On agite et on laisse décanter. On extrait ensuite une ou deux
fois avec 50 ml d’éther de pétrole. On lave la phase éthérée par 3 fois avec 100 ml
d’eau. On filtre, on évapore et on concentre jusqu’à obtenir 1 ml (ROUGEREAU.,
1984).

11
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.2.2.2.- Extraction de la vitamine (D2) ou (D3)

II.2.2.2.1.- Principe

L’extraction de la vitamine D2 ou D3 par l’addition de pyrogallol, éthanol-absolu


et une solution de potasse à l’aliment à doser, le mélange est met au bain-marie à l’abri
de l’air et de la lumière. L’extraction de ce mélange s’effectue 3 fois avec l’éther de
pétrole suivi par un lavage avec l’eau. Ensuite la filtration, l’évaporation et la
concentration de cet extrait.

II.2.2.2.2.- Méthode d’extraction

On pèse entre 5 et 10 g de l’aliment à doser. On ajoute 1 g de pyrogallol, et 90


ml d’un mélange de 60 ml d’éthanol-absolu, et 30 ml d’une solution de potasse à 50.
On met au bain-marie à 90°C pendant 30 min à l’abri de l’air et de la lumière. On extrait
trois fois avec à chaque fois 50 ml d’éther de pétrole. On lave l’extrait éthéré par trois
fois avec de l’eau. Ensuite on filtre, on évapore, et l’on concentre jusqu’à obtenir 1 ml.
La saponification avec le mélange de potasse alcoolique n’est pas nécessaire si les
produits à analyser ne comportent pas de graisses. On extrait dans les végétaux la
vitamine D et dans les tissus animaux un mélange de D2 et de D3 (ROUGEREAU.,
1984).

II.2.2.3.- Extraction de la vitamine (E)

II.2.2.3.1.- Principe

L’extraction de la vitamine E se fait par le broyage d’aliment puis l’addition


d’une solution méthalonique d’acide ascorbique. Après l’ébullition, une solution de
KOH à 70 est ajoutée, le mélange est porté au bain-marie. Après la décantation de
contenu avec l’éther éthylique, le mélange est filtré en Na2SO4. Ensuite une deuxième
décantation suivie par une filtration, évaporation et concentration à 1 ml.

II.2.2.3.2.-Méthode d’extraction

On pèse entre 5 et 10 g de l’aliment que l’on broie. On ajoute 100ml d’une


solution méthanolique d’acide ascorbique obtenue en mélangeant 0,5 g d’acide
ascorbique, 4ml d’eau ,20ml d’éthanol, et l’on ajoute à 100ml avec du méthanol. On
met au bain-marie bouillant pendant 15 à 20 minutes. On ajoute 15 ml d’une solution
de KOH à 70%.On remet au bain-marie pendant 40 minutes. On transvase ensuite le
contenu du ballon dans une ampoule à décanter, en lavant le ballon avec 50 ml d’eau.

12
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

On ajoute 120ml d’éther éthylique, et l’on agite le mélange. On laisse décanter, et l’on
filtre sur Na2SO4 .On extrait à nouveau avec 120 ml d’éther éthylique. On filtre, évapore
et concentre à 1 ml. La saponification avec la potasse n’est pas nécessaire pour les
produits non gras. On peut, pour chacune de ces extractions, avant de transvaser dans
l’ampoule à décanter, passer le mélange à 10000t /min, pendant 10 à 15 minutes
(ROUGEREAU., 1984).

II.3.-Méthodes de dosage des vitamines

II.3.1.-Dosage des vitamines liposolubles

II.3.1.1.- Dosage chromatographique liquide haute pression

II.3.1.1.1.- Principe

La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les


constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile
(liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la
répartition sélective des solutés entre ces deux phases (figure 2). Chaque soluté est donc
soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de
mobilité (due à la phase mobile). Lorsque les molécules à séparer sont entraînées par
une phase mobile gazeuse sur une phase stationnaire (solide ou liquide) : c’est la
chromatographie en phase gazeuse (CPG). Si les molécules à séparer sont éluées par
une phase mobile liquide sur une phase stationnaire (solide ou liquide) on l’appelle
chromatographie en phase liquide (Safi., 2009).

Figure 2- Schéma principal de la chromatographie en phase liquide à haute


performance (PENCHEV., 2010).

13
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

1- Réservoirs des solvants, 2 - Dégazeur, 3 - Valve de gradient d'élution, 4 - Doseur de


phase mobile (ou éluant), 5 - Pompe à haute pression, 6 - Vanne d'injection en position
"inject", 6 -Vanne d'injection en position "load", 7 - Boucle d’injection de l'échantillon,
8 - Pré – colonne (Éventuelle), 9 - Colonne analytique, 10- Détecteur, 11 - Acquisition
du signal, 12-Décharge déchets.

Sur le liquide d’extraction, en générale l’hexane, on peut procéder à un dosage en

H .P.L.C. dont les conditions suivantes :

 Débit : 2 ,5 ml/mn.

 Solvant : eau méthanol (8 /92).

 Pression colonne : 72 bar.

Température eau : 80°C.

Température méthanol : 45°C.

 Longueur d’ondes : 265nm.

 Atténuateur : 4.

La colonne choisie est une lichrosorb RP 8,25cm×4,6mm ×10µm (ROUGEREAU.,


1984).

II.3.1.1.2.- Dosage du carotène

Dans ce dosage il n’y a pas d’interférence entre carotène et la vitamine A, car les
deux composés ne possèdent pas les mêmes temps de rétention dans les mêmes
conditions.

 Choix des colonnes : On peut utiliser pour le β carotène, plusieurs colonnes :

-chromosorb , type RP 8,25 cm × 4,6 mm × 10 µm.

-porasil, 25cm × 4,6 mm × 10µm.

-bondapack, C 18.

 Solvant : On utilise de l’eau et du méthanol dans les proportions : 8/92,


respectivement.

 Débit : On utilise un débit de 2 ml/mn.

14
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

 Pression de colonne : entre 40 et 70 bar.

 Température des solvants : L’eau est portée à 80°C, le méthanol à 45°C


(ROUGEREAU., 1984).

II.3.1.1.3.- Dosage de la vitamine (A)

On réalise tout d’abord une gamme étalon, à partir d’une solution à 200 Ul/ml.
Le volume des injections a été fixé dans notre méthode à 20µl, mais il peut être inférieur
ou supérieur. La limite de sensibilité obtenue est de 5 Ul/ml de solution. Les conditions
sont les suivantes :

 Colonnes : Les même que pour la détermination du β carotène. RP 8, c 18, ou µ


porasil (ROUGEREAU., 1984).

II.3.1.1.4.- Dosage des vitamines (D2), (D 3) et de leurs métabolites

On peut, si l’échantillon contient l’ensemble des métabolites de la vitamine D,


réaliser une chromatographie en H.P.L.C dans les conditions suivantes :

 Débit : 1 ml/mn.

 Solvant : acétonitrile 55 . Mélange eau/acide acétique 45 (96/4).

 Pression colonne : 30 bar.

 Température solvant : acétronitrile : 30°C ; eau/acide acétique : 30°C.

 Longueur d’ondes : 254 ou 265 nm.

 Atténuateur : 4.

 La colonne choisie est une colonne fatty acid analysis. On peut également utiliser le
mélange : eau/méthanol (9/92), avec une colonne µC 18 (ROUGEREAU., 1984).

II.3.1.1.5.- Dosage de la vitamine (E)

Sur l’extraction préparée comme nous l’avons décrit précédemment, on procède


à un dosage en H.P.L.C.dans les conditions suivantes :

 Débit : 2,5 ml /mn.

 Solvant : méthanol, 92 ; eau, 8.

Température : méthanol ,45°C ; eau, 80°C.

15
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

 Longueur d’ondes : 288nm.

 Atténuateur : 4.

 Colonne lichrosorb RP 8,25×4 ,6.10µm .

Dans le cas de certains aliments ne présentant pas ou peu de lipides, on peut en


modifiant certaines dispositions, obtenir l’ensemble de ces trois vitamines, ou bien les
vitamines A et E (ROUGEREAU., 1984).

L’HPLC en phase normale avec phase stationnaire à base de silice présente une
grande sélectivité et permet de différencier les nembreuses formes d’antioxydants
tocophérols et tocotriénols, comme le montre le chromatogramme de la figure 2.

La figure 2 représente le chromatogramme d’analyse des tocophérols et


tocotriénols par HPLC normale avec détecteur de fluorescence.

Figure 3-analyse des tocophérols et tocotriénols par HPLC normale avec détecteur de
fluorescence (CUVELIER., 2003).

(HPLC en phase normale avec phase stationnaire à base de silice E)

16
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.1.2.- Dosage calorimétrique

II.3.1.2.1.- Principe

Les techniques calorimétriques sont les techniques qui consistent à mesurer des
quantités de chaleur échangée entre un échantillon et une enceinte de mesure. La
quantité de chaleur fournie(ou empruntée) à l’échantillon peut correspondre à :

La quantité de chaleur nécessaire pour faire varier sa température. Elle est alors
directement proportionnelle à sa chaleur spécifique.

-Une chaleur de changement d’état (fusion, vaporisation, dissolution, adsorption ou le


phénomène inverse).

-Une chaleur de réaction (SIMATOS., 1984).

II.3.1.2.2.- Dosage des caroténoïdes

Les caroténoïdes sont dosés à 450 nm. Après avoir évaporé la phase éthérée
provenant de la solution extractée , on dissout l’extraction par 1 ml d’hexane. On
détermine la densité optique de cette phase à 450nm. Ayant au préalable établi une
courbe-étalon de carotène, on peut quantifier alors les caroténoïdes. La concentration en
carotène permettra ensuite de corriger la valeur de la densité optique obtenue pour la
vitamine A, car le carotène réagit avec l’acide trifluoroacétique utilisé pour doser la
vitamine A (ROUGEREAU., 1984).

II.3.1.2.3.- Dosage de la vitamine (A)

On reprend la phase hexane précédente que l’on évapore. On remet l’extrait en


solution avec du chloroforme. On ajoute alors au volume de chloroforme, quatre
volumes du réactif à l’acide trifluoroacétique, que l’on obtient en mélangeant ex-
temporanément un volume de l’acide trifluoacétique à trois volumes de chloroforme.
On observe ensuite la densité optique à 620 nm par rapport à un blanc constitué de
chloroforme. Ayant auparavant établi une gamme étalon, on peut en déduire ,compte
tenu de la présence de carotène, la teneur en vitamine A ,en fonction de la prise d’essai
choisie(ROUGEREAU., 1984).

17
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.1.3.-Dosage colorimétrique

II.3.1.3.1.- Dosage de la vitamine (E)

Après extraction et évaporation on recueille le résidu par du n-heptane. On


ajoute 1ml d’une solution de αα1 dipyridyl. On lit ensuite à 460 nm (ROUGEREAU.,
1984).

II.3.2.- Dosage des vitamines hydrosolubles

II.3.2.1.- Dosage chromatographique liquide haute pression

II.3.2.1.1.- Dosage de la vitamine (B1)

Après extraction nous obtenons une solution à PH 6.9 .On peut, pour concentrer,
pratiquer une lyophilisation. Après avoir ramené le lyophilisat à un volume minimum
connu, les conditions sont les suivant :

 Colonne lichrosorb M H2 10 µm.25×4.6.

 Solvant : acétronitrile 72 ; KH2PO4 0.005 N : 28.

 Température solvant acétronitrile : 30°C ; température KH2PO4 :25°C.

 Débit : 3.5 ml à 3ml /mn.

 Pression colonne : 92 bar.

 Longueur d’onde : 234 nm.

 Sensibilité : 4 (ROUGEREAU., 1984).

II.3.2.1.2.- Dosage de la riboflavine (B2)

Après lyophilisation du liquide, on ramène ce lyophilisat à un volume minimum


connu pour concentrer l’extrait .On pratique alors la chromatographie dans les
conditions suivantes :

 Colonne lichrosorb M H2 25 × 4 ,6.10 µm.

 Solvant : acétonitrile : 72 ; KH2 PO4 : 28.

 Température acétonitrile : 30C° ; KH2 PO4 :25C°.

 Débit : 2.5 à 3 ml /mn .

 Pression colonne : 90 bar.

 Longueur d’ondes : 272 nm (ROUGEREAU., 1984).

18
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.2.1.3.- Dosage de la vitamine PP ou niacine (B3)

Après avoir ramené le liquide d’extraction en volume minimum comme pour


concentrer, on utilise la méthode suivante :

 Colonne Lichrosorb M H2 24× 4,6. 10µm.

 Solvant : acétonitrile 72 ; k H2 PO4 0,005. 28.

 Température acétonitrile : 30°C.

Température ; K H2 PO4 25°C.

 Pression colonne : 90-100 bar.

 Débit : 2,5 à 3 ml /minute.

 Longueur d’onde : 218 nm (ROUGEREAU., 1984).

II.3.2.1.4.-Dosage de l’acide pantothénique ou vitamine (B5)

On utilise les conditions suivantes, après préparation de l’échantillon :

 Colonne Lichrosorb M H2 25 × 4,5 × 10 µm.

 Solvant acétonitrile : 92.

 Température solvant : 65°C.

 Débit : 3 ml/minute.

 K H2 PO4 0,005 M.8.

Pession colonne : 100 bar (ROUGEREAU., 1984).

Le protocole analytique proposé mise en solution de l’acide pantothénique dans


un tampon tris; purification par passage sur une cartouche échangeuse d’anions;
acidification à pH= 3, purification par passage sur cartouche échangeuse de cations. La
chromatographie liquide avec dérivation post-colonne a permis d’obtenir un isolement
et un dosage corrects de l’acide pantothénique contenu dans toutes les matrices
alimentaires testées (Figure 3).

La figure 3 représente Chromatogramme obtenue pour la détermination de


l’acide pantothénique lib dans l’avocat (a),la carotte (b), les épinards(c),le foie de
porc(c) , les haricots verts(d),le lait en poudre(f),les lentille(g) et la levure (h)

19
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

Figure 3- Chromatogramme obtenue pour la détermination de l’acide pantothénique


libre dans l’avocat (a),la carotte (b), les épinards(c),le foie de porc(c) , les haricots
verts(d),le lait en poudre(f),les lentille(g) et la levure (h) (PAKIN., 2004) .

II.3.2.1.5.- Dosage de la vitamine (B6)

On dissout l’extrait lyophilisé, avec le plus faible volume d’eau, ou de solution


tampon, on utilise les conditions suivantes :

 Colonne : Lichrosorb M H2 25× 4,6. 10µm

 Débit : 2,5 à 3 ml /mn

20
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

 Solvant acétonitrile : 92 ; K H2 PO4 0,005 M. 8

 Température solvant : 30°C

 Longueur d’onde : 286 nm

 Pression colonne : 90-100 bar (ROUGEREAU., 1984).

II.3.2.1.6.- Dosage de la vitamine (B12)

On préconise les conditions techniques suivantes :

 Colonne Lichrosorb RP 8, 24 × 4 ,6 . 10 µm

 Solvant acétonitrile : 15 ; tampon acétate de sodium : 0,005 M 85

 Température du solvant : 40°C

 Débit : 2 ml/min

 Pression : 50 bar

 Longueur d’onde : 212 nm (ROUGEREAU., 1984).

II.3.2.1.7.- Dosage de la vitamine C

Cette méthode peut permettre de doser l’acide ascorbique et l’acide


déhydroascorbique, avec les conditions suivantes :

 Colonne Lichrosorb MH2 25 × 4,6. 10 µm.

 Solvant acétonitrile : 73 ; tampon : KH2 PO4 0,005 M 27.

Température solvant : 40°C.

 Débit : 2ml/min.

 Pression : 50 à 70 bar.

 Longueur d’ondes : 268 nm (ROUGEREAU., 1984).

L’élution de l’acide L-ascorbique est moins rapide, mais le temps de rétention est
parfaitement reproductible dans le temps (Figure4).

La figure 4 représente le chromatogramme de séparation de l’acide L-ascorbique


(2) et de la DL-homocystéine en exée Par chromatographique liquide haute pression.

21
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

Figure 4 - séparation de l’acide L-ascorbique (2) et de la DL-homocystéine en exée par


chromatographique liquide haute pression (DIOP., 1987).

II.3.2.2.- Dosage fluorimétrique

II.3.2.2.1- Principe

L’absorption d’un photon par un atome entraine le passage d’un électron de


valence d’une orbitale E0 à une orbitale E2 d’énergie supérieure. Dans ce nouvel état,
l’atome est instable et le retour se réalisera avec émission de photon dit de fluorescence
(LINDEN., 1984).

II.3.2.2.2.- Dosage de la Riboflavine (B2)

On dissout le résidu dans un solvant pyridine, acide acétique glacial, eau distillée
(10: 1: 40 volume). On mesure la fluorescence, avec comme Filtre primaire 400-420
nm, et comme filtre secondaire 550-570 nm. On calcule ensuite la concentration par
rapport à l’étalon de riboflavine préparé de la même façon (ROUGEREAU., 1984).

II.3.2.2.3.-Dosage de l’acide ascorbique (C)

Elle consiste, après oxydation de l'acide L-ascorbique en acide déhydro L-


ascorbique, à transformer ce dernier en un produit fluorescent par l'intermédiaire de
l'orthophény1 ènediamine. Si Tono et Fujita (1982) ont utilisé l’ascorbate oxydase
comme réactif d'oxydation, la plupart des auteurs utilisent le charbon actif, préconisé
pour la première fois par Deutsch et Weeks (1965) Cette méthode qui peut-être
partiellement automatisée est très sensible et possède une assez bonne spécificité. La
méthode à 1’orthophénylènediamine a été retenue par l'association française de

22
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

normalisation (AFNOR, 1980) pour le dosage de la vitamine C dans les jus de fruits et
légumes et constitue la méthode officielle de l’AOAC (1984) pour le dosage de la
vitamine C dans les préparations vitaminées (DIOP., 1987).

II.3.2.3.- Dosage microbiologique

II.3.2.3.1.- Principe

La méthode microbiologique de dosage des vitamines repose sur le fait que


certains micro-organismes exigeants, les lactobacilles en particulier sont incapable de
synthétiser certaines substances appelés ʺFacteur de croissanceʺ, la plupart des
vitamines sont des facteurs de croissance pour telle ou telle souche de micro-
organisme. Tant que l’apport de cette substance est fait au micro-organisme, dans le
milieu de culture à dose sous optimale, la carence partielle demeure le facteur qui limite
son développement par conséquent, pour chacune des doses sous optimales du facteur
de croissance introduites dans le milieu de culture, le développement du microbe est
limités mais la fonction de la quantité du facteur de croissance présente. Le dosage
microbiologique d’une vitamine comporte les étapes suivantes :

-Obtention d’une souche exigeant la vitamine à doser comme facteur de


croissance .On peut se les procurer auprès des collections françaises (institut pasteur) ou
internationales (Americain type culture collection).

-Préparation d’un milieu de culture renfermant tout ce dont le microbe a besoin


mais rigoureusement exempt de la vitamine à doser.

-Etablissement d’une courbe de référence faisant correspondre le développement


microbien obtenue à des doses sous optimales du facteur de croissance ajoutées au
milieu.

L’appréciation du développement microbien, après incubation est faite


généralement soit par acidimétrie soit par opacimétrie.

-Préparation, dans des conditions déterminées, d’un extrait de la vitamine a dosé,


à partir d’un produit naturel dont on cherche à établir la teneur.

-Comparaison du développement microbienne obtenue en introduisant un


volume connu de cet extrait dans le milieu de culture à ceux de la courbe de référence.
On en déduit la quantité de la vitamine présente, donc la concentration de l’extrait et
ainsi la teneur du produit naturel (LEVEAU et BOUIX., 1984).

23
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.2.3.2.-Dosage de la vitamine (B1)

On utilise plusieurs lactobacilles : Lactobacillus fermentum et Lactobacillus


viridiceus ATTC 1270 G. Le milieu utilisé est suivant :

 Peptone 10,0 g

 Hydrolysat acide de caséine 2,5 g

 Cystine 0,1 g

 Glucose + sels 25,0 g

 Adénine, uracil, guanine 400,0 µg

 Vitamine B 400,0 µg

 Vitamine PP 100,0 µg

 Acide panthoténique 100,0 µg

 Pyridoxine 100,0 µg

 Biotine 0,4 µg

 Acide folique 0,2 µg

 Acide paraaminobenzoĭque 100,0 µg

On titre, après incubation, les turbidités produites à l’aide d’un néphélomètre,


après avoir arrêté le développement des réactions (ROUGEREAU., 1984).

II.3.2.3.3.-Dosage de la vitamine PP ou Niacine (B3)

On utilise l’emploi de lactobacillus arabinosus 17/5, leuconostoc mesentéroides


ATCC 9135.Certains autres emploient également le lactobacillus caséi ATCC 7469.
Les milieux de base sont montrés dans le tableau suivant :

24
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

Tableau 1 - Les milieux de culture (ROUGEREAU., 1984).

Milieu1 Milieu2 Milieu3


Hydrolysat acide de 5g 5g 5g
caséine
L cystine 100 g 100 g 200 g
DL Tryptophane 100 g 100 g -
Peptone - - 2,5 g
Extrait de foie - - 1g
Extrait de levure - - 2g
Glucose + sel 12 g 25 g 25 g
Acétate de sodium 6g 20 g 18 g
Adénine, uracil, guanine 10 mg 10 mg -
Thiamine 100 µg 100 µg -
Riboflavine 200 µg 200 µg -
Panthoténate de ca 100 µg 100 µg 100 g
Acide - 100 µg -
paraaminobenzoique
Biotine 0,4 µg 0,2 µg -

La mesure de la croissance des colonnes se fait soit par une photométrie ou une
tétrimétrie (ROUGEREAU., 1984).

II.3.2.3.4.- Dosage de l’acide pantothénique ou vitamine (B5)

On utilise le lactobacillus casei , ou bien le Lactobacillus arabinosus ATCC


2112, ou encore le Leuconostoc meseteroïde. On peut encore utiliser le Saccharomyces
cerevisiae ATCC 4228. Le milieu de culture est le suivant :
-Pour le Lactobacillus arabinosus
 Peptone 5g
 Hydrolysat acide caséine 2g
 Extrait de leveur 1g
 Extrait de leveur 7 ,5 g
 Mélange salin glucosé 25 g
 Acétate de sodium 25 g
 L cystine 100 mg
 DL tryptophane 200 mg
 Riboflavine 100 mg
(ROUGEREAU., 1984).

25
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.2.3.5.- Dosage de la vitamine (B6)

On utilise plusieurs souches, soit Neurospora sitophila ATCC 9276,


Saccharomyces carlsbergensis ATCC 4228. Le milieu de base utilisé est le suivant :

Tableau 3 – les constituants de milieu de base (ROUGEREAU., 1984).

Solution Quantité

A 500 ml Glucose 400g

KCl 3 ,5g

CaCl 2 1g

Mg So4 1g

Fe Cl 3 0 ,02g

Mn So4 0,01g

eau 4 ml

B 100 ml Citrate neutre de Na 100g

Acide citrique 20 g

Eau q.s.p. 2ml

C 50 ml Solution hydrolysat (acide de caséine) 10

D 100 ml Vitamine B 1,5mg

Acide pantothénique 22,5mg

Inositol 125mg

Biotine 0,04mg

Eau q .s .p. 500ml

(ROUGEREAU., 1984).

26
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.2.3.6.- Dosage de la biotine (B8)

La souche utilisée est le Lactobacillus arabinosus.


Le milieu employé est constitué des éléments suivants :
 Hydrolysat acide de caséine 10 g
 L cystine 100 mg
 DL tryptophane 50 mg
 Mélange salin 20 mg
 Adénine , guanine , uracil 10 mg
 Xanthine 10 mg
 Acétate de sodium 15 mg
 Vitamine B2 0,8 mg
 Vitamine B1 0,1 mg
 Acide panthoténique 0,2 mg
 Acide nicotinique 0,4 mg
 Pyridoxine 0,2 mg
 Sulfate d’ammonium 3 mg
 Chlorure de sodium 5 mg
(REGEREAU., 1984).
II.3.2.3.7.- Dosage de l’acide folique (B9)
Plusieurs souches ont été préconisées : Streptoccocus faecalis ATCC 8043 et
Lactobacillus casei ATCC 7469.
Pour la souche faecalis, on peut utiliser le mélange suivant :
 Hydrolysat acide de caséine 5g
 Citrate de sodium 25 g
 DL alanine 0,2 g
 L cystine 0,2 g
 DL tryptophane 0,4 g
 Adénine, guanine, xanthine 10 mg
 Uracil 10 mg
 Thiamine 200 µg
 Riboflavine 200 µg
 Acide nicotinique 600 µg

27
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

 Acide panthoténique 400 µg


 Pyridoxine 1,500 µg
 Biotine 0,4 µg
 Acide para aminobenzoique 10 µg
 Glucose 20 g
 PO4 H K2 2,5 g
Pour le Lactobacillus Casei, on a préconisé le milieu suivant :

 Caséine enzymatique hydrolysé 800 ml


 Glucose 160 g
 Acétate de sodium 160 g
 L asparagine 2,4 g
 L cystine 1,6 g
 L tryptophane 0,8 g
 K2 PO4 4g
 DL alanine 1,6 g
 K H2 PO4 4g
 Glutathion réduit 20 mg
 Adénine, guanine, uracil 40 mg
 Xanthine 80 mg
 Acide para aminobenzoique 8 mg
 Acide pantothénique 3,2 mg
 Acide nicotinique 3,2 mg
 Pyridoxine 16 mg
 Thiamine 1,6 mg
 Riboflavine 4 mg
 Biotine (10g/ml) 8 ml
 Solution saline 40 ml
 Tween 80 (1 :10) 4 ml
 Eau distillée. q.s.d. 4 litres
(ROUGEREAU., 1984).

28
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.2.3.8.- Dosage de la vitamine (B12)

On utilise le plus souvent les souches suivantes : Lactobacillus lactis ATCC


8.000, Lactobacillus lelschmani ATCC 7830, Escherichia coli

Le milieu pour les lactobacillus est les suivants :

 Mélange salin glucosé 25 g

 Acétate de sodium 10 g

 Hydrolysat acide de caséine 5g

 L cystéine 0,2 g

 DL tryptophane 0,2 g

 Asparagine 0,1 g

 Adénine, guanine, uracil 10 mg

 Xanthine 10 mg

 PO4 H K2 et PO4 H2 K 1+1 mg

 Tween 80 1 ml

 A-para aminobenzoique 1.000 µg

 Acide nicotinique 1.000 µg

 Riboflavine 500 µg

 Pyridoxine 2.000 µg

 Pyridoxamine 400 µg

 Pyridoxal 2.000 µg

 Biotine 4 µg

 Thiamine 500 µg

 Acide ascorbique 2g

 Cystéine 100 g

(ROUGEREAU., 1984).

29
Chapitre II Méthodes d’extraction et de dosage des vitamines

II.3.2.4.- Dosage colorimétrique

II.3.2.4.1.- Dosage de la vitamine (B1)

Après action de ferricyanure de potassium en présence de potasse, on détermine


la fluorescence en utilisant un filtre primaire 360-365 nm et un filtre secondaire 460-480
nm (ROUGEREAU., 1984).

30
Conclusion
Conclusion

CONCLUSION

La mise au point de méthodes analytiques spécifiques et sensibles permettant

le dosage des vitamines dans les aliments s’est néanmoins révélée indispensable à la
fois pour des raisons nutritionnelles. Les méthodes calorimétriques, colorimétriques et
microbiologiques sont actuellement encore largement utilisées pour le dosage des
vitamines. Les méthodes microbiologiques sont basées sur les besoins vitaminiques
d’un microorganisme particulier à chaque vitamine, la croissance de ce microorganisme
étant proportionnelle à la quantité de vitamine ajoutée dans le milieu de culture. Bien
que ces méthodes soient très sensibles et puissent s’appliquer directement aux
échantillons alimentaires, elles sont souvent d’une spécificité contestable. Associée à un
système de détection par fluorimétrie, la chromatographie en phase liquide haute
performance peut ainsi constituer une méthode de dosage présentant une limite de
détection suffisamment basse pour estimer correctement les teneurs en vitamines
habituellement présentes dans un aliment, quelle que soit sa nature.

La mise au point d’un tel protocole peut cependant s’avérer très délicate
dans la mesure où il est généralement nécessaire de proposer une transformation pré- ou
post-colonne de la vitamine (non fluorescente) en composé fluorescent, mais aussi une
hydrolyse enzymatique des échantillons afin de rompre les formes vitaminiques liées
dans les aliments à d’autres constituants (protéines, phosphates, polysaccharides, NAD,
coenzyme A), tout en ne dosant finalement que les formes vitaminiques bio disponibles.
Les problèmes analytiques seront bien entendu d’autant plus complexes à résoudre que
la vitamine existe dans l’aliment sous plusieurs formes chimiques et en faibles
concentrations.

32
Références bibliographiques
Références bibliographiques

Références bibliographiques

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Méthodes d’extraction et de dosage de différentes vitamines
Résumé
Le travail porte sur l’étude des méthodes d’extraction et de dosage des vitamines dans les
aliments.
Le dosage des vitamines est procédé par une extraction à partir de l’aliment. Les principales
méthodes d’extraction utilisées sont : extraction par voie enzymatique, extraction chimique suivie
par la filtration, décantation, centrifugation, évaporation et saponification. Les principales
méthodes de dosage des vitamines sont : chromatographie liquide haute pression qui sépare les
constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou
gaz) le long d'une phase stationnaire. La fluorimétrie qui est basée sur le principe de l’émission d’un
photon due au retour à la stabilité. La méthode calorimétrique qui consiste à mesurer des quantités
de chaleur échangée. Les vitamines peuvent être dosées aussi par des méthodes microbiologiques
qui s’intéressent des souches exigeant la vitamine à doser comme facteur de croissance et les
méthodes colorimétriques par la détermination de la densité optique.
Mots Clés: Vitamines hydrosolubles, vitamines liposolubles, méthodes d’extraction, méthodes de
dosage.

‫ فحص الفيتامينات جيرى باالستخراج من قبل‬,‫تركز الدراسة على دراسة وسائل استخالص وفحص الفيتامينات يف األغذية‬
,‫ استخالص كيميائي يتبع بالترشيح‬, ‫ االستخالص بالطريقة اخلمريية‬: ‫ الطرق األساسية املستعملة يف االستخالص هي‬.‫األغذية‬
(HPLC) ‫ السائل اللوين‬:‫ الطرق األساسية املستعملة يف فحص الفيتامينات هي‬.‫ التصنب‬, ‫ التبخر‬,‫ قوة الطرد املركزي‬,‫الترسيب‬
‫ طريقة اإلستشعاع‬.‫الذي يفصل مكونات املزيج عن طريق السحب بواسطة طور متحرك (سائل أو غاز) على طول الطور الثابت‬
‫ الطريقة الكلورميترية (املسعرية) اليت ترتكز على قياس كميات‬.‫املركزة على مبدأ اصدار فوتون ناتج من الرجوع إىل االستقرار‬
‫ ميكن فحص الفيتامينات أيضا بطرق األحياء اجملهرية اليت هتم السالالت املتطلبة للفيتامينات املفحوصة كعامل تكاثر‬. ‫احلرارة املتبادلة‬
. ‫و الطرق امللوانية بتحديد الكثافة البصرية‬
‫ طرق الفحص‬,‫ طرق االستخالص‬,‫ الفيتامينات الدوابة يف الدسم‬,‫الفيتامينات املنحلة يف املاء‬

Methods of extraction and dosage of different vitamins


Summary
The work focuses on the study of methods of extraction and determination of vitamins in foods.
The assay method of the vitamins is by extraction from the food. The main extraction methods are:
extraction enzymatically, chemical extraction followed by filtration, decantation, centrifugation,
evaporation and saponification. The main assays vitamins are: high pressure between the
components of a mixture (solutes) to drive by means of a mobile phase (liquid or gas) along a
stationary phase liquid chromatography. Fluorimetry which is based on the principle of emission of
a photon due to return to stability. Calorimetric method of measuring quantities of heat exchanged.
Vitamins can also be assayed by microbiological methods interested vitamin requiring strains to be
assayed as a growth and colorimetric methods by determining the optical density.
Key words: hydrosoluble vitamins, liposoluble vitamins, the methods of the extraction, the
methods of the dosage.