TFE000193

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS
MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA
Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adición

de tipo S-michael sobre una deshidroalanina quiral
Ismael Compañón Pérez
Tutores: Alberto Avenoza Aznar y Jesús Héctor Busto Sancirián

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Curso 2011-2012
Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adición de tipo S-michael sobre una
deshidroalanina quiral, trabajo fin de estudios
de Ismael Compañón Pérez, dirigido por Alberto Avenoza Aznar y Jesús Héctor Busto
Sancirián (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
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© El autor
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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA
Grupo de Síntesis Química de La Rioja
U.A. – C.S.I.C.
SÍNTESIS DE CISTEÍNAS GLICOSILADAS

MEDIANTE ADICIÓN DE TIPO S-MICHAEL
SOBRE UNA DESHIDROALANINA QUIRAL
Trabajo de investigación.
Proyecto fin de Máster.
Ismael Compañón Pérez

Junio 2012
ALBERTO AVENOZA AZNAR, Catedrático de Química Orgánica del Departamento
de Química de la Universidad de La Rioja y
JESÚS HÉCTOR BUSTO SANCIRIÁN, Profesor Titular de Universidad del

Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.
HACEN CONSTAR:
Que la memoria " Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adición de

tipo S-Michael sobre una deshidroalanina quiral." ha sido realizada por el
Licenciado ISMAEL COMPAÑÓN PÉREZ en el Departamento de Química de
la Universidad de La Rioja, bajo su inmediata dirección y reúne las
condiciones exigidas para conseguir los 30 créditos ECTS correspondientes
al período de investigación del Trabajo fin de Máster.
Logroño, Junio 2012
Fdo.: Alberto Avenoza Aznar Fdo.: Jesús Héctor Busto Sancirián

A mis padres, por su comprensión y apoyo en todo momento
A mi hermana, por su cariño y paciencia.
A mi familia y amigos, por estar ahí.
Han pasado ya más de dos años desde que formo parte de este grupo
y a lo largo de este periodo ha habido buenos y mejores momentos y por
ello antes de entrar en el contenido de esta memoria, me gustaría agradecer
el apoyo prestado a todos aquellos que me han acompañado:
A Alberto y Héctor, mis directores, a los cuales les estaré

eternamente agradecido por haber permitido formar parte de este grupo; a
Pere, Marimar y Paco, muchas gracias por todo cuánto me habéis
enseñado durante la carrera y por haber estado ahí en todos los momentos en
los que he dudado; a Fer, mi primer “jefe” durante las tuteladas, gracias por
haberme inculcado el espíritu trabajador que tienes en el laboratorio; a Javi,
que aunque no he compartido mucho tiempo contigo, no me puedo olvidar
de esos bailes las noches de fiesta; a Charlie, “jefe” no hay palabras para
agradecer el apoyo incondicional que me has prestado todo este año, no sé
qué hubiera sido de mi sin tu ayuda; a Eva, siempre dispuesta a gastar de su
tiempo para dárselo a los demás; a Lara, al principio en el laboratorio y más
tarde en el despacho, una indispensable compañera; a Nuria, qué sería del
laboratorio sin sus devaneos de cabeza a la hora de pedir material; a Víctor
S., que nos anima a todos con su buen humor; a Víctor R., indispensable en
el laboratorio por su organización y también en el despacho por su
paciencia; a Iván, por muchísimas cosas pero sobre todo por enseñarme a
manejar el carro, cuanto tiempo he ganado gracias a ello; a Mada, siempre
dispuesto a pasárselo bien; a Claudio y Laura, mis compañeros de master
y grupo, por aguantarme en general.
No me olvido de mis vecinos fotoquímicos, Anselmo, Alegría,

Héctor y Marina con los que también he compartido muy buenos
momentos.
Y por supuesto que tampoco me olvido de mi amigo y compañero

Justo, han sido muchos años dando guerra con nuestras discusiones sobre
química, dentro y fuera de la universidad, y espero que sean muchos más.
Por último, pero no menos importante, agradecer al resto de gente de

los otras áreas por todos los momentos compartidos durante este tiempo.
También me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la ayuda

económica aportada para la realización de este trabajo:
x Ministerio de Educación y Ciencia, por la aportación económica al
proyecto CTQ2009-13814/BQU.
x Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y

tecnológico idóneo para el desarrollo de este trabajo.
ÍNDICE
Abreviaturas I
1. Introducción 1
2. Antecedentes y objetivos 11
3. Discusión de resultados 21
4. Conclusiones 29
5. Experimental 33
6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 45

Abreviaturas
G desplazamiento químico
1
H RMN resonancia magnética nuclear de protón
13
C RMN resonancia magnética nuçclear de carbono-13
Ac acetilo
Ac2O anhídrido acético
AcOEt acetato de etilo
Boc terc-butoxicarbonilo
Boc2O dicarbonato de di-terc-butilo
tBu terc-butilo
BuOH butanol
c concentración (g/100 mL)
Cbz benciloxicarbonilo
COSY COrrelated SpectroscopY
d doblete
DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida
dd doblete de dobletes
DIEA diisopropiletilamina
Et etilo
EtOH etanol
Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo
Fmoc·OSu succinimida de N-(9-Fluorenilmetoxicarbonilo)
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
J constante de acoplamiento
m multiplete
Me metilo
MeOH metanol
MeONa metóxido de sodio
mmol milimol
NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
R sustituyente alquilo o arilo
Rdt rendimiento
RMN resonancia magnética nuclear
s singlete, ázucar (del inglés, sugar)
SPPS solid-phase peptide synthesis
t triplete, tiempo
TBTU tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N´,N´-
tetrametiluronio
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
TMS trimetilsililo, tetrametilsilano
1.- Introducción
Introducción 3
1-I I
Las modificaciones post-traduccionales de proteínas son cambios químicos

ocurridos tras la síntesis proteica. Las modificaciones post-traduccionales más
comunes en la naturaleza son llevadas a cabo con diversos fines como la
incorporación de grupos hidrófobos para su anclaje en la membrana celular,
adición de cofactores para la mejora de la actividad enzimática1, glicosilaciones
para el reconocimiento celular, etc.
Además de las modificaciones post-traduccionales ocurridas de manera

2a-b
natural se pueden incluir las utilizadas por los científicos como la incorporación
de sondas fluorescentes o radioactivas, que permiten el seguimiento de la proteína
en tiempo real. El logro de la modificación selectiva está a menudo lleno de
dificultades, un único residuo debe reaccionar con preferencia entre cientos de
cadenas laterales, por lo que es necesario el uso de una síntesis química muy
selectiva. (Figura 1.1)
i ur 1.1. Modificaciones post-traduccionales
1
Qi, D.; Tann, C.-M.; Haring, D.; Distefano, M. D. Chem. Rev. 1, 101, 3081–3111.
2
(a) de Graaf, A. J.; Kooijman, M.; Hennink,W. E.; Mastrobattista, E. Bioconjugate Chem.
, 20, 1281–1295. (d) Ohta, A.; Yamagishi, Y.; Suga, H. Curr. Opin. Chem. Biol. ,
12, 159–167. (c) Johnson, J. A.; Lu, Y. Y.; Van Deventer, J. A.; Tirrell, D. A. Curr. Opin.
Chem. Biol. 1 , 14, 774–780. (b) Xie, J.; Schultz, P. G. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. ,
7, 775–782.
4 Introducción
De los aminoácidos naturales, la cisteína es uno de los más

convenientes a la hora de ralizar estas modificaciones debido a su alta
nucleofília, siendo un objetivo clásico para la reacción selectiva con
electrófilos3. Es fácil de introducir en un sitio de interés mediante
mutagénesis y su abundancia natural relativamente baja permite la
preparación de mutaciones selectivas de cisteína.
Además de las modificaciones post-traduccionalaes basadas en la

química de los aminoácidos naturales como la cisteína existen otras
estrategias de marcado basadas en la incorporación de aminoácidos no
naturales y su posterior modificación bio-ortogonal4.
Como se ha mencionado anteriormente la cisteína es un aminoácido

fácilmente modificable gracias a su elevada nucleofilia3. En primer lugar se
describió el uso de la cisteína como un precursor de puentes disulfuro,
pudiéndose generar estos puentes de manera selectiva. Además se han
utilizado rutas no clásicas de modificación de la cisteína, como la
conversión de los puentes disulfuro a tioéteres y la conversión de la cisteína
a deshidroalanina para la incorporación de nuclelófilos azufrados y formar
también tioéteres de interés.
En este sentido la generación de glicoproteínas mediante la

formación de puentes disulfuro es crítica a la hora de generar
modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Trivialmente la mezcla
de una proteína que contiene un residuo de cisteína junto con un tiol genera
mezclas de puentes disulfuro tras la oxidación con aire. Bajo estas
condiciones pueden aparecer productos no deseados. Sin embargo reactivos
como el metanotiosulfonato (MTS)5, 6, feniltiosulfonato (PTS),7 o el sulfuro
de fenilselenio (SeS)8 reaccionan rápida y específicamente con la cisteína
3
Chalker, J.M.; Bernardes, G. J. L.; Lin, Y. A.; Davis, B. G. Chem. Asian J. , 4, 630–
640.
4
Slotten, E. M.; Bertozzi, C.R. Acc. Chem. Res. 11, 44, 666–676.
5
Davis, B. G.; Lloyd, R. C.; Jones, J. B. J. Org. Chem. 1 , 63, 9614–9615.
6
Davis, B. G.; Maughan, M. A. T.; Green, M. P.; Ullman, A.; Jones, J. B. Tetrahedron
Asymmetry , 11, 245–262.
7
Gamblin, D. P.; Garnier, P.; Ward, S. J.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G.
Org. Biomol. Chem. , 1, 3642–3644.
8
Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B.
Angew. Chem. Int. Ed. , 43, 828–833.
Introducción 5
para formar puentes disulfuro casi de manera instantánea y por ello es fácil
llevar a cabo la generación de productos de control cinético sin necesidad de
utilizar grandes excesos de reactivos. (Figura 1.2)
i ur 1. . Modificación post-traduccional por formación de puentes

disulfuro.
Esta química ha sido utilizada por ejemplo para la generación de

dendriglicoproteinas9 capaces de neutralizar patógenos tras su adhesión,10
también se ha empleado para la glicosilación de proteínas con sacáridos
complejos (heptasacáridos) e incluso se han podido generar puentes
trisulfuro.11
La facilidad y la utilidad de la formación de puentes disulfuro inspiró

un método para la tionación directa de alcoholes utilizando el reactivo de
Lawesson, que ha permitido la incorporación de carbohidratos más
complejos. (Figura 1.3)
9
Davis, B. G. Chem. Commun. 1, 351– 352.
10
Rendle, P. M.; Seger, A.; Rodrigues, J.; Oldham, N. J.; Bott, R. R.; Jones, J. B.; Cowan,
M. M.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. , 126, 4750–4751.
11
Bernardes, G. J. L.; Marston, J. P.; Batsanov, A. S.; Howard, J. A. K.; Davis, B. G.
Chem. Commun. , 3145–3147.
6 Introducción
i ur 1. . Utilización del reactivo de Lawesson.
Aunque hay muchos métodos para la síntesis de tioglicósidos, la

mayoría de ellos requieren en gran medida métodos de protección de
grupos.12 Como gran ventaja, la conversión de azúcares reductores a
tioglicoles mediante la utilización del reactivo de Lawesson no requiere la
intervención de estos grupos protectores13 y permite la utilización directa de
azúcares aislados de fuentes naturales y su posterior unión a la proteína.12
Como hemos visto los puentes disulfuro pueden llegar a ser lábiles
bajo condiciones reductoras. Cuando la modificación anclada es crítica para
la función específica de la proteína, se hace esencial un enlace estable.
Mediante el uso de fosfinas ricas en electrones como la HMPT se puede
aprovechar esa labilidad del puente disulfuro para generar el
correspondiente tioéter,13 con aumento de la estabilidad química y
resistencia enzimática.14 (Figura 1.4)
12
Pachamuthu, K.; Schmidt, R. R. Chem. Rev. , 106, 160–187.
13
Bernardes, G. J. L.; Gamblin, D. P.; Davis, B. G. Angew. Chem. Int. Ed. , 45, 4007–
4011.
14
(a) Galonic D. P.; van der Donk, W.A.; Gin, D. Y. Chem. –Eur. J., , 9, 5997–6006.
(b) Zhu, X,; Pachamuthu, K.; Schmidt, R.R. J. Org. Chem., , 68, 5641. (c)
Pachamuthu, K.; Schmidt, R.R. Chem. Rev., , 106, 160–187. (d) Comegna, D.; De
Riccardis, F. Org. Lett. , 11, 3898–3901.
Introducción 7
i ur 1. . Formación de un tioéter.
El mecanismo parece implicar al correspondiente derivado de

deshidroalanina, que se genera mediante el ataque de la fosfina sobre el
azufre de la cisteína y la posterior eliminación del ión tiofosfonio genera la
aparición del derivado de deshidroalanina. La adición del tiol liberado sobre
la deshidroalanina15 generada proporciona el tioéter. (Figura 1.5)
i ur 1. . Generación y desaparición de deshidroalanina.
Viendo los estudios mecanísticos de la formación de tioéteres

mediante el procedimiento anteriormente mencionado surgió la idea de la
utilización de deshidroalanina para la obtención de estos derivados. Con el
fin de llevar a cabo este propósito se desarrolló un método para la obtención
de deshidroalanina a partir de cisteína.
El tratamiento con O-mesitilsulfonilhidroxilamina (MSH) consiguió

que la cisteína eliminara rápidamente para generar deshidroalanina.15 La
15
Bernardes, G. J. L.; Grayson, E. J.; Thompson, S.; Chalker, J. M.; Errey, J. C.; El Oualid,
F.; Claridge, T. D. W.; Davis, B. G. Angew. Chem. Int. Ed. , 47, 2244–2247.
8 Introducción
posterior adición de tioglicoles generó la aparición de los derivados

deseados. (Figura 1.6)
i ur 1. . Generación de tioéteres a partir de deshidroalanina.
Como se puede observar el uso de deshidroalanina como sustrato

proporciona una vía muy útil para generar un amplio rango de
modificaciones post-traduccionales.16 Sin embargo, esta metodología no
proporciona control sobre el nuevo centro estereogénico creado,
proporcionando mezclas diasteroméricas.
Por otro lado, la resistencia antibiótica es un problema importante en

la sociedad actual. Esta resistencia aparece de manera natural debida a
mutaciones surgidas al azar. En aquellas bacterias en las que surja una
mutación que les permita sobrevivir se reproducirán, trasmitiendo de esta
manera la información genética necesaria para producir esa resistencia.
El abuso de los antibióticos en la sociedad actual es sin duda una de

las causas más influyentes en esta resistencia antibiótica, pues impone una
nueva presión evolutiva en organismos que tienen un tiempo de vida
generacional muy corto (unos 20 minutos) y una tasa de mutación de 1 en
10 millones. Esto quiere decir que en apenas unos pocos años estas
16
Bernardes, G. J. L.; Chalker, J. M.; Errey, J. C.; Davis, B. G. J. Am. Chem. Soc. ,
130, 5052–5053.
Introducción 9
mutaciones pueden hacer que la bacteria codifique la síntesis de proteínas

que le ayuden a soportar estos antibióticos.
La manera que tenemos de combatir este problema es el desarrollo

de antibióticos de nueva generación. Una de las familias de antibióticos que
se está estudiando en la actualidad son las bactericinas. Se trata de
antibióticos de naturaleza peptídica eficaces contra bacterias Gram
positivas.
En este contexto, el acoplamiento de residuos deshidrogenados,

como la deshidroalanina, a cisteínas da como resultado la formación de las
denominadas lantioninas, las cuáles son aminoácidos con un puente
tioéter.17 Las lantioninas son conocidas principalmente por su presencia en
antibióticos que contienen estas estructuras y se denominan lantibióticos.
Los lantibióticos pertenecen a la clase I de bacteriocinas y son antibióticos
peptídicos de aproximadamente 20-40 residuos, activos fundamentalmente
frente a bacterias Gram positivas.
Nuestro grupo de investigación tiene experiencia en la síntesis de

lantionina (Lan), a través de nuevos sintones quirales de deshidroalanina y
en la síntesis de derivados como la metilnorlantionina (MeLan) mediante la
apertura selectiva de sulfamidatos cuaternarios18.
En el último año, de forma independiente, dos grupos han mostrado

la S-glicosilación en péptidos bacterianos que actúan como bacteriocinas19.
Estos descubrimientos sugieren que la S-glicosilación se encuentra de
manera natural y además está mucho más extendida de lo que se pensaba.
17
Moll, G.N.; Kuipers, A.; Rink, R. Antonie Leeuwenhoek 1 , 97, 319–333.
18
(a) Avenoza, A.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Peregrina, J. M. Org. Lett. , 8,
2855–2858. (b) Aydillo, C.; Avenoza, A.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Peregrina, J. M.;
Zurbano, M. M. Org. Lett. 1 , 14, 334–337.
19
(a) Oman, T. J.; Boettcher, J. M; Wang, H.; Okalibe, X. N.; van der Donk, W. A. Nat.
Chem. Biol. 11, 7, 78–80. (b) Wang, H.; van der Donk, W. A. J. Am. Chem. Soc. 11,
133, 16394–16397. (c) Katayama, H.; Asahina, Y.; Hojo, H. J. Pept. Sci. 11, 17, 818–
821. (d) Stepper, J.; Shastri, S.; Loo, T. S.; Preston, J. C.; Novak, P.; Man, P.; Moore, C.
H.; Havlicek, V.; Patchett, M. L.; Norris, G. E. FEBS Lett. 11, 585, 645–650. (e)
Venugopal, H.; Edwards, P. J. B.; Schwalbe, M.; Claridge, J. K.; Libich, D. S.; Stepper, J.;
Loo, T.; Patchett. M. L.; Norris, G. E.; Pascal, S. M. Biochemistry 11, 50, 2748–2755.
10 Introducción
Por un lado el Profesor van der Donk y colaboradores han

presentado el descubrimiento de la S-glicosilación en un péptido
antimicrobiano producido por el Bacillus subtilis 168 y llamado
sublancina19a-c. Dicha glicosilación está localizada en el residuo Cys22 y el
carbohidrato es la β-glucosa. La S-glicosilación es requerida, según
muestran los bioensayos, para la actividad antimicrobiana del péptido y esta
actividad, se mantiene con el cambio de otras hexosas por la glucosa. Todas
estas características, sugieren que la glicosilación en Cys22 puede constituir
una inusual clase de auto-resistencia. (Figura 1.7)
i ur 1. . Fragmento de la secuencia de sublancina con la glucosa unida

a la cisteína.
En un segundo estudio, el Profesor Norris y colaboradores

encontraron que el glicopéptido gliocina F tiene un carbohidrato, la β-N-
acetilglucosamina (β-GlcNAc) unido a un residuo de Cys43.19d-e También en
este caso la glicosilación de la cisteína contribuye al aumento de actividad
antimicrobiana aunque parece no ser imprescindible. (Figura 1.8)
i ur 1. . Fragmento de la secuencia de gliocina F con una β-N-

acetilglucosamina unida a la cisteína.
.- nt c d nt ti o
Antecedentes y Objetivos 13
Una de las opciones propuestas para la síntesis de péptidos

glicosilados es la estrategia denominada “Fmoc-strategy solid phase peptide
synthesis” (Fmoc -SPPS).
Esta estrategia de síntesis peptídica requiere la utilización como “building
blocks” de aminoácidos glicosilados cuyo grupo amino está protegido por el
grupo Fmoc. En este apartado veremos los métodos más comunes para la
obtención de tio-glicoaminoácidos con algún ejemplo seleccionado para
cada uno.
S- ui ción d tio no rico
Una de las metodologías más comunes consiste en una alquilación

de tiocarbohidratos empleando como electrófilos derivados halogenados de
aminoácidos convenientemente protegidos.1
Asi utilizando β-bromoalaninas y γ-bromoalaninas en presencia de

del tiol, hidrogenosulfato de tetra-n-butilamonio y NaHCO3 con acetato de
etilo como disolvente se obtienen los correspondientes tioglicopéptidos con
buenos rendimientos y sin producir racemización2. (Figura 2.1)
i ur .1
1
Monsigny, M. L. P.; Vaculik, D. D. M. Carbohydr. Res. 1 , 59, 589–593.
2
Zhu, X.; Schmidt, R. R. Tetrahedron Lett. , 44, 6603–6067.
14 Antecedentes y Objetivos
Wong y colaboradores3 modificaron esta metodología generando el

tiolato in situ y adicionando el derivado de bromoalanina posteriormente sin
generar la β-eliminación de ésta. (Figura 2.2)
i ur .
Halcomb4,5 y colaboradores describen otra estrategia para la

alquilación utilizando sulfamidatos cíclicos como electrófilos. Consiste en la
pregeneración de sulfamidatos cíclicos, los cuales reaccionan con el 1-
tioazucar, que tras posterior hidrólisis ácida proporcionan el
glicosilaminoácido con excelentes rendimientos. (Figura 2.3)
3
Thayer, D. A.; Yu, H. N.; Galan, M. C.; Wong, C.-H. Angew. Chem., Int. Ed. , 44,
4596–4599.
4
Cohen, S. B.; Halcomb, R. L. J. Am. Chem. Soc. , 124, 2534–2543.
5
Cohen, S. B.; Halcomb, R. L. Org. Lett. 1, 3, 405–407.
i ur .
Esta estrategia también se ha desarrollado para la síntesis en fase

sólida uniendo el sulfamidato del aminoácido a una resina de poliestireno
modificada y así elevando el rendimiento de la reacción. Este método está
limitado a monosacáridos debido a que la etapa de escisión de la resina se
realiza con un ácido fuerte lo que conlleva la ruptura de los enlaces O-
glicosídicos de los polisacáridos.
cción d ic ntr d ri do d d idro nin uir -

uc ó i o
Otra de las metodologías más empleadas consiste en emplear como
electrófilos derivadodos de deshidroalanina generados in-situ efectuando
reacciones tio-Michael sobre ellos. Sin embargo, muchos de estos ejemplos
carecen de control sobre el nuevo centro estereogénico creado.6 (Figura 2.4)
i ur .
6
Pachamuthu, K.; Schmidt, R. R. Chem. Rev. , 106, 160–187
En este contexto, recientemente en nuestro grupo de investigación se

ha desarrollado un método para la obtención de alquil derivados de cisteína
mediante el empleo de la reacción de Michael sobre derivados quirales de
deshidroalanina7 como el compuesto 1. Esta es una manera muy efectiva de
obtención de estos derivados debido a la elevada diasteroselectividad que
presenta esta reacción.
En primer lugar se había probado esta reacción con S-alquil

derivados a 0 ºC y DBU viéndose la aparición de los dos diasteromeros
posibles.
Debido a ello se llevó a cabo la reacción disminuyendo la

temperatura hasta los -78 ºC con el motivo de imponer condiciones
cinéticas. De esta manera solo se apreció por RMN la aparición de uno de
los dos diasterómeros posibles. (Figura 2.5)
i ur .
7
Aydillo, C.; Avenoza, A.; Busto, J.H.; Jimenez-Osés, G.; Peregrina, J.M.; Zurbano, M.M.
Org. Lett. 1 , 14, 334–337.
Además del ataque con los tioles mostrados anteriormente, también

se consiguió realizar esta adición empleando 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-
8
D-glucopiranosa. La configuración del nuevo centro estereogenico se
determinó por comparación con trabajos anteriores. (Figura 2.6)
i ur .
-. I
En el siguiente trabajo se pretenden escalar las reacciones de adición

de Michael de tioglucósidos al derivado de deshidroalanina 1 para la
obtención del tiogliciominoacido , debido a que en trabajos anteriores se
han llevado a cabo en muy pequeñas cantidades.
8
Tesis de Carlos Aydillo Miguel 11
Puesto que únicamente se ha descrito con anterioridad la adición de

la 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosa a este tipo de derivados,
uno de los objetivos es también el de llevar a cabo esta reacción con los
glucósidos 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-galactopiranosa, N-Cbz-3,4,6-
tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucosamina y 4-O-β-Tetra-O-acetil-D-
galactopiranosil-Tri-O-acetil-D-glucupiranosa-1’’-β-tio).
Por último se procederá a la derivatización del producto de adición

de la 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosa con el fin de conseguir
el tioglicopéptido modelo con los extremos amida para posteriores estudios
conformacionales. Ademas la obtención del “building block”,
convenientemente protegido, para su incorporación en la síntesis en fase
sólida, permitirá su inclusión en diferentes cadenas glicopeptídicas
.- i cu ión d r u t do
Discusión de resultados 21
.1 nt i d roducto d rtid
La síntesis del derivado de deshidroalanina 1 se llevó a cabo
siguiendo la metodología que ya se había empleado anteriormente en
nuestro grupo de investigación. A partir de (S)-serina comercial se obtiene
(S)-N-Boc-serinato de metilo, al que se adicionó 2,2,3,3-tetrametoxibutano
en presencia de ácido p-toluensulfónico como catalizador a reflujo de
tolueno.1 De esta forma se obtiene el N,O-acetalbiciclico con buen
rendimiento. A partir de él se pudo obtener el deshidroalinato quiral 1, con
excelente rendimiento, por tratamiento con la base KHDMS.
(Figura 3.1).
i ur .1
. ccion d tio- ic o r d ri do d
d idro nin
Una vez que se llevó a cabo la síntesis del precursor 1 se pasó a
ensayar la reacción de adición conjugada con diferentes tioglicósidos.
Teniendo en cuenta la experiencia de nuestro grupo, las condiciones
iniciales elegidas fueron emplear atmósfera de argón a -78 ºC y THF como
disolvente, con el fin de poder mantener un control cinético de la reacción y
asi obtener un exceso diasteromérico elevado.
De esta forma se repitió la adición conjugada de la tetra-O-acetil-1-

tio-β-D-glucosa sobre el deshidroalinato, anteriormente descrita en nuestro
grupo de investigación. Dicha reacción se había realizado partiendo de 32
mg del compuesto 1 en presencia de DBU obteniendo un 86% de
rendimiento del producto de tio-Michael. El proceso transcurre con
1
Aydillo, C., Jiménez- Oses, G., Busto, J. H., Peregrina, J. M., Zurbano, M. M., Avenoza,
A. Chem. Eur. J. , 13, 4840–4848
22 Discusión de resultados
excelente diasteroselectividad, detectando un solo diasterómero en el que el

nuevo centro quiral generado posee la configuración (S)2. Así para un
primer objetivo de este trabajo nos propusimos optimizar esta reacción
empleando una mayor cantidad del producto de partida. De esta forma y
empleando 200 mg del deshidroalinato 1 se pudo obtener 312 mg (63%) del
producto de ataque tio-Michael. El exceso diasteromérico se conserva
observándose un único producto por 1H RMN, (Figura 3.2). El rendimiento
disminuye pero la escala utilizada permite obtener la cantidad necesaria de
compuesto para realizar las posteriores transformaciones.
i ur .
Animados por los excelentes resultados obtenidos tras la reacción

anteriormente descrita, se planteó realizar esta adición conjugada con
diferentes tio-β-glucósidos, con el fin de ver si se mantenía el elevado
exceso diasteromérico además de tener acceso a nuevos glicoconjugados.
Así se probó la reacción de Michael con la tetra-O-acetil-1-tio-β-D-
galactosa. (Figura 3.3)
i ur .
Con una cantidad del compuesto 1 de (200 mg) se emplearon las

mismas condiciones utilizadas anteriormente, para el compuesto . En este
caso el rendimiento obtenido fue del 82% y al igual que en el caso anterior
se comprobó la elevada diastereoselectividad de esta reacción al no
observarse el otro diasterómero por 1H RMN.
2
Tesis de Carlos Aydillo Miguel 11
El siguiente objetivo fue llevar a cabo la adición de un

aminoglucósido, en concreto la N-Cbz-tri-O-acetil-1-β-tio-D-glucosamina
previamente sintetizada.3 (Figura 3.4)
i ur .
En ese caso el rendimiento obtenido fue del 56%, algo menor que en
los casos anteriores, sin embargo el exceso diasteromérico siguió siendo
muy elevado al no observarse ningún otro isómero por 1H RMN.
Posiblemente, la desprotonación del grupo amida haga disminuir la eficacia
catalítica de la DBU.
Por último se planteó la adición de un glucósido de mayor tamaño, la

S-(2,3,4,6-tera-O-acetil-β-D-glgalactopiranosil-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetil-β-
D-glucopiranosa). (Figura 3.5)
i ur .
Empleando las mismas condiciones y partiendo de 200 mg del

compuesto 1, el rendimiento obtenido en este caso fue del 78% y una vez
más fue éste el único diasterómero detectado con la técnica de 1H RMN.
(Figura 3.6)
3
Tesis de Gonzalo Jiménez Osés
i ur .
. nt i d di id od o
A la hora de estudiar las conformaciones espaciales que adoptan los
aminoácidos glicosilados en disolución acuosa lo correcto es acercarnos lo
más posible a la situación real. En la naturaleza los aminoácidos se unen
entre sí para formar péptidos, esta unión se realiza a través de los conocidos
enlaces peptídicos de tipo amida, tanto por el extremo del grupo carboxilo
como por el extremo del grupo amino.
Con el fin de emular esta situación, una aproximación acertada es la

de derivatizar nuestro aminoácido, generando una metilamida en el extremo
carboxilo y acetilando el grupo amino. Con ese propósito se planteó la
formación de la diamida de la cisteína glucosilada. (Figura 3.7)
i ur .
Así lo primero fue obtener el aminoácido desprotegido, algo que ya

se había conseguido con anterioridad en nuestro grupo de investigación pero
en pequeña escala. La desprotección se llevó a cabo mediante hidrólisis
ácida con HCl (6 N) a 60 ºC en agua durante 8 horas. (Figura 3.8)
i ur .
El rendimiento para la obtención del clorhidrato tras la etapa de

desprotección fue elevado, en concreto del 95%. La etapa de purificación
consistió en lavar el crudo disuelto en agua con acetato de etilo. No se
observó epimerización del aminoácido y el valor del poder óptico rotatorio
coincide con el descrito previamente por nuestro grupo de investigación y
que confirma la configuración (S) del nuevo centro estereogénico creado.
Lo siguiente fue proteger el grupo amino con el grupo Fmoc, para

ello se hizo reaccionar el producto con Fmoc-OSu en medio básico y una
mezcla de CH3CN/H2O (2:1) como disolvente durante 72 horas (Figura 3.9).
El compuesto se utilizó en la siguiente reacción sin mayor purificación.
i ur .
Con el objetivo de obtener el éster terc-butílico del compuesto , se

disolvió éste en diclorometano y se añadió a una mezcla de DCC, tBuOH, y
CuCl que previamente se había dejado con agitación a temperatura
ambiente en atmosfera de argón durante 5 días. Esta mezcla se dejó 4 horas
con agitación bajo atmosfera de argón, se filtró en una placa porosa y se
evaporó el filtrado obteniéndose un crudo que contenía el producto de
esterificación.
Debido a la difícil purificación de este intermedio, se siguió adelante

con el crudo, suponiendo el rendimiento teórico del 100%. Con el fin de
proteger los grupos hidroxilo del tioglicósido en forma de acetatos se añadió
el crudo anterior a una mezcla Ac2O/Py (1:2) reaccionando con agitación
durante 2 horas y dando como resultado el producto previa eliminación
del disolvente. (Figura 3.10)
i ur .1
De esta forma hemos accedido al tio-glicoaminoácido

ortogonalmente protegido y preparado para su incorporación en síntesis
peptídica, tanto en disolución como en fase sólida.
Con el glicoaminoácido ortogonalmente protegido se procedió a la

formación de las amidas.
El crudo anterior se disolvió en CH2Cl2 y se añadió TFA dejando la

mezcla con agitación durante 1 h. Se evaporó el disolvente a vacío
obteniendo un sólido amarillento correspondiente a la desprotección del
éster terc-butílico. En un matraz se disolvió el crudo anterior junto con
TBTU y tamiz molecular adicionando DIEA. Pasados 5 minutos con
agitación se añadió NH2Me·HCl y se dejó reaccionar durante 8 h. El
producto se purificó parcialmente por columna cromatográfica en gel de
sílice obteniéndose el compuesto 1 como un sólido blanco. (Figura 3.11)
i ur .11
El producto anterior se disolvió en CH3CN y se añadió piperidina

manteniendo la agitación durante 2.5 horas para desproteger el grupo amino.
El crudo obtenido se trató con Ac2O/Py (1:2) consiguiendo acetilar
fácilmente la amina recientemente desprotegida. Con el fin de desproteger
los grupos hidroxilo de la glucosa, se disolvió el producto anterior en MeOH
y se añadió MeONa/MeOH (0.5 M). Por último se utilizó la resina de
intercambio iónico Dowex-H+ para neutralizar la base anteriormente
añadida sin generar sales en el medio. El crudo anterior se purificó por
columna cromatrográfica en gel de sílice obteniéndose el producto .
(Figura 3.12)
Figura 3.12
. ui
Conclusiones 31
Se ha conseguido escalar las reacción de adición conjugada de

Michael de 1-β-tioglucosa al derivado de deshidroalanina 1 obteniéndose
327 mg del compuesto 2.
Se ha llevado a cabo con éxito la síntesis de tres productos de

adición conjugada de Michael sobre ese mismo derivado 1 observándose en
todos los casos un solo diastereoisómero confirmando la alta selectividad
del proceso.
32 Conclusiones
Se ha conseguido la obtención del derivado glucosilado de cisteína

en cantidad suficiente (475 mg) para obtener la diamida correspondiente ,
que será objeto de posteriores estudios conformacionales.
. ar ri a
Parte experimental 35
Los espectros de RMN 1H y 13C se realizaron en un espectrómetro

Bruker Avance-400, los desplazamientos químicos se expresaron en ppm en
la escala G y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como
disolventes deuterados CD3Cl, con TMS como referencia interna, y D2O.
Los análisis de espectrometría de masas por ionización electrospray

(ESI-MS) se realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente
Multi Mode, ionización ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.
La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel

(Polichrom SI F254) sobre soporte de poliéster o aluminio y para su
visualización se utilizó luz ultravioleta y revelador de ácido fosfomolíbdico
en etanol.
La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-

0.06 mm (230-400 mesh).
Todas las reacciones se llevaron a cabo empleando disolventes

secos. Dichos disolventes se purificaron y secaron utilizando técnicas
estándar.
36 Parte experimental
g ra a i i uga a 1 i r el α,β
i r a i i uira
El α,β-deshidroaminoácido (1 eq.) es introducido en un schlenk

disuelto en THF seco (~ 10 mg de α,β-deshidroaminoácido/mL de THF)
bajo atmósfera de argón. La disolución es enfriada a –78 ºC y agitada. El
correspondiente tiol (1.2 eq.) es introducido en el schlenk. Seguidamente se
adiciona DBU (1.1 eq.) lentamente. La reacción es seguida mediante
cromatografía de capa fina y cuando se ve la desaparición de todo el α,β-
deshidroaminoácido, se para con disolución saturada de NH4Cl (el mismo
volumen que de THF). La mezcla se calienta hasta temperatura ambiente
mientras se agita vigorosamente. El crudo se diluye en éter dietílico y la fase
acuosa se extrae con más éter (3x20 ml). Las fases orgánicas se juntan, se
lavan con disolución saturada de NaCl y se secan con Na2SO4 anhidro. El
disolvente es evaporado y el crudo purificado por columna cromatográfica
en gel de sílice para dar el correspondiente producto de adición de Michael.
S 3 ra O a i gu ira a 1’’ β i 2 ((4’S,5’R 4’ i r i

5’ i 4’,5’ i i 2’ ai i 3’ i r a a i 2
A través del método general de adición

de Michael, partiendo de 1 (200 mg, 0.82
mmol), 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-
glucopiranosa (327 mg, 0.90 mmol) y DBU
(136 μL, 0.89 mmol) y después de 2 horas de
reacción se obtuvo el compuesto 2. El crudo fue
purificado por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt, 1:1)
para dar 2, como un sólido blanco (312 mg, 3 ).
ሾߙሿଶହ
ୈ = – 34.5 (c 1.03, CHCl3)
HRMS ESI+ (m/z) = 632.1626 [M+Na+]; calculado C24H35NO15SNa+ =

632.1620
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.40 (s, 3H; CH3), 1.57 (s, 3H; CH3),
1.99 (s, 3H; Ac), 2.02 (s, 3H; Ac), 2.04 (s, 3H; Ac), 2.04 (s, 3H; Ac), 3.31
(dd, J = 5.3, 14.3 Hz, 1H; CHCH2), 3.43 (s, 3H; OCH3), 3.49 – 3.62 (m, 1H;
CHCH2), 3.76 (s, 3H; CO2CH3), 3.70 – 3.78 (m, 1H; CHGlc), 4.08 – 4.19 (m,
2H; CH2Glc), 4.19 – 4.29 (m, 1H; CHCH2), 4.64 (d, J = 10.1 Hz, 1H; CHGlc),
4.95 – 5.09 (m, 2H; CHGlc), 5.21 (t, J = 9.3 Hz, 1H; CHGlc)
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) G (ppm) 15.6 (CH3), 19.8 (CH3), 20.5, 20.5,
20.6, 20.6 (Ac), 30.7 (CHCH2), 50.8 (OCH3), 52.9 (CO2CH3), 55.8
(CHCH2), 62.0 (CH2Glc), 68.0, 70.0, 73.4, 76.2, 84.9 (CHGlc), 90.0
(CNCH3OH), 108.4 (CCH3OCH3), 154.5 (NCO2), 169.3, 169.4, 169.4,
170.0 (Ac), 170.4 (CO2CH3)
S 3 ra O a i ga a ira a 1’’ β i 2 ((4’S,5’R 4’

i r i 5’ i 4’,5’ i i 2’ ai i 3’ i r a a
i 3

de Michael, partiendo de 1 (200 mg, 0.82 mmol),
2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-galactopiranosa
(327 mg, 0.82 mmol) y DBU (136 μL, 0.89
mmol) y después de 2 horas de reacción se
obtuvo el compuesto 3. El crudo fue purificado
por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt, 1:1) para dar 3,
como un solido blanco (406 mg, 2 ).
P.F. = 64.2 - 66.2 ºC
ሾߙሿଶହ
ୈ = – 24.6 (c 1.00, CHCl3)

632.1620
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.43 (s, 3H; CH3), 1.59 (s, 3H; CH3), 1.99 (s,
3H; Ac), 2.04 (s, 3H; Ac), 2.07 (s, 3H; Ac), 2.18 (s, 3H; Ac), 3.36 (dd, J = 5.0, 14.8
Hz, 1H; CHCH2), 3.44 (s, 3H; OCH3), 3.53 – 3.59 (m, 1H; CHCH2), 3.71 (s, 1H;
OH), 3.77 (s, 3H; CO2CH3), 3.98 (t, J = 6.31 Hz, 1H; H5-Gal), 4.07 – 4.17 (m, 2H;
H6-Gal), 4.21 – 4.25 (m, 1H; CHCH2), 4.59 (d, J = 9.9 Hz, 1H; H4-Gal), 5.03 – 5.06
(m, 1H; H2-Gal), 5.24 (t, J = 9.9 Hz, 1H; H3-Gal), 5.43 (d, J =3.2 Hz, 1H; H1-Gal)
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) G (ppm) 15.6 (CH3), 19.9 (CH3), 20.6, 20.7, 20.7,
20.8 (Ac), 30.3 (CHCH2), 50.9 (OCH3), 53.0 (CO2CH3), 56.0 (CHCH2), 61.9 (C6-
Gal), 67.1(C3-Gal), 67.3(C1-Gal), 71.7(C2-Gal), 75.2(C5-Gal), 85.0 (C4-Gal), 90.2
(CNCH3OH), 108.6 (CCH3OCH3), 154.6 (NCO2), 169.5, 169.7, 170.1, 170.4 (Ac),
170.4 (CO2CH3)
S 3 N i i ar i 3 ri O a i gu a i a 1’’ β i
2 ((4’S,5’R 4’ i r i 5’ i 4’,5’ i i 2’ ai i 3’ i
r a a i

de Michael, partiendo de 1 (22 mg, 0.09 mmol),
N-Cbz-3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-β-D-
glucosamina (45 mg, 0.1 mmol) y DBU (15 μL,
0.1 mmol) y después de 2 horas de reacción se
obtuvo el compuesto . El crudo fue purificado
por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt, 1:1) para dar ,
como un sólido blanco (36 mg, 0.05 mmol, ).
P.F. = 68.4 - 70.4 ºC
ሾߙሿଶହ
ୈ = – 27.4 (c 1.00, CHCl3)
HRMS ESI+ (m/z) = 723.2037 [M+Na+]; calculado C30H40N2O15SNa+ =

723.2042
1
1.93 (s, 3H; Ac), 2.02 (s, 3H; Ac), 2.06 (s, 3H; Ac), 3.31 (dd, J = 4.5, 14.9
Hz, 1H; CHCH2), 3.44 (s, 3H; OCH3), 3.63 – 3.72 (m, 3H; CHCH2; CH5-Glc;
CH4-Glc), 3.76 (s, 3H; CO2CH3), 4.10 – 4.23 (m, 2H; H6-Glc), 4.28 (d, J = 6.1
Hz, 1H; CHCH2), 4.84 (d, J = 10.00 Hz, 1H; H1-Glc), 4.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H;
NHCbz) 5.01 – 5.13 (m, 3H; CH2-Glc; OCH2Ph), 5.20 (d, J = 9.2 Hz, 1H;
CH3-Glc), 7.29 – 7.43 (m, 5H; OCH2Ph)
C NMR (100 MHz, CDCl3) G (ppm) 15.7 (CH3), 19.9 (CH3), 20.6, 20.7, 20.7
13
(Ac), 30.8 (CHCH2), 51.0 (OCH3), 53.1 (CO2CH3), 55.6 (CHCH2), 56.0 (C4-Glc),
62.3 (C6-Glc), (68.5C2-Glc), 73.2(C3-Glc), 76.3(C5-Glc), 86.0 (C1-Glc), 90.3 (CNCH3OH),
108.6 (CCH3OCH3), 128.2, 128.4, 128.7 (Ph), 154.8 (NCO2), 155.9 (NCO2Bn),
169.6, 169.6, 170.7 (Ac), 170.8 (CO2CH3)
S 3 β ra O a i ga a ira i ri a i
gu ira a 1’’ β i 2 ((4’S,5’R 4’ i r i 5’ i 4’,5’ i i
2’ a i i 3’ i r a a i
A través del método general de

adición de Michael, partiendo de 1
(200 mg, 0.82 mmol), 4-O-β-Tetra-O-
acetil-D-galactopiranosil-tri-O-acetil-
D-glucupiranosa-1’’-β-tio, (52 mg,
0.82 mmol) y DBU (136 μL, 0.897
mmol) y después de 2 horas de reacción se obtuvo el compuesto . El crudo
fue purificado por columna cromatográfica en gel de sílice (hexano/AcOEt,
1:1) para dar , como un sólido blanco (566 mg, 0.64 mmol, ).
P.F. = 97.3 – 99.3. ºC
ሾߙሿଶହ
ୈ = – 21.0 (c 1.00, CHCl3)

920.2465
1
1.96 (s, 3H; Ac), 2.03 (s, 3H; Ac), 2.04(s, 3H; Ac), 2.05 (s, 3H; Ac), 2.07 (s,
3H; Ac), 2.08 (s, 3H; Ac), 2.15 (s, 3H; Ac), 3.27 (dd, J = 4.2, 14.9 Hz, 1H;
CHCH2), 3.44 (s, 3H; OCH3), 3.57(s, 1H; OH), 3.61 – 3.68 (m, 2H; CHCH2;
H5-Glc), 3.75 – 3.79 (m, 4H; CO2CH3; H4-Glc), 3.87 (dd, J = 6.4, 7.2 Hz, 1H;
H5-Gal), 4.01(dd, J = 5.9, 12.1 Hz, 1H; H6-Glc), 4.09 – 4.14 (m, 2H; H6-Gal),
4.20 (dd, J = 4.2, 10.7 Hz, 1H; CHCH2), 4.46 (d, J = 7.9 Hz, 1H; H1-Gal),
4.56 (dd, J = 1.7, 12.0 Hz, 1H; H6-Glc), 4.61 (d, J = 10.0 Hz, 1H; H1-Glc), 4.91
– 4.97 (m, 2H; H2-Glc; H3-Gal), 5.10 (dd, J = 7.9, 10.4 Hz, 1H; H2-Gal), 5.20 (t,
J = 9.1 Hz, 1H; H3-Glc), 5.34 (d, J = 2.6 Hz, 1H; H4-Gal)
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) G (ppm) 15.6 (CH3), 19.8 (CH3), 20.5, 20.7,
20.7, 20.7, 20.7, 20.7, 20.8 (Ac), 30.6 (CHCH2), 50.9 (OCH3), 53.0
(CO2CH3), 55.9 (CHCH2), 60.9 (C6-Gal), 62.1 (C6-Glc), 66.7 (C4-Gal), 69.1
(C2-Gal), 70.3 (C5-Gal), 70.8(C3-Gal), 71.0 (C2-Glc), 73.4 ( C3-Glc), 75.9 ( C4-Glc),
77.2 ( C5-Glc), 84.8 (C1-Glc), 90.1 (CNCH3OH), 101.1 (C1-Gal), 108.5
(CCH3OCH3), 154.5 (NCO2), 169.1, 169.4, 169.7, 169.7, 170.1, 170.2,
170.3 (Ac), 170.4 (CO2CH3)
(S) β u ira i i a
El compuesto 2 (934 mg, 1.57 mmol) se introdujo

en un matraz con HCl 6 N (30 mL). La mezcla se
agitó durante una noche a 60 ºC. El disolvente se
eliminó a vacío, el residuo fue disuelto en agua (20
mL) y se lavó con AcOEt (20 mL). La fase acuosa
se evaporó para dar el compuesto en forma de clorhidrato (475 mg, ).
ሾߙሿଶହ
ୈ = + 43.0 (c 0.56, H2O)
HRMS ESI+ (m/z) = 284.0799 [M+]; calculado C9H18NO7S+ = 284.0798

1
H NMR (400 MHz, D2O) G (ppm) 3.21 – 3.41 (m, 6H; CHCH2; H3-Glc; H2-
Glc; H4-Glc; H5-Glc), 3.62 (dd, J = 6.3, 12.3 Hz, 1H; H6-Glc), 3.84 (dd, J = 3.2,
12.3 Hz, 1H; H6-Glc), 4.34 (dd, J = 4.0, 6.6 Hz, 1H; CHCH2), 4.53 (d, J = 9.8
Hz, 1H; C1-Glc)
13
C NMR (100 MHz, D2O) G (ppm) 31.1 (CHCH2), 53.0 (CHCH2), 60.9 (C6-
Glc), 69.4 (C4-Glc), 72.0 (C2-Glc), 76.9 (C3-Glc), 79.9 (C5-Glc), 85.8 (C1-Glc),
170.3 (CO2H)
Cys(β u ira i
El compuesto (475 mg, 1.49 mmol) se

introdujo en un matraz junto con NaHCO3 (430
mg, 5.23 mmol) y se disolvió en 30 ml
CH3CN/H2O (2:1). Se añadió Fmoc-OSu (867
mg, 2.56 mmol) y se agitó la mezcla durante 72
h. El CH3CN se eliminó a vacío, y la disolución acuosa se lavó con Et2O. Se
acidificó la fase acuosa y se extrajo con CHCl3/ iPrOH (3:1) (3 x 20 ml). La
fase orgánica se evaporó a vacío obteniéndose el compuesto como un
aceite amarillento.
El crudo obtenido se disolvió en 10 ml de CH2Cl2 y se añadió a una

mezcla de DCC (1.139 g, 5.47 mmol), tBuOH (0.66 ml, 7.00 mmol), y CuCl
(16 mg, 0.17 mmol) que previamente se había dejado con agitación a
temperatura ambiente en atmosfera de argón durante 5 días. La mezcla
resultante se dejó con agitación durante 4 h a temperatura ambiente y
posteriormente se filtró en una placa porosa. El filtrado se evaporó a vacío y
el crudo resultante se añadió a un mezcla de Ac2O/Py (1:2, 10 ml) dejándose
con agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Se evaporó la mezcla a
vacío obteniéndose un aceite amarillo.
El crudo anterior se disolvió en 2 ml de CH2Cl2 y se añadieron 2 ml

de TFA dejándose con agitación durante 1 h. Se evaporó el disolvente a
vacío obteniendo un sólido amarillento. En un matraz se mezcló el crudo
anterior junto con TBTU (62 mg, 0.19 mmol) y tamiz molecular, se disolvió
posteriormente con 20 ml de CH3CN y se adicionó DIEA (115 mg, 0.89
mmol). Pasados 5 minutos con agitación se añadió NH2MeHCl (20 mg, 0.30
mmol) y se dejó reaccionar durante 8 h. Se filtró en placa cerámica y se
evaporó el disolvente a vacío. Se purificó parcialmente el producto por
columna cromatográfica en gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 20:1)
obteniéndose el compuesto 1 como un sólido blanco.
El producto anterior se disolvió en 10 ml de CH3CN, se añadió

piperidina (2.25 ml, 0.56 mmol) y se dejó con agitación durante 2.5 h. Se
evaporó el disolvente a vacío obteniéndose un sólido blanco que fue tratado
con Ac2O/Py (1:2) (6 ml) a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se
evaporó a vacío obteniéndose un aceite amarillo. El crudo anterior se
disolvió en 3 ml de MeOH y se añadieron 3 ml MeONa/MeOH (0.5 M)
dejándose con agitación durante 1 h. Se añadió Dowex previamente lavado
con metanol y se filtró en una placa porosa. Se evaporó el disolvente a vacío
y el crudo se purificó mediante columna cromatográfica en gel de sílice
(NH3/EtOH/BuOH/CHCl3, 4:5:4:2) obteniéndose el compuesto como un
sólido blanco.
HRMS ESI+ (m/z) = 360.1025 [M+]; calculado C9H18NO7S+ = 361.1040

1
H NMR (400 MHz, D2O) G (ppm) 2.08 (s, 3H; Ac), 2.76 (s, 3H;
CONHCH3), 3.06 – 3.19 (m, 2 H; CHCH2), 3.33 (dd, J = 8.2, 17.4 Hz, 1H;
H2-Glc), 3.39 – 3.44 (m, 1 H; H4-Glc), 3.48 – 3.52 (m, 2 H; H3-Glc; H5-Glc), 3.72
(dd, J = 5.8, 12.5 Hz, 1H; H6-Glc), 3.91 (d, J = 12.7 Hz, 1H; H6-Glc), 4.55
(dd, J = 8.1, 5.5 Hz, 1H; CHCH2), 4.60 (d, J = 9.9 Hz, 1H; H1-Glc)
1
H NMR (400 MHz, H2O/D2O 9:1 Región de amidas) G (ppm) 8.09 (d, J =
4.4 Hz, 1H; NHAc) , 8.40 (d, J = 7.1 Hz, 1H; CONHCH3)
13
C NMR (100 MHz, D2O) G (ppm) 21.8 (COCH3), 25.9 (CONHCH3), 31.8
(CHCH2), 54.2 (CHCH2), 60.9 (C6-Glc), 69.4 (C4-Glc), 72.2 (C2-Glc), 77.1 (C5-
Glc), 79.9 (C3-Glc), 86.0(C1-Glc), 172.6 (COCH3), 174.5 (CONHMe)
r
ANEXO: Espectros de RMN 47
A continuación se presentan los espectros de RMN mono y

bidimensionales de los productos sintetizados en esta memoria.
Los espectros de RMN de 1H, 13C, COSY y HSQC fueron tratados y

representados con el programa MestreNova (6.1) a partir de los archivos fid
y ser obtenidos del espectrómetro Bruker Avance-400.
48 ANEXO: Espectros de RMN
1
H RMN 400 MHz en CDCl3
13
C RMN 100 MHz en CDCl3
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
1
13
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
1
13
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
1
13
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
1
H RMN 400 MHz en D2O
13
C RMN 100 MHz en D2O
COSY en D2O
HSQC en D2O
1
H RMN 400 MHz en D2O
1
H RMN 400 MHz en H2O/D2O (9:1)
13
C RMN 100 MHz en H2O/D2O (9:1)
COSY en D2O
HSQC en D2O

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TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA

Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adición

Ismael Compañón Pérez

Tutores: Alberto Avenoza Aznar y Jesús Héctor Busto Sancirián

SÍNTESIS DE CISTEÍNAS GLICOSILADAS

Ismael Compañón Pérez

JESÚS HÉCTOR BUSTO SANCIRIÁN, Profesor Titular de Universidad del

Que la memoria " Síntesis de cisteínas glicosiladas mediante adición de

Logroño, Junio 2012

Fdo.: Alberto Avenoza Aznar Fdo.: Jesús Héctor Busto Sancirián

A Alberto y Héctor, mis directores, a los cuales les estaré

No me olvido de mis vecinos fotoquímicos, Anselmo, Alegría,

Y por supuesto que tampoco me olvido de mi amigo y compañero

Por último, pero no menos importante, agradecer al resto de gente de

También me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la ayuda

x Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y

6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 45

Las modificaciones post-traduccionales de proteínas son cambios químicos

Además de las modificaciones post-traduccionales ocurridas de manera

i ur 1.1. Modificaciones post-traduccionales

De los aminoácidos naturales, la cisteína es uno de los más

Además de las modificaciones post-traduccionalaes basadas en la

Como se ha mencionado anteriormente la cisteína es un aminoácido

En este sentido la generación de glicoproteínas mediante la

i ur 1. . Modificación post-traduccional por formación de puentes

Esta química ha sido utilizada por ejemplo para la generación de

La facilidad y la utilidad de la formación de puentes disulfuro inspiró

i ur 1. . Utilización del reactivo de Lawesson.

Aunque hay muchos métodos para la síntesis de tioglicósidos, la

El mecanismo parece implicar al correspondiente derivado de

i ur 1. . Generación y desaparición de deshidroalanina.

Viendo los estudios mecanísticos de la formación de tioéteres

El tratamiento con O-mesitilsulfonilhidroxilamina (MSH) consiguió

posterior adición de tioglicoles generó la aparición de los derivados

i ur 1. . Generación de tioéteres a partir de deshidroalanina.

Como se puede observar el uso de deshidroalanina como sustrato

Por otro lado, la resistencia antibiótica es un problema importante en

El abuso de los antibióticos en la sociedad actual es sin duda una de

mutaciones pueden hacer que la bacteria codifique la síntesis de proteínas

La manera que tenemos de combatir este problema es el desarrollo

En este contexto, el acoplamiento de residuos deshidrogenados,

Nuestro grupo de investigación tiene experiencia en la síntesis de

En el último año, de forma independiente, dos grupos han mostrado

Por un lado el Profesor van der Donk y colaboradores han

i ur 1. . Fragmento de la secuencia de sublancina con la glucosa unida

En un segundo estudio, el Profesor Norris y colaboradores

i ur 1. . Fragmento de la secuencia de gliocina F con una β-N-

Una de las opciones propuestas para la síntesis de péptidos

S- ui ción d tio no rico

Una de las metodologías más comunes consiste en una alquilación

Asi utilizando β-bromoalaninas y γ-bromoalaninas en presencia de

Wong y colaboradores3 modificaron esta metodología generando el

Halcomb4,5 y colaboradores describen otra estrategia para la

Esta estrategia también se ha desarrollado para la síntesis en fase

cción d ic ntr d ri do d d idro nin uir -

En este contexto, recientemente en nuestro grupo de investigación se

En primer lugar se había probado esta reacción con S-alquil

Debido a ello se llevó a cabo la reacción disminuyendo la

Además del ataque con los tioles mostrados anteriormente, también

En el siguiente trabajo se pretenden escalar las reacciones de adición

Puesto que únicamente se ha descrito con anterioridad la adición de

Por último se procederá a la derivatización del producto de adición

De esta forma se repitió la adición conjugada de la tetra-O-acetil-1-