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RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
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1.2. Fosfatasa alcalina
O
HO P OH Fosfatasa O
O alcalina
O
+
+ H2 O + HO P OH + H
+
OH
+
N N
- - -
O O O O
p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenol
Figura 1. Reacción enzimática
1.4. Objetivos
2.1. Equipamiento
Baño termostatizado a 30ºC.
Colorímetro ajustado a 405 nm (fototubo normal).
2.2. Material
Pipetas de vidrio (5,0 ml).
Pipeta automática P-1000 (puntas).
Propipeta.
Rotulador para vidrio.
Tubos de ensayo de vidrio (1,5x 16 cm) 16 en una gradilla.
Cronómetro.
Tubos especiales para medir en el colorímetro.
2.3. Reactivos
Tampón de ensayo.
Solución sustrato.
Enzima: fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina.
Solución para detener la reacción.
3. PROTOCOLOS A REALIZAR
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3.2.1. A una serie de 5 tubos de ensayo se les añade los distintos reactivos
según se indica en la Tabla 2, obteniéndose así concentraciones
crecientes de enzima en los mismos. Tras agitar suavemente se
incuban en baño termostatizado el tiempo indicado:
3.3.1. A una serie de tubos de ensayo se les añade los reactivos que se
detallan en la Tabla 3 y se agitan suavemente, obteniéndose de esta
manera concentraciones crecientes de sustrato en los mismos. Se
introducen los tubos en el baño termostatizado a 30 ºC el tiempo
indicado para que se desarrolle la reacción.
3.3.2. Al finalizar los 10 minutos de reacción, retirar los tubos del baño y
añadir inmediatamente 0,5 ml de la solución de fosfato mezclando
para detener la reacción.
3.3.3. Medir la absorbancia a los distintos tubos a 405 nm; usando como
blanco el nº 1.
4. RESULTADOS ESPERADOS
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de producto (p-nitrofenol) se basa en la ley de Lambert-Beer: A = ε.C.l; en
este caso l = 1 cm y ε (coeficiente de extinción milimolar) es 18,5 mM cm . -1 -1
0,0 24
0,0 18
0,0 12 d [P] a
= vi =
dt b
(m
M
O
O
-N
R
N
E
[p
IT
L
]
)
0,0 06
b
a
0
0 5 10 15 20
TIEMPO (min)
Figura 2. Representación del efecto del tiempo de reacción en la
aparición de producto.
A = ε . C. I
A
C=
ε.I
Aplicando esta ecuación a las absorbancias obtenidas para cada uno de
los tubos, teniendo en cuenta que I = 1 cm y ε = 18,5 mM-1 cm-1, se obtiene la
concentración producto formado en cada uno de ellos.
Para representar la curva de progreso de la reacción (Figura 3), se
trasladan los datos obtenidos de los cálculos correspondientes de la Tabla 4
5
4 15 1,203 0,065
5 20 1,300 0,07
b
Vi = t g α =
a
Aplicando la ecuación:
b 0,0 5 -0 ,0 3 5
Vi = = = 0 ,0 0 3 mM min- 1
a 10 -5
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4.1.3. Determinación de la concentración de enzima en mU/ml.
Para determinar las mU/ml de fosfatasa alcalina utilizadas en la
reacción se realizan los cálculos apropiados (apartado 4.1).
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Figura 5. Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de la
reacción.
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En la representación de Eadie-Hofsteese se presentan los valores de las
velocidades enzimáticas obtenidas frente a los cocientes de las velocidades
entre las respectivas concentraciones de sustrato y se obtiene una recta cuyo
corte con el eje de abscisas corresponde a la Vm/Km y con el eje de
ordenadas equivale a la Vm, siendo la pendiente -Km.
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Figura 8. Representación de Eadie-Hofstee: Velocidad frente
al cociente V/[S]
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3.3.2.Cálculo de Vm y Km mediante las representaciones de Eadie-
Hofstee y de Lineweaber-Burk.
La Km y Vm se determinan en ambas presentaciones por los
puntos de corte de la recta:
Eadie- Hofstee (Figura 10)
o en abcisas corresponde a la relación Vm/Km,
o en ordenadas directamente indica la Vm de la reacción.
5. DISCUSIÓN Y COMENTARIOS
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Existe, en las condiciones de trabajo empleadas, una relación (Figuras 3 y
4) entre el tiempo en que transcurre la reacción con la aparición de producto,
o lo que es lo mismo con la desaparición de sustrato, que indica la vi de la
misma, a partir de la cual se puede determinar la concentración de la enzima
(mU/mL) necesaria para que transcurra la reacción en esas condiciones.
Cuando se estudia el progreso de la reacción utilizando concentraciones
variables de enzima, se puede comprobar (Figura 5) como ésta es factor
limitante de la velocidad, siendo dicha velocidad proporcional a la
concentración de enzima siempre que el sustrato se encuentre en condiciones
de saturación tal y como ocurre en las condiciones de trabajo utilizadas.
Ante la disyuntiva de seleccionar un método fiable para la determinación a
partir de una gráfica de la Km y Vm de la reacción se han utilizado dos, la de
Eadie–Hofstee como transformación lineal de la ecuación de Michaelis y
Menten, y la de Lineweaber y Burk o de los dobles inversos también como
transformación lineal de la ecuación de Michaelis y Menten. Como se puede
observar (Figuras 10 y 11), en ambos casos los valores obtenidos para la Km
y Vm son muy similares y por lo tanto los dos métodos son válidos para
determinar estos parámetros.
Al finalizar la práctica, se le suministra a los alumnos el material necesario
para que presenten los resultados obtenidos.
6. BIBLIOGRAFÍA COMENTADA
Tabla 9. Sustrato.
p-nitrofenilfosfato 0,026 g
Tampón de ensayo Hasta 200 ml
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