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NOTICE D’UTILISATION

AMPLIX®
NEISSERIA GONORRHOEAE

REF 5603

INSTRUCTIONS FOR USE


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Pour diagnostic in vitro uniquement For in vitro diagnostic use only

-20°C
Conserver à -20°C Store at -20°C

Tests par coffret Tests per kit

Péremption Use by

Numéro de lot Lot number

Fabricant Manufacturer

Usage unique Do not reuse

Code produit Catalog #

Directive 98/79/CE Mise à jour : 23.12.2010 / Update: 2010.12.23

Distribué par / Distributed by: ALL DIAG


10 rue Ettoré Bugatti - CS 28006 - 67038 Strasbourg Cedex - France
Tél : +33 (0)3 88 78 80 88 - Fax : +33 (0)3 88 78 76 78
Site : www.alldiag.com - E-mail : info@alldiag.com
AMPLIX® NEISSERIA GONORRHOEAE
Kit RT PCR destiné à la détection de l’ADN de Neisseria Gonorrhoeae

Utilisation professionnelle uniquement


Diagnostic in vitro

1. Composition du kit
Ce kit comprend le matériel nécessaire à la réalisation de 50 tests :
• 2 x 750 µl de MasterMix Neisseria Gonorrhoeae,

2
1 x 200 µl de Contrôle Positif Neisseria Gonorrhoeae (10 copies/ µl),
• 1 x 1000 µl de Standard Interne Neisseria Gonorrhoeae.

2. Conditions de transport et de conservation


• Transporter le kit à une température comprise entre -20°C et -80°C.
• Conserver le kit à une température de -20°C : il r estera stable 9 mois. Eviter de répéter le processus
de congélation / décongélation, qui risque d’altérer la qualité du MasterMix, du Contrôle Positif et du
Standard Interne. Il est recommandé d’aliquoter le MasterMix par volume de 30 µl dans des tubes
PCR, à conserver à une température de -20°C. Le Con trôle Positif et le Standard Interne peuvent
être conservés à une température de 4°C.

3. Informations sur l’agent pathogène


La gonorrhée est une maladie grave qui fait partie du groupe des maladies sexuellement transmissibles.
Causée par le pathogène Neisseria Gonorrhoeae (gonocoque), elle se caractérise par une inflammation non
invasive des membranes muqueuses du système urogénital. Elle se manifeste aussi bien chez l’homme que
chez la femme sous la forme d’une urétrite accompagnée d’un écoulement purulent de l’urètre. Chez la
femme, elle peut aussi apparaitre sous la forme d’une cervicite. En cas de complication, elle engendre une
infection de la région pelvienne, pouvant aller jusqu’à l’infertilité féminine. Certains porteurs de la maladie
(pourcentage significatif) ne présentent aucun symptôme.
Les antibiotiques à base de pénicilline utilisés habituellement sont relativement efficaces, mais il existe de
plus en plus de souches résistantes. La sensibilité des méthodes de culture communément utilisées pour le
diagnostic de la gonorrhée est souvent diminuée en raison de la variation de température à laquelle les
gonocoques sont exposés lors d’un transport inapproprié des échantillons en laboratoire, et des tentatives
d’automédication par le biais d’antibiotiques inadaptés. Si la détection par culture échoue, il est possible de
recourir au diagnostic microscopique.
Comme la sensibilité de l’analyse au microscope est assez faible, de nouvelles méthodes par mise en
évidence d’acides nucléiques sont actuellement de plus en plus employées pour détecter la gonorrhée.
Malgré l’efficacité de la technique des sondes génétiques, les méthodes par PCR deviennent prédominantes
du fait de leur plus haute sensibilité. Elles sont parfaitement adaptées à la détection de la gonorrhée à partir
d’échantillons provenant d’écouvillonnages vaginaux, cervicaux, urétraux, rectaux ou laryngaux. Il est
nécessaire de prendre en considération les 3 semaines de persistance du résultat positif obtenu par PCR à
partir d’échantillons de membranes muqueuses. Un examen supplémentaire doit être réalisé 3 à 4 semaines
après la fin du traitement. Les méthodes PCR sont également très efficaces pour détecter la gonorrhée à
partir d’échantillons d’urine, de frottis de l’œil et en cas d’infection disséminée, de sang et de liquide synovial.

4. Principes de la méthode de détection


Ce kit a été conçu pour détecter l’ADN génomique de Neisseria Gonorrhoeae. La méthode de détection
repose sur l’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) d’une partie du gène codant pour le
pseudogène porA. La fluorescence émise par une amorce marquée permet de mesurer la quantité de gènes
amplifiés par PCR (temps réel).
L’amorce marquée au fluorophore permet la détection de l’agent pathogène : son signal est détecté au
niveau du canal FAM. Le Standard Interne contrôle l’éventuelle inhibition de la réaction PCR et l’efficacité du
processus d’extraction de l’ADN. Son signal est détecté au niveau du canal JOE.
Ce kit de détection prend l’avantage sur la « PCR à démarrage à chaud », minimisant les réactions non
spécifiques et assurant une sensibilité maximum. Il contient de l’uracile-ADN-glycosylase (UAG) qui contrôle
l’éventuelle contamination de la réaction PCR par les produits d’amplification, permettant d’obtenir une haute
sensibilité dans le processus de détection de Neisseria Gonorrhoeae. Conçu pour un diagnostic in vitro, il
offre la possibilité de pratiquer des détections qualitatives.
ALL.DIAG -1- Version 1
5. Mode opératoire

Extraction d’ADN
Echantillon

+
Standard Interne
(0,1 µl Standard / µl de volume d’élution)

ADN EXTRAIT PURIFIE


(efficacité de l’extraction d’ADN contrôlée)

Amplification PCR
30 µl de MasterMix

+
10 µl d’ADN extrait ou de Contrôle Positif

ADN AMPLIFIE
(inhibition de la réaction PCR contrôlée)

5.1. Prélèvement et conservation de l’échantillon


• Utiliser du matériel stérile pour le prélèvement de l’échantillon.
• Pour détecter Neisseria Gonorrhoeae, il est possible de prélever des échantillons de l’urètre, du
vagin, du col, ou de la prostate par écouvillonnage ou frottis avec écouvillon sec. La détection à
partir d’échantillons d’urine (au moins 2 ml) est possible mais problématique en raison de leurs
faibles et variantes concentrations en gonocoques. De rares infections disséminées peuvent être
détectées à partir d’échantillons de sang périphérique incoagulable et de liquide synovial.
• Placer tout type d’échantillon directement dans un tube (tube revêtu d’EDTA pour le sang), sans
utiliser de récipient intermédiaire. Les échantillons peuvent être conservés ainsi durant 12
heures à une température de 4°C. Pour une conservat ion plus longue, il est possible de les
conserver à une température de -20°C.

5.2. Extraction de l’ADN


• Pratiquer l’extraction de l’ADN en utilisant des kits dédiés à l’extraction de microorganismes :
ALLDIAG (en particules magnétiques).
• Pour améliorer la sensibilité, il est recommandé d’augmenter la concentration de l’urine par
centrifugation (14 000 à 18 000 G / 15 à 20 min), d’ôter le surnageant pour ne garder que 200 µl
et d’en utiliser que 50 µl pour le processus d’extraction.
• Tous les kits PCR AMPLIX comprennent un Standard Interne, qui contrôle l’éventuelle inhibition
®

de la réaction d’amplification par PCR et l’efficacité du processus d’extraction. Composé d’un


plasmide et de son insert, le Standard Interne a été précisément défini et quantifié selon des
méthodes d’ingénierie génétique.
• Ajouter le Standard Interne à l’échantillon, avant de procéder à l’extraction de l’ADN, en
respectant la proportion 0,1 µl de Standard / µl de volume d’élution.

Volume d’élution 25 µl 50 µl 100 µl 200 µl


Volume de Standard Interne 2,5 µl 5 µl 10 µl 20 µl

ALL.DIAG -2- Version 1


5.3. Amplification par PCR

ALL.DIAG -3- Version 1


5.4. Interprétation des résultats

Détection Neisseria Gonorrhoeae Détection Standard Interne


RESULTATS
(Canal FAM) (Canal JOE)

POSITIF

NEGATIF

INVALIDE

6. Précautions d’emploi
• Le kit a été élaboré en tant qu’élément de diagnostic médical, dans le respect de la directive
correspondante 98 / 79 / CE.
• Manipuler l’échantillon et le Contrôle Positif avec précaution : une mauvaise manipulation peut
engendrer une contamination des éléments du kit.
• Procéder à l’élimination du kit après utilisation selon les recommandations du GBEA en tenant compte
des faits suivants : le kit ne contient aucun élément dangereux, infectieux ou toxique nécessitant un
traitement spécifique, les emballages utilisés ne sont constitués que de papier ou de polypropylène.

ALL.DIAG -4- Version 1


AMPLIX® NEISSERIA GONORRHOEAE
RT PCR kit designed for the detection of the Neisseria Gonorrhoeae DNA

Professional use only


In vitro diagnostic

1. Kit composition
This kit contains the necessary material for the realization of 50 tests:
• 2 x 750 µl of Neisseria Gonorrhoeae MasterMix,

2
1 x 200 µl of Neisseria Gonorrhoeae Positive Control (10 copies/ µl),
• 1 x 1000 µl of Neisseria Gonorrhoeae Internal Standard.

2. Transportation and storage conditions


• Transport the kit at temperature ranging from -20°C to -80°C.
• Store the kit at the temperature of -20°C: it rema ins stable for 9 months. Repeated freezing and
thawing of the MasterMix, the Positive Control and the Internal Standard may result in lower
detection quality. It is recommended to aliquot the MasterMix by 30 µl directly to PCR tubes and hold
in stock at -20°C. The Positive Control and the Int ernal Standard may be held in stock at 4°C.

3. Pathogen information
Gonorrhea is a serious disease from the group of classic sexually transmitted diseases. Caused by the
pathogen Neisseria Gonorrhoeae (gonococcus), it is characteristic by a usually non-invasive inflammation of
urogenital mucous membranes. It is manifested in men and women as a urethritis with purulent discharge
from urethra, in women also as a cervicitis. Infection in pelvic region may be a complication which may result
in infertility in women. There is a significant percentage of asymptomatic carriers.
Penicillin-based antibiotics commonly used for therapy are still quite effective, yet there is an increasing
number of resistant strains. Cultivation methods are dominant in the gonorrhea diagnostics, but their
sensitivity is frequently negatively influenced by the improper transportation of samples into the laboratory
due to the high sensitivity of the gonococci to temperature variations and also due to gonorrhea self-
treatment attempts by means of incorrectly used antibiotics. In case of the cultivation detection failure there
is usually used the microscopic diagnostics.
As the microscopic analysis is little-sensitive, methods demonstrating the presence of nucleic acids have
been increasingly used in the gonorrhea diagnostics. The gene probe method is currently a classic efficient
approach, but PCR methods have started to dominate due to their higher sensitivity. These methods are
suitable for gonococci detection in the samples from vaginal swabs, cervix swabs, urethra swabs, in rectum
and larynx swabs. It is necessary to take into account the up to 3-week persistence of PCR positivity in the
mucous membrane swab samples. Therefore a follow-up examination after a treatment should be performed
3-4 weeks after the end of the treatment. High sensitivity of this method provides for gonococci detection
also in urine samples, eye scrapings and in case of disseminated infections also in blood and synovial fluid.

4. Method principles
This kit is designed for the detection of the Neisseria Gonorrhoeae DNA. The method is based on the
amplification of a part of the gene encoding the porA pseudogene, by means of the PCR (Polymerase Chain
Reaction) and for measuring of the amplification product concentration growth in the course of the PCR by
means of the fluorescence marked probe (real-time).
The probe marked by the fluorofor is designated for pathogen detection: its signal is detected on the FAM
channel. The Internal Standard controls the possible inhibition of the PCR reaction and the efficiency of DNA
isolation process. Its signal is detected on the JOE channel.
This detection kit takes an advantage of the “hot start PCR technology”, minimizing non-specific reactions
and assuring maximum sensitivity. It contains Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) controlling possible contami-
nation of the PCR reaction by amplification products, providing very high sensitivity of the Neisseria
Gonorrhoeae detection. Designed for in vitro diagnostic, it provides qualitative detections.

ALL.DIAG -5- Version 1


5. Procedure

ADN isolation
Sample

+
Internal Standard
(0.1 µl Standard / µl of elution volume)

PURIFIED EXTRACTED DNA


(DNA isolation efficiency controlled)

PCR amplification
30 µl of MasterMix

+
10 µl of extracted DNA or Positive Control

AMPLIFIED DNA
(PCR reaction inhibition controlled)

5.1. Sampling and sample storage


• Sterility principles should be observed during sampling.
• To detect Neisseria Gonorrhoeae, it is possible to sample from urethra, vagina, cervix or
prostate, using swab or scraping on a swab “dry”. Detection in urine samples (at least 2 ml) is
possible but problematic, due to their low and fluctuating gonococci concentrations. Rare
disseminated gonococci infections can be detected in the samples of incoagulable peripheral
blood and synovial fluid.
• All type of samples should be placed into tubes (EDTA tubes for blood) without any transporta-
tion media. The samples should be stocked at 4°C within 12 hours. For a longer storage, they
can be frozen at -20°C.

5.2. DNA isolation


• DNA isolation should be performed by kits designed for microorganism isolation: RealLine DNA
Extraction kit (ALLDIAG).
• To improve sensitivity, it is recommended to increase concentration of the urine sample by
centrifugation (14.000 to 18.000 G / 15 to 20 min), to remove the supernatant keeping 200 µl of
urine and to take 50 µl from that sample to proceed to isolation.
• All AMPLIX PCR kits include an Internal Standard providing for an effective monitoring of
®

eventual inhibition of the PCR amplification and also of the isolation process efficiency. The
Internal Standard is a precisely defined and quantified construct of a plasmid and insert,
prepared by genetic engineering methods.
• The Internal Standard should be added into the sample at the beginning of the isolation process
with the proportion 0.1 µl of Standard / µl of elution volume.

Elution volume 25 µl 50 µl 100 µl 200 µl


Internal Standard volume 2.5 µl 5 µl 10 µl 20 µl

ALL.DIAG -6- Version 1


5.3. PCR amplification

ALL.DIAG -7- Version 1


5.4. Results evaluation

Neisseria Gonorrhoeae detection Internal Standard detection


RESULTS
(Channel FAM) (Channel JOE)

POSITIVE

NEGATIVE

INVALID

6. Warnings
• The kit has been manufactured as an in vitro medical diagnostic device in harmony with the
98/79/EC Directive.
• Be careful when handling the Positive control or the clinical material: incorrect handling could result
in contamination and the consequent impairment of the kit components.
• The kit should be disposed of after use according to the current legal regulations considering the fact
that the kit doesn’t contain any dangerous, infectious or toxic components that would be subject to
special safety regulations and the packaging materials are made of paper and polypropylene.

ALL.DIAG -8- Version 1


ALL . DIAG
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67038 STRASBOURG Cedex - France
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