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NOTICE D’UTILISATION

AMPLIX®
VARICELLA-ZOSTER VIRUS

REF 5608

INSTRUCTIONS FOR USE


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Pour diagnostic in vitro uniquement For in vitro diagnostic use only

-20°C
Conserver à -20°C Store at -20°C

Tests par coffret Tests per kit

Péremption Use by

Numéro de lot Lot number

Fabricant Manufacturer

Usage unique Do not reuse

Code produit Catalog #

CE 98/79/CE Mise à jour : 05.04.2011 / Update: 2011.04.05

Distribué par / Distributed by: ALL DIAG


10 rue Ettoré Bugatti - CS 28006 - 67038 Strasbourg Cedex - France
Tél : +33 (0)3 88 78 80 88 - Fax : +33 (0)3 88 78 76 78
Site : www.alldiag.com - E-mail : info@alldiag.com
AMPLIX® VARICELLA-ZOSTER VIRUS (VZV)
Kit RT PCR destiné à la détection de l’ADN du Varicella-Zoster Virus (VZV)

Utilisation professionnelle uniquement. Diagnostic in vitro

1. Composition du kit
Ce kit comprend le matériel nécessaire à la réalisation de 100 tests :
• 4 x 750 µl de MasterMix VZV,
• 1 x 200 µl de Calibrateur VZV (10 copies / µl),
4

• 1 x 200 µl de Calibrateur VZV (10 copies / µl),


3

• 1 x 200 µl de Calibrateur VZV(10 copies / µl),


2

• 1 x 200 µl de Calibrateur VZV (10 copies / µl),


1

• 2 x 1000 µl de Standard Interne VZV.

2. Conditions de transport et de conservation


• Transporter le kit à une température comprise entre -20°C et -80°C.
• Conserver le kit à une température de -20°C : il r estera stable 9 mois. Eviter de répéter le processus
de congélation / décongélation, qui risque d’altérer la qualité du MasterMix, du Contrôle Positif et du
Standard Interne. Il est recommandé d’aliquoter le MasterMix par volume de 30 µl dans des tubes
PCR, à conserver à une température de -20°C. Le Con trôle Positif et le Standard Interne peuvent
être conservés à une température de 4°C.

3. Informations sur l’agent pathogène


Très fréquentes chez l’homme, les infections à VZV surviennent la plupart du temps sans symptômes graves.
La primo-infection a généralement lieu durant l’enfance, sous la forme d’une maladie bénigne, la varicelle.
Des complications peuvent apparaitre - sous la forme d’une encéphalite - mais elles sont plutôt rares. Cette
primo-infection peut être dangereuse lorsqu’elle intervient durant les cinq premiers mois de la grossesse.
Chez les personnes atteintes d’hypo-immunité, les infections à VZV sont à l’origine d’une maladie très grave
qui se manifeste sous la forme d’abondantes efflorescences hémorragiques à répétition, affectant même des
organes internes. Après la première infection, le virus persiste à vie au niveau du ganglion nerveux et peut
être réactivé, se manifestant alors la plupart du temps sous la forme d’un zoster d’herpès (zona). Chez les
personnes immunodéprimées, le développement du zoster peut provoquer des complications : pneumonies,
encéphalites. De graves affections de l’œil (kératite, iridocyclite, panophtalmie), des nerfs moteurs oculaires
ou des nerfs faciaux peuvent également surgir.
Il est important de diagnostiquer correctement une infection à VZV pour trouver le traitement antiviral le plus
efficace. Les symptômes cliniques sont habituellement suffisants pour diagnostiquer les maladies causées
par le VZV. La primo-infection est détectée dans la salive, généralement chez les patients immunodéficients.
La sérologie, et plus précisément la recherche d’anticorps IgM, est hautement spécifique mais des réactions
croisées avec le HSV peuvent néanmoins apparaitre. Les méthodes classiques de détection directe sont
lentes, fastidieuses et peu sensibles. La PCR est quant à elle très sensible pour détecter le VZV. Cette
méthode est particulièrement intéressante lorsqu’il s’agit de tester des échantillons de liquide oculaire
(larmes, frottis) ou de liquide céphalo-rachidien en cas de complications neurologiques. Il est primordial de
compléter ces examens par un test du sang périphérique. L’infection pouvant être latente, son interprétation
doit toujours être faite en tenant compte de la clinique et des résultats précédemment obtenus en laboratoire.

4. Principes de la méthode de détection


Ce kit a été conçu pour détecter l’ADN du Varicella-Zoster Virus. La méthode de détection repose sur
l’amplification par PCR de la séquence d’ADN du gène à simple copie ORF62. La fluorescence émise par
une amorce marquée permet de mesurer la quantité de gènes amplifiés par PCR (temps réel).
L’amorce marquée au fluorophore permet la détection de l’agent pathogène : son signal est détecté au
niveau du canal FAM. Le Standard Interne contrôle l’éventuelle inhibition de la réaction PCR et l’efficacité du
processus d’extraction de l’ADN. Son signal est détecté au niveau du canal JOE.

ALL.DIAG -1- Version 2


Ce kit de détection prend l’avantage sur la « PCR à démarrage à chaud », minimisant les réactions non
spécifiques et assurant une sensibilité maximum. Il contient de l’uracile-ADN-glycosylase (UAG) qui contrôle
l’éventuelle contamination de la réaction PCR par les produits d’amplification, permettant d’obtenir une haute
sensibilité dans le processus de détection du VZV à partir d’échantillons de liquides corporels ou de sang.
Conçu pour un diagnostic in vitro, le kit offre la possibilité de pratiquer des détections qualitatives et
quantitatives.

5. Mode opératoire
Extraction d’ADN
Echantillon

+
Standard Interne
(0,1 µl Standard / µl de volume d’élution)

ADN EXTRAIT PURIFIE


(efficacité de l’extraction d’ADN contrôlée)

Amplification PCR
30 µl de MasterMix

+
10 µl d’ADN extrait ou de Contrôle Positif

ADN AMPLIFIE
(inhibition de la réaction PCR contrôlée)

5.1. Prélèvement et conservation de l’échantillon


• Utiliser du matériel stérile pour le prélèvement de l’échantillon.
• Placer tout type d’échantillon, sauf le sang, directement dans un tube, sans utiliser de récipient
intermédiaire. Ils peuvent être conservés ainsi durant 12 heures à une température de 4°C.
• Pour détecter le VZV, le volume d’échantillon de fluide corporel nécessaire dépendra de la méthode
d’extraction utilisée. En générale, 0.2 à 0.5ml est suffisant mais un volume d’échantillon de fluide
corporel (larmes, écouvillons ou frottis, salive, tissus …).jusqu’à 2ml peut être utilisé.
• Pour le sang, un échantillon de sang périphérique incoagulable doit être prélevé dans un tube
revêtu d’EDTA : il pourra être conservé 24 heures à une température de 4°C.
• Pour une conservation plus longue, il est possible de placer tout type d’échantillon à une tempé-
rature de -20°C.

5.2. Extraction de l’ADN


• Pratiquer l’extraction de l’ADN en utilisant des kits dédiés à l’extraction de microorganismes :
DNA Extraction Kit ALLDIAG (en particules magnétiques).
• Tous les kits PCR AMPLIX comprennent un Standard Interne, qui contrôle l’éventuelle inhibition
®

de la réaction d’amplification par PCR et l’efficacité du processus d’extraction. Composé d’un


plasmide et de son insert, le Standard Interne a été précisément défini et quantifié selon des
méthodes d’ingénierie génétique.
• Ajouter le Standard Interne à l’échantillon, avant de procéder à l’extraction de l’ADN, en
respectant la proportion 0,1 µl de Standard / µl de volume d’élution.

Volume d’élution 25 µl 50 µl 100 µl 200 µl


Volume de Standard Interne 2,5 µl 5 µl 10 µl 20 µl
ALL.DIAG -2- Version 2
5.3. Amplification par PCR

ALL.DIAG -3- Version 2


5.4. Interprétation des résultats

5.4.1. Interprétation qualitative

Détection VZV Détection Standard Interne


RESULTATS
(Canal FAM) (Canal JOE)

POSITIF

NEGATIF

INVALIDE

5.4.2. Interprétation quantitative


• Pour l’interprétation quantitative des résultats, ne sont à prendre en compte que les concen-
trations comprises dans l’intervalle de valeurs de la courbe d’étalonnage.
• La quantification des échantillons dont la concentration est en dehors de la courbe d’étalonnage
doit être considérée comme peu précise.
• Les échantillons dont la concentration est légèrement supérieure à la valeur étalonnée la plus
haute, doivent être dilués pour permettre une quantification plus précise.
• Les échantillons dont la concentration est légèrement inférieure à la valeur étalonnée la plus
basse, ne peuvent être quantifiés que de manière approximative.
• Tenant compte de la procédure d’extraction, la formule suivante peut être utilisée pour convertir
les concentrations d’un échantillon en unités / ml :

Concentration échantillon (unités / µl) x Volume d’élution sélectionné (µl)


Concentration (ml) =
Volume d’échantillon utilisé pour l’extraction (ml)

6. Précautions d’emploi
• Le kit a été élaboré en tant qu’élément de diagnostic médical, dans le respect de la directive
correspondante 98 / 79 / CE.
• Manipuler l’échantillon et le Contrôle Positif avec précaution : une mauvaise manipulation peut
engendrer une contamination des éléments du kit.
• Procéder à l’élimination du kit après utilisation selon les recommandations du GBEA en tenant compte
des faits suivants : le kit ne contient aucun élément dangereux, infectieux ou toxique nécessitant un
traitement spécifique, les emballages utilisés ne sont constitués que de papier ou de polypropylène.

ALL.DIAG -4- Version 2


AMPLIX® VARICELLA-ZOSTER VIRUS (VZV)
RT PCR kit designed for the detection of the Varicella-Zoster Virus (VZV) DNA

Professional use only


In vitro diagnostic

1. Kit composition
This kit contains the necessary material for the realization of 100 tests:
• 4 x 750 µl of VZV MasterMix,

4
1 x 200 µl of VZV Calibrator (10 copies / µl),

3
1 x 200 µl of VZV Calibrator (10 copies / µl),

2
1 x 200 µl of VZV Calibrator (10 copies / µl),

1
1 x 200 µl of VZV Calibrator (10 copies / µl),
• 2 x 1000 µl of VZV Internal Standard.

2. Transportation and storage conditions


• Transport the kit at temperature ranging from -20°C to -80°C.
• Store the kit at the temperature of -20°C: it rema ins stable for 9 months. Repeated freezing and
thawing of the MasterMix, the Positive Control and the Internal Standard may result in lower
detection quality. It is recommended to aliquot the MasterMix by 30 µl directly to PCR tubes and hold
in stock at -20°C. The Positive Control and the Int ernal Standard may be held in stock at 4°C.

3. Pathogen information
Very frequent in human population, VZV infections mostly occur without serious symptoms. Primary infection
occurs generally in childhood, under the appearance of the benign disease varicella. Complications - in the
form of encephalitis - can appear but they are rather rare. This primary infection may be dangerous in the first
5 months of pregnancy.
In people with hypo-immunity, the VZV infections cause a very serious disease, manifested by abundant and
long-term occurrence of hemorrhagic efflorescences, even affecting internal body organs. After the primary
infection, the virus persists in nerve ganglias for the whole life and may reactivate mostly in the form of
herpes zoster. In immunodefficient persons, the zoster development may cause complications: pneumonias,
encephalitis. Moreover, there may occur serious affections of eyes (keratitis, iridocyclitis, panophtalmitis) or
facial and eye-moving nerves.
Correct diagnostic is important for early application of an efficient antivirus therapy. Clinical symptoms are
mostly sufficient for diagnosing diseases caused by the VZV. Virus detection in saliva helps to detect primary
infection, mostly in immunodefficient patients. Serological tests, more specifically the detection of specific
IgM antibodies are highly specific, yet there is the problem of the crossed-over reactivity with HSV. Classic
methods of direct demonstration are slow, tedious and little sensitive. PCR method is very efficient, since it
provides for a very sensitive VZV detection. This method is especially important in testing samples of eye
fluid (tears, eye scrapings) or of cerebrospinal fluid, in case of neurological complications. To assure correct
interpretation this examination should be complemented by a peripheral blood test. Due to possible latent
infection, the test should be interpreted in connection with the clinical state and with the results of precedent
laboratory tests.

4. Method principles
This kit is designed for the detection of Varicella-Zoster Virus DNA. The method is based on the amplification
of a specific conservative DNA sequence of a single-copy ORF62 gene by means of the PCR (Polymerase
Chain Reaction) and for measuring of the amplification product concentration growth in the course of the
PCR by means of fluorescence marked probe (real-time).
The probe marked by the fluorofor is designated for pathogen detection: its signal is detected on the FAM
channel. The Internal Standard controls the possible inhibition of the PCR reaction and the efficiency of DNA
isolation process. Its signal is detected on the JOE channel.

ALL.DIAG -5- Version 2


This detection kit takes an advantage of the “hot start PCR technology”, minimizing non-specific reactions
and assuring maximum sensitivity. It contains Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) controlling possible contami-
nation of the PCR reaction by amplification products, providing very high sensitivity of the VZV detection in
body fluid or blood samples. Designed for in vitro diagnostic, the kit provides qualitative and quantitative
detections.

5. Procedure

ADN isolation
Sample

+
Internal Standard
(0.1 µl Standard / µl of elution volume)

PURIFIED EXTRACTED DNA


(DNA isolation efficiency controlled)

PCR amplification
30 µl of MasterMix

+
10 µl of extracted DNA or Positive Control

AMPLIFIED DNA
(PCR reaction inhibition controlled)

5.1. Sampling and sample storage


• Sterility principles should be observed during sampling.
• All type of samples, except blood, should be placed into tubes without any transportation media.
The samples should be stocked at 4°C within 12 hours.
• To detect the VZV, the volume of sample of necessary physical fluid will depend on the method of
used extraction. Generally, 0.2 in 0.5ml is sufficient but a volume of sample of physical fluid until 2ml
can be used.
• For blood sampling, a sample of incoagulable peripheral blood should be sampled into an EDTA
tube: it may be stored at 4°C within 24 hours.
• For a longer storage, all type of samples can be frozen at -20°C.

5.2. DNA isolation


• DNA isolation should be performed by kits designed for microorganism isolation: DNA Extraction
Kit ALLDIAG.

®
All AMPLIX PCR kits include an Internal Standard providing for an effective monitoring of
eventual inhibition of the PCR amplification and also of the isolation process efficiency. The
Internal Standard is a precisely defined and quantified construct of a plasmid and insert,
prepared by genetic engineering methods.
• The Internal Standard should be added into the sample at the beginning of the isolation process
with the proportion 0.1 µl of Standard / µl of elution volume.

Elution volume 25 µl 50 µl 100 µl 200 µl

ALL.DIAG -6- Version 2


Internal Standard volume 2.5 µl 5 µl 10 µl 20 µl
5.3. PCR amplification

ALL.DIAG -7- Version 2


ALL.DIAG -8- Version 2
5.4. Results Evaluation

5.4.1.Qualitative evaluation

VZV detection Internal Standard detection


RESULTS
(Channel FAM) (Channel JOE)

POSITIVE

NEGATIVE

INVALID

5.4.2.Quantitative evaluation
• For a quantitative evaluation of results, only concentrations in the range specified by the cali-
bration curve may be measured.
• Quantification of samples with concentration out of calibration curve should be considered to be
not very precise.
• Samples with a concentration upper the highest concentrated calibrator should be diluted to
achieve more precise quantification.
• Samples with lower concentration then the lowest concentrated calibrator can be quantified
approximately only.
• Taking into account the isolation procedure, the following formula can be used to convert sample
concentrations to units / ml:

Sample concentration (units / µl) x Selected elution volume (µl)


Concentration (ml) =
Volume of sample used for isolation (ml)

6. Warnings
• The kit has been manufactured as an in vitro medical diagnostic device in harmony with the
98/79/EC Directive.
• Be careful when handling the Positive control or the clinical material: incorrect handling could result
in contamination and the consequent impairment of the kit components.
• The kit should be disposed of after use according to the current legal regulations considering the fact
that the kit doesn’t contain any dangerous, infectious or toxic components that would be subject to
special safety regulations and the packaging materials are made of paper and polypropylene.

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ALL . DIAG
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