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Royaume du Maroc

Université Abdelmalek Essaâdi


Faculté des Sciences et Techniques –
Tanger
Département de biologie

Licences Sciences et Techniques Année universitaire 2016-2017


Filière Biotechnologie végétale

Projet De Fin D’études


Sous le titre :

Les analyses microbiologiques nécessaire


pour la détermination de la conformité
sanitaire de la viande hachée chez certaines
boucheries de Tanger
Réaliser au sein de :

Laboratoire Régional d’Analyses Et de Recherches de Tanger

Par :
ANNAZ HASSAN & ANNAZ HOUSSAM

Encadrés par : Membres de Jury :

Pr. BARAKAT AMINA


Pr. GHAILANI NOUROUTI Naima (FSTT)
Pr. BENNANI MOHCINE
Mme. SILAHI Rqia (L’ONSSA)
Pr. BENYASSI AHMED
1
Dédicace

A nos chers parents pour leur amour, leur patience, leur


soutien et leur encouragement, vous avez été toujours à coté de
nous durant ce parcours.
Aucune dédicace pourrait exprimer mes sentiments, je vous offre ce
modeste travail pour vous remercier pour vos sacrifices, que dieu
vous préservez et vous procurez la santé et longue vie.

A nos professeurs qui ont pris en charge notre enseignement,


nous espérons que nous serons le fruit mur de vos efforts et que
nous ferons l’objets de votre fierté aussi.

A nos frères et sœurs pour leurs compréhensions, leurs


soutiens, et leur tendresse.

A nos ami(e)s et nos collègues pour les moments agréables et


inoubliables que nous avons passés ensemble.

2
Remerciements

Nous adressons tout d’abord nos remerciements et nos


gratitudes les plus sincères à Mr le directeur MAADOUDI
Mohammed pour son accueil au sein de laboratoire régionale
d’analyses et de recherches de l’onssa de Tanger section
microbiologie. Faire notre stage dans votre laboratoire a été un
plaisir, nous avons pu apprendre beaucoup grâce à vous.
Nous tenons à remercier aussi très chaleureusement notre
respectueuse encadrante madame GHAILANI Nourouti Naima
professeure à la faculté des sciences et techniques de Tanger pour
les conseils précieux, la disponibilité et la patience dont nous avons
bénéficiés pour bien préparer ce travail.
Pour la même occasion nous tenons à remercier notre
encadrante de laboratoire madame SILAHI Rqia pour l’intérêt
particulier qu’elle a accordée à notre projet de fin d’études.
Merci à toute l’équipe de la section microbiologie au sein de
laboratoire MR. BENAICHE Mohammed, MR WELD ABDERAHMAN
Hassan et Mlle. Ibtissam pour leur serviabilité et leur disponibilité.

3
LISTE DES ABREVIATIONS

 ASR: Anaérobie sulfito-réducteurs


 BP: gélose Baird Parker
 BCC : Bouillon Coeur Cervelle
 EPT: Eau Peptonée Tamponnée
 E. Coli : Escherichia Coli
 FMAT: Flore Mésophile Aérobie Totale
 g: gramme
 h: heure
 L.R.A.R.T : Laboratoire Régional d’Analyses et de Recherches
 MKTTn : bouillon Muller Kauffmann au Tétrationate et au Novobiocine
 ml : Millilitre
 min : minutes
 ONSSA : Office nationale de la sécurité sanitaire des produits alimentaires
 PCA : Plate Count Agar
 RVS : Bouillon Rappaport Vassiliadis Soja
 RPF : Rabbit Plasma Fibrinogen = gélose au plasma du lapin au fibrinogène
 UFC : Unité Formatrice de Colonie
 TSC :Tryptone Sulfite Cyclosérine
 TBX :Tryptone Bile X-Gluc Agar
 XLD : Xylose-Lysine-Désoxycholate
 % : pourcentage
 °C : degré Celsius

4
Listes des tableaux et figures

Figure 1 : Séparation de la section de microbiologie en zone sale et zone propre.


Figure 2 : Vue microscopique d’une salmonelle
Figure 3 : Vue microscopique de staphylocoques aureus
Figure 4 : Vue microscopique d’Escherichia coli
Figure 5 : Clostridium perfringens
Figure 6 : Flore mésophile aérobie totale sur le gélose PCA
Figure 7 : Préparation de la suspension mère
Figure 8 : Technique de la dilution décimale
Figure 9 : Technique d’ensemencement en profondeur pour le dénombrement des
FMAT
Figure 10 : Technique d’ensemencement en profondeur pour le dénombrement
d’E. Coli
Figure 11 : Technique d’ensemencement en profondeur pour le dénombrement
des ASR
Figure 12 : Etapes d’enrichissement de la salmonelle
Figure 13 : Méthodes d’ensemencement en surface à partir d’un bouillon RVS et
MKTTn
Figure 14 : La galerie API
Figure 15 : Dénombrement de Staphylococcus aureus par ensemencement en
surface
Figure 16 : Résultats de l’isolement de salmonelle sur XLD et HEKTOEN des
échantillons E1, E2, E3 et E5.
Figure 17 : Résultats de l’isolement de salmonelle sur XLD et HEKTOEN de
l’échantillons E4
Figure 18 : Résultats de l’identification par galerie d’API
Figure 19 : résultats de l’ensemencement en surface de staphylocoque aureus sur
le gélose Baird Parker

5
Figure 20 : Résultats d’ensemencement en profondeur des anaérobies sulfito-
réducteur sur le gélose TSC
Figure 21: Résultats de l’ensemencement en profondeur d’Escherichia coli sur TBX
Figure 22 : Résultats de l’ensemencement en profondeur de FMAT sur gélose PCA :
Liste des tableaux
Tableau I : La composition de la viande hachée
Tableau II : La norme de la conformité de la viande hachée
Tableau III : Les milieux de culture correspondant à chaque microorganisme.
Tableau IV : La durée de conservation de chaque type de milieu de culture.
Tableau V : Contrôle de qualité des milieux de culture préparés
Tableau VI : Nombre de colonies de staphylocoques aureus comptées dans chaque
boite
Tableau VII : Nombre de colonies d’anaérobie sulfito-réducteur comptées dans
chaque boite
Tableau VIII : Nombre de colonies d’Escherichia coli comptées dans chaque boite
Tableau IX : Nombre de colonies FMAT comptées dans chaque boite
Tableau X : Récapitulation des résultats des 5 échantillons de la viande hachée.
Tableau XI: Matériels utilisés pendant les différentes manipulations.
Tableau XII : Etapes de préparation des différents milieux de cultures.

6
SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE……………………………………………………………………1
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE…………………………………………………………………….3
I-PRESENTATION GENERALE DE L’ETABLISSEMENT DE STAGE………………4
1-Présentation DE L’ONSSA………………………………………………………………….4
2-Présentation de LRART……………………………………………………………….......4
2.1- Présentation de la section microbiologie alimentaire……………….5
2.1.1- Organisation de la section de microbiologie
alimentaire…………………………………………………………………………………………….5
II-Toxi-infection alimentaire…………………………………………………………………7
1-Caractéristiques de la viande hachée……………………………………………...7
1.1-La composition de la viande hachée………………………………………….8
1.2- Les microorganismes recherchés dans la viande hachée………..8
1.2.1- Les Salmonelles……………………………………………………………....8
1.2.1.1 Description………………………………………………………….8
1.2.1.2- Les symptômes d’infection par la salmonelle….....9
1.2.1.3- Les traitement……………………………………………………9
1.2.2- Les staphylocoques aureus………………………………… …………..9
1.2.2.1- Description…………………………………………………………9
1.2.2.2- Les Symptômes ………………………………………………...10
1.2.2.3- Les traitements………………………………………………..10
1.2.3- Escherichia coli :…………………………………………………………..11
1.2.3.1- Description ………………………………………………………11
1-2-3-2- Les Symptômes………………………………………………..11
1-2-3-3- Les traitements …………………………………………….…12
1.2.4- Les Anaérobies Sulfito-réducteurs………………………………..12
1.2.4.1- Description…………………………………………………….…12
1.2.4.2- Les symptômes …………………………………………………13
1.2.4.3- Les traitements ………………………………………………..13
1-2-5- La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT)…………………13
1-2-5-1- Description …………………………………………………….13
1.2.5.2- Les symptômes et les traitements…………………….14
2- Les milieux de culture des bactéries……………………………………………..15
2-1- les composants d’un milieu de culture…………………………………...15
2-2- les Types de milieux de culture ……………………………………………..15
2-2-1- Composants……………………………………………………………….…16

7
2-2-2 Consistance…………………………………………………………….…….16
2.2.3-Fonction………………………………………………………………………..16

2-3- Contrôle de qualité des milieux de culture :………………………..…17


2-3-1- contrôle de pH …………………………………………………………….17
2.3.2- Contrôle de la couleur ………………………………………………….17
2.3.3- Contrôle de la stérilité…………………………………………………..17
PROBLEMATIQUE………………………………………………………………………………….18
OBJECTIF………………………………………………………………………………………………19
MATERIELS ET METHODES……………………………………………………………………20
I-MATERIELS ………………………………………………………………………………………..21
II-METHODOLOGIES……………………………………………………………………………..21
1-Préparation et contrôle de qualité des milieux de culture…………….21
2-Echantillonnage…………………………………………………………………………….22
3-Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales…….23
3.1-Préparation de la suspension mère……………………………………...23
3.2-Préparation des dilutions……………………………………………………24
4-Les analyses microbiologiques…………………………………………………….24
4.1-Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale (FMAT)…..24
4.2-Dénombrement d’E. Coli……………………………………………………………25
4.3-Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs (ASR)…………25
4.4-La recherche de la salmonelle …………………………………………………..26
4.4.1-Pré-enrichissement…………………………………………………………26
4.4.2-Enrichissement………………………………………………………………..26
4.4.3-Isolement de la salmonelle………………………………………………27
4.4.4-Identification par la galerie API………………………………………28
4.5-Dénombrement de Staphylococcus aureus………………………………..28

RESULTATS ET DISCUSSION………………………………………………………………….30
I.Contrôle de qualité des milieux de culture préparés………………………..31
II.Recherche et dénombrement des différents germes………………………...32

8
1. La recherche de salmonelle…………………………………………….32
2. Le dénombrement des staphylocoques aureus……………….34
3. Le Dénombrement des Anaérobies Sulfito-Réducteur…….36
4. Le dénombrement d’Escherichia coli ……………………………..37
5. Le dénombrement des flores mésophile aérobie totaux….39
6. Résultats globale …………………………………………………………….40
CONCLUSION……………………………………………………………………………………..42
REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………………………..43
ANNEXE ……………………………………………………………………………………………45

9
INTRODUCTION GENERALE

De part dans le monde, la viande est considérée comme un aliment de base


pour plusieurs personnes car cet aliment est une bonne source de sels minéraux de
fer et de protéines surtout.
Sur le plan culinaire, la consommation de chaque type de viande par
exemple volaille, bœuf, vau ou mouton ne procure pas le même plaisir, et au sein de
la même catégorie de viande, le gout diffère d’un morceau à d’autre.
A nos jours, il y une forte consommation de la viande hachée des différents
types de viande cités auparavant. Cette viande hachée est produite après broyage de
la masse musculaire isolée des os et à la quelle une quantité de la matière grasse est
ajoutée. En effet la quantité de la matière grasse est déterminée en fonction de choix
du client, qui peut aller de 0% à 50%.
A noter que la viande hachée présente une facilité et rapidité de cuisson pour
les ménagères mais au même temps elle devient cible facile pour le développement
des micro-organismes pathogènes et non pathogènes. Ces micro-organismes sont à
l’origine de la dégradation des qualités organoleptiques, nutritionnelles et sanitaires
du produit en la rendant insalubre et inappropriée à la consommation.
C’est dans cette perspective que le Maroc a installé plusieurs offices
nationaux de la sécurité sanitaire des produits alimentaires (ONSSA) qui se chargent
en partie des contrôles sanitaires des produits alimentaires fabriqués soit
industriellement ou de façon artisanale comme le cas de la viande hachée cher les
bouchers. Afin d’éviter aux consommateurs des risques d’intoxication d’origine
alimentaire.
En effet LRART qui appartient à l’ONSSA, réalise des inspections régulières
chez les bouchers et font des analyses sur les échantillons de la viande hachée. La
liste des analyses est longue mais nous allons nous focaliser que sur les analyses
microbiologiques. En effet les analyses des germes recherchés sont surtout
salmonelle, staphylocoque aureus, Escherichia coli, les anaérobies sulfito-réducteur,
et la flore mésophile aérobie totale.
La réalisation de ces analyses garantie la sécurité alimentaire de la viande
hachée tout en épargnant le consommateur d’intoxications d’origines alimentaires.
Lors de notre stage, nous nous sommes intéressés à la recherche des germes
suivant dans la viande hachée prélevée de différentes boucheries localisées dans des
zones différentes de Tanger. Après la recherche nous avons comparés nos valeurs a
ceux autorisées par les normes en vigueurs spécifiques à chaque micro-organismes
présent exclusivement dans la viande hachée.

10
Suite à ce travail nous notons que certains bouchers ne respectent pas les
règles d’hygiènes ni les bonnes conditions de conservation de la viande hachée ce
qui confirme l’importance des laboratoire d’analyses microbiologiques. Pour cela
nous recommandons la généralisation et l’augmentation de la fréquence des
contrôles sanitaires.

11
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

12
I- PRESENTATION GENERALE DE L’ETABLISSEMENT DE
STAGE
1- Présentation de L’ONSSA

ONSSA : L'office national de sécurité sanitaire des produits


alimentaires, correspond à l’institut responsable de la sécurité sanitaire au Maroc.
En effet, depuis la création du laboratoire central, d’autres laboratoires régionaux
ont vu le jour dans les différentes villes du royaume. Actuellement il existe 10
laboratoires régionaux.

Cet office a été créé pour remplir plusieurs fonctions parmi ces fonctions, nous
allons citer quelques-unes:
- Adopter des techniques récentes au niveau des différents laboratoires
d’analyses répondant aux exigences des normes internationales comme NM
ISO 9001, NM ISO 17020, NM ISO 17025…etc.
- Les laboratoires sont soumis aux audites fréquentes afin que la démarche de
travails soit uniforme dans tous ces laboratoires et obéisse aux normes
nationales et internationales.
- Des contrôles de qualités des différents produits d’origines animales ou
végétales sont effectuées et au terme des accréditations sont délivrées pour
des produits locaux destinés à la consommation locale ou à l’exportation.

2- PRESENTATION DE LRART:
Comme il fait partie d’ONSSA, ses axes de travail sont identiques à ceux
d’autres laboratoires régionaux. Par ailleurs, les lignes directives suivies sont
similaires à celles décrites lors de la description ci-dessous de l’ONSSA.

Nous signalons que LRART est composé de trois sections dont chacune
effectue des analyses bien particulières :
a) Section santé :
Dans le cadre de la surveillance des épidémies liées à des maladies
contagieuses d’origine animales, des analyses en sérologie et en biologie
moléculaire sont effectuées par cette section

b) Section Chimie Alimentaire :


Section qui réalise le dosage de certaines substances comme l’histamine,
métaux lourdes et dioxyde de soufre sur différents produits de la pèche,
produits laitiers, conserves et semi-conserves.

13
2.1 - Présentation de la section microbiologie alimentaire :

La section est dirigé par un responsable dit chef de section qui est compètent
dans la matière, qui a sous sa direction :
- Des techniciens qui effectuent la maintenance des différents appareils du
laboratoire.
- Des analystes qui effectuent les différentes analyses microbiologiques

Pour confirmer la salubrité d’un aliment, les analystes se chargent de la


recherche et le dénombrement de plusieurs germes :
- Le dénombrement des Coliformes totaux.
- Le dénombrement des Coliformes fécaux.
- Le dénombrement des Staphylocoques aureus à coagulase positive.
- Le dénombrement des Levures et moisissure.
- Le dénombrement des Streptocoques fécaux.
- Le dénombrement d’Escherichia coli.
- Le dénombrement et la recherche des anaérobies sulfito-réducteurs.
- La recherche des Salmonelles.
- La recherche de Listeria monocytogenes.
- La recherche de Vibrocholerea.

2.1.1- Organisation de la section de microbiologie


alimentaire :
La section de microbiologie dispose des salles séparées en deux zones clairement
identifiées, adoptant un principe spécial de la marche en avant, ce principe consiste
à ce que l’échantillon déjà analysé ne croise en aucun cas le chemin d’échantillon à
analyser, ceci afin d'éviter des contaminations croisées, qui sont susceptibles
d'influer sur la qualité et la crédibilité des analyses. Ce principe est possible grâce à
une organisation particulière des salles de la section qui utilise à deux zones :

14
La zone sale La zone propre

* Une salle de l’isolement et de * Une salle de la laverie.

l’identification. * Une salle de la préparation et stérilisation


des milieux de culture.
CLOISON

* Une salle de l’incubation. * Une salle de la réception et préparation


des échantillons.
CLOISON
* Une salle de l’ensemencement.
* Une salle de décontamination.
* Une chambre froide.

FIGURE 1 : Séparation de la section de microbiologie en zone sale et zone propre

A souligner que pour bien respecter le principe de la marche en avant, le


personnel ne peut circuler librement d’une salle de la zone propre à une salle de la
zone sale et inversement. Pour faciliter la communication entre les salles, il existe
des petites fenêtres ou cloisons entres les salles qui permettent le transfert des
milieux de cultures et des boites de pétri inoculées.

15
II. Toxi-infection alimentaire
On parle d’intoxication ou toxi-infection alimentaire lorsqu’une personne
ingère un aliment contaminé par un micro-organisme pathogène, comme les
champignons et les bactéries.

Selon le rapport 2015 de l’organisation mondiale de la santé (OMS), les


premières estimations sur les toxi-infections alimentaire montrent que
mondialement chaque année 1 personne sur 10 tombe malade en consommant des
aliments contaminés et que 420000 en meurent de le nombre 125000 sont des
enfants de moins de 5 ans[1].

La grande majorité des intoxications alimentaires sont causées par les


bactéries et par les toxines qu’elles fabriquent. Parmi ces bactéries on peut citer : la
Salmonelle, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Listeria monocytogéne et les
staphylocoques aureus. Ces infections résultent habituellement du manque
d’hygiène lors de la manipulation, de la préparation, du stockage, de la conservation
ou de la cuisson des aliments.

Les symptômes de toxi-infection débutent plusieurs heures à plusieurs jours


après l’ingestion d’un aliment contaminé, le plus souvent c’est : la diarrhée, les maux
de tête, les vomissements et la fièvre. Dans la plupart des cas ces symptômes
disparaissent sans médication mais quand l’infection est grave la prise des
antibiotiques est recommandée ainsi une bonne hydratation [2].

Les aliments les plus incriminés dans les toxi-infections alimentaires


d’origines bactérienne sont : les produits laitiers crue, le fromage, le lait, le beurre,
les crèmes, les boissons, les jus de fruits, l’olive, les produits de la pèche, les anchois,
les crevettes…, les fruits rouges, les conserves et la viande crue et hachée [3].

C’est sur le dernier aliment que nous avons focalisé notre travail.

1.Caractéristiques de la viande hachée


La viande hachée est définie comme la viande crue qui a été soumise à une
opération d’hachage en fragment et peut contenir 0% à 50% de la matière grasse.
Depuis le 20ème siècle son utilisation a vu une croissance fulgurante surtout dans le
domaine de la restauration rapide (Fast-Food) à cause de sa préparation facile et
rapide et ses valeurs nutritionnelles élevées.
16
1-1 La composition de la viande hachée

La viande hachée est un aliment de grande valeur nutritionnelle et le tableau


suivant résume sa composition pour 100g [4] :
Tableau I : La composition de la viande hachée
Constituants Quantité % Apport journalier
recommandé
Protéines 19,6 g 39%
Glucides 0g 0%
Lipides 4,69 g 7%
Eau 73,8 g -
Phosphore 184 mg 26%
Magnésium 22 mg 6%
Sodium 58 mg 2%
Potassium 353 mg 18%
Vitamines et enzymes Traces -
Energie 121 kcal 6%

1.2- Les microorganismes recherchés dans la viande hachée


Pour la viande hachée le risque sanitaire est plus important car les bactéries
ne trouvent aucune difficulté pour se développer, en plus la composition riche en
éléments nutritionnels forme un milieu favorable pour la croissance de différents
types de ces bactéries parmi lesquelles on peut citer : la Salmonelle, Escherichia coli,
Clostridium perfringens, la flore mésophile aérobie totale et les Staphylocoques
aureus.

1.2.1- Les Salmonelles


1-2-1-1 Description
Les salmonelles appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae. Ce sont
des bacilles à Gram négatif, souvent mobiles grâce à leur ciliature péritriche
(rarement immobiles), non sporulés, et anaérobie facultatif. Mesurant 0,7-1,5 µm
de largeur sur 2,0-5,0 µm de longueur, sensible à la chaleur et à l’acidité de
l’estomac. Elles sont présentes dans le système gastro-intestinal de l’Homme et des
animaux [5]. Ces germes sont mortels, l’absence totale de salmonelle dans la
viande hachée est exigée [6].

17
Par ailleurs, l’Homme sera contaminé en ingérant un aliment souillé par
cette bactérie ou après avoir un contact avec des animaux ou des humains
infectés, le manque d’hygiène est le facteur principal de la propagation de
salmonelle.

Salmonelle

Figure 2 : Vue microscopique d’une salmonelle [7]

1.2.1.2- Les symptômes d’infection par la salmonelle


Salmonella cause une infection dite salmonellose, Il s’agit de l’une des
principales causes d’intoxications alimentaires. La plupart des personnes infectées
souffrent des maux de ventre, d’une diarrhée, des vomissements, des maux de tête et
la fièvre. Ces symptômes apparaissent de 12 à 72 heures après l’ingestion d’un
aliment contaminé [8].
1.2.1.3- Les traitement :

La réhydratation est le premier soin qui doit être utilisé. Pour les cas
graves, il faut exiger une antibiothérapie.

18
1.2.2- Les staphylocoques aureus

1.2.2.1- Description :

Les staphylocoques appartiennent à la famille de micrococcaceae, qui


sont des coques (cocci) à Gram positif, groupés en amas formant des grappes de
raisin, sont immobiles de 0.5 à 25 µm de longueur, non sporulés, aérobie ou
anaérobie facultatifs. Ce sont des germes ubiquitaires trouvés dans l’air, les sols, et
les eaux, la peau et les muqueuses de l’homme et les animaux. Ils poussent aussi sur
les aliments [9]. Tout échantillon de la viande hachée analysé dépassant 500 UFC/g
est non conforme et toxique. A noter que l’infection se transmet soit en ingérant un
aliment contaminé ou juste après contact direct avec cet aliment [6].

Staphylocoque
aureus
sous forme de
cocci

Organisation en
amas

Figure 3 : Vue microscopique de staphylocoques aureus [10]

1.2.2.2- Les Symptômes :

Les staphylocoques aureus sont responsables soit des infections dermiques


causant des démangeaisons ou des infections gastro-entéritiques qui se traduisent
par des vomissements violents et la fièvre accompagnée de la diarrhée. Les
personnes ayant un système immunitaire affaibli et souffrant de maladies
chroniques sont plus sensibles à l'infection par ces germes [11].

19
1.2.2.3- Les traitements :

La plupart des infections par les staphylocoques aureus touchent


uniquement la peau et sont traités efficacement à l'aide des antibiotiques adaptés.

1.2.3- Escherichia coli :


1.2.3.1- Description

Escherichia coli ou colibacille appartient à la famille des entérobactéries,


c’est une bactérie à gram négatif, capable de fermenter le lactose et de produire de
l'indole. Vie normalement dans l’intestin de l’Homme et des animaux. Elle se
développe dans l’eau non traitée et impropre à la consommation et dans les aliments
notamment la viande hachée [11]. Elle ne provoque normalement pas des maladies
mais lorsque le nombre d’Escherichia coli dépasse 500 UFC/g dans la viande hachée
l’échantillon est considéré non conforme et pathogène. L’Homme risque de
contracter une infection par cette bactérie soit en ingérant un aliment contaminé ou
boire de l’eau non traitée donc impropre à la consommation [6].

Escherichia
Coli

Figure 4 : Vue microscopique d’Escherichia coli [12]

1-2-3-2- Les Symptômes :

Les personnes infectées par Escherichia coli souffrent d’une diarrhée,


des vomissements, d’une fièvre légère et des infections urinaires. Ces symptômes
apparaissent dans les 10 jours après l’exposition à la bactérie.

20
1.2.3.3- Les traitements :

La majorité des gens se rétablissent d’eux-mêmes et la plupart de ces


symptômes disparaissent après 5 à 10 jours de l’infection mais certains peuvent
développer une maladie grave qui nécessite des soins hospitaliers tel que la prise
des antibiotiques et une bonne hydratation pour remplacer les nutriments et les
minéraux perdus à cause de La diarrhée et les vomissements.

1.2.4- Les Anaérobies Sulfito-réducteurs


Clostridium
Perfringen

Figure5: Clostridium perfringens [14]

1.2.4.1- Description :

Les anaérobies sulfito-réducteurs se présentent sous forme de bâtonnets


dites bacilles, sont des bactéries à Gram positif, anaérobies stricts,
thermorésistantes, elles réduisent les sulfites en sulfures noires et elles sont
capables de se transformer sous forme sporulé dans des conditions défavorables,
Parmi les bactéries anaérobies sulfito-réducteurs on peut citer le Clostridium
perfringens, c’est un germe tellurique, que l’on trouve aussi dans l’intestin de
l’Homme et des animaux et se développe sur les denrées alimentaires [13].
A noter que la norme N°5214 de conformité d’analyse microbiologique exige un
taux de cette bactérie qui ne dépasse pas 100 UFC/g dans la viande hachée, ces
germes se transmettent uniquement en ingérant un aliment contaminé. Le manque
d’hygiène et les mauvaises conditions de stockage des aliments sont les facteurs
principaux de l’infection par cette bactérie.

21
1.2.4.2- Les symptômes :

Les symptômes d’une infection par les anaérobies sulfito-réducteurs


sont la diarrhée, perte d’appétit, perte de poids, douleur musculaires et la fatigue.
Ces symptômes apparaissent généralement 6 à 12 heures après l’exposition à la
bactérie [15].

1.2.4.3- Les traitements :

La plupart des personnes qui sont infectées par les Anaérobies sulfito-
réducteur se rétablissent sans recevoir des traitements, dans les cas les plus graves
la prise des antibiotiques.

1-2-5- La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) :


1-2-5-1- Description :
Ce sont des bactéries aérobies c’est-à-dire qu’il ont besoin d’oxygène
pour se développer, ces germes n’ont pas d’effets direct sur la santé mais sont des
indicateurs de contamination qui révèlent la présence possible d’une contamination
bactériologique. Toute échantillon da la viande hachée qui dépasse 5x106 UFC/g est
considéré non conforme et pathogène. Ce groupe se compose de 3 types de flore [6]
 La flore thermophile :
La température optimale de croissance est supérieure à 40 °C.
 La flore mésophile :
La température optimale de croissance est située entre 20 °C et 40 °C.
 La flore psychrophile :
La température optimale de croissance est inférieure à 20 °C.

Figure 6 : Flore mésophile aérobie totale sur le gélose PCA (photo personnelle)

22
1.2.5.2- Les symptômes et les traitements:

Ces germes n’ont pas d’effets directs sur la santé, ils permettent d'évaluer le nombre
d'UFC présente dans un produit.

En résumé de cette revue bibliographique concernant les différents germes


rencontrés et leurs normes respectives le tableau ci-dessous donne une idée plus
précise.
Tableau II : La norme de la conformité de la viande hachée
Type de bactérie Salmonelle Staphylocoque Escherichia Anaérobie FMAT
(UFC/g) Aureus coli sulfito- (UFC/g)
Qualité de la (UFC/g) (UFC/g) réducteur
Viande hachée (UFC/g)
Satisfaisant Absence ≤100 ≤100 ≤10 ≤ 5x105
Conforme
acceptable Absence 100 - 500 100 - 500 10 - 100 5 à 50x105

Non conforme présence >500 >500 >100 > 6x106

Pour pouvoir dénombrer ces types de bactéries dans les échantillons de la viande
hachée, il faut bien les faires pousser dans des milieux de culture à l’exigence de
chaque bactérie.

23
2- Les milieux de culture des bactéries
Un milieu de culture est un support nutritif qui permet la multiplication et la
croissance des microorganismes bactériens, afin de les identifier et les dénombrer.
En principe le milieu de culture renferme les composants indispensables à la
multiplication rapide et en grand nombre des germes. Et parfois des composants qui
permettront de privilégier un genre bactérien ou une famille spécifique par rapport
aux autres.
2-1- les composants d’un milieu de culture :
En général, Un milieu de culture minimum comportant les éléments
chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne, il contient :
 Une source de carbone et d’énergie généralement le glucose.
 Une source de Potassium et de phosphore : KH2PO4
 Une source d’Azote et de Soufre : (NH4)2 SO4
 Une source de Magnésium : MgCL2
 Une source de Calcium : CaCL2
 Une source de fer on emploie le citrate de fer (le citrate maintient le Fer en
solution)
 Une source d’oligoélément : sels de Cu, Zn, Co, Ni
 Une source d’eau : on utilise l’eau distillée stérile.
 Un tampon PH : il maintient un ph correct voire optimum : KH2PO4
En absence de l’un de ces composants, les bactéries ne se développent pas, car elles
ne peuvent pas synthétiser ces produits.
2-2- les Types de milieux de culture :
Il existe une grande variété de milieu de culture en rapport avec la
diversité des exigences nutritives des microorganismes, la différence peut
concernes la composition, la consistance et la fonction.

24
2-2-1- Composants
Selon les composants des milieux de culture, on peut distinguer :
- Les milieux synthétiques :

La composition exactement connue, qualitativement et quantitativement. Ces


milieux sont surtout utilisés pour l’étude des bactéries autotrophes ou pour
étudier les besoins nutritifs d’un germe.
- Les milieux empiriques :
La composition connue seulement avec approximation, car dépondant des
matières premières utilisées : extrait de la viande ou de levure, peptones, sucres
et éventuellement liquides biologiques (sérum, sang …...…)
2-2-2 Consistance
Il existe 3 types de milieu de culture :
-les milieux solides qui contiennent habituellement 1,5-2% d’agar,
-les milieux semi-solides contenant une quantité d’agar inférieur à 1% .
-les milieux liquides (bouillons nutritifs)
En effet, les microorganismes se développent parfaitement dans les milieux
liquides mais l’isolement bactérien nécessite des milieux solides afin de séparer les
différents germes présents dans un prélèvement.
2.2.3-Fonction
Selon leur fonction, on distingue :
- Les milieux sélectifs : qui permettent uniquement la culture de certains genres
de microorganismes. Pour cela, on ajoute des éléments qui inhibent la croissance
des micro-organismes indésirables comme le chlorure de sodium, à forte
concentration, le thiosulfate de Sodium, le cristal violet ou certains antibiotiques,
etc.
- Les milieux d’enrichissement: milieux liquides utilises pour l’obtention d’une
densité élevée de germes. Le milieu d’enrichissement peut être :
 Sélectif : qui permet la multiplication des micro-organismes spécifiques
tout en empêchant partiellement ou totalement la croissance d’autres
micro-organismes.
 Non sélectif : qui permet la croissance d’une grande variétédes micro-
organismes.
25
- Les milieux d’isolement : un milieu d’isolement est un milieu solide ou semi-
solide qui permet la croissance des microorganismes. Il peut être :
 sélectif : permettant la croissance des germes cibles spécifiques tout en
empêchant celle d’autres microorganismes.
 Non sélectif : qui n’est pas destiné à l’inhibition sélective de micro-
organismes.
2-3- Contrôle de qualité des milieux de culture :

Après stérilisation par autoclavage, chauffage et ébullition des milieux, il


est recommandé de soumettre tous les milieux à un contrôle en ce qui concerne leur
PH, leur couleur et leur stérilité.

2-3-1- contrôle de pH :

Il consiste à mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre et l’ajuster si


nécessaire de sorte qu’après la stérilisation et refroidissement le milieu soit au pH
demandé ± 0,2 unités de pH.
L’ajustement est généralement effectué par une solution d’hydroxyde de sodium
(NaOH) à 40g/l pour augmenter le pH ou par une solution de HCL à 36,5g/l, si
l’ajustement de pH est effectué après la stérilisation, il faut utiliser des solutions
stériles.

2.3.2- Contrôle de la couleur :

Il s’effectue par une comparaison à l’œil nu entre la couleur de milieu à


contrôler et la couleur habituelle de milieu.

2.3.3- Contrôle de la stérilité :

Il convient de soumettre à essai une quantité de chaque lot de milieu de


culture adapté à sa taille pour évaluer la contamination microbienne par incubation
dans des conditions appropriées.
Pour les essais, il convient de prélever au moins une boite ou un tube contenant le
milieu de culture dès le début de la répartition de milieu et les incubés pendant au
moins 18h à 37C° ou dans les conditions d’incubation habituellement utilisées pour
ce milieu conformément à la norme applicable [16].

26
PROBLEMATIQUE

Suite aux effets indésirables des toxi-infections alimentaires d’origine bactérienne,


il s’avère nécessairement de réaliser des contrôles sanitaires fréquents de certains
produits de grand consommation par la population. Surtout s’il s’agit de produit
périssable et fabriqué de façon artisanale sans respect des normes d’hygiène.

Sous la direction de LRART, des contrôles sanitaires sont effectués auprès des
boucheries de différentes zones de Tanger afin de les sensibiliser sur les règles
d’hygiène et le risque sanitaire d’une contamination bactérienne.

27
OBJECTIF
Suite à une augmentation incessante de cas de gastro-entérites dans certaines
régions de Tanger, les autorités sanitaires ont jugé utile et même impératif de
renforcer les contrôles sanitaires de certains catégories d’aliment à grande
consommation comme le poisson et la viande hachée.
Ces aliments sont facilement périssables et vulnérables au manque des
conditions d’hygiène, aux mauvaises conditions de conservation, de transport et
stockage non adapté.
LRART faisant partie de l’ONSSA a mené des compagnes durant le mois de
Mars et avril a fin d’évaluer la qualité hygiénique de la viande hachée. Ceci en
dénombrant les principaux micro-organismes suivants : salmonelle, staphylocoque
aureus, Escherichia coli, les anaérobies sulfito-réducteur, et la flore mésophile
aérobie totale, fortement impliqués dans les gastro-entérites.

28
MATERIEL ET METHODES

29
Dans ce chapitre expérimentale, nous allons vous présenter grossièrement, en
premier lieu la méthode de préparation des milieux de culture des bactéries
recherchées à savoir la salmonelle, FMAT, ASR, E. coli et Staphylococcus aureus. En
deuxième lieu l’échantillonnage, puis la préparation de la suspension mère et les
dilutions décimales et dernièrement nous exposerons la méthodologie suivie pour
la culture et le dénombrement de chaque bactérie.

I- MATERIEL : (Voir L’annexe I)


II- METHODOLOGIES
1. Préparation et contrôle de qualité des milieux de
culture
Avant de commencer l’analyse microbiologique la préparation des milieux
de cultures est nécessaire. Chaque microorganisme se développe dans un milieu
bien connu qui favorise sa croissance et permet son apparition pour le
dénombrement :
Tableau III : Les milieux de culture correspondant à chaque microorganisme

Microorganisme Milieu de culture

FMAT Gélose PCA

ASR Gélose TSC

E. coli Gélose TBX

Gélose XLD et HEKTOEN, Bouillon RVS et


Salmonelle
MKTTn
Staphylococcus Gélose BP et Bouillon BCC
aureus

Quand le milieu est prêt à utiliser on peut soit le couler dans des boites de pétri
ou le laisser dans les flacons puis le stocker dans les réfrigérateurs pendant des
durées variables :

30
Tableau IV: La durée de conservation de chaque type de milieu de culture

Durée de conservation
Nature de Milieu Milieu préparé en flacon Milieu préparé en boite
EPT 6mois(à 2-8°C) -----------------------
Bouillon MKTTn 1mois à l’abri de la lumière ------------------------
(à 2-8°C)
Bouillon RVS 6mois à l’abri de la lumière ------------------------
(à 2-8°C)
Gélose PCA 6mois (2 à 25°C) 1mois (à 2-8°C)
Gélose TBX 1mois à l’abri de la lumière 15j à l’abri de la lumière
(à 2-8°C) (à 2-8°C)
Gélose TSC 6mois (à 2-8°C) ------------------------
-
Gélose XLD ------------------------ 8jours (à 2-8°C)
Gélose HEKTOEN ------------------------ 14jours (à 2-8°C)
Gélose Baird-Parker 6 mois (à 2-8°C) 5jours (à 2-8°C)

La préparation et contrôle de milieu de culture se font selon les normes


ISO/TS 11133-1 et ISO/TS 11133-2[17][18], le tableau (Voir l’annexe II) montre les
étapes de préparation des différents milieux de culture.

2. Echantillonnage
Il faut effectuer cette étape dans des conditions aseptiques totale en utilisant
des sachets plastiques stériles ou des flacons stériles pour éviter toute
surcontamination qui faussera les résultats des analyses effectuées.
La viande hachée a été achetée de différentes boucheries de Tanger comme
pour tout client, c’est-à-dire sans précautions particulières. C’est un test à l’aveugle
pour le boucher. Une fois arrivé au laboratoire de LRART, la suspension mère ainsi
que les dilutions nécessaires ont été préparées à partir des différents échantillons.

31
3. Préparation de la suspension mère et des dilutions
décimales
Il faut assurer toutes les conditions d’hygiène de lieu de de manipulation
(travaillant sous des hottes à flux laminaire ou à coté de Bec bunsen et lavage des
supports de travails avec les détergents) et un personnel utilisant des gants stériles
en se lavant les mains avec de l’alcool.
Ces précautions sont prises pour ne dénombrer que les microorganismes
présents dans l’échantillon.

3.1- Préparation de la suspension mère


Conformément la norme ISO 6887-1[19], on prend x g de l’échantillon dans 9 x ml
de diluant qui l’EPT. Ceci est réalisé à température ambiante :

Figure 7 : Préparation de la suspension mère (Préparée par PowerPoint)

Pour la recherche de la salmonelle nous avons pris 12 g dans 108 g de l’EPT


qui est le diluant. La préparation est effectuée dans un dilumat à côté du bec bunsen.
Le sachet plastique de la suspension mère est ensuite passé dans un
homogénéisateur de type péristaltique (stomacher) programmé automatiquement
à 1min, nous le laissons décanter pendant 30 min avant de commencer l’étape
suivante. La suspension mère correspond une dilution de 1/10.

32
3.2- Préparation des dilutions
Dans le cas où la charge microbienne est très élevée, il faut préparer des
dilutions décimales, la figure ci-dessous illustre la manière de procéder pour la
solution 10 , 1 ml de la suspension mère à 10 est ajouté à 9 ml de diluant qui est
le peptone-sel

Figure 8 : Technique de la dilution décimale (Préparation personnelle par Powerpoint)

4- Les analyses microbiologiques


Pour un travail sérieux, sans tout risque de contamination supplémentaire des
échantillons, la majorité des étapes a été faite sous la hotte à flux laminaire.
4.1- Dénombrement de la flore mésophile aérobie totale
(FMAT)
Conformément à la norme ISO 4833[20], le dénombrement des FMAT se
fait selon la technique d’ensemencement en profondeur :

Figure 9 : Technique d’ensemencement en profondeur pour le dénombrement des


FMAT (Préparée par Powerpoint)

33
Trois dilutions ont été utilisées à savoir . La procédure
d’ensemencement est illustrée dans la figure ci-dessus. De ce fait, 1ml de la
dilution a été prélevé séparément et déposé dans une boite de pétri stérile, puis
15 ml de gélose PCA a été versé au-dessus. C’est pour cela nous parlons
d’ensemencement en profondeur. L’inoculum est mélangé soigneusement avec
le milieu de culture puis laissés de solidifier. Après solidification les boites ont
été incubées à +30°C durant 72h.

4.2 - Dénombrement d’E. Coli


Nous allons procéder comme pour Les FMAT en effectuant un
ensemencement en profondeur.

Figure 10 : Technique d’ensemencement en profondeur pour le dénombrement d’E. Coli


(Préparée par Powerpoint)

Pour l’ensemencement d’E. coli, il s’effectue en profondeur comme illustré et


expliqué dans la figure ci-dessus, à préciser que les dilution utilisées sont (à
partir de la suspension mère) et et que le milieu utilisé est cette fois TBX .
Après solidification, les boites sont incubées pendant 20h ±2h à 44°C.
4.3 - Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs
(ASR)
Le dénombrement des ASR se fait suivant la technique
d’ensemencement en profondeur :

34
Figure 11 : Technique d’ensemencement en profondeur pour le dénombrement des ASR
(Préparée par PowerPoint)

Pour les ASR, comme expliqué dans la figure ci-dessus, le principe


d’ensemencement en profondeur est le même, sauf que nous utilisons des
tubes, un milieu différent qui est le TSC et que nous travaillons avec deux
dilutions et , les tubes seront homogénéisés sans créer des bulles
d’air et incubés après solidification pendant 24h à 48h à 46°C.

4.4- La recherche de la salmonelle :


Conformément à la norme ISO 6579 : 2002-amendement 2004[21], la
recherche de la salmonelle se fait suivant les quatre étapes suivantes :
4.4.1- Pré-enrichissement
Permet la stabilisation des bactéries stressées et consiste à placer la
suspension mère dans l’étuve à 37°C pendant 16 à 20h.
4.4.2- Enrichissement
Cette étape permet la multiplication de la salmonelle même en présence
des autres microorganismes concurrents. Nous avons utilisé pour cette étape
deux bouillons RVS et MKTTn qui jouent un rôle inhibiteur de la croissance
des bactéries Gram+ et les entérobactériaceaes autres que la salmonelle :

35
Figure 12 : Etapes d’enrichissement de la salmonelle (Préparée par Powerpoint)

Pour cette étape, comme illustré dans la figure 12, 0,1 ml de la culture
pré-enrichie a été prélevé et déposé dans un tube de 10ml de bouillon RVS
puis incubé pendant 24h à 41,5°C, 1 ml a été prélevé de la culture pré-enrichie,
ajouté dans un tube de 10 ml de MKTTn puis incubé pendant 24h à 37°C.

4.4.3- Isolement de la salmonelle

Figure 13 : Méthodes d’ensemencement en surface à partir d’un bouillon RVS et


MKTTn (Préparée avec PowerPoint)

Apres incubation, à l’aide d’une anse stérile, une goutte a été prélevé des deux
milieux séparément puis ensemencé sous forme de strie dans des boites de pétri qui
referment soit le milieu XLD soit le milieu HEKTOEN, les boites seront ensuite
incubées à 37°C pendant 24h.

36
4.4.4- Identification par la galerie API 20E
La galerie API Permet la confirmation des colonies suspectes qui apparaissent
sur la gélose sont bien de la salmonelle ou non.

Limite de remplissage

Figure 14 : La galerie API 20E (Préparée par PowerPoint)

Nous ensemençons une colonie prélevée de milieu HEKTOEN dans 5 ml de


l’eau physiologique puis nous inoculons la suspension dans les micros tubes de la
galerie en remplissant les tests CIT, VP et GEL entièrement. Nous remplissons les
test ADH, LDC, ODC, H2S et URE pour créer l’anaérobiose. Nous mettons la galerie
dans un support de micropuits rempli avec de l’eau pour former une chambre
humide et nous incubons la galerie pendant 24h à 37C°. Après incubation, nous
avons ajouté les réactifs suivants et puis réalisation de la lecture :
- Pour le test de VP : une goutte de VP1 + une goutte de VP2 (Lecture après 10
minutes).
-Pour le test de TDA : une goutte de réactif TDA (Lecture immédiate).
- Pour le test IND : une goutte du réactif JAMES (Lecture immédiate).
Ensuite la lecture des réactions se fait en se référant au tableau de lecture
fournit par le fabricant (BIOMERIEUX), nous comparons les chiffres selon les
résultats obtenus avec le code dans le livre de référence.
4.5- Dénombrement de Staphylococcus aureus
Conformément à la norme ISO 6888-1 [22], le dénombrement de la bactérie
Staphylococcus aureus se fait selon les étapes suivantes :

37
Figure 15 : Dénombrement de Staphylococcus aureus par ensemencement en
surface (Préparée par Powerpoint)

Nous ensemençons un volume de 0,1 ml de la suspension à la surface du


milieu BP, puis nous étalons de façon homogène à l’aide d’un étaleur stérile
(ensemencement en surface). L’incubation des boites se fait à 37°C pendant 48h.
(Un témoin contenant le même mélange, mais non ensemencé est incubé dans les
mêmes conditions). Après incubation, nous obtenons des colonies
caractéristiques (noires et entourer d’un halo blanc) et des colonies non
caractéristiques (noires).

38
RESULTATS ET DISCUSSION

39
Dans ce dernier chapitre, nous allons présenter en premier lieu les résultats
de contrôle de qualité des milieux de culture que nous avons préparé.
Et en deuxième lieu les résultats de dénombrement des différents germes
présents dans les échantillons de la viande hachée.
A la suite, nous allons comparer les valeurs obtenues avec les normes en
vigueur pour chaque germe dans cet aliment précisément.

I. Contrôle de qualité des milieux de culture préparés.


Les paramètres étudiés sont l’aspect, la couleur, le pH, et la stérilité du milieu.
Tableau V : Contrôle de qualité des milieux de culture préparés :

Nom du Milieu Aspect Couleur pH Stérilité Conformité

EPT Bouillon jaune 7 (7,0±0,2)


Bouillon bleue
Bouillon 7,9 (8,0±0,2)
MKTTn verdâtre
Bouillon RVS Bouillon bleue 5,3 (5,2±0,2)
jaune
Gélose PCA Gélose 7,1 (7,0±0,2) Tous les
claire
milieux de
Gélose TBX Gélose jaune 7,1 (7,2±0,2) Absence
culture
de
Gélose TSC Gélose vert 7,7 (7,6±0,2) préparés
germe
rouge sont
Gélose XLD Gélose 7,2 (7,4±0.2) conformes
orangé
vert
Gélose HEA Gélose 7,7 (7,6±0.2)
foncé
Gélose Baird- jaunâtre
Gélose 7 (7,2±0,2)
Parker opaque

A partir de notre tableau ci-dessus, nous notons que les différents milieux
préparés, soit en solution ou solide, ils sont conformes aux normes et peuvent servir
pour la culture des germes appropriés. En effet leur aspect, pH, couleur et stérilité
sont correctes. Ce que nous pouvons dire c’est que la préparation des milieux de
cultures, nécessite un travail soigné.
A souligné que la préparation est faite dans une salle réservée uniquement à
la préparation des milieux de culture et aucun échantillon ne s’y trouve. Ceci fait
partie du système marche en avant adopté par LRART.

40
II. Recherche et dénombrement des différents germes
Dans cette partie nous allons dénombrer 5 types des germes à savoir
salmonelle, staphylocoque aureus, les anaérobies sulfito-réducteur, Escherichia coli
et la flore mésophile aérobie totale. Nous allons les présenter selon l’ordre
d’importance dans les analyses.
Pour rappel nous avons travaillé sur 5 échantillons de viande hachée achetés
de 5 bouchers différents et les échantillons respectivement prennent la
numérotation suivante : E1, E2, E3, E4, E5.
1. La recherche de salmonelle
A partir de nos résultats, nous notons 2 points essentiels : l’apparition des
colonies sur les boites de pétri des 2 milieux XLD et HEKTOEN, ceci pour les
échantillons E1, E2, E3 et E5.

Colonie jaune

Colonie rouge

XLD HEKTOEN
Figure 16 : Résultats de l’isolement de salmonelle sur XLD et HEKTOEN des échantillons
E1, E2, E3 et E5.

Ces Colonies ne sont pas caractéristiques de salmonelle car leur couleur est
jaune sur XLD et rouge sur HEKTOEN.

41
Colonie jaune (Non
Caractéristique)

Colonie verte à
centre noire
(Caractéristique)

XLD HEKTOEN
Figure 17 : Résultats de l’isolement de salmonelle sur XLD et HEKTOEN de l’échantillons
E4

Le 2ème point consiste à souligner pour l’échantillons E4 on remarque


l’apparition des colonies jaune non caractéristiques de salmonelle sur le milieu XLD,
et des colonies vertes à centre noire caractéristiques de salmonelle sur le milieu
HEKTOEN.
Généralement s’il y’a présence des colonies suspectes caractéristique de
salmonelle il faudra passer à l’identification en utilisant la galerie API.

Figure 18 : Résultats de l’identification par galerie d’API (Préparée par Powerpoint)

La galerie API est composée de 7 Lots, dans chaque lot peut exister 2 à 3
microtubes. À retenir que chaque microtube de chaque lot est identifié par une
numéro qui sera utilisée pour l’exploitation de la galerie API 20E. Selon la coloration
obtenue dans les microtubes, nous déduisons si le test est positif ou négatif :
- La coloration de chaque microtube est identique à celle trouvé dans le tableau de
référence d’API donc la coloration est positive et nous accordons le signe + et
inversement pour un test négatif.

42
L’association des tests positifs se résumera à l’addition des numéros affectés
à chaque microtube pour déduire chaque chiffre.
Pour l’obtention du code de la bactérie suspecte, il suffit d’aligner les chiffres
obtenus de chaque lot en allant de gauche à droite.
Pour notre galerie api nous avons obtenu le code 6170511 ce dernier signifie
que les colonies appartiennent à une autre bactérie.
En conclusion, au moment que l’échantillon E4 ne renferme pas de salmonelle
nous pouvons dire que nos 5 échantillons de la viande hachée sont conformes selon
[6] qui exige l’absence absolue des germes de salmonelle.
2. Le dénombrement des staphylocoques aureus
L’observation de nos boites des différents échantillons montre la présence des
colonies caractéristiques de staphylocoque aureus. Elles sont des colonies à centres
noir entourées d’une zone d’éclaircissement, leur nombre est plus élevée, nous
passons au dénombrement correspondant à chaque dilution.
Colonie à centre noir entourée d’une zone
d’éclaircissement caractéristique de
staphylocoque aureus

Figure 19 : résultats de l’ensemencement en surface de staphylocoque aureus sur le


gélose Baird Parker

La détermination de nombre des colonies pour chaque échantillon de la viande


hachée nous permet de dresser le tableau suivant :

43
Tableau VI : Nombre de colonies de staphylocoques aureus comptées dans chaque boite

Echantillons
staphylocoque
aureus E1 E2 E3 E4 E5

Dilution Dilution Dilution Dilution Dilution


Nombre des
colonies 10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2
comptées 32 13 18 6 24 9 70 32 105 22
Nombre des
colonies par 409 218 300 927 1154
gramme
conformité conforme conforme conforme Non conforme Non conforme

A partir de tableau ci-dessus, nous notons que la charge microbienne des


staphylocoques aureus est très élevée dans les échantillons E4 et E5 par rapport aux
3 autres (E1, E2 et E3).
Le passage de nombre de colonies comptées par boite au nombre de colonies
par gramme d’échantillon est déterminé selon la formule suivante :

=
,
Avec
N : nombre de microorganismes par g d’échantillon
Σ C : est la somme des colonies comptées sur la boite retenue de la première et la
deuxième dilution.
V : est le volume d’inoculum appliqué à chaque boite en ml.
d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

La conformité de chaque échantillon selon la norme N°5214 de la conformité


d’analyse microbiologique de la viande hachée, est fonction du nombre de
colonies/g :

- si le nombre de colonies/g est ≤100 colonies/g, l’échantillon est conforme et


satisfaisant.
- si le nombre de colonies/g est compris entre 100 et 500 colonies/g, l’échantillon
est conforme et acceptable.
-si le nombre est >500 colonies/g, l’échantillon est non conforme.

44
En se basant sur cette norme nous pouvons dire que les échantillons E4 et E5
sont non conformes donc non consommables, par contre les échantillons E1, E2 et E3
sont acceptables tout en restant conformes et consommables.
3. Le Dénombrement des Anaérobies Sulfito-Réducteur
Dans les tubes de différents échantillons nous remarquons la présence des
colonies entourées d’un halo noir caractéristiques de bactérie d’anaérobie sufito
réducteur. Leur nombre est plus élevée, nous passons au dénombrement
correspondant à chaque dilution.

Colonie caractéristique d’anaérobie sulfito


réducteur

Figure 20 : Résultats d’ensemencement en profondeur des anaérobies sulfito-réducteur


sur le gélose TSC

Le tableau suivant montre le nombre des colonies correspondant à chaque


échantillon de la viande hachée :
Tableau VII : Nombre de colonies d’anaérobie sulfito-réducteur comptées dans chaque
boite

Echantillons
Anaérobie sulfito
réducteur E1 E2 E3 E4 E5

Dilution Dilution Dilution Dilution Dilution


Nombre des
colonies 10+1 10-1 10+1 10-1 10+1 10-1 10+1 10-1 10+1 10-1
comptées 7 1 8 2 22 8 6 0 40 18
Nombre des
colonies par 72 90 272 54 527
gramme
Conformité conforme conforme Non conforme Non conforme
conforme

Le passage du nombre de colonies comptées par boite au nombre de colonies


par gramme d’échantillon est déterminé selon la formule suivante :

45
=
,
Avec
N : nombre de microorganismes par g d’échantillon
Σ C : est la somme des colonies comptées sur la boite retenue de la première et la
deuxième dilution.
V : est le volume d’inoculum appliqué à chaque boite en ml.
d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

La conformité de chaque échantillon selon la norme N°5214 de la conformité


d’analyse microbiologique de la viande hachée est fonction du nombre de
colonies/g :
- si le nombre de colonies de bactérie/g est ≤10 colonies/g, l’échantillon est
conforme et satisfaisant.
- si le nombre de colonies de bactérie/g est compris entre 10 et 100 colonies/g,
l’échantillon est conforme et acceptable.
-si le nombre de colonies de bactérie est >100 colonies/g, l’échantillon est non
conforme.
Selon cette norme les échantillons E3 et E5 sont non conformes donc non
consommables, par contre les échantillons E1, E2 et E4 sont acceptables tout en
restant conformes et consommables.
Nos résultats des 5 échantillons révèle la présence des colonies bleues
verdâtres caractéristiques d’Escherichia coli. Il faut donc passer au comptage des
colonies correspondant à chaque boite, puis déterminer le nombre des colonies/g
d’échantillon de la viande hachée.
4. Le dénombrement d’Escherichia coli :
Colonie caractéristique d’Escherichia coli

Figure 21: Résultats de l’ensemencement en profondeur d’Escherichia coli sur TBX

46
Le tableau suivant montre le nombre des colonies caractéristique
d’Escherichia coli correspondant à chaque échantillon de la viande hachée :
Tableau VIII : Nombre de colonies d’Escherichia coli comptées dans chaque boite

A partir de tableau ci-dessus, on remarque que le nombre des colonies


caractéristiques d’Escherichia coli est très élevée dans les échantillons E3 et E5 par
rapport aux 3 autres (E1, E2 et E4).
Le passage de nombre de colonies comptées par boite au nombre de colonies
par gramme d’échantillon est déterminé selon la formule suivante :

=
,
Avec
N : nombre de microorganismes par g d’échantillon
Σ C : est la somme des colonies comptées sur la boite retenue de la première et la
deuxième dilution.
V : est le volume d’inoculum appliqué à chaque boite en ml.
d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

La conformité de chaque échantillon selon la norme N°5214 de la conformité


d’analyse microbiologique de la viande hachée, est en fonction du nombre de
colonies/g :
- si le nombre de colonies/g est ≤100 colonies/g, l’échantillon est conforme et
satisfaisant.
- si le nombre colonies/g est compris entre 100 et 500 colonies/g, l’échantillon est
conforme et acceptable.

47
-si le nombre de colonies de bactérie/g est >500 colonies/g, l’échantillon est non
conforme.
En se basant sur cette norme nous pouvons dire que les échantillons E3 et E5
sont non conformes donc non consommables, par contre les échantillons E1, E2 et E4
sont acceptables tout restant conformes et consommables.
5. Le dénombrement des flores mésophile aérobie totaux :
Dans les boites de différents échantillons on remarque la présence des
colonies de plusieurs formes et différents couleurs nous passons au dénombrement
de toutes les colonies présente dans chaque boite.

Toutes les colonies sont caractéristiques

Figure 22 : Résultats de l’ensemencement en profondeur de FMAT sur gélose PCA :

La détermination de nombre des colonies pour chaque échantillon de la viande


hachée nous permet de dresser le tableau suivant :
Tableau IX : Nombre de colonies FMAT comptées dans chaque boite

Le passage du nombre de colonies comptées par boite au nombre de colonies


par gramme d’échantillon est déterminé selon la formule suivante :

=
,

48
Avec
N : nombre de microorganismes par g d’échantillon
Σ C : est la somme des colonies comptées sur la boite retenue de la première et la
deuxième dilution.
V : est le volume d’inoculum appliqué à chaque boite en ml.
d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

La conformité de chaque échantillon selon la norme N°5214 de la conformité


d’analyse microbiologique de la viande hachée est fonction du nombre de
colonies/g :
- si le nombre colonies de bactérie/g est ≤5x105 colonies/g, l’échantillon est
conforme et satisfaisant.
- si le nombre de colonies de bactérie est compris entre 5x105 et 5x106 colonies/g,
l’échantillon est conforme et acceptable.
-si le nombre de colonies de bactérie est >5x106colonies/g, l’échantillon est non
conforme.
Selon cette norme tous les échantillons sont conformes et acceptables.
6. Résultats globale :
Pour juger le résultat global des 5 échantillons de la viande hachée achetées
de différents bouchers nous avons dressé le tableau suivant :
Tableau X : Récapitulation des résultats des 5 échantillons de la viande hachée.
Échantillons
E1 E2 E3 E4 E5
Bactérie
Salmonelle conforme Conforme conforme conforme conforme

Staphylocoque acceptable Acceptable acceptable Non Non


aureus conforme conforme
FMAT acceptable Acceptable acceptable acceptable acceptable
E. coli acceptable Acceptable Non acceptable Non
conforme conforme
Anaérobie acceptable Acceptable Non acceptable Non
Sulfito- conforme conforme
Réducteur
Conformité acceptable Acceptable Non Non Non
globale conforme conforme conforme

49
D’après ce tableau récapitulatif nous notons la non-conformité des
échantillons 3, 4, et 5 c’est-à-dire leur viande hachée est inconsommable et doit être
détruite, par contre les échantillons 1 et 2 sont conforme et leur viande hachée peut
être consommée sans risque.
Vue l’origine de contamination par les Staphylocoques aureus qui provoquent
les infections dermiques, il est recommandé au bouchers 4 et 5 de se faire soigner,
se laver les mains avant chaque contact de la viande hachée et porter les gants.
La contamination par Escherichia coli et Anaérobie sulfito-réducteur de
certains échantillons révèle surtout le manque d’hygiène et les mauvaises
conditions de conservation de la viande hachée.

50
Conclusion

À nos jours, dans le monde entier, la consommation de la viande hachée est en


croissance continue car elle est source de nutriments utiles pour le corps, de gout
appréciable et facile de préparation.
Néanmoins, elle est facilement détériorée par les microorganismes la rendant
impropre la consommation.
En effet les toxi-infections liées à la consommation de la viande hachée
contaminée par un plusieurs germes sont devenues très fréquentes à conséquences
sanitaires plus ou moins graves.
Actuellement la population avisée ou non à bien assimilé le fait que la viande
hachée est une denrée alimentaire qu’il faut bien conserver en frais et de
préférences la consommer bien cuite.
À l’échelle industrielle, la préparation de la viande hachée obéit au normes
strictes de production, conservation et stockage. Par contre chez les boucheries,
travaillant de façon artisanale et généralement sans aucune prise de conscience de
l’ampleur des dégâts des toxi-infections mortels. Par ailleurs, les conditions de
travail, l’exposition de marchandise à température ambiante font que la viande
hachée devient un milieu propice pour le développement bactérien.
À cet égard, les contrôles ou les inspections fréquente des services sanitaires
et les personnels de LRART sont d’une grande utilité pour assurer et garantir aux
clients des produits alimentaires exemples de toutes contaminations.
De notre travail, il découle que certains bouchers vendent quotidiennement
de la viande hachée non conforme car elle renferme un ou plusieurs germes à des
valeurs dépassant les normes autorisées.

51
Référence Bibliographique
1 - Organisation mondiale de la santé, 2015
2 - Delmas G et Coll, BEH, 2006
3 - Gerald Moy, Ewen C. D.Todd , Elsevier, 2014
4 - Daniel TOME, 2008
5 - Bronze, M.S., and Greenfield, R.A (Ed.). (2005)
6 – La norme N°5214 de la conformité d’analyse microbiologique.
7 – Heithoff DM, SHIMP WR, 2012
8 - Ryan, K. J., & Ray, C. G. (Eds.) (2004)
9 - Patrick Murray, ASM Press 2007
10 - CDC-Matthew J. Arduino, DRPH
11 - Flower VG, Allen KB JAMA 2013
12 - James B, Kaper Harry L, 2004
13 - Duncan A.J Carman R.J, Bacteriol .1993
14 - JP Euzéby, 2000
15 - Collins M.D Lawson P.A Bacteriol 1994
16 -Washinton JA, Baron’s medical microbiology, 1996
17- ISO/TS 11133-1 : Microbiologie des aliments-Lignes directrices pour la
préparation et la production des milieux de culture _ Partie 1 : lignes directrices
générales d'assurance qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
18 - ISO/TS 11133-2 : Microbiologie des aliments-Guide pour la préparation et la
production des milieux de culture _ Partie 2 : guide général pour les essais de
performance des milieux de culture.
19 - ISO 6887-1 Microbiologie des aliments-Guide pour la préparation de la
suspension mère
20 - ISO 4833 : Microbiologie des aliments-Méthode horizontale pour le
dénombrement des micro-organismes _ Technique par comptage des colonies à
30°C.
21 - ISO 6579 : Microbiologie des aliments – Méthode horizontale pour la
recherche des Salmonella spp.

52
22 - ISO 6888-1 : Microbiologie des aliments-Méthode horizontale pour le
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et
autres espèces) _ Partie 1 : Technique utilisant le milieu gélosé de Baird-Parker.

53
ANNEXE
Annexe I : Matériels utilisés pendant les manipulations
Tableau : Matériels utilisés pendant les différentes manipulations :

Appareillages Outillages Récipients


 Autoclave.  Boites de Pétri  Eau distillée stérile
 Bain-marie réglable 47 stériles de 90mm.  Eau distillée
°C et 100°C.  Flacons stériles.  Alcool à 70°
 Balance munie de  Etaleur.  Détergeant
plateau électrique.  Anses.  Milieu de culture
 Bec bunsen.  Tubes à essai. commercialisé sous
 Congélateur et  Tube à hémolyses forme déshydratée
réfrigérateur (pour la  Pipettes graduées (PCA, TBX, TSC, RVS,
conservation avant et de 1ml et 10ml. MKTTn, XLD, HEA,
après analyses.  Pipeteur BP)
 Dilumat (Appareil à  Portoirs pour tubes
dilution automatique). à essai.
 Etuve réglée à 30°C,
37°Cet à 44°C.
 Hotte à flux laminaires.
 pH-mètre.
 Plaque chauffante.
 Stomacher
(Homogénéiseur de
type péristaltique)
 Vortex

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Annexe II : Préparation de Milieux de culture
Tableau : Etapes de préparation des différents milieux de cultures

Autoc
Milieu de
Préparation du milieu lavag Contrôle de Qualité
Culture
e

Dissoudre 12,75 g du milieu EPT - Contrôle de la couleur.


EPT déshydraté dans 500 ml d’eau distillée et OUI - Contrôle de pH.
répartir dans des flacons. - Contrôle de stérilité.

Dissoudre 44,6 g du milieu MKTTn


déshydraté dans 500 ml d’eau distillée
froide. Bouillir le milieu puis refroidir
jusqu’à 48-50 °C et ajouter le contenu d’un
Bouillon - Contrôle de la couleur.
flacon supplément de Novobiocin MKTTn NON
MKTTn - Contrôle de pH.
Antimicrobic et 10 ml de solution d’iode.
Mélanger et distribuer 10 ml dans des
tubes stériles.

Dissoudre 13,4g du milieu RVS


déshydraté dans 500ml d’eau distillée
Bouillon réparti dans un flacon. Chauffer et porter - Contrôle de la couleur.
OUI
RVS à ébullition agitation jusqu’à dissolution - Contrôle de pH.
complète et distribuer 10 ml dans des
tubes stériles.
Dissoudre 18,5g du milieu BCC
déshydraté à 500ml d’eau distillée.
- Contrôle de la couleur.
Bouillon Chauffer et porter à ébullition jusqu’à
- Contrôle de pH.
BCC dissolution complète et répartir dans des OUI
tubes et autoclaver.
Dissoudre 11,75g du milieu PCA
déshydraté dans un flacon contenant 500 - Contrôle de la couleur.
Gélose
ml d’eau distillée stérile. Chauffer et OUI - Contrôle de pH.
PCA
porter à ébullition agitation jusqu’à - Contrôle de stérilité.
dissolution complète
Dissoudre 17,8g du milieu TBX
déshydraté dans 500ml de l’eau distillé,
en suite chauffer et porter à ébullition - Contrôle de la couleur.
Gélose
agitation jusqu’à dissolution complète, OUI - Contrôle de pH.
TBX
dernièrement refroidir le milieu à une - Contrôle de stérilité.
température comprise entre 44C° et 47C°.

Suspendre 21g du milieu TSC déshydraté


- Contrôle de la couleur.
Gélose dans un flacon contenant 500 ml d’eau
OUI - Contrôle de pH.
TSC distillée stérile. Chauffer et porter à
ébullition agitation jusqu’à dissolution

55
complète, Apres autoclavage refroidir le
milieu à une température comprise entre
44C° et 47C° puis ajouter le supplément
antimicrobien cyclosérine et verser 15ml
du milieu dans des tubes stériles.

Suspendre 27,5g du milieu XLD


déshydraté dans 500ml d’eau distillée
stérile. Chauffer et porter à ébullition
agitation jusqu’à dissolution complète. - Contrôle de la couleur.
Gélose
Refroidir le milieu à une température NON - Contrôle de pH.
XLD
comprise entre 44C° et 47C°. Verser dans - Contrôle de stérilité.
des boites de Pétri si tôt le milieu soit
froid.

Suspendre 38,3 g du milieu HEKTOEN


déshydraté dans 500 ml d’eau distillée.
Gélose Porter à ébullition sous agitation jusqu’à - Contrôle de la couleur.
HEKTOE dissolution complète. Refroidir à 45-50°C. NON - Contrôle de pH.
N Mélanger très bien et répartir le contenu - Contrôle de stérilité.
en boites de pétri stériles.

Suspendre 29 g du milieu Baird-Parker


déshydraté dans 500 ml d’eau distillée.
Chauffer et porter à ébullition jusqu’à
dissolution complète. On refroidit à 44-
Gélose 47°C et ajouter aseptiquement 50 ml du - Contrôle de la couleur.
Baird- supplément « Egg Tellurite Emulsion » OUI - Contrôle de pH.
Parker (jaune d’œuf au Tellurite). Mélanger et - Contrôle de stérilité.
répartir le contenu des flacons en boites
de Pétri stériles dans des conditions
d’asepsie.

(N.B : L’autoclavage est réalisé après la dissolution de milieu dans l’eau


distillée à une température de 121°C pendant 15min.)

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