Oecologia aquatica, 5: 7-1 9 .

1 98 1

El problema de la determ i nación de clorofila a en

el fitom icrobentos : discus ión sobre
la metodología *
MANUEL VARELA
Instituto Español de Oceanografía. Muelle de Animas s/n. Aptdo. 130. La Coruña

INTRODUCCióN l a-a a feofórb ido-a , a través de la

feofi tina-a o d e l a c l orofi l i da-a , según
Está demos trado que l os productos e l e squema s eñalado .
de degradac ión de la c l orofi l a represen­ La c l orofi l i da y sus formas oxi da­
tan en el bentos una fracc ión i mportante das presentan un espectro d e absorc ión
del total de p i gmentos verdes presentes . i déntico al de la c l orofi l a-a y , por
E stas formas degradadas o i nact i vas ab­ tanto , en l os anál i s i s espectrofotomé­
sorben l uz en l a parte roja del e spectro tricos e s tas c lorofilas degradadas s e
y e s ta abso.ción no es d i s t i ngu i b l e de valorarán c omo c lorofi la activa . Por
la de l as formas activas . Las técnicas otra parte , feo f i t i na y feofórb i do ( feo­
emp leadas para la determinac ión de p i g­ p i gmentos ) presentan un espectro l igera­
mentos deben por tanto tener en cuenta mente d i ferente al de la c l orofi l a acti­
esta c ircunstanc i a , porque de lo contra­ va . La ab sorc ión en l a parte roj a d e l
rio l o s resul tados obten i dos serí an poco espectro se desp laza de 665 a 6 6 7 nm
fiab l e s . y decrece aproximadamente en un 50 %
El e squema de la degradac ión de ( fi g . 1). S i n embargo , e s ta d i ferenc i a
la c l orofi l a-a es e l s iguiente ( YENTSCH ,
es t a n es casa que no perm i te u n a c l ara
1 967 ) :
d i st inc ión e ntre los p i gmentos , y por
-Mg -Fitol
Feofi tina-� -----.. tanto los feop i gmentos pueden i n terferir
........,
Clorofila-� -----.. � Feof6rbido-� . seriamente l as determinac iones especto­
Clorofilida-a
-ritol -Mg fotomé tricas de c lorofi la-a , ya que e s ­
t o s productos s e incluirán c omo s i casi
La p érdida del núcleo magnés i c o la mi tad de l a correspond i ente canti dad
y de l a c adena fito l degrada l a c l orofi- de c l orofi l a e s tuv i e s e p resente .
La c l orofi l a-a puede s e r trans for­
mada en feof i t i na-a y la c l orof i l i da
* t: ate trab aj o ha sido r�alizado con fondos
del programa cooperativo hispano-americano "IN­
en feofórb i do , ac i d i fi cando l os extrac­

VESTIGACIONES BIOLOGICAS DE LAS RIAS DE GALI-

tos de p i gmentos con ác i dos m inerales
CIA". nº de proyecto 0020. d i lu i dos . Parti endo de e s ta base , se
8 M A NUEL V A R E LA

han desarrollado procedimientos espec­ Tacla 1 - Eficiencia del metanol absoluto y

de la acetona al 90 % en la extracción de clo�

trofotométricos con los factores de co-
rofi1a-a, en diatomeas y cianofíceas (de HOLM-
rrección adecuados para permitir discri­
-HANSEN & RIEMANN, 1978).
minar entre clorofila-a (in c luyendo clo­

rofilida y formas oxidadas) y feopigmen­ GRUPO TIEMPO (h) p

g CLOROFILA-a/MUESTRA

tos (suma de feofitina y feofórbido) TAXONOMICO EXTRACCION ACETONA 900� METANOL

(LORENZEN , 1 9 67; TETT et al . , 1975).

Diatomeas 34,2!O,4 37,0 0,6
La cantidad de pigmentos puede así obte-
6 35,1!0,8
nerse indirectamente de la relación en-
12 36,2!0,7
tre las absorbancias antes y después
20 36,8!O,6
de la acidificación . Esta rel ación puede

variar desde un mínimo de 1 , en el caso Cianofíceas 28,6!0,2 34,1 0,4

de la existencia exc lusiva de feopigmen­ 6 29,4!0,4

12 29,8!0,8
tos , hasta un valor máximo si éstos se
20 30,O!O,5
encuentran ausentes.

ELECCIÓN DEL SOLVENTE un lado , y la estabilidad de l os pigmen­

tos en él durante los procesos de ex­

Los c riterios a tener en cuenta tracción y ac idificación , por otro .

para la elección de un sol vente están

basados en la capacidad extractora , por CAPACIDAD DE EXTRACCION

Los so lventes más amp liamente uti­

lizados son , tanto en oceanografía como

en limnología , el metanol absoluto y

la acetona al 90 %. Como extractor , e l

metanol es mucho más rápido y eficaz

que l a acetona , como puede verse en la

tabla r. Al cabo de una hora , la extrac­

ción fue c omp leta en metano l , pero in­

comp leta en el caso de l a a cetona . Des-

pués de 20 h las muestras de diatomeas

se aproximan al 100 % de extracción ,

600 650 700
LONGITUD DE ONDA
mientras que en cianofíceas son sólo

un 88 % comparadas con l as muestras de

Fig. l. Espectros de absorción de un extracto
metano l . Sin embargo , si l as muestras
de acetona al 100 % procedente del alga verde

Scenedesmus dimorphus, tratado con diferentes son trituradas y extraídas durante unas
concentraciones de ClH (MOED & HALLEGRAEFF, pocas horas , l os resultados son compara-
1978) . bIes en ambos solventes . Por tanto ,
Fig. l. Abso:-tior. spectra of 100 % acetone ex-:ract
cuando se emp lea acetona , si se desea
of the green alga Scenedesmus dimorphus, treated
una extrac ción completa , l as muestras
with successively increasing molarity of C1H

(MOEr & HALLEGRAEFF, 1978). deben triturarse o bien extraerse duran-

DETE R M I N ACI Ó N DE C LOROF I LA a EN EL F I TOM I C R O B E NTOS 9

te al menos 24 h , aunque en es te caso influenc ia en el espectro d e d i s t intas

l a extracc ión no sea comp l e ta en algunos concentrac iones de ác i do . Si l a mo l ari-
grupos , especialmente c l orofíceas y c ia­ dad final del ác i do se mant i ene por de­
nofíceas . Como se comprobará posterior­ baj o de c i ertos valores , l a degradac ión
mente , la acetona presenta duran te l o s de l a c lorofi l a-a a feofi ti na-a provoca
procesos de ac i d i ficac i ón numerosas ven­ e l desplazami ento del máximo de absor­
taj as comparada c on el me tano l , hac i endo c ión , en la parte roj a de l espectro ,
que su uso sea prefer i b l e a l de éste . de 665 a 667 nm . Un incremento en l a
Además , dado que l as di atomeas cons t i tu­ concentrac ión de ác i do origina u n corri­
yen en general el grupo más abundante m i ento del máximo a 6 57 nm . Por l a ob-
del fi tomi crobentos , el empl e o de ac e to­ servac ión de la figura , resu l ta evidente
na no conduce a grandes s ubestimac i ones que l a apl icación de baj as c oncentrac io­
de la can t i dad de c l orofi la . I nc luso nes de ác i do , j unto con cortos ti empos
en el caso de la presenc ia de organi smos de reacc ión , es i nsufi c i ente para as egu­
en los que l a extracc ión sea i ncomp l eta rar la c onvers ión de toda la c l orofi l a
con acetona , puede i ncrementarse l a e f i ­
cac i a de é s ta , hasta e l n ivel de l a d e l
me tano l , u t i l izando u n a mezc l a de d ime­
Tabla I I - Comparac i ón d e l a eficac ia extracto­
t i l su l fóxi do ( DMSO ) y acetona a partes
ra de acetona al 90 % Y dimet ilsu l fóxido ( DMSO
iguales ( V/v ) ( tab la 11) . Por otra par­ + acetona 90 %, v/v ) ( de SHOAF & L I UM , 1976 ) .
te , el DMSO ro mod i fica el e spectro de
mg/ l
absorción de L c l orofi l a-a .
..

GRUPO TAXONOMICO EXTRACTOR CLOROFILA-a

ESTABILIDAD DE LOS PIGMENTOS Diatomeas

EN DISTINTOS SOLVENTES
Nitzschia sp . DMSO 1 , 32
Como ya se ha señal ado , el camb io Acetona 1 , 31

en la absorbanc i a de una so luc ión de Clclotella sp . DMSO 0 , 86

p igmentos después de la a c i d i fi cac ión , Ac etona 0 , 86

es la base de los mé todos espec trofoto­

C1orofíceas
métricos para la e s t i mac ión de c l orofi la
Chlore lla pyrenoidosa DMSO 2 , 66
en presenc ia de feofi t ina. Los mé todos
Acetona 0 , 64
e s tán basados en la supos i c ión de que Selenastrum caEricornutum DMSO 1 , 18
el coefi c i ente de absorc ión de l a feofi- Acetona 0 , 02

tina , próxi mo a 665 nm , no varía con Ankistrodesmus braunii DMSO 1 , 05

Acetona 0 , 21
la ac idi ficac i ón . Esta supos ic ión es
s in embargo incorrecta , y el coefici ente
C i anofíceas
de absorc ión puede vari ar ampl i amente Anaclst i s nidulans DMSO 0 , 40
dependi endo del ti po de s o l vente , su Acetona 0 , 40

contenido en agua y la molaridad d e l Anabaena flos-aquae DMSO 2 , 45

ác ido en el extracto y por tanto d e l Acetona 2 , 45

Freml e l la diplosiphon DMSO 3 , 28
pH .
Acetona 3 , 16
La figura 1 mues tra c l aramente l a
10 MANUEl VARELA

presente en feof i tina , y en e s te caso l l ega� a inc rementar de forma consi dera­
s e obtendr ían valores de feofi tina muy ble la absorc ión de fondo , uti l izada.
e l evados , y valores de la r e l ac ión entre p ara c orreg i r la turbidez de la s olu­
las absorbanc ias antes y después de l a c ión , introduc iendo de e sta forma nuevos
ac i d i ficac i ón (R) muy baj os . De otro errores en el cálculo de p i gmentos . E ste
l ado , una fuerte ac i d i f i c ac ión hace que incremento de la absorc ión a 750 nm s e
el p i co de absorc ión se d e s p l ace de 667 debe a la e s c i s ión de la fucoxant ina
a 657 nm. E sto se debe ( USACHEVA , 1 971 ) en productos de tipo furano ( fig . 2).
a la exi stenc ia de un equi l ibr i o , depen­ E l empteo de me tanol c omo s o l vente
d i el,te del pH , en tre la forma neutra presenta prob lemas seme j antes al de l a
de l a feofitina , su monocatión y su d i ­ ace tona , con desp l azami entos de l o s má­
catión. L a apar i c ión d e l p i co de absor­ xi mos de absorc ión hac ia l ongi tudes de
c i ón a 6:;7 nm sería indi cativa de l a onda menores de la es perada ( fi g . 3 ) .
formac ión de dicationes de feo f i t ina- E sta reacc ión es mucho más ráp ida
a . En aque l l os casos en que e s tas trans­ en me tanol acuoso que en acetona acuosa .
formac i ones no hayan s i do detectadas , La tran.s formac ión de monoca " i ones de
es to llevaría a 1& obtenc ión de valores feo fitina en sus respecti vos d i cationes
de feop igmentos muy baj os , i nc luso nega­ t i ene lugar a un pH < 2 en me tanol acuo­
t i vos , y v a l ores de n al t�s . Una concen­ s o y s ó l o a pH < 0,5 en ac e tona acuosa .
trac ión de ác i do e l evada puede i nc l uso E ste desplazam i ento del espec tro es c om-

,
<t Fucoxantlna
U
Z ''''' -.
<t �� o"

al
a:: ..... , ............
O
(/)
al
<1:

450 500 550 600 650 700

LONGITUD DE ONDA

F i g . 2 . Espectros de absorción de la fucoxant i na antes

(---) y después (---) de s er ac idi ficado
-2
el extracto (100 % de acetona ) hasta una molaridad fi nal de ClH de 4 , 4 XlO M ( MOED & HALLEGRA EFY,
1978) .

F"ig. 2. A bsortion spectra of fucoxantin befare ( -) and after (----) acidification with Clli. Final molar"ity

of the acid. (MOED & III1L['F.CRAEF"F. 1978).

-2
4. 4XIO M
 DF.TERMI NACI 6N DE CLOROFILA '8 EN EL FITOMICROBENTOS 11

pres ente formac ión de dicat i ones . HOLM­

-HANSEN & RIEMANN ( 1 978 ) acons e j an el

anles acidificar
/' (664) emp l eo d e 2 5 m g d e C0 Mg p o r m l d e ex­
3
tracto , para una conc entrac ión fi nal
-3
de ác ido 3x10 M , con un t i empo de reac­

c i ón de 1 0 m i nutos y ag itac ión suave .

ot(
ü
z MEDIDAS DEL pH ANTES Y DESPU�S
""
m DE LA ACIDI FICACIÚN
a:
O
12 MOE D & HALLEGHAEFF ( 1 978 ) han l l e-
""
vado a c abo un c omp l eto e s tudia ac erca

600 650 700 de la influenc i a del pH del e xtracto

LONGITUD DE ONDA (nml en la absorbanc i a de los p i gmentos , que
'
Fig. 3. Espectros de absorc ión de pigmentos permite exp l i c ar de forma c l ara numero­
extraídos en metanol de un cultivo de Dunalie­ sos prob l emas que p l antea la a c i d i f i c a­
lla tertiolecta ( HOLM-HANSEN & RIEMANN , 1978 ) .
c i ón , en un i ntento de c aracterizar l as
3. spectra _f pigments extracted
Fig. Absortion
cond i c i ones ópt imas de l a m i sma en r e l a­
in methanol from a culture of Dunaliella tertiolecta

(HOLM-HANSEN & RIEMANN,

c i ón con l a mo l ari dad fina l d e l á c i do .
1978).

En e ste se ntido , la de term inac ión del

pH en l o s extractos parece s e r un c r i te­

p l etamente revers i b l e m e d i ante neutral i ­ rio más adecuado que el cálculo de la

zac ión c on CI Mg , l o c u a l i n d i c a l a molari dad del ácido puesto que aqu é l

3
e x i stenc i a d e u n c amb io fís i c o más que no d epende ú n i c amente de la c anti dad

de uno quí m i co de transformac ión en feo­ de á c i do añad i do s i no tamb i é n del con-

fórb i do . tenido en agua del s o l vente . De todas
E stos cambios e sp e c tral e s de la formas l as m e d i daS de pH en s o l ventes

feofi tina en r e l ac ión c on el pH , h an acuosos orgán i cos debe r í an ser interpre­

s i do s eñal ados p ara metanol al 80 , 90 , tadas c on grandes precauc iones , ya que
95 Y 1 00 % ( LIVINGSTONE et al . , 1 9�3 ; e l concepto d e pH h a s i do d e fi n i do úni­
MARKER , 1 97 2 ) Y 100 % de ac etona ( MOED c amente en r e lac i ón c on el agua como
& HALLE GRAEFF , 1 9 78 ) , Y no fueron d e - s o l vente .
te ctados e n ac etona a l 80 , 90 Y 95 % . La ad i c i ón de in� luso p e queñas can­
E sto e s d ebi do a que e n acetona acuosa t i dades de CIH d i l u i do a s o l Ventes orgá­
es necesario a l c anzar un pH tan baj o n i cos c on un bajo c onte n i do en agua
c omo 0 , 5 p ara que c om i ence la formac ión (" 5 %) hace desc ender el pH , en s ó l o
de d i c ati one s de fe ofit ina , m i entras un m i nuto , a val ores compr endi dos entre
que en metanol acuoso e sta transforma­ 0,5 y 2,0; m i entras que la m i sma cant i­
c i ón t i ene l ugar ya a un p H de 2 . Por dad de á c ido en s o l ventes c on un mayor

tanto , cuando se emp l e e el me tano l como c onten ido en agua ( 1 0-20 % ) , da 1 ugar

b J l ven te , despué s de la a c i d i ficac ión a valores de pH que o s c i l an entre 2,5

es necesario neutral izar el extracto Y 3, dependi endo de la natural eza del

h asta un n iv e l de pH en el cual no se s o l vente ( fi g . 4). El c onsumo d e á c i do

12 M A N U E L VA R E LA

e s , pues , mayor cuanto mayor s e a l a c an- ficándose de forma muy l e nta y siendo

tidad d e agua , y e s sup erior en met ano l mucho más rápida a un pH c omprendido,

que en ac etona p ara ·la misma c antidad entre 1 y 1,5.

d e agua. E n so luciones acuosas d e m eta­ Dado que el pH final d e l extracto

nol y a c etona la c omp l eta d egr adación no es únicamente función d e la mo l aridad

de c l orofi l a en fe ofi tin a ti ene lugar d el ácido sino del c onte nido en agua

a un pH c omprendido entre 2 , 6 y 2 , 8 . del mismo. los cálcu l o s d e l pH d e l e x­

L a rotura d e l a fucox antina e n furanos tracto. a p artir de la c on c e ntración

y el incremento sub sigui ente de la ab­ del ácido en' e l mismo, no c orre sponden

sorción a 750 nm es d e p endiente del a l valor real. Por e sta razón. aun cuan­

tiempo y comienza a un pH � 2-2,5, veri- do teóric amente' una c on c e ntración de

3
ácido en e 1 extracto e ntre 2 y 3xl0-:-

daría e l rango de pH s eñ a l a do c omo idó­

neo ( 2 ,6-2.8 ) , en la práctica e sto no

es cierto. La figura 4 representa la

disminución del pH e n r e l ación c on la

c antidad de ácido añadido a distintos

so lventes c o n diferentes c o n c entraciones

de agua. A p artir d e la misma s e puede

d e ducir el vo lumen de ácido a añadir

a distintos volúmenes de e xtracto . Mu-

chos autores acidifican directamente
en la cubeta del e s p e ctrofotómetro aun­
10 15
n' gotas que s ería pr eferib l e utilizar e xtractos

Metanol

095 'l.
� de mayor vo l umen c on

añadir c antidades e xactas d e ácido . Ade­

objeto de p o der

6 • 80 'l. más. d ado que numerosos investigadores

usan a c etona, metano l e i n c luso etanol

4 c on variadas c o nc entraciones de agua.

3 s ería c o nveniente que. en c ada c aso ,

se e stab l eciese e l vo lumen d e ácido re-

querido p ara a l c anzar el pH s eñal ado:

2.6-2.8 .
5 10 15
n' gotas

Fig. 4. Variac i ón del pH en re lación con la

CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN
cantidad de ácido ( CIH 0 .4 M ) añadido a 2 5 mI
DE PIG MENTOS
de d iferentes extractos de acetona y metanol
con dist intas, concantrac iones de agua ( M OED
Una vez obtenidos los e xtractos
& HALLEGRAEFF. 1978 ) .
en a c etona del 90 %. l as l e cturas se
Fig. 4. Effect of the addition of an increasing
realizan en e l e sp e c �rofotómetro a 665
amount of acid (0,4 � C1H) 0:1 t he pH of extracts

(2'; r.11 ) of
n m , antes y d e spués d e l a a cidificación
acetone ano methanol with different

water conten';;s (MOEO & HALLEGRAEFF, 1978). con CIH , c orregidas por la l e ctura a
DETER M I N A C I Ó N DE CLOROFILA a EN EL FITO M I CROB ENTOS 13

7 50 nm y c on l as p recauc iones anter ior­ inc onven iente , espec i a l mente en mues tras

mente s eñal adas e n r e l ac i ón c on l a c an- bentón i c as , en donde e s tos productos

t i dad de ác ido añad i do . de degradac ión pueden r epresentar un

E l c á l c u l o de l a c oncen trac i ón de e l evado porc entaj e de la c an t i dad t o tal

c l orofi l a-a s e o bt i ene a p ar t i r de l as de p i gmentos . Por o t ra p arte , si la c l o­

s i gu i entes ecuac iones ( L O�SNZEN , 1967): rofi l a- b e s tá presen te , se o bti ene un

valor de feofi t i na-a muy al to , ya que

2
Clorofila'a (mg/m ) AxKx(6650-665a)xvxl0 el e spec tro de a bsorc i ón de l a feo fi t i na
LxS
-a y de la feo f i t ina- b en l o s ext ractos
2
Feofitina a (mg/m )= AxKx(Rx665a-6650)xvxl0
ac i d i fi cados �s muy s eme j ante ( fi g . 5).
LxS
J EF F R EY (1974) c omenta e s tas l i m i tac io-

(A, c oe f i c i ente de absorc ión d� l a c l o­ nes y s eñala que c ua l q u i e r mé todo que

rofi l a a = 1 1 , 0; ,K , fac tor para i gual ar no i mp l i que la s eparac ión f í s i ca de l o s

la r e duc c i ón en la a bsorbanc i a a la c on­ p i gmentos porporc iona resul tados poco

centrac ión i n i c ial de c l orof i l a = 2 , 43 ; prec i sos y e s t á comprome t i do por l a pre­

6 6 50 , a bs o r ban c i a ant e s d e l a ac i d i fi ca­ s enc i a de p roductos de degradac ión nue­

c i ón , c orregida; 6 6 5a , a bsorbanc i a des­ vos , r e s u l tantes de la a c i d i fi c ac i ón

pués de la ac i d i fi c ación , corregi da; de l as mues tras . Es te autor p ropone l a

v, v o l umen de extracto acetónico en m i; u t i l i zac i ón de técni cas de cromatografí a

2 en c apa f i na , l as cuales p ermi ten la
10 , fac tor de c onvers ión a m ; L , l ong i ­

tud d e p a s o d ' l a c ube ta e n c m ; S , s u ­ se parac i ón de l as formas principales

2 de c l orofi l a ( a , b y c ) y c aroteno i des ,
perfi c i e de l a mue s t ra , en :m ; R , máxi­

ma r e l ac i ón de 6 6 50 / 6 6 5a en ausenc i a as í c omo feof i t inas , feofórbi dos y c l o­

de feop igmentos = 1,7). rofi l i das . S i n e m bargo , en l a e s t imac ión

de la bi omasa de la m i c rofl ora bentóni­

ca , en l a que e l p robl ema de l a patchi­

LIMITACIONES DE LOS M�TODOS ness ex ige la toma d e numerosas mues­

NORMALMENTE UTILIZADOS
t ras son quizá p r e fe r i bl e s a aqué l l os

más exactos p ero l entos .

Los mé todos e spec trofotométr i c os
empl eados p ara la de terminac i ón de p i g­

mentos , tal c omo e l d e s c r i t o anteri or­ U N A APROXIM ACIÓN AL PROBLEMA

mente ( LO R ENZ EN , 1967) u o tros s i m i l ares
( HOLM-HANS EN & R IEMANN , 1978; T ETT et El emp l eo de t é c n i cas de s eparac ión
a l . , 1975), a s í c omo los de fl uore s c en­ de fase es s uge r i do por J EF F R EY (1974)
cia ( YENTSCH & M EN Z EL , 1 963; HOLM­ c omo una opc ión p ara m e j orar la m e todo­
-HANS EN e t al . , 196 5 ) , p roporc ionan e s­ l og í a normalmente u t i l i zada . WH ITNEY
t i mac iones poco vál i das ya que la m e d i da & DARL EY (1979) de sarro l l an en e s te sen-
de c lorofi l a-a c orre sponde a la s uma t i do un proc e d i m i ento p ara la determ i na­
de c lorofi l a-a y c l oro fi l i da-a y la de c i ón prec i s a de c l oro f i l a-a en mues tras
feofi t i na-a a la s uma de feofi t i na-a que c onti enen grandes c an t i dades de p ro­
y feofórbi do-a . Es to supone un serio ductos de degradac ión. La p ar t i c ión c on
14 M A N U E L VA R E LA

hexano de un e x trac to acetón i co da l ugar nes de LOREN Z EN ( 1 967 ) . Dado que e s te

a un s i s tema de dos fases . La h i perfase proc e d i m i ento s upone una i mportante m e - ,

c on t i ene los c arotenos , c l orof i l as a j ora en la m e todolog í a , es más s i mple

y b Y feofi t i nas a y b, d e b i do a que y ráp i do que l as t é c n i c as c romatográfi­

e s tos c omponentes r e t i enen la c adena c as en uso , y no requi ere e qu i p o e spe­

no p o l ar ( f i tol ) . La h i pofase c o n t i ene c i al , s e rá de s c r i to en deta l l e .

la c l oro f i l a- c , parte de c arotenos y La p ar t i c i ón c on h exano es c omo

l os p roductos de degradac ión de l a c l o­ s igue : 10 ml de un e x trac to a c e tó n i c o

ro f i l a que c arecen del grupo f i tol , c l o­ ( 90 % de acetona ) se añaden a 3 , 5 m l

rofi l i das a y b Y feofórb i dos a y b. de C 1Na al 0 , 0 5% Y 1 3 , 5 ml de h exano

De e s ta forma , l a p art i c i ón c on hexano ( de grado espec t roscóp i c o , rango de ebu­

s e para l as formas d egradadas de la c l o­ l l i c i ón : 6 8 , 0-6 8 , 8 ) en un e mbudo de de­

ro f i l a a c t i va . La c l oro f i l a a puede en­ c antac i ón de 60 m l . El e mbudo es agi tado

tonc es ser c a l cu l ada en l a c apa d e h e ­ fuertemente durante 5 m i nutos en una

xano , en p res enc i a de f e o f i t i na-a por agi tadora r e c í p roca a 60 v i brac i ones

u n a li gera mod i f i c ac i ón d e l as e cuac io- por m i nuto , p ara a l c anzar una máx i ma

A B

Clorofila a
(665)

Clorofila b
(655)

ct
_Feofitina b
()
z ( 653)
ct
Feofitina a al
(655)
a::
O
en
al
ct

600 650 700 600 650 700

LONGITUD DE ONDA

Fig. 5. Espectros de absorción de las clorofilas a y b Y feofitinas a y b en metanol. Acidifica­

2
ción hasta una molaridad de 3X10- M (HOLM-HANSEN & RIEMANN, 1978).

Fig. 5. Absortion spectra for chlorophylls a and b and phaeophytins a and b in methanol. Molarity 01' thc

acid in the extract. 3Xl0-2M (HOLM-IIANSEN &. RIEMANN. 1978).

DHERMINACION DE CLOROFILA. EN EL FITOMICROBENTOS 15

s eparac i ón. Después de e l i m inar l a h i po­ c omp l eta ( 100 , 3 �0 , 8%), de acuerdo con

fase acetón i c a , dos a l í cuotas de la hi­ las d etermi nac iones de la absorbanc i a

perfase , de 5 ml c ada una , se re c ogen de l a c l orofi l a remanente en l a h i po fase

en v i ales d� v i dr i o d e 20 mI d e c apac i­ ac etónica . Aunque la presenc i a de ex­

dad . Una go�á�de l CIH a l 50 % s e aftade tracto de s e d i mento interfiere a l go la

a unó d e l o �'v i a l e s agitándose a c ont i ­ transparenc ia , e s te p ro b l ema s e r e duce

nuac ióD- para c onvertir la c l orofi l a en en gran p arte agi tando los sol ventes

feo f i t i na . Aproximadamente 0,5 g de durante 5 mi nutos .

SO 4 N� anh i dro se aftade a c ada v i a l c on Us ando feofitina-a obten i da por

objeto de s e car e l hexano . Las abs orb an­ ac i d i fi c ac ión y neutral izac ión d e c l o­

c i as de las dos s o l uc iones de he xano rofi l a-a pura , se ve que su e s p e c tro

se m i d en c o ntra un b l anco d e he xano a de absorc i ón no var í a c on el pH ( MARKE R ,

663 y 750 nm en un e spe c trofotómetro . 1 977 ) en hexano . Los valores de R próx i ­
La c onc entrac ión de c l orof i l a-a puede mos a l,O de muestras fe c a l e s apoyan
entonc es ser c a l cu l ada a partir de l as e sta c onc l u s i ó n ( tab l a 1 1 1 ). La r e l ac i ón
ec uac iones de LORENZEN ( 1 9 67 ) , adaptán- de l as absorb anc i as antes y d e s pu é s de
do l as a l as mue stras de hexano . la a c i d i f i c ac i ón , R, var í a s i gn i f i c ati­

vamente con p e queftos c amb ios en la l on­

2
Clorofila a (mg/m ) = AxKx ( 6630-663a ) xVxvxl0 gitud de onda para ambos s o l ventes , pe ro
LxS
de manera especial en l os e xtractos d e
2
Feofi tina a (mg/m )= AxKx( Rx663a-6630) xVxvxl0
hexano ( f ig . 6) . E l grado d e hexano em­
LxS
p l eado a fe c ta tamb ién a e s ta re l ac ión .
( A , c o e fi c i ente de absorc i ón de la c l o­ Por es to es nece sario c a l ibrar c u i d ado-
rofi l a-a en hexano = 1 1 , 05 ; K, factor s amente el e s pectrofotómetro ut i l izado ,
para i gua l ar la reducc ión en la ab sor­ determinando la l ongitud de onda a la
banc i a a la c oncentrac ión inic ial de cual s e obti ene e l máxi mo d e absorc ión ,
c l orofi l a = 1 , 82 ; 6630 , abs orbanc i a d e l o b i en estab l e c i endo e l valor de R p ara
extracto o r i ginal c orregi da ; 663a , ab­ el aparato , u s ando c l orofi l a pur i f icada
sorbanc i a del extracto ac i d i fi c ado ; V, por cromatograf í a .
factor de c o rrecc ión p ara l a d i fere nc i a Los p ares de mue stras anal izadas
de v o l umen entre l as capas de he xano por ambos métodos , acetona y h e xano ,
y ac etona 1 , 6 ; v , vo l umen del extracto son c omparab l e s , ya que proc eden de l a
ac etón i c oo r i ginal en ml ; 10 , factor m i sma s o luc ión de ac etona . Los v a l ores
2
de c onvers ión a m L, l ongitud de p aso obten i dos p ara c l orofi l a-a y feofitina-a
de cubeta en c m ; S , s up e rfi c i e de l a pura s on igua l e s . Para muestras c on
2
muestra en cm ; R , r e l ac i ón 6630/663a productos de degradac ión , el hexano pro­
para c l orofi l a-a pura = 2 , 23 ) . porc iona v a l or e s de c l orofi l a-a más ba­
La transferen c i a de c l orofi l a-a jos . Las c l orofi l id as son reteni das en
a la c apa de he xano es i ndepend i ente la h i pofase ac etón ica durante l a p art i ­

d� la concentración de c lorofila-a en ci ón y p or t anto no son medidas como

el rango e s tudi ado p o r l o s autores ( has­ p igmento activo . E s tas d i fer enc ias en

ta 3 mg/ l de ac etona ) y es prácti c amente porc entaj e de p i gmento activo pued en

16 MANUEL VARElA

Tabla III - Comparación de las cantidades de clorofila-a y feofitina-a obtenidas por los

métodos de acetona y hexano, en varios tipos de muestras. Concentraciones en mg de pigmento

por litro de extl'acto acetónico (de WIUTNEY & DARI.EY, 1979).

Acetona Hexano

R R

6640: 664a Cla feofitina 6630: 663a C1a feofitina

Clorofila-ª pura 1,802 23,896 0,002 2,227 23,898 0,009

Cllindrotheca fusiformis (cultivo)I,768 37,893 1,138 2,105 34,083 7,139

Fitoplancton 1,569 5,400 2,215 1,798 3,592 1,926

Fango 1 , 5 44 9,583 4,548 1,711 7,648 5,547

Heces 1,054 0,525 7,270 1,057 0,200 4,085

Feofitina pura 1 , 02 1 0,1 2 8 4,6 51 1,050 0, 1 64 3,958

s er de hasta e l 62 % (tab la IV) . Incluso

en la fa s e logarítmica de cultivo de

Cylindrotheca fusiformis, el por c entaj e

de productos degradados de la c l orofila­

Tabla IV - Comparación de los valores de cloro­
-a puede a l canzar e l lO % (tabla 111). fila-a y feopigmentos obtenidos por los métodos

de acetona y hexano. En el caso de la clorofi­

la, los porcentajes corresponden a la relación

entre los valores de hexano y acetona, conside-

'

150
rando que los primeros representan la forma

~
140
activa del pigmento los segundos el total

(activa + degradada = clorofila + clorofílida).

130
En el caso de los feopigmentos, los porcentajes
120
expresan la relación entre los valores obteni­
�
oC
Ü 110 ----Q -- - dos por uno y otro método.
-- - -Q Las muestras señala­
- ---
---
0_____
! 100 das con un * representan cantidades de feopig-.
-
-ºo----_ --: ACETONA
0-- _
--

� 90 -
•
• _ _ -'
(1---
mentos más elevados en acetona que en hexano.

80
Muestras procedentes de la ría de Arosa (VARELA
--
& PENAS , en preparación). N, número de mues­
70
a: HEXANO
•
tra .

� 60 "
1t'

-3 -2 -1
% Cl-a activa

rvn 01 ofSVI"'CION DE l'" _, DE ... aSO ..... NCI ... M"XIM4

Clorofila-a FEOPI GMENTOS
2 2
(mg/m ) (m g/m )
Fig. S. Variación del valor de R (relación de
%
y
N acetona hexano acetona hexano %
las abso!"bancias a 663 nro antes df'spués de

aCidi!'icar) con la longitud de onda para la

373 , 8 198,4 53 285,1 348 , 5 122
clorofila-a pura, en acetona al 90 % Y hexano.
2 2 57,3 133,1 51 30 1, 7 399 , 8 1 32
(WHITNEY & DARLE Y , 1979). 3 377,8 217 , 7 58 283 , 2 453 , 7 160

Fig, 6, Dependence af befare-ta-after acidificatian

' 4 133,4 52 , 3 39 365,8 628,5 171

rat;ic, E. wavelength faI' pure chlaI'aphyl1-a 5 203,0 1 18 , 5 58 225,9 210,1 *107

9:': % a ce 't ane anó hexane (WHITNEY & DARLEY, 6 245,2 123,4 50 226,7 204 , 9 *110
1979) ,
D ETE R M I NACI Ó N DE C LOROF I LA a EN EL F I TOM I C R O B E NTOS 17

Las d i ferenc ias entre las c oncen- feofi t i n i zac ión . Además , MOED & HALLE­

t rac iones de feof i t i na no s on c ons i s ten- GRAEFF ( 1 978 ) s eñ a l an que nunca l o s va­

tes ; en a l gunos c asos e l mé todo d e l he­ l ores de pH d e l e x trac to s on tan b a j o s

xano :p ropopc iona una mayor c an t i dad de c omo p ara p e rm i t i r l a más m í ni ma feofi­

feofi tina . ��� �l de a c e tona ( tab l as 111 ti n i zac ión . D e sde e s t e p unto de v i sta ,

y IV ) . E � , el c aso de mues tras de s e d i ­ por tanto , l a ap l i c a c i ón de C0 Mg s e r í a

3
mentos :p rocedentes de l a ría de Aro sa innec esaria y s ó l o d e b e r í a s e r empl eado

( VARELA' & P ENAS , en p re p arac ión ) , el en c ondic iones de a c i dez de mues tras

hexano proporc ionó e n l a mayoría d e l os procedentes de c uerpos de agua o s e d i ­

c asos valores más e l evados que la a c e to­ mentos á c i do s .

na ( tab l a IV) , en o c a s i one s hasta un Pero e l u s o de C0 Mg p l antea además

3
170 % mayores . E s to r e su l t a probab l emen­ o tro grave p rob l ema , c omo es su te nden­

te d e la d i ferenc ia en el n i ve l de feo- c i a a absorb e r canti dades s i gn i fi c a t i v as

fórb i do en l as mues tras ( WH I TNEY & D AR­ de c l orofi l i das y feofórb i dos . Por todo

LEY , 1 979 ) o de a l gún t i po de i nterfe- e l l o , el emp l eo de C0 Mg es d e s aconsej a­

3
renc ia no c onoc i da , pues to que l a aceto­ do , m i en tras no se presente una a l terna­

na d e b e r í a p ropo r c i onar v a l ores de feo­ t i va adecuada .

p i gme ntos más e l evados que el h exano ,

pues en é s t e l os feofórb i dos son e l im i ­

nados en l a h i p ofase acetón i c a durante CONCLU SIONES

la p ar t i c ión y no son med i dos como feo­

fi t i na . Aunque la i n formación e x i s tente

acerca d e la d e t erminac ión d e p i gmentos

en mues tras con gran c an t i dad de produc­

EL USO DE C03Mg D U R ANTE EL PROCESO
DE EXTRACCI'ÓN tos de degradac ión , c omo son l as proce­

dentes del b e ntos , y que e x i gen la ac i­

El C0 Mg es amp l i amente u t i l izado d i fi cac ión de l o s extrac tos p ara d i s t i n­

3
durante la extracc ión de p i gmentos en gu ir l as formas a c t i vas de l as degrada­
fi top l ancton , macrófi tos y fi tomi croben­ d as es abundante , numerosos autores s i ­
tos , p ara p r � ven i r la a c i d i ficac ión de guen anal izando sus muestras sin l as
los e x tractos . Sin emb argo , su emp l e o debi das precauc i ones , lo cual hace que
es d i scut i do p o r HOLM-HANSEN & R I E MANN l o s resul tados ob teni dos s ean poco f i a­
( 1 978 ) , qui enes encuentran poca o n i ngu­ b l e s y en o c as iones d i fí c i lmente c ompa­
na d i ferenc i a entre mue s t ras de fi to­ rab l e s . E s tá c l aro que es prec i s a una
p l anc ton c on y s in t ra tamiento c on puesta ·a punto d e la m e todo l og í a y una
C0 Mg . Por o t ra parte , su u s o en mues­ e s tandar izac ión de la m i sma . En e s te
3
tras d e s t inadas al e s tu d i o de p i gmentos sent i do s e proponen l os s i gu i entes pun­
por l o s mé t odos d e a c i d i f i c ac ión d e s c r i ­ tos :
tos puede c ausar serios probl emas , ya 1 ) E l emp l e o de ace tona c on un c on­

que h a c e que los valores de pH s ub s i ­ tenido en agua d e l 10 al 20 % es aconse­

gu i entes a l a a c i d i f i c ac i ón s e an mayores j ab l e sobre o t ros s o lventes , por propor­
que l os r e qu e r i dos p ara una c omp l e ta c i onar una mayor e s tab i l i dad a l o s p ig-
18 M A N U E L VA R E LA

mentos durante l o s pr ocesos d e a c i d i f i - p l e a me tano l c omo s o l ve n te , e l e x trac to

c ac i ón , aunque su c apac i dad e x t rac tora debe n e u tra l i zarse c on C 0 Mg .

3
s e a i n fe r i o r a l a del me tan ol . 4 ) E l mé todo d e l hexano se p r e sen­

2) La t r i turac i ón , s on i c a c i ón o ta c omo una a l terna t i v a a d e cuada por

el emp l e o de DMSO c on a c e tona acuo s a , reun i r e f i c ac i a y rap i d e z e n la d e termi­

p e rm i ten u n a e f i cac i a y una rap i d e z e n nac i ó n de c l or o f i l a- a ac t i v a . El uso

l a e x trac c i ón c omparab l e a l a d e l me ta­ conj unto del mé todo t r ad i c i onal de ace-

nol . tona y el del hexano p e rm i te c o nocer

3) La a c i d i f i cac ión de l o s ex trac- l a c an t i dad ° d e p roduc tos d e d egradac i ón

tos debe p e rm i t i r a l canzar un p H f i nal e x i s tente en l as muest ras .

c omp rend ido e n tre 2 , 6 y 2 ,8. Si s e em- 5) E l uso de C 0 Mg d e b e o m i t i r s e .

3

SUMMARY
T H E PROBLEM OF CLOROPH Y LL a DETERM INATI ON IN T H E P H YTOMICROBENT H OS:
A METODOLOGICAL DISCUSSION

A general discussion about t h e de�ermina­ of the a� id in the acidified extract and the

� i on of pigments in samples containing high use ofC0 Mg. The method of WHITNEY & DARLEY
3
percentages of degrada�ion produc�s , as those ( 1979 ) , .... hich invol ves parti tion of acetonic

from the benthos , is presented . The �radi tional extracts .... i th hexane, allo.... s a be tter dist inc-

methods based on the spectrophotQmetric rea­ t i on bet .... een active a nd non-active forms of

dings before and after acidification of the chlorophyll-�, .... hich is not possible .... i th the

extracts are discussed in relation .... i th the current spectrophotometric procedures , and is

solvents , their .... ater content , the molarity proposed as a sui table alternative.

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