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THESE

Présentée à l'Université Aix-Marseille

Laboratoire de physiologie et physiopathologie du système nerveux

somato-moteur et neurovégétatif, PPSN EA 4674

Pour obtenir le grade de

Docteur de l'Université Aix-Marseille

Discipline : Neurosciences

Présentée et soutenue publiquement par

Adeline Orts-Del'immagine
Le 20/05/14

CARACTERISATION DES NEURONES BULBO-SPINAUX


PKD2L1+ QUI CONTACTENT LE LIQUIDE CEPHALO-
RACHIDIEN

Examinateurs : Dr. Patrick Delmas et Dr. Jean-Philippe Hugnot

Rapporteurs : Dr. Claire Wyart et Pr. Didier Morin

Directeur : Pr Jérôme Trouslard

Co-directeur : Dr. Nicolas Wanaverbecq


Remerciements
Tant de personnes ont rendu possible l’avènement de ce travail de thèse qu’il m’est
aujourd’hui difficile de n’en oublier aucune et je m’excuse par avance des oublis éventuels.
Au terme de ces années de doctorat et au commencement d’une nouvelle étape de ma vie,
j’éprouve une sincère gratitude envers tous ceux qui ont participé à ce travail et je tiens ici
à les remercier.
Je remercie tout particulièrement mes directeurs de thèse

Pr. Jérôme Trouslard qui a bien voulu diriger ce travail, en me faisant profiter de son
expérience, de ses connaissances, de ses conseils et remarques qui m’ont été très bénéfiques
et surtout pour la confiance qu’il m’a accordée durant cette aventure
Dr. Nicolas Wanaverbecq pour son aide et ses conseils, pour avoir toujours été là pour me
soutenir et me défendre en portant un regard neuf sur mes travaux, tout en me proposant
des idées pertinentes.
Je tiens à les remercier tous deux pour m’avoir ouvert les portes de l’électrophysiologie et
du patch clamp et surtout d’avoir enrichi mon travail d’une dimension humaine essentielle.
J’espère que cette thèse ne constitue que le point de départ d’une collaboration durable.

J’exprime ma gratitude à l’ensemble du jury pour l’honneur qu’ils m’ont fait d’avoir
accepté d’être président, rapporteurs et membres du jury de cette thèse et pour avoir
évalué ce travail.
J’aimerais remercier tous les gens avec qui j’ai pu avoir des interactions au sujet de ma
thèse et qui ont su m’écouter me conseiller et m’encourager, je pense plus particulièrement
à Lourdes Mounien qui a toujours répondu à mes questions tout en sachant supporter mes
humeurs de fin de thèse, mais également à Jean-Denis Troadec et Michel Dallaporta qui
m’ont initiée à l’immunohistochimie.

J’ai une pensée particulière pour l’ensemble des membres du Laboratoire PPSN, et de la
Start-up BIOMEOSTASIS pour leur appui professionnel mais aussi personnel dont ils ont
fait preuve tout au long de ces années de thèse. Plus particulièrement Catherine Tardivel,
Coraline Airault, Vanessa Tillement et Sandrine Signou pour leur bonne humeur, leur
soutien, leur aide scientifique ou technique ainsi que pour leur amitié.
Merci également à Marion, Thaïs, Laetitia, Clément, Adel et Ghizlane pour leur soutien
moral, pour les pauses et les fous-rires partagés.
Me voilà au terme de cette thèse qui représente un chapitre important de ma vie avec ces
hauts et ses bas, ses rires et ses larmes ses souffrances et ses satisfactions ses rencontres
ses départs, ce chemin jamais linéaire aux embranchements multiples est celui d’un
apprentissage professionnel mais surtout personnel et j’ai la chance d’avoir été
accompagnée à chaque étape de ce travail par les personnes que j’aime. Je pense à Hanan
Khemiri et Marc Maresca ; ils ont su être à l’écoute de toutes mes avancées et reculades
quotidiennes, me donner leurs opinions tout en sachant me divertir. Ils ont été d’un soutien
moral sincère et dévoué d’une valeur exceptionnelle.
J’aimerais dire un immense merci à toute ma famille qu’il serait trop long de citer ici, mais
qui chacun à sa manière a enrichi et embelli ces dernières années et plus particulièrement
Emma qui m'a donnée la force et le courage en ces derniers temps de thèse souvent
difficiles, ainsi que mes parents qui ont su me donner le goût de la curiosité pour le monde
qui nous entoure. Ils m’ont soutenue et encouragée dans mes choix au cours de ma vie et je
les remercie de m’avoir laissé cette liberté.
Sommaire
Sommaire

I. INTRODUCTION ...............................................................................................................................1
A. Les NCLCR : Une population neuronale très conservée aux multiples facettes ...................1
1. Rappels sur le système ventriculaire et le liquide céphalo-rachidien .................................1

2. Hétérogénéité et diversité des couches épendymaires et sous-épendymaires ................15

3. Les neurones qui contactent le liquide céphalo-rachidien : NcLCR .................................21


4. Quels réseaux et quelles fonctions pour les NcLCR ............................................................52

B. PKD2L1 un pH- et osmosenseur de la famille des TRP ..........................................................60

1. La famille TRP...........................................................................................................................60

2. Structure des canaux TRRP3 ...................................................................................................66

3. Localisation ...............................................................................................................................73

4. Fonctionnalité............................................................................................................................78
5. Du gène à la fonction ...............................................................................................................95
II. MATERIELS ET METHODES.......................................................................................................104

A. Animaux ......................................................................................................................................104

B. Etude immunohistochimique ...................................................................................................106


1. Préparation des coupes histologiques .................................................................................106

2. Immunomarquages ................................................................................................................107
3. Observations, acquisition et traitement des images ..........................................................110
4. Analyses morphologiques et comptage ..............................................................................111

5. Statistiques...............................................................................................................................114
C. Etude électrophysiologique ......................................................................................................114

1. Préparation des tranches de tronc cérébral.........................................................................114

2. Enregistrements électrophysiologiques sur tranches ........................................................117

3. application des drogues et solutions ...................................................................................121

4. Analyses et tests statistiques .................................................................................................124


III. RESULTATS ................................................................................................................................128

A. Distribution & Caractérisation morphologique et Propriétés électrophysiologiques


générales des NcLCR .........................................................................................................................128

1. Distribution des cellules PKD2L1+ dans le système nerveux central, et caractérisation


générale dans les zones bulbo-spinales .......................................................................................128

2. Patron de décharge et activité spontanée des NcLCR PKD2L1+......................................135

3. Caractérisation morphologique des NcLCR PKD2L1+ bulbo-spinaux ...........................138


Sommaire

B. Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des NcLCR PKD2L1+ du tronc cérébral .148


1. Les NcLCR PKD2L1+ sont GABAergiques..........................................................................148
2. Les NcLCR PKD2L1+ expriment divers récepteurs ionotropiques fonctionnels ...........151

3. Les NcLCR PKD2L1+ du tronc cérébral sont intégrés dans un réseau synaptique .......160

4. Les NcLCR sont des senseurs environnementaux via PKD2L1 ......................................163


C. Stade de maturité des NcLCR bulbospinaux chez l'adulte ..................................................186

1. Les NcLCR présentent un état de maturité transitoire chez l'adulte : marqueurs


immunohistochimiques .................................................................................................................186

2. Les NcLCR présentent un état de maturité transitoire chez l’adulte : Un marqueur


électrophysiologique, le potentiel de réversion du chlore .......................................................190

IV. DISCUSSION ..............................................................................................................................196

A. Morphologie, distribution et propriétés générales des NcLCR PKD2L1+ bulbo-spinaux196


1. Localisation et organisation des NcLCR PKD2L1+ autour du canal central ..................196
2. Morphologie des NcLCR PKD2L1+ : des cellules polarisées ............................................199

3. PKD2L1 est un marqueur spécifique des NcLCR-S bulbo-spinaux : implication


fonctionnelle ....................................................................................................................................202

4. Propriétés électrophysiologiques générales des NcLCR PKD2L1+ du tronc cérébral ..204


B. Modulation et caractérisation fonctionnelle des NcLCR PKD2L1+ du tronc cérébral ......205

1. Les NcLCR sont GABAergiques et reçoivent des afférences synaptiques GABA/Glycine


205

2. Les NcLCR intègrent les variations du milieu extérieur grâce au canal PKD2L1 .........210
C. Des neurones encore immatures à l'âge adulte ? ...................................................................216

V. CONCLUSION ...............................................................................................................................224
VI. PERSPECTIVES ..........................................................................................................................226

A. Les NcLCR PKD2L1 des senseurs environnementaux .........................................................226

B. Bases moléculaires des deux effets du GABA, effets de l’inflammation ou de la lésion sur
les NcLCR PKD2L1+ ...........................................................................................................................228

C. Données préliminaires : quelques pistes sur la fonction des NcLCR PKD2L1+ ................229

VII. REFERENCES .............................................................................................................................234


ABRÉVIATIONS
(2-Me-S)ATP : (2-méthyl-S)Adenosine triphosphate

(E)GFP : (Enhanced)Green fluorescent protein

3V : Troisième ventricule

4V : Quatrième ventricule

5-HT : 5-hydroxytryptamine ou sérotonine

AC3 : Type 3 adenylyl cyclase

ACh : Acétylcholine

AQP1 : Canaux aquaporine de type 1

AQP1 : Aquaporine de type 1

ASICs : Acid sensing ionic channels

ATP : Adénosine triphosphate

AVP : Arginine vasopressine

BHE : Barrière hémato-encéphalique

BLBP : Brain lipid-binding protein

BrdU : Bromodéoxyuridine (5-bromo-2'-deoxyuridine)

cc : Canal central

CDR : C-terminal regulatory domain

ChAT : Choline acétyltransférase

DA : Dopamine

DCX : Double cortine

DMA : Dimethylamine

EGF : Epidermal growth factor

Eion : Potentiel d’équilibre de l’ion

ERK5 : Extracellular signal-regulated kinase 5

FGF2 : Fibroblast growth factor 2

GABA : Acide-γ-aminobutyrique

GAD : glutamic acid decarboxylase

GAP 43 : Growth associated protein 43


GFAP : Glial fibrillary acidic protein

GFAP : Glial fibrillary acidic protein

Glu : Glutamate

HuC/D : Human neuronal protein HuC/HuD

HEK : Human embryonic kidney cells

KA : Cellules de Kolmer et Agduhr

KCC : K+/Cl- cotransporter

KO : Knockout

Krd : Kidney and retinal defects

LCR : Liquide céphalo-rachidien

MA : Methylamine

MAP2 : Microtubule-associated protein 2

MEC : Milieu extracellulaire

MIC : Milieu intracellulaire

N.P0: Probabilité d'ouverture

NA : Noradrénaline

NcLCR : Neurones qui contactent le liquide céphalo-rachidien

NeuN : Neuronal nuclei

NF : Neurofilament

NF-160 : Neurofilament-160 kDa

NKCC : Na+/K+/Cl- cotransporter

Nkx6.1 : Homéoprotéine Nkx6.1

NMDG : N-méthyl-D-glucamine

NO : Monoxyde d’azote

OCV : Organe(s) circum-ventriculaire(s)

OSC : Organe sous-commissural

OT : Ocytocine

PA : Potentiel d'action

PC : Plexus choroïde

PCM-1 : Pericentriolar material 1

PKC : Protéine Kinase C

PKD1L3 : Polycystic Kidney disease 1 like 3 protein


PKD2L1 : Polycystic Kidney disease 2 like 1 protein

PSA-NCAM : Polysialylated neuronal cell adhesion molecule

Px : Age post-natal x

R_mGlu : Récepteur glutamatergique métabotropique

RACK : Receptor for activated C kinase

RE : Réticulum endoplasmique

SCO : Organe sous-commissural

Shh : Sonic hedgehog

SNC : Système nerveux central

SP : Substance P

SVZ : Zone sous-ventriculaire

TAA : Tétra-alkylammonium

TBA : Tétra-butylammonium

TC : Tronc cérébral

TEA : Tétraéthylammonium

TH : Tyrosine hydroxylase

TMA : Tétra-methylammonium

TPA : Tétra-propylammonium

TPeA : Tétra-pentylammonium

TriEA : Triéthylamine

TRP : Transient receptor potential

TRPP : Transient receptor potential Polycystin

TTX : Tétrodotoxine

VIP : Vasoactive intestinal peptide

VL : Ventricules latéraux

VP : Vasopressine

Vr : Potentiel de repos

WT : Wild type
OBJECTIFS DE LA THESE :
Durant ma thèse, je me suis intéressée à des neurones très particuliers qui contactent le

liquide céphalorachidien (LCR). Ces neurones dits de contact sont présents au niveau de la

couche épendymaire qui délimite le canal central bulbo-spinal. Malgré une conservation

phyllogénétique chez tous les cordés de l’amphioxus à l’homme, leurs rôles restent inconnus

(Vígh et al., 2004). Ces neurones présentent une dendrite qui s’immisce entre les cellules

épendymaires et qui se termine par une structure ampoulée venant au contact du LCR. Basées

sur cette morphologie particulière, deux hypothèses ont été émises quant à leur rôle

physiologique. La première hypothèse serait que ces neurones auraient un rôle sensoriel leur

permettant d'analyser des variations de composition du LCR (chémosensibilité). Cette

hypothèse a été renforcée récemment par la démonstration de l’expression dans les neurones de

contact d’une protéine membranaire sensible au pH extracellulaire (Huang et al., 2006). Cette

protéine s’appelle PKD2L1 (polycystic kidney disease 2-like 1 protein) et fait partie de la famille

des "transient receptor potential" (TRP) qui sont des canaux cationiques (Chen et al., 1999)

présents également dans le rein, la rétine et les bourgeons du goût (Wu et al., 1998a). L'autre

hypothèse serait qu'ils seraient impliqués dans la détection des variations de flux du LCR par la

structure ampoulée qui porte une structure ciliaire dont la nature reste inconnue

(méchanosensibilité). Ces neurones font partie de la niche neurale épendymaire (Hugnot &

Franzen, 2011) et une troisième hypothèse a été suggérée. En effet, ces neurones conservent des

marqueurs d’immaturité chez l’adulte voire des capacités de migration et pourraient constituer

une source de neurones mobilisables suite à un traumatisme médullaire (Marichal et al., 2009).

Cette source serait autre que celle issue d’une véritable neurogénèse adulte qui reste au

demeurant très limitée au niveau médullaire (Horner & Gage, 2000; Sabelström et al., 2013).

Le contexte physiologique dans lequel s’inscrivent mes travaux est celui de l’étude de la

régulation centrale de la prise alimentaire et c’est d’ailleurs, le thème principal de l’équipe dans

laquelle j’ai effectué mes travaux. Plus précisément, le laboratoire recherche à mieux

comprendre le rôle joué par le complexe vagal dorsal (CVD), une structure bulbaire qui avec

l’hypothalamus sont les deux grandes structures nerveuses majeures qui régulent la balance

énergétique.

Le CVD regroupe trois noyaux : le noyau moteur dorsal du nerf vague à l’origine de la

voie efférente vagale, le noyau du tractus solitaire, un réseau neuronal assez complexe qui
intègre des informations nerveuses notamment périphériques et issus de la sphère gastro-

intestinale (afférences vagales), et enfin l’area postrema, un organe neuro-hémal présentant une

barrière hémato-encéphalique lâche permettant à des hormones circulantes d’accéder au

parenchyme nerveux et de réguler les fonctions physiologiques du CVD. Ainsi de nombreux

travaux du laboratoire ont montré la capacité du CVD à intégrer des signaux humoraux et

nerveux avec au final une modulation du réflexes de satiété et de déglutition, deux réflexes mis

en forme au niveau du CVD et importants dans la régulation de la prise alimentaire et de la

balance énergétique.

Mes travaux s’inscrivent dans cette même ligne, mieux comprendre le rôle du CVD mais

j’ai posé une nouvelle question : le système des NcLCR participe-t-il au fonctionnement du

CVD dans ce contexte physiologique de prise alimentaire ? Ceci est justifié, d’une part, par la

présence de NcLCR au niveau du tronc cérébral (et également au niveau de l’hypothalamus) et,

d’autre part, par la présence dans le LCR d’hormones connues pour réguler la prise alimentaire

(NPY, leptine). Formulé autrement, le CVD par ces nouveaux partenaires que sont les NcLCR,

intègre-t-il des éléments circulants dans le LCR et les NcLCR participent-ils à la régulation

centrale de la balance énergétique ? Mais avant de répondre à cette question, il était important

de connaitre les propriétés des NcLCR présents aux niveaux médullaires, celles-ci étant

totalement inconnues au moment où j’ai débuté ma thèse. J’ai donc naturellement entrepris une

étude électrophysiologique et immunologique des NcLCR au niveau du CVD. J’ai appris et

appliqué ces deux techniques principalement à des tranches de tronc cérébral de souris

transgéniques PKD2L1:EGFP adultes âgées de 3 mois. Les résultats de ces travaux font l’objet

de cette thèse et ont fait pour l’instant l’objet de deux publications qui sont annexées à ce

manuscrit (J Physiol et Plos One), deux autres publications sont en cours de rédaction.

Avant de présenter les résultats de cette étude, nous détaillerons les connaissances

actuelles sur le système des neurones en contact avec le LCR (NcLCR) ainsi que sur le canal

PKD2L1 exprimé par ces cellules et dont l'activité pourrait conférer à ces neurones des capacités

sensorielles. Mais tout d'abord, pour mieux comprendre ce système sensoriel ainsi que

l'importance de son étude, nous rappellerons brièvement quelques généralités sur le LCR.
Introduction

I. INTRODUCTION

A. LES NCLCR : UNE POPULATION NEURONALE TRES CONSERVEE AUX

MULTIPLES FACETTES

1. RAPPELS SUR LE SYSTEME VENTRICULAIRE ET LE LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN

Le système nerveux central (SNC) baigne dans un liquide protecteur appelé liquide

céphalo-rachidien (LCR), qui est issu d’une filtration plasmatique et de sécrétions

membranaires. Initialement, le LCR était connu pour ses fonctions de protection physique et de

support mécanique pour le cerveau ainsi que pour son rôle dans l’homéostasie cérébrale

puisque sa circulation permet non seulement l’apport de nutriments mais également le drainage

des déchets métaboliques (Segal, 1993, 2001; Redzic & Segal, 2004; Iliff et al., 2012).

Actuellement, le LCR est décrit comme une troisième voie de communication permettant le

transport de molécules actives (hormones, neurotransmetteurs…) dans différentes régions

cérébrales (Agnati et al., 1995; Sawamoto et al., 2006; Veening & Barendregt, 2010; Xiao et al.,

2010). Il semble ainsi jouer un rôle plus actif dans le développement cérébral (Salehi &

Mashayekhi, 2006; Bachy et al., 2008; Gato & Desmond, 2009; Alonso et al., 2011; Vera et al.,

2013), dans la migration de neuroblastes issus de la neurogénèse chez l'adulte (Sawamoto et al.,

2006) et dans les processus de migration et de réparation du SNC après lésion (Mashayekhi et

al., 2002; Redzic et al., 2005; Johanson et al., 2008, 2011a; Buddensiek et al., 2010).

a) Localisation, Circulation et Synthèse du LCR

Le LCR occupe 18 % du volume total du cerveau (Lüders et al., 2002). Il est de l'ordre de

150-160 ml chez l'Homme (Silverberg et al., 2001) et de 0,04 ml chez la souris (Oshio et al., 2005).

Il se répartit dans deux espaces distincts (Figure 1. A) : l'un, qualifié d'externe, correspondant

aux espaces sous-arachnoïdiens intracrâniens et intrarachidiens (≈ 83 % du volume total); l'autre

dit interne, et défini par l'ensemble des ventricules cérébraux et le canal central de l'épendyme

(≈ 17 % du volume total) (Reiber, 2003; Sakka et al., 2011). Ces cavités dans le SNC forment un

continuum réparti le long de l'axe rostro-caudal. Dans le cerveau antérieur se trouvent les

ventricules latéraux (VL), creusés dans la profondeur de chacun des deux hémisphères

cérébraux et reliés par le trou de Monro au troisième ventricule (3V). Le 3V est situé sur la ligne

1
Introduction

médiane de l'encéphale, dans le diencéphale. Ce dernier est lui-même connecté au quatrième

ventricule (4V) par l'aqueduc de Sylvius. Le 4V est localisé au niveau du tronc cérébral, sous le

cervelet. Il communique dans sa partie rostrale avec les espaces liquidiens sous-arachnoïdiens,

par trois orifices : le foramen de Magendie et les deux foramina de Luschka. Dans sa partie

caudale, il se prolonge par le canal central, ou canal de l'épendyme, qui s'étend de la partie

caudale du tronc cérébral jusqu'à la fin de la moelle épinière (Figure 1. B). L'ensemble de ces

cavités liquidiennes internes au SNC, est séparé du parenchyme par une monocouche de

cellules épendymaires tandis que l'espace sous-arachnoïdien (cortical et spinal) est délimité par

la pie-mère (qui recouvre le parenchyme) et l'arachnoïde (qui tapisse le versant interne de la

dure-mère), deux des trois feuillets constituant les méninges (Figure 1. B). L'espace sous-

arachnoïdien entoure tout le SNC et est traversé par les nerfs crâniens, des veines et des artères.

Cet espace s'élargit par endroits et une telle dilatation focale est désignée sous le nom de citerne.

La circulation du LCR s’effectue depuis les sites de sécrétion, les plexus choroïdes (PC), vers les

sites de résorption, dans les granulations arachnoïdiennes, selon un flux unidirectionnel rostro-

caudal dans les cavités ventriculaires et un flux pluridirectionnel dans les espaces sous-

arachnoïdiens (flèches noires, Figure 1. B). Il s’agit d’un flux pulsatile correspondant à l’ondée

systolique dans les artères choroïdiennes (Johanson et al., 2008; Sakka et al., 2011). Cette

circulation est également sous-tendue par le battement des cils mobiles des cellules

épendymaires (Banizs et al., 2005; Sawamoto et al., 2006). Enfin, il semblerait que l’orientation de

cette circulation implique également l’organe sous-commissural (SCO) grâce à la synthèse, dans

le LCR, de la SCO-spondine organisée en fibre de Reissner (Pérez-Fígares et al., 2001; Somera &

Jones, 2004; Meiniel, 2007; Ortloff et al., 2013).

La production journalière de LCR est dépendante de l'âge, ainsi, celle-ci varie entre 500

ml/jour (0,4 ml/min) chez l'homme jeune à 250 ml/jour (0,19 ml/min) chez les personnes âgées

(Reiber, 2003). Ce liquide est renouvelé en permanence et il est estimé qu’environ 600 ml/24h de

LCR est produit chez l’Homme, ce qui correspond au remplacement du volume total de LCR

trois à quatre fois par jour. Cette synthèse est majoritairement réalisée au niveau des plexus

choroïdes (PC; ~75 % de la synthèse chez l'homme, voir histologie des PC) (Speake et al., 2001)

localisés dans les ventricules cérébraux (Figure 2).

2
Introduction

A
LCR interne LCR externe
espace
espaces sous-arachnoïdien
ventriculaires et
canal central

PC du VL Sinus veineux dural


Granulations/Villosités
arachnoïdiennes
Dure mère

Méninges Arachnoïde

Pie mère Espace sous-


arachnoïdien
VL cortical

3V

Foramen de Monro

PC du 3V C
Citerne interpédonculaire TC 4V

Aqueduc de Sylvius Citerne quadrigéminale

Citerne cérébellomédullaire
(grande citerne)
Foramen de Luschka
ME Foramen de Magendie
PC du 4V

Canal central
Espace sous-
Arachnoïdien spinal

FIGURE 1. LES ESPACES LIQUIDIENS DU SNC ET FLUX DU LCR. A, Représentation schématique des espaces
liquidiens internes (ventricules cérébraux) et externes (espace sous-arachnoïdien) chez l'homme. B, Schéma illustrant les
espaces liquidiens cérébraux, la représentation du flux monodirectionnelle du LCR (flèches noires) et la voie de drainage
(flèches blanches). La circulation débute dans les ventricules cérébraux, où se trouvent les plexus choroïdes, lieu de synthèse
du LCR. A partir des VL, le LCR passe dans le 3V par les deux foramina de Monro, puis rejoint le 4V par l’intermédiaire de
l’aqueduc de Sylvius. Enfin, il atteint le canal central (du tronc cérébral à la moelle épinière cervicale, thoracique et
lombaire) ainsi que diverses citernes par les foramina de Magendie et de Luschka avant de rejoindre les espaces sous-
arachnoïdiens corticaux et spinaux. Le LCR atteint ainsi la citerne cérébellomédullaire localisée dans la surface extra-
encéphalique (flèches blanches). Le liquide circule dans les espaces sous-arachnoïdiens crâniens et spinaux. Le drainage du
LCR se fait dans les espaces sous-arachnoïdiens crâniens. Le LCR est résorbé au niveau d'expansions digitiformes appelées
villosités ou granulations arachnoïdiennes. Puis il rejoint la circulation systémique à partir des sinus veineux duraux
(flèches noires). Le drainage du LCR fait appel à des variations de pression entre le LCR et le compartiment sanguin (quand
la pression du LCR est supérieure à la pression veineuse) (Weller et al., 1992; Fenstermacher et al., 1997). Une autre partie du
LCR est résorbée par la muqueuse olfactive et la gaine des nerfs crâniens et gagne la circulation lymphatique. Dans les
espaces sous-arachnoïdiens spinaux, la partie du LCR résorbée par les plexus veineux et la gaine des nerfs spinaux rejoint la
circulation lymphatique tandis que l’autre partie revient selon un courant caudo-rostral vers les espaces sous-arachnoïdiens
crâniens (Sakka et al., 2011). C : cervelet ; LCR : liquide céphalo-rachidien ; ME : moelle épinière ; PC : plexus choroïde ; TC :
tronc cérébral : VL : ventricules latéraux ; 3V : troisième ventricule ; 4 V : quatrième ventricule.

3
Introduction

Mais la synthès est également sous-tendue par des sécrétions extra-plexuelles provenant

des espaces cérébraux extracellulaires (Cserr, 1971), de la couche épendymaire (Pollay & Curl,

1967) et de la membrane arachnoïdienne (Johanson, 1998). La sécrétion choroïdienne du LCR

comprend deux phénomènes majeurs : une filtration plasmatique à partir des capillaires

fenêtrés irrigant les PC (Pollay et al., 1983) et une sécrétion "active" assurée par les cellules de

l'épithélium choroïdien qui repose essentiellement sur l'expression d'une batterie de

transporteurs, d'échangeurs et de récepteurs protéiques localisés sur les pôles apicaux et

basolatéraux des cellules épithéliales choroïdiennes (Figure 2. D et E et Figure 3) (Wright, 1978;

Speake et al., 2001; Brown et al., 2004; Damkier et al., 2010). Les PC sont également la source de

nombreuses sécrétions. Ils sécrètent des facteurs de croissance (rôle dans la réparation des

altérations tissulaires), des cytokines, des vitamines, les folates, la β2microgloguline, l’arginine

vasopressine (AVP) et le monoxyde d’azote (Redzic et al., 2005; Sakka et al., 2011; González-

Marrero et al., 2013). Les PC représentent également un des sites majeurs pour la synthèse de la

pré-albumine et de la transthyrétine (Dickson et al., 1985a, 1985b; Stauder et al., 1986), protéines

qui seraient impliquées dans le transport et l’entrée dans le cerveau de l'hormone thyroïdienne

T4 (thyroxine) (Schreiber et al., 1990; Dratman et al., 1991; Chanoine et al., 1992; Kassem et al.,

2006).

La filtration plasmatique est essentiellement dépendante du gradient de pression et

concerne majoritairement les électrolytes, l'eau mais également les protéines. Elle se réalise en

deux étapes. Tout d'abord, une filtration passive du plasma depuis les capillaires choroïdiens

vers le secteur interstitiel choroïdien et d'autre part, le passage des molécules issues de cette

filtration depuis le secteur interstitiel vers la lumière ventriculaire (Wright, 1978; Segal, 2000).

Certaines protéines plasmatiques passent également dans le LCR au niveau des PC. En général,

la majorité des protéines retrouvées dans le LCR est le reflet de celles retrouvées dans le plasma.

Toutefois, il faut noter que la concentration des protéines dans le LCR est bien plus faible que

dans le plasma (Reiber, 2003; Hühmer et al., 2006) et que le ratio de la concentration en protéines

plasmatiques sur la concentration en protéines du LCR varie avec la taille de ces protéines

(Tableau 1). Ceci suggère que le passage de ces protéines se fait par diffusion en fonction du

gradient de concentration donc de manière non sélective (Segal, 1993). Toutefois, il faut noter

que le passage de certaines protéines se fait à l'aide de récepteurs spécifiques exprimés à la

surface des cellules choroïdiennes par trancytose (Redzic & Segal, 2004; Redzic et al., 2005).

4
Introduction

La sécrétion extra-plexuelle provient du liquide extracellulaire et des capillaires

cérébraux à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). Les échanges entre le liquide

extracellulaire et le LCR sont réalisés d'une part au niveau de la couche épendymaire bordant

l'ensemble des cavités intracérébrales mais également au niveau de la pie-mère bordant l'espace

sous-arachnoïdien (Abbott, 2004). La participation de cette voie dans l'élaboration du LCR

semble faible dans les conditions physiologiques. La synthèse du LCR implique également

l’épithélium épendymaire dont l'activité de sécrétion est régulée (Wright, 1978; Sakka et al.,

2011). Enfin, certains neuropeptides et neurotransmetteurs retrouvés dans le LCR (Tableau 2)

semblent provenir d'un système neuronal particulier caractérisé par la présence de contacts

avec le LCR : les neurones de contact du LCR ou NcLCR (Taniguchi et al., 1988; Vigh & Vigh-

Teichmann, 1998; Vígh et al., 2004; Xiao et al., 2005).

Le taux de sécrétion du LCR est un mécanisme finement régulé. Cette régulation fait

appel à des détections mécaniques (pression intraventriculaire), humorales (hormones régulant

les enzymes et les transporteurs membranaires) et nerveuses (innervation végétative :

cholinergique, adrénergique, sérotoninergique et peptidergique) ainsi qu'à des facteurs

neuropeptidergiques tels que l’arginine vasopressine (AVP) et le peptide natriurétique. Ces

peptides sont également synthétisés par les PC et sont impliqués dans une régulation autocrine

de leur activité de sécrétion (Faraci et al., 1990; Scavone et al., 1995; Weaver et al., 2003; Preston et

al., 2003; Johanson et al., 2006). Des altérations de ce taux de sécrétion peuvent conduire à des

pathologies dont la plus étudiée est l’hydrocéphalie (Redzic et al., 2005; Orešković & Klarica,

2011; Sakka et al., 2011). En effet, c'est la balance entre la production de LCR et sa résorption qui

participe au maintien de la pression intracrânienne (niveau physiologique : 5-15 mmHg) en

dépit des variations de pression sanguine ou d'osmolarité plasmatique (Balachandra & Anand,

1993; Silverberg et al., 2002; Pollay, 2010). Enfin, le drainage du LCR joue un rôle majeur dans le

maintien de l'homéostasie cérébrale en éliminant les déchets du métabolisme (clearance du

milieu extracellulaire : élimination des neurotransmetteurs en excès, des protéines solubles,

débris cellulaires...) ainsi que les agents pathogènes (bactéries, virus). Ce mécanisme

participerait ainsi à la neuroprotection (Davson et al., 1962; Wald et al., 1978; Abbott, 2004; Koh

et al., 2005; Iliff et al., 2012).

5
Introduction

b) Histologie des Plexus choroïdes

Les plexus choroïdes (PC) sont localisés dans les ventricules cérébraux, plus

particulièrement au niveau du corps et d'une partie de la corne temporale des VL ainsi que dans

le toit des 3V et 4V (Figure 1. B et 2.A). La masse totale des PC représente environ 2 g, ce qui

permet un taux de sécrétion du LCR d’environ 0,21 ml/min/g de tissus. Ce fort taux de sécrétion

est sous-tendu par la structure même des PC (Figure 2) (Maxwell & Pease, 1956; Redzic & Segal,

2004). Les PC sont des structures richement vascularisées, localisées dans la lumière

ventriculaire et dont la surface épithéliale se prolonge avec la couche épendymaire (Figure 2.

A). L'épithélium choroïdien est nettement polarisé et le pôle apical est caractérisé par la

présence d'une multitude de microvillosités (Figure 2. B). Il est composé de cellules cubiques

ciliées unistratifiées (Figure 2.A) comportant une bordure en brosse. Ces cils contiennent 10

doublets de microtubules dont neuf périphériques et un central (structure dite 9+2), structure

caractéristique des cils mobiles (Figure 6) (Maxwell & Pease, 1956). Le cytoplasme de ces

cellules contient de nombreuses mitochondries qui fournissent l'énergie indispensable à

l’élaboration du LCR (Clementi & Marini, 1972). Enfin, puisqu'au niveau des PC, les capillaires

sont à paroi fenêtrée (Maxwell & Pease, 1956; Redzic & Segal, 2004), les cellules épendymaires

présentent une organisation spécialisée, caractérisée par la présence de jonctions serrées de type

Zonula Occludens sur leur pôle apical (Figure 2. C) (Brightman & Reese, 1969; Bohr & Mollgård,

1974) qui unissent les cellules entre elles et limitent la diffusion paracellulaire de molécules

(Sakka et al., 2011).

FIGURE 2. LES PLEXUS CHOROÏDES. A, Dessins illustrant les principales caractéristiques des plexus choroïdes localisés
dans le 4V chez la grenouille. Chaque plexus consiste en un réseau de capillaires fenêtrés recouvert par un épithélium
cubique simple. B, Microscopie électronique de cellules épithéliales choroïdiennes dont la partie apicale en contact avec le
LCR comprend de nombreuses microvillosités (triangles noirs) et qui sont reliées entre elles par des jonctions serrées
(flèches). Marquage immunohistochimique des plexus choroïdes avec un anticorps contre l’occludine (C), l’AQP1 (D) et les
transporteurs de NaHCO3 impliqués dans la production de LCR et localisés au niveau basolatéral : NBCn2/NCBE (vert) et
apical : NBCn2 (rouge) (E). AQP1 : aquaporine de type 1 ; EP : Epithélium ; LCR : Liquide céphalo-rachidien ; S : Stroma ; 4V
: quatrième ventricule. (Voir page suivante).

6
Introduction

A
Cil Epithélium
choroïdien
Jonctions
serrées
Epithélium Lame basale

4V
Capillaires Capillaires
fenêtrés

Espace sous-dural
D’après Wright et al.,1972
B C
occludine
LCR

D’après Brightman et Reese D’après Wolburg et Paulus, 2010


D E
AQP1

LCR

D’après Wolburg et Paulus, 2010 D’après Damkier et al., 2010

FIGURE 2. LES PLEXUS CHOROÏDES.

7
Introduction

De plus, ces cellules présentent quelques jonctions d’ancrage de type Zonula Adherens, localisées

sur toute la longueur de l’espace intercellulaire (Lippoldt et al., 2000; Vorbrodt & Dobrogowska,

2003) qui limitent également le passage des molécules par voie paracellulaire. L’épithélium

choroïdien constitue ainsi une barrière régulant le passage de nombreuses molécules

hydrosolubles entre le sang et le LCR d’une part et entre le sang et le parenchyme d’autre part.

Les cellules épithéliales des PC constituent ainsi la barrière sang-LCR.

c) Composition du LCR et modulations physiopathologiques

La composition ionique du LCR est très proche de celle du plasma, les concentrations en

chlore et en magnésium sont légèrement supérieures tandis que celles en potassium, en calcium

et en glucose sont légèrement inférieures (Tableau 1).

Concentration (mM)
Plasma LCR
Na+ 155 151
K + 4,6 3,0
Mg + 0,7 1,0
Ca ++ 2,9 1,4
Cl - 121 133
HCO 3- 26,2 25,8
Glucose (mEq/kg H2O) 6,3 4,2
Acides aminés (mEq/kg H2O) 2,3 0,8
pH** 7,41 7,33
Osmolalité (mosmol.Kg/H2O) 300 305
*Protéines (mg . 100/ g) 6500 25

TABLEAU 1. CONCENTRATION DE DIVERS IONS ET SOLUTES DANS LE LCR ET LE PLASMA DE CHIEN (Brown et al., 2004).
*valeur provenant du LCR de lapin, D’après (Davson et al., 1988). **valeurs de pH plasmatique artériel et du LCR
ventriculaire, chez l'homme (Mitchell et al., 1965b).

8
Introduction

LUMIÈRE
VENTRICULAIRE LCR

K+
Na+ 2K+
Na+ 2Cl -

Clir/ Kir/
NKCC1 AQP1 NBCe2 Nhe1 ATP KCC4
VRAC Kv
CELLULE
ÉPITHÉLIALE
Na+, K+, Cl-, HCO3-,H2O

CHOROÏDIENNE H2O Na+/3HCO3- H+ Cl- K+ 3Na+ Cl - K+


Flux net

HCO3-
K+

Anhydrase H2O
H2CO3 CO2
Carbonique

H+
Cl-
HCO3- K+ Cl -
Na+ (48), K+ (145), Cl -
(65), HCO3 - (9,5)
Ncbe/
Ae2 AQP1 NBCn1 KCC3
NBCn2

Cl - H2O Na+/HCO3- Na+ HCO3-

COMPARTIMENT
SANGUIN

FIGURE 3. SYNTHESE DU LCR PAR FILTRATION PLASMATIQUE AU NIVEAU DES PLEXUS CHOROÏDES. La sécrétion choroïdienne
issue de cette filtration plasmatique fait intervenir l'anhydrase carbonique (enzyme qui permet la formation de bicarbonate
et de protons à partir d’eau et de CO2) et des transports ioniques transmembranaires (Figure 2). Au niveau du pôle apical
des cellules épithéliales choroïdiennes, le transport actif de sodium via la pompe Na +/K+-ATPase crée un gradient de
concentration sodique en faveur du LCR (Zeuthen & Wright, 1978). Ce gradient est soutenu par la présence de co-
transporteurs Na+/HCO3- essentiellement localisés au niveau du pôle basolatéral (Johanson et al., 1985; Praetorius et al., 2004;
Bouzinova et al., 2005; Fukuda et al., 2013) et dont le fonctionnement semble en partie lié à celui de l'échangeur Na+/H+
(Kalaria et al., 1998; Damkier et al., 2009) localisé sur le pôle apical des cellules de l'épithélium choroïdien. De plus, le co-
transporteur Na+/K+/2Cl- (NKCC1) (Bairamian et al., 1991; Wu et al., 1998b) permet la sortie de potassium et de chlore à partir
du pôle apical des cellules de l'épithélium choroïdien vers la lumière ventriculaire, ce qui renforce le gradient osmotique
existant entre le sang et le compartiment ventriculaire. Le gradient osmotique établi par l'ensemble de ces transports est
suivi par un flux d'eau principalement assuré par les canaux à eau : aquaporine de type 1 (AQP1) (Nielsen et al., 1993;
Venero et al., 2001) constituant ainsi le LCR (Damkier et al., 2010; Sakka et al., 2011). Une large gamme de protéines
membranaires semble contribuer à la sécrétion du LCR, localisée soit au niveau apical (NKCC1 : co-transporteur Na+/K+/Cl- ;
Nhe1 : co-transporteur Na+/H+ permet la sortie de protons dans le LCR ; Clir, VRAC : deux types de conductances
anioniques dont l'identité moléculaire est inconnue ; kir, Kv : canaux potassiques caractérisés par une conductance rectifiant
entrante ou rectifiant sortante respectivement ; KCC4 : co-transporteurs Cl-/K+) soit au niveau basal (Ae2 : co-transporteur
Cl-/HCO3- ; NBC1 : co-transporteurs Na+/HCO3- ; KCC3 : co-transporteurs Cl-/K+) de cellules épithéliales choroïdiennes.
Certains transporteurs tels que l'AQP1 et NBCe2 : co-transporteurs Na+/HCO3- sont présents sur les deux pôle de ces
cellules.

9
Introduction

Les différences majeures de composition entre ces deux liquides sont que le LCR

contient très peu de cellules et qu'il présente une faible concentration en protéines (Di Terlizzi &

Platt, 2009). Il est également intéressant de noter que la concentration en protéines varie au sein

même du LCR en fonction de la localisation. Ainsi, au niveau du LCR lombaire la concentration

en protéine et la pression oncotique qui en découle sont supérieures à celles retrouvées au

niveau des ventricules cérébraux (40-60 mmHg vs. 15-25 mmHg respectivement) (Fishman &

Chan, 1980; Segal, 1993).

La majeure partie de ces protéines provient du plasma, telle que l'albumine qui constitue 35 à 80

% des protéines totales du LCR, tandis que seulement 20 % sont d'origine nerveuse (Reiber &

Peter, 2001; Reiber, 2003). Le LCR contient également de faibles concentrations en transthyrétine

et en transferrine, qui sont synthétisées par les PC (Dickson et al., 1985a; Stauder et al., 1986;

Aldred et al., 1987, 1995). Enfin, de nombreuses substances neuroactives (neurotransmetteurs et

neuropeptides), dont la source est encore inconnue, sont également retrouvées dans le LCR

(Tableau 2).

Concentrations des molécules bioactives dans le LCR, mM


LCR Références
GABA** 67.10-6 (Tullberg et al., 2000)
Glutamate** 1,8 (Larson et al., 2000)
Glycine** 10,99 (Larson et al., 2000)
Acétylcholine** 27.10-9 (Eisenach et al., 1996)
Noradrénaline** 1,19.10 -6 (Buvanendran et al., 2012)
ATP** 16.10 -6 (Muñoz et al., 1995)
5-HT** 5-25.10 -6 (Engbaek & Voldby, 1982)
Leptine* 5,75.10-9 (Cano et al., 2008)
Neuropeptide Y** 0,19.10-6 (Baker et al., 2013)
Alpha-MSH** 13,2.10 -9 (Rainero et al., 1988)
CCK** 21,1.10 -9 (Gunnarsson et al., 1997)
AVP** 1.10 -9 (Kiviranta et al., 1996)
VIP** 7,3.10 -9 (Tullberg et al., 2000)

TABLEAU 2. NEUROTRANSMETTEURS ET NEUROPEPTIDES RETROUVES DANS LE LCR (*: chez le rongeur ; ** : chez
l'Homme).

La différence de composition entre le plasma et le LCR est surtout liée à la structure des

PC qui leur permet d’agir comme une barrière sélective limitant le passage de nombreuses

molécules. D'autre part, la composition du LCR dépend également de sa vitesse d'écoulement

10
Introduction

dans les cavités cérébrales. En effet, cette vitesse module les taux de diffusion des molécules

dans le LCR. Ainsi une diminution de la vitesse d'écoulement est accompagnée par une

augmentation de la concentration en protéines plasmatiques dans le LCR (Reiber & Peter, 2001).

La régulation du taux de sécrétion et de la vitesse de circulation du LCR sont des mécanismes

majeurs pour le maintien de l'homéostasie cérébrale.

D'autres paramètres du LCR sont également finement contrôlés, c'est le cas du pH et de

l'osmolarité (Siesjö, 1972; Nielsen et al., 1993; Noda & Sakuta, 2013). De nombreuses études

montrent que le pH physiologique du LCR est légèrement inférieur à celui du sang (Harris et al.,

1934; Manfredi, 1962), autour de 7,33 à 37 °C (Siesjö, 1972) et est généralement maintenu entre

7,30 et 7,36 chez l'homme (Mitchell et al., 1965a). Classiquement, les variations physiologiques

de pH du LCR sont faibles, en moyenne de 0,04 unités et en relation avec le seuil d'activation

des chémosenseurs centraux (Siesjö, 1972). Le pH du LCR et le pH sanguin sont tous deux

dépendants de la teneur en CO2 dans ces milieux liquidiens (Siesjö, 1972) et la plus forte tension

en CO2 du LCR explique en partie que le pH soit entre 0,02 et 0,1 unité plus faible que celui du

sang (Siesjö, 1972). De plus, il faut noter que la valeur du pH varie dans les cavités cérébrales,

ainsi, celui-ci est légèrement inférieur dans les citernes intracérébrales (~7,325) qu'au niveau

lombaire (~7,345) (Siesjö, 1972). Le pH est étroitement lié au CO2 puisque c'est l'hydratation du

CO2 qui produit des protons H+ responsables de l'acidification. Cette réaction est réversible et

l'Anhydrase carbonique catalyse la formation de carbonate et de proton à partir du CO2 en

solution (Lahiri & Forster, 2003) selon la réaction suivante :

CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-

La concentration de protons est régulée et est maintenue constante par des interactions ayant

lieu au sein du système respiratoire et rénal (Lahiri & Forster, 2003). Cette régulation du pH des

milieux liquidiens extracellulaires est essentielle pour le fonctionnement du cerveau puisque

l'activité neuronale et la survie cellulaire sont très sensibles aux variations de pH (Wyke, 1963;

Posner & Plum, 1967; Balestrino & Somjen, 1988; Staub et al., 1990; Schuchmann et al., 2006).

Cependant, dans certaines conditions, des variations de pH peuvent être à l'origine d'acidose

(acidose métabolique ou respiratoire lors d'hypercapnie, lésions) où le pH peut être inférieur à

7,0 (Scribner et al., 1955; Posner & Plum, 1967), ou d'alcalose (alcalose respiratoire en altitude,

alcalose métaboliques) avec des valeurs de pH des milieux liquidiens autour de 7,7 (Mitchell et

11
Introduction

al., 1965a; Siesjö, 1972). En général, il est admis que dans ces conditions particulières, le pH varie

dans une gamme allant de 7,2 à 7,8 (Kawai et al., 2006; Lesage & Barhanin, 2011). La relation

entre les variations de pH sanguin et celles du LCR est encore soumise à de nombreuses

questions puisque si dans certains cas ces deux paramètres fluctuent communément (Kazemi et

al., 1967; Dempsey et al., 1974), d'autres études montrent que les variations de pH sanguin

n'altèrent pas le pH au niveau du LCR (Mitchell et al., 1965a; Posner & Plum, 1967; Abeysekara

et al., 2012). La régulation du pH du LCR est un phénomène complexe, encore peu connu, la

plupart des études s'intéressant à ce sujet sont anciennes et il existe très peu de données

récentes. Le LCR ne contient que très peu de protéines ou autres tampons tels que le phosphate

(Davson, 1967), la régulation du pH semble donc être assurée par le bicarbonate (Siesjö, 1972),

mais également par des mécanismes d'absorptions et de sécrétions d'équivalents acido-basiques

au niveau des PC et par des phénomènes sodium-dépendants (transports acido-basiques Na+-

dépendants) (Christensen et al., 2013). De ce fait, les PC semblent équipés pour "protéger" le pH

du LCR des variations de pH sanguins.

Le maintien de l'osmolarité du LCR est également un paramètre important, indispensable au

maintien de la pression intracrânienne (Paredes-Andrade et al., 2012) et protège de la formation

d'hydrocéphalies ou d'œdèmes (Krishnamurthy et al., 2009, 2012; Odland et al., 2011). Chez

l'homme, la valeur moyenne de l'osmolalité du LCR à 37 °C est de 281 milliosmoles/kg

(mosmoles) et varie entre 257 et 305 mosmoles/kg (Goldberg et al., 1965).

Il semblerait que les variations de l'osmolarité plasmatique soient compensées dans le système

ventriculaire par la variation du volume du LCR (Jurjević et al., 2012), cependant les

mécanismes de régulation sont encore peu connus et les variations extrêmes d'osmolarité du

LCR (jusqu'à 3347 mosmole.l-1), sont essentiellement observées lors d'inductions expérimentales

de conditions pathologiques (Krishnamurthy et al., 2012).

d) Fonctions du LCR : une troisième voie de communication

Classiquement, les fonctions du LCR et des tissus qui le sécrètent, les PC, sont celles de

protection physique (liquide amortissant les chocs, régulation de la pression intracrânienne),

mécanique (allègement du poids ressenti du cerveau) et chimique (drainage des métabolites

cérébraux, régulation de l’équilibre ionique du liquide interstitiel, élimination des drogues et

des agents pathogènes) (Davson et al., 1962; Di Terlizzi & Platt, 2006; Iliff et al., 2012). Des études

12
Introduction

plus récentes suggèrent que le système LCR-PC jouerait un rôle plus actif dans le

développement du SNC et les processus de réparation après lésion (Gato et al., 2005; Parada et

al., 2005; Sawamoto et al., 2006; Martín et al., 2006; Bachy et al., 2008; Buddensiek et al., 2009,

2010; Johanson et al., 2011a; Alonso et al., 2011). En effet, le tissu fortement spécialisé constituant

les PC synthétise divers facteurs trophiques et angiogéniques, de plus il est stratégiquement

positionné au sein des cavités ventriculaires pour assurer la distribution de ces différentes

substances actives dans le SNC (Redzic et al., 2005) . En plus des substances neuroactives

synthétisées par les cellules des PC, le LCR contient de nombreuses substances provenant de la

couche épendymaire et du liquide interstitiel, pouvant être acheminées vers les sites d'action

dans des régions plus ou moins éloignées du névraxe (Agnati et al., 1995; Proescholdt et al.,

2000; Abbott, 2004; Feng et al., 2011). Il est actuellement postulé que le LCR jouerait un rôle

important dans la transmission volumique (Nicholson, 1999; Veening & Barendregt, 2010;

Veening et al., 2012; Zappaterra & Lehtinen, 2012). Ce mode de distribution par le flux du LCR

modulerait l’activité de certaines régions cérébrales par imprégnation tandis que les

transmissions synaptiques produiraient des changements plus rapides (Sakka et al., 2011).

Ce concept est basé sur le fait que la couche épendymaire bordant les cavités intracérébrales

ainsi que la pie mère bordant le versant externe du SNC sont perméables aux marqueurs de

poids moléculaires élevés (Brightman & Reese, 1969). Cependant, il faut noter que la

pénétration des molécules actives, synthétisées par les PC, dans le parenchyme est limitée au

neuropile sous-épendymaire ou bordant la pie mère (Proescholdt et al., 2000). Néanmoins, de

nombreuses études mettent en évidence que l'administration de molécules actives dans le LCR

conduit à des modifications physiologiques et comportementales par des mécanismes encore

peu connus à ce jour (Nicholson, 1999; Veening & Barendregt, 2010; Veening et al., 2012;

Zappaterra & Lehtinen, 2012). Une des hypothèses actuelles serait que ce mode de

communication implique une population neuronale en contact direct avec les espaces liquidiens

du SNC : les NcLCR. Ces neurones peuvent projeter leur axone (communication antérograde)

ou leur dendrite (communication rétrograde) dans le LCR et ainsi détecter les molécules bio-

actives qui y circulent (Ferguson et al., 1991; Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Mufson et al., 1999).

En plus de leur position clé pour la réception des signaux circulant dans le LCR, ils possèdent

également une batterie de récepteurs leur permettant d'intégrer ces signaux (Stoeckel et al.,

2003; Vígh et al., 2004; Marichal et al., 2009). Enfin, il semblerait que les NcLCR puissent

participer directement à la transmission volumique par la synthèse et la libération de substances


13
Introduction

neuroactives dans le LCR (Taniguchi et al., 1988; Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Vígh et al.,

2004).

Actuellement, le LCR apparait comme une troisième voie de communication qui s'ajoute

aux voies de communication hormonale et nerveuse. Le LCR semble ainsi participer de manière

plus active au fonctionnement cérébral. L'étude du système de neurones qui contactent le LCR

prend donc une nouvelle importance dans la compréhension de ce mode de communication.

14
Introduction

2. HETEROGENEITE ET DIVERSITE DES COUCHES EPENDYMAIRES ET SOUS-

EPENDYMAIRES

De manière générale, les cavités intraventriculaires sont séparées du reste du

parenchyme par un épithélium cubique unistratifié appelé couche épendymaire. Cet épithélium

est composé de cellules épendymaires liées entre elles par des jonctions communicantes

(jonction GAP) et portant sur leur face apicale (en contact avec le LCR) des cils mobiles (Privat,

1977) qui participent à la circulation du LCR (Banizs et al., 2005). La couche épendymaire

représente la barrière entre le liquide interstitiel et le LCR. Cependant, l'absence de jonctions

serrées entre les cellules épendymaires permet un libre échange entre le LCR et le parenchyme

sous-épendymaire (Proescholdt et al., 2000; Abbott, 2004). Cet épithélium se caractérise par

diverses spécialisations structurales liées à des fonctions spécifiques de certaines zones

cérébrales. Nous verrons brièvement ces multiples spécialisations de la composition et de

l'organisation des couches épendymaires.

a) Plexus choroïdes et organes circum-ventriculaires

Certaines régions spécialisées telles que les organes circum-ventriculaires (OCV) et les

plexus choroïdes, sont caractérisées par l'absence de barrière hémato-encéphalique (BHE). Les

OCV regroupent plusieurs noyaux du SNC : l'organe subfornical, l'organe vasculaire de la lame

terminale, la neurohypophyse, l'éminence médiane, la glande pinéale ou épiphyse ; l'organe

sous-commissural et l'area postrema. Dans ces régions nerveuses, les échanges entre le

compartiment sanguin et le milieu extracellulaire (MEC) se font librement (absence de BHE :

capillaires fenêtrés) afin de permettre les fonctions de ces organes (neurosécrétion,

chémosensibilité) (Cottrell & Ferguson, 2004; Duvernoy & Risold, 2007; Sisó et al., 2010). En

revanche, la diffusion de molécules entre le LCR et les OCV est limitée par la présence de

jonctions serrées liant les cellules de la couche épendymaire entre elles (voir histologie des PC)

(Abbott, 2004). Au niveau des OCV, en plus des cellules épendymaires, on retrouve également

des cellules gliales particulières, les tanycytes, qui présentent des jonctions serrées entre leur

extension, isolant ces organes du MEC (Abbott, 2004; Mullier et al., 2010; Langlet et al., 2013).

Les tanycytes sont des cellules gliales spécialisées, de type radial, dont le corps cellulaire se

trouve dans la couche épendymaire et dont les projections s'étendent dans le parenchyme pour

15
Introduction

venir au contact des neurones, des vaisseaux sanguins et de la pie-mère au niveau de

l’éminence médiane (Zhang et al., 2003; Rodríguez et al., 2005).

b) Couche épendymaire et niches neurogéniques

Les couches épendymaires sont également connues comme étant des zones de plasticité

et de neurogénèse. Il est maintenant bien établi que la neurogénèse, ou production de nouveaux

neurones, se déroule tout au long de la vie adulte dans le cerveau de mammifère (Kempermann

et al., 2000), y compris chez l'homme (Eriksson et al., 1998). La zone sous ventriculaire (SVZ), qui

borde la paroi des ventricules latéraux (VL), est l'une des principales régions du SNC de

mammifère où s’effectue la neurogénèse chez l’adulte (Doetsch et al., 1997, 1999a; Taupin &

Gage, 2002; Alvarez-Buylla & Lim, 2004; Conover & Notti, 2008). A ce niveau, la neurogénèse

permet de générer de nouveaux neurones qui migrent selon la voie de migration rostrale vers le

bulbe olfactif pour former des interneurones (Taupin & Gage, 2002; Ming & Song, 2011).

L’organisation cellulaire de la SVZ, qui a été révélée par l’étude des caractéristiques

ultrastructurales observées en microscopie électronique (Figure 4. A) (Doetsch et al., 1997;

García-Verdugo et al., 1998; Luo et al., 2008), joue un rôle majeur dans le maintien de cette niche

neurogénique (Conover & Shook, 2011). La SVZ est constituée principalement de cellules

progénitrices hautement prolifératives (cellules de type « C ») donnant naissance aux

neuroblastes, cellules à haute capacité de migration, et de cellules épendymaires (Figure 4. A et

B) (Doetsch et al., 1997; García-Verdugo et al., 1998). Cette niche contient également une

population cellulaire apparentée aux astrocytes qui correspond à des cellules souches neurales

(Figure 4. B) (Doetsch et al., 1999b). Ces cellules se distinguent par leur morphologie de type

radial caractérisée par la présence d’un prolongement apical qui s’étend vers la paroi

ventriculaire et porte à son extrémité un cil primaire unique baignant dans le LCR, et d’un

prolongement basal au contact des vaisseaux sanguins (Mirzadeh et al., 2008; Ming & Song,

2011). La partie ventriculaire de la SVZ, est séparée du LCR contenu dans les VL par une

monocouche de cellules épendymaires ciliées (Figure 4. A et B) où s’interposent quelques

prolongements astrocytaires (Mirzadeh et al., 2008). Les cellules épendymaires interagissent

avec ces projections apicales des cellules souches neurales par des jonctions adhérentes et des

jonctions serrées (Doetsch et al., 1997; Mirzadeh et al., 2008) constituant une unité régénérative

dénommée le « pinwhells » (Shook et al., 2012).

16
Introduction

Plus récemment, il a mis en évidence que la couche épendymaire spinale constituant le

canal central représenterait également une niche neurogénique (Anderson & Waxman, 1985;

Horner & Gage, 2000; Sabourin et al., 2009; Barnabé-Heider et al., 2010; Sabelström et al., 2013).

Le canal central s’étend de la partie caudale du tronc cérébral jusqu’au filum terminal de la

moelle épinière. Sa surface est tapissée par la couche épendymaire qui est constituée d’un

épithélium pseudo-stratifié cilié (Figure 4. C et D) (Bruni & Reddy, 1987; Meletis et al., 2008;

Hugnot & Franzen, 2011). Cet aspect pseudo-stratifié est sous-tendu par la présence de

plusieurs types cellulaires localisés soit en contact avec la lumière du canal central, soit au

niveau sous-épendymaire (Hugnot & Franzen, 2011). Cet épithélium est constitué

principalement de cellules épendymaires, qui sont des cellules cubiques, liées entre elles par des

jonctions communicantes (jonctions GAP) ainsi que par des jonctions adhérentes de type Zonula

adherens (Figure 4. D) (Bruni & Reddy, 1987). Sur toute la longueur du canal central, la surface

apicale de l'épithélium (en contact avec le LCR) porte des cils ainsi que des microvillosités

(Bruni & Reddy, 1987). Des dendrites et des faisceaux d'axones non myélinisés sont insérés

entre les cellules épendymaires (Bruni & Reddy, 1987; Stoeckel et al., 2003). En plus des cellules

épendymaires, il a également été montré que cet épithélium contient d'une part des tanycytes

qui envoient des projections vers les vaisseaux sanguins (Figure 4. C et E) (Seitz et al., 1981;

Bruni & Reddy, 1987) d'autre part, nombreux autres types cellulaires (Figure 4. E). Dans les

parties dorsales et ventrales du canal central, des cellules radiales sont soit insérées dans la

couche épendymaire, soit retrouvées au niveau sous-épendymaire (Figure 4. E). Parmi ces

cellules, certaines expriment le filament intermédiaire GFAP (Glial fibrillary acidic protein) ou

la nestine, qui sont également exprimées par la glie radiale de la SVZ et du gyrus denté. Ces

cellules émettent de longs prolongements qui s’étendent dans le parenchyme pour atteindre la

substance blanche ou la pie mère (Hugnot & Franzen, 2011).

17
Introduction

A B

Cellule gliale de type radial


(cellules souches neurales)

Cellule progénitrice
(cellule C)
Neuroblaste
Vaisseaux sanguins

Cellules épendymaires

Astrocytes

C E

cc

cc

cc f
Za
mit

f
mv

FIGURE 4. HETEROGENEITE DES COUCHES EPENDYMAIRES. A, Photomontage de microscopie électronique montrant


l’organisation cellulaire de la couche épendymaire bordant les ventricules latéraux et constituant la niche neurogénique de
la zone sous-ventriculaire. Les flèches blanches indiquent la présence de jonctions adhérentes entre les cellules
épendymaires. As : Astrocyte ; E : Cellules épendymaires ; N : Neuroblastes ; V : Ventricule latéral. Barre d’échelle : 2 µm.
Adapté de Luo et al., 2008. B, Représentation schématique de l'organisation cellulaire au niveau de la zone sous ventriculaire
de cerveau adulte. Adapté de Ming et Song, 2011. C, Immunohistochimie montrant l’expression de creER (marqueur de
cellules ciliées) dans les cellules constituant le canal central (microscopie électronique). L’ajout de fausses couleurs permet

18
Introduction

de différencier les cellules épendymaires (bleu), des cellules qui contactent le liquide céphalo-rachidien (violet), des
tanycytes (jaune). Ces différents sous-types cellulaires sont responsables de l’aspect pseudo-stratifié de la couche
épendymaire spinale. cc : canal central. Barre d’échelle : 10 µm. A droite, grossissement d’une cellule possédant la
morphologie classique des neurones qui contactent le LCR. Barre d’échelle : 3 µm. D’après Meletis et al., 2008. D,
Microscopie électronique de la partie apicale de cellules épendymaires, montrant la présence abondante de filaments (f), de
mitochondries (mit), d’appareils de golgi (G) et de ribosomes (r) ainsi que de spécialisations incluant des microvillosités
(mv) et des cils (pointes de flèche). Les cellules sont liées entre elle par des jonctions communicantes (flèches) et des
jonctions adhérentes de types Zonula adhérens (Za). x 24 500. Adapté de Bruni et Reddy, 1987. E, Représentation schématique
de la constitution cellulaire de la couche épendymaire spinale. D’après Hugnot et al., 2011. cc : canal central

Au niveau sous-épendymaire, dans les parties latérales du canal central, on retrouve également

des cellules GFAP+ qui émettent des projections dans la lumière, en contact avec le LCR (Figure

4. E, cellules roses). Du fait de leur morphologie de type radial, ces cellules sont considérées

comme un sous-type de tanycytes. Enfin, une dernière catégorie de cellules radiales retrouvées

dans la partie dorsale du canal central, expriment la "brain lipid-binding protein" (BLBP) et

CD15 (Hugnot & Franzen, 2011), deux marqueurs de cellules souches (Figure 4. E, en vert)

(Anthony et al., 2004; Capela & Temple, 2006). Certaines cellules sont retrouvées au niveau

supra-épendymaire, en contact avec la partie apicale des cellules épendymaires (Vigh & Vigh-

Teichmann, 1998; Hugnot & Franzen, 2011). Ces cellules expriment la forme polysialilée de la

molécule d'adhésion cellulaire neurale (PSA-NCAM, polysialylated neuronal cell adhesion

molecule), la protéine stabilisatrice des microtubules "microtubule-associated protein 2" (MAP2)

ainsi qu la protéine constituant les microtubules : la β-III-tubuline (Sabourin et al., 2009; Hugnot

& Franzen, 2011). Ces cellules sont retrouvées essentiellement dans la partie lombaire de la

moelle épinière, mais sont aussi présentes au niveau du 3V et du 4V, où l’infusion de facteurs

de croissance épidermique (EGF) ou de fibroblaste (FGF2) induit leur prolifération (Sabourin et

al., 2009; Hugnot & Franzen, 2011). Un dernier type cellulaire a également été décrit et entre

dans la constitution de la couche épendymaire : les neurones qui contactent le LCR ou NcLCR

(Figure 4. C et schéma 4. E, gris foncé) (Vigh et al., 1977; Barber et al., 1982; Stoeckel et al., 2003;

Sabourin et al., 2009; Hugnot & Franzen, 2011). Ces cellules sont en contact avec les cellules

épendymaires via des jonctions de type Zonula adherens et Zonula occludens (Stoeckel et al., 2003)

et ont des caractéristiques morpho-phénotypiques propres qui seront détaillées ultérieurement

(voir partie Introduction A. 3).

Il apparait que la moelle épinière et plus précisément la couche épendymaire bordant le

canal central représente une niche neurogénique (Anderson & Waxman, 1985; Hugnot &

19
Introduction

Franzen, 2011; Sabelström et al., 2013). Chez les vertébrés inférieurs, la présence de cellules

souches au niveau de la moelle épinière est à la base des capacités de régénération après

transsection (Reimer et al., 2009; Kuscha et al., 2012). Cependant, chez les mammifères,

contrairement aux cellules souches présentes dans la niche neurogénique de la SVZ, la nature et

la fonction de ces cellules dans la niche neurogénique spinale restent controversées. Au niveau

spinal, si in vitro, ces cellules forment des neurosphères à l’origine de cellules gliales et de

neurones, in vivo, les cellules souches spinales semblent n'être activées qu'après lésion et se

différencient préférentiellement en cellules gliales participant à la formation de la cicatrice gliale

(Horner & Gage, 2000; Meletis et al., 2008; Sabourin et al., 2009; Sabelström et al., 2013).

En effet, chez l’adulte « sain », les cellules souches de cette niche spinale prolifèrent très

lentement ou pas et cette prolifération n’a jamais été associée, à ce jour, à une oligogénèse ni à

une neurogénèse (Meletis et al., 2008; Hamilton et al., 2009; Hugnot & Franzen, 2011). Il

semblerait que la niche spinale soit en état de quiescence en condition physiologique et qu’il y

ait un maintien du pool de cellules souches chez l’adulte qui pourrait participer aux processus

de réparation après lésions (Marichal et al., 2009; Hugnot & Franzen, 2011).

Cette distinction fonctionnelle entre ces deux niches neurogéniques (SVZ vs. épendyme spinal)

peut être liée aux différences de constitution de la couche épendymaire, puisqu’il est

maintenant établi que l’environnement moléculaire et cellulaire joue un rôle crucial dans la

maintenance des propriétés de la niche neurogénique (Conover & Notti, 2008; Ming & Song,

2011; Shook et al., 2012).

20
Introduction

3. LES NEURONES QUI CONTACTENT LE LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN : NCLCR

C'est en 1871 que le Dr. E. Landolt a visualisé par imprégnation argentique à partir de

rétine d'amphibiens, la présence de neurones particuliers de type bipolaire dont la dendrite

s’étend à travers la rétine et se termine par un renflement appelé « Landolt’s bulb » d’où émane

un cil unique (Figure. 7). La présence de ces « cellules bipolaires de Landolt » a été ensuite

décrite chez les mammifères tels que le chimpanzé et l’homme (Haverkamp et al., 2003). En

1921, W. Kolmer, décrit au niveau du troisième ventricule et du canal central de nombreux

vertébrés, des cellules de morphologie similaire aux cellules de Landolt, qui possèdent

également des renflements nerveux ou « Landolt’s bulb » baignant dans le LCR. Ces cellules

sont alors dénommées cellules de Kolmer ou cellules de Kolmer et Agduhr (KA cells) (Vigh &

Vigh-Teichmann, 1998). C'est en 1977 que l’équipe du Professeur Vigh pose le terme de

neurones de contact du LCR (NcLCR) (Vigh et al., 1977) qui regroupe l’ensemble des cellules

nerveuses de type bipolaire qui contactent les surfaces liquidiennes du SNC.

Ces neurones sont retrouvés autour des ventricules cérébraux et du canal central. Une

particularité majeure de ce système neuronal est leur grande conservation au cours de

l’évolution puisqu’ils sont retrouvés dans le SNC de l’étoile de mer (échinoderme

deutérostomien) ainsi que chez tous les chordés de l’amphioxus, un ancêtre des vertébrés,

jusqu’à l’homme (Vígh et al., 2004). Cependant, malgré cette grande conservation, leur rôle

demeure inconnu de nos jours et les fonctions suggérées sont essentiellement liées à des études

morpho-phénotypiques. Ainsi, en fonction de la structure cérébrale où sont retrouvés les

NcLCR et de leurs caractéristiques morphologiques et phénotypiques, une hypothèse

fonctionnelle est émise. Enfin, cette question reste encore plus en suspend chez les mammifères

où il n’existe que très peu de travaux visant à caractériser cette population neuronale.

Dans cette partie sera décrit l’essentiel des connaissances actuelles sur ces « vieux »

neurones qui, malgré leur grande conservation au cours de l’évolution, restent actuellement

encore très mystérieux.

21
Introduction

LCR Structure ciliée


Diffusion Bud
Cil
mobile
Cellule épendymaire

NcLCR
intra-épendymaire
NcLCR
sous-épendymaire
Tanycyte

,
Capillaire
NcLCR
distal
?
Parenchyme
axones

FIGURE 5. LES NEURONES QUI CONTACTENT LE LCR. Schéma illustrant l’organisation de la couche épendymaire avec les
cellules épendymaires et les neurones qui contactent le LCR (NcLCR) de type intra-épendymaire, sous-épendymaire et
distal.

a) Caractéristiques générales

Le terme de NcLCR représente un système neuronal qui regroupe une multitude de

neurones qui diffèrent dans leur localisation et leur phénotype. Toutefois, si chacune de ces

populations neuronales possède certaines spécificités morphologiques, on observe des

caractéristiques morphologiques communes à l'ensemble de ces neurones qui sont à la base de

cette notion de système neuronal (Figure 7). En effet, ce système comprend des neurones

majoritairement de type bipolaire qui contactent le LCR par leur soma, leur dendrite ou leur

axone. De manière générale, le prolongement dendritique se termine par une partie renflée

appelée bud qui porte une structure ciliée baignant dans le LCR (Figure 5 et 8. C-E). La présence

ainsi que la nature de ces cils dépend de l’espèce étudiée ainsi que de la région nerveuse

d’intérêt. Il convient de rappeler que les cils sont de petits appendices (0,25 µm de diamètre)

projetés à partir de la face apicale de la cellule (Figure 6). Les cils sont constitués par des

faisceaux de microtubules (MT) parallèles formant l’axonème et qui sont maintenus par le corps

basal et peuvent être révélés par un marquage anti-α-tubuline acétylée (α-Tub. Ac.) (Piperno &

Fuller, 1985).

22
Introduction

A
Cil moteur Cil primaire
Doublet de MT
périphérique
Bras de dynéine
interne
Bras de dynéine
externe Doublet de
MT central

9+ 2 9+ 0

Axonème
(doublets de
microtubules)
Membrane
intraflagellaire

intraflagellaire
Dynéine
plasmique
Transport

Transport
kinésine

Vésicule
cargo
Corps basal
(triplets de
microtubules)

Centrosome Matériel péricentriolaire

B
Cil primaire Cil moteur
Cellules rénales, pancréas, thyroïde,
Epithélium respiratoire, cellules
Localisation cellules endocrines, fibroblastes,
épendymaires
neurones, cellules musculaires lisses
Chémodétection, mécanodétection,
Migration cellulaire, reproduction
osmodétection, prolifération,
sexuelle, mouvement des fluides
Fonctions différentiation, transduction du
(LCR, mucus), développement
signal
cérébral

- Cancer
- Syndrome de Meckel-Gruber
- Polykystose rénale (PKD) - Hydrocéphalus
Ciliopathies - Néphronophthisis - Syndrome Kartagener (dyskinésies
- Rétinite pigmentaire ciliaires primitives)
- Obésité : Syndrome de Bardet-
Biedl, et d’Alström

FIGURE 6. COMPARAISON DE LA MORPHOLOGIE ET DES FONCTIONS DES CILS MOTEURS ET PRIMAIRES. A, Schémas et
micrographies illustrant les différences ultrastructurales entre cils moteurs et cils primaires ainsi que l’organisation
cytosolique permettant le transport intraflagellaire. B, Tableau résumant la localisation, les fonctions et les ciliopathies
associées aux cils moteurs et primaires.

23
Introduction

Il existe deux types de cils : les cils mobiles dont l'axonème est constitué par une

couronne de neuf doublets de faisceaux de MT et d'un doublet central (structure dite de type :

9+2) et les cils primaires dont l’axonème est constitué de neuf doublets de faisceaux de MT (9+0)

(Figure 6) et qui sont spécifiquement marqués par l'adenylate cyclase de type 3 (AC3) (Bishop et

al., 2007). Certaines pathologies sont associées à des malformations du cil ou à des défauts de

transports intra-ciliaires et sont regroupées sous le terme général de ciliopathie (Fliegauf et al.,

2007; Veland et al., 2009; Lee & Gleeson, 2011) (Tableau B Figure 6). Enfin, ces neurones

émettent un prolongement axonal dans le parenchyme dont les cibles restent inconnues à ce

jour.

Le corps cellulaire de ces neurones est plus ou moins enchâssé dans la couche épendymaire et

en fonction de la position du soma par rapport à la couche épendymaire, trois catégories de

NcLCR ont été établies (Figure 5 et 8. A et B) (Vígh et al., 2004) :

- Les NcLCR intra-épendymaires dont le corps cellulaire est localisé dans la couche

épendymaire (voir un exemple figure 8. B),

- Les NcLCR sous-épendymaires dont le corps cellulaire se trouve sous la couche

épendymaire (voir un exemple figure 8. B),

- Les NcLCR distaux qui ont le corps cellulaire localisé dans le

parenchyme, éloigné de la couche épendymaire.

En terme de localisation, à l’heure actuelle, aucune donnée ne semble indiquer que les

NcLCR soient regroupés au sein de structures nerveuses bien individualisées. Au contraire, les

NcLCR semblent plutôt distribués au sein de plusieurs noyaux cérébraux (Figure 7). De plus,

ces diverses localisations cellulaires varient également en fonction de l’espèce étudiée. Au sein

de ces diverses régions cérébrales, les NcLCR présentent différents phénotypes (Tableau 3 et 4).

Ceci traduit la grande hétérogénéité neuronale qui caractérise le système des NcCLR. Les

tableaux ci-dessous regroupent l’ensemble des structures nerveuses où la présence de NcLCR a

été décrite, chez les vertébrés non mammifères (Tableaux 3.1 à 3.6) et chez les mammifères

(Tableaux 4.1,2), ainsi que les phénotypes des NcLCR dans ces régions. La plupart des NcLCR,

chez les vertébrés non mammifères, sont retrouvés dans le diencéphale et plus particulièrement

dans l’hypothalamus (Tableaux 3.2 à 3.4). Nous verrons tout d'abord les caractéristiques

morphologiques en fonction de la localisation des NcLCR chez les vertébrés non mammifères

(Tableau 3) de la zone bulbo-spinale et mésencéphalique (Tableau 3.1), du noyau

24
Introduction

magnocellulaire hypothalamique (Tableau 3.2), du noyau parvocellulaire hypothalamique

(Tableau 3.3), de la zone périventriculaire du 3V (Tableau 3.4), des aires photoréceptrices

(Tableau 3.5) et de la région télencéphalique (Tableau 3.6). Chez les mammifères, nous avons

regroupé d'une part les caractéristiques des NcLCR intra- et sous-épendymaires (Tableau 4.1) et

énuméré celles des NcLCR distaux (Tableau 4.2).

FIGURE 7. LE SYSTEME DES NEURONES QUI CONTACTENT LE LCR : ORGANISATION CELLULAIRE. 1, NcLCR péri-ventriculaires
spinaux ; C : cellule coronet ; CST : Trajet centro-superficiel ; F : Fibre de Reisner ; H : NcLCR hypothalamiques ; Hy :
Hypophyse ; LC : cellules de Landolt ; LV : Ventricule latéral ; ME : Eminence médiane ; LCR : Liquide céphalo-rachidien ;
N : NcLCR de la glande pinéale ; NcLCR : Neurones qui contactent le LCR ; NT : Terminaisons neuro-hormonales ; OVLT :
Organe vasculaire de la lame terminale ; PIN : cellules de la glande pinéale qui contactent le LCR ; R : Noyau du Raphé ;
RET : Rétine ; S : Synapses ; SEP : Aire septale ; SCO : Organe sous-commissural ; SP : NcLCR bulbo-spinaux ; TEL :
Télencéphale ; TF : Filum terminal ; UF : Urophyse ; VS : NcLCR du sac vasculaire ; Astérisques : NcLCR intra-
ventriculaires. D’après Vigh et al., 1998,

25
Introduction

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce/Classe
exprimée Morphologique
ACh (ACh esterase+),
Monoamines,
Dendrite en contact avec le LCR Poisson
Urotensine II,
Somatostatine, au niveau apical,
Zone bulbo-spinale
Présence de plusieurs stéréocils et
(partie distale du 4V GABA Amphibiens
d’un kinocil moteur (9 + 2)
jusqu’au filum terminal) GABA1, GABA + DA1,
Prolongement basal de type Lamproie marine
Glutamate2
axonal (trajet centro-superficiel)
5-HT3 Brochet alligator
Catécholamines (TH+)4 Poisson chien
NcLCR intra- ou sous-
épendymaires, 2 formes de
terminaisons dendritiques en
contact avec le LCR :
ACh (ACh esterase+),
Grosses terminaisons,
Urophyse Urotensine I, II, Poisson
Petites terminaisons possédant
Sauvagine-like
plusieurs cils
Terminaisons axonales dans la
surface externe de l’urophyse et
du filum terminal
Tectum optique NcLCR avec un corps cellulaire de Poisson
Monoamines
mésencéphalique gros diamètre cartilagineux

TABLEAU 3. 1. NcLCR DE LA ZONE BULBO-SPINALE ET MESENCEPHALIQUE CHEZ LES VERTEBRES NON MAMMIFERES. D'après
Vigh & Vigh-Teichmann, 1998 ; 1 : Rodicio et al., 2008 ; 2 : Fernández-López et al., 2012 ; 3 : Chiba, 2007 ; 4 : Sueiro et
al., 2003.

26
Introduction

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce/Classe
exprimée Morphologique
Gomori positifs,
Multipolaires, NcLCR intra-
Neurophysine, épendymaires, dendrite au contact
Vasotocine, du LCR Poisson,
Isotocine/Mésotocine Présence d’un cil unique (9 + 0), Amphibiens
Noyau pré-optique Enképhaline Terminaison dendritique contenant
(Hypothalamus) des granules de sécrétion

Gomori négatif, prolongement Poisson :


ACh
dendritique dans le LCR Téléostéen
LHRH Cyclostomes
ND
TRH, α-MSH, CRF Grenouille
Terminaison dendritique
intraventriculaire contenant des
granules de sécrétion et portant un
cil unique (9 + 0)
ACh (ACh esterase ), + Synapses axo-dendritiques Reptiles, oiseaux,
Noyau paraventriculaire Somatostatine, provenant d’axones volaille, pigeon,
(Hypothalamus) Neurophysine*, intraventriculaires canard, lézards*,
CRF** Terminaisons axonales retrouvées tortue**
sur d’autres neurones
magnocellulaires, ou vers
l’éminence médiane
(neurosécrétion)
Projection d’une très large
terminaison dendritique dans le
LCR qui porte un cil (9 + 0),
ACh (ACh esterase+),
Granules de sécrétion dans la
Noyau tubéral (Noyau NPY, ACTH, Poisson,
terminaison dendritique,
latéral du Tuber) Calbindine D, Phe- Téléostéens
Synapse axo-dendritique provenant
Met-Arg-Phe-NH2
d’axones supra-épendymaires,
Projections axonales vers la
neurohypophyse

TABLEAU 3. 2. NcLCR DU NOYAU MAGNOCELLULAIRE HYPOTHALAMIQUE CHEZ LES VERTEBRES NON MAMMIFERES. ACh :
acétylcholine ; LHRH : Luteinizing hormone-releasing hormone ; TRH : thyrotropin-releasing hormone ; α-MSH : α-
melanocyte-stimulating hormone ; CRF : corticotropin-releasing factor ; NPY : neuropeptide Y; ACTH :
adrenocorticotrophine ; ND : non défini. D'après Vigh & Vigh-Teichmann, 1998.

27
Introduction

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce/Classe
exprimée Morphologique
2 populations :
- Intra/sous-épendymal : large
Catécholamines terminaison dendritique contenant
(TH , DA ),
+ + des granules de sécrétion
Monoamines, - Distal : petites terminaisons
Noyau Préoptique Amphibiens,
Somatotropine, dendritiques
Parvocellulaire Poissons, Reptiles
Prolactine, Substance Chacune de ces terminaisons
P, Calcitonine, présente un cil (9 + 0)
GABA, Galanine Prolongements axonaux vers la
zone périventriculaire
hypothalamique et l’hypophyse
Multipolaires (reptiles),
Terminaison dendritique Poissons osseux,
Noyau Périventriculaire ACh (ACh esterase+),
intraventriculaire ciliée (9 + 0), Amphibiens,
antérieur Somatostatine
Terminaisons axonales dans la Reptiles
neurohypophyse
ACh (ACh esterase ), + Terminaison dendritique
Catécholamines, 5- intraventriculaire contenant des Amphibiens*,
HT*, Gastrine*, granules de sécrétion et recevant lamproie marine**
Noyau Infundibulaire
Somatostatine* **,, des synapses d’axones Reptiles, Oiseaux
VIP*, Galanine intraventriculaires
Somatostatine ND Lamproie marine
Noyau Mammillaire
Hypothalamique Bipolaires, Terminaison dendritique
DA1 Lamproie
(paroi récessus intraventriculaire
infundibulaire)

TABLEAU 3. 3. NcLCR DU NOYAU PARVOCELLULAIRE HYPOTHALAMIQUE CHEZ LES VERTEBRES NON MAMMIFERES. TH :
tyrosine hydroxylase ; DA : dopamine ; GABA : acide-γ-aminobutyrique ; ACh : acétylcholine ; 5-HT : sérotonine ;
VIP : Vasoactive intestinal peptide. D'après Vigh & Vigh-Teichmann, 1998 ; 1 : Vigh-Teichmann & Vigh, 1989.

28
Introduction

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce/Classe
exprimée Morphologique
NcLCR intra- sous-épendymaire Amphibien*,
et distal Volaille,
NA, DA, L-Dopa, 5- (NcLCR GABA : distaux),
+ Téléostéen**, Sterlet,
HT, Monoamines, L’accumulation de catécholamine Poisson chien,
GnRH II*, ACh** semble provenir de sources Poisson
externes (pas de synthèse dans les cartilagineux,
NcLCR). Reptiles
Projection d’une terminaison Esturgeon blanc,
dendritique intraventriculaire Poisson chien,
VIP dont la taille dépend du type Saumon
neuronal (distal vs. sous- d’Atlantique,
Organe épendymaire). Présence d’un cil (9 Lézard
Paraventriculaire + 0), Synapses axo-dendritiques Triton, Grenouille
GABA
intraventriculaires, Granules de verte
Substance P, sécrétions dans la terminaison
Reptiles
Galanine dendritique, Nombreuses
CRF synapses axo-somatiques, axo- Tortue
dendritiques et axo-axoniques,
Projections axonales vers
l’éminence médiance,
NO l’hypothalamus, le thalamus, le Truite arc-en-ciel
striatum, l’habenula, le
mésencéphale, le rhombencéphale
et la moelle épinière
Granules denses dans le
prolongement ventriculaire apical
Recessus postérieur et le soma. Connections Pigeon, Poulet
5-HT
(Plancher du 3V) synaptiques sur le prolongement domestique
basal, Projections vers la tige
pituitaire
Bipolaires, Terminaison
dendritique intraventriculaire
ciliée (9 + 0) contenant quelques
granules de sécrétion, Synapses
Sac Vasculaire ACh Poissons,
axo-somatiques, projections
axonales dans le sac vasculaire et
vers la lame basale du système
nerveux

TABLEAU 3. 4. NcLCR DES ORGANES PERIVENTRICULAIRES HYPOTHALAMIQUES CHEZ LES VERTEBRES NON MAMMIFERES.

NA : noradrénaline ; DA : dopamine ; 5-HT : sérotonine; GnRH : gonadotropin-releasing hormones ; ACh :


acétylcholine ; VIP : Vasoactive intestinal peptide ; GABA : acide-γ-aminobutyrique ; CRF : corticotropin-releasing
factor. D'après Vigh & Vigh-Teichmann, 1998.

29
Introduction

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce/Classe
exprimée Morphologique
Aire septale et Région Fibres axonales dans le neuropile
VIP, Opsine Oiseaux
Tubérale hypothalamique

Opsine, Rétinoïdes*
Noyau commissural (associés à la
ND Lézard*, Lamproie**
post-optique phototransduction),
α-transducine**

Bipolaires, terminaison
dendritique portant un cil (9 + 0)
dans l’espace dérivé du ventricule
optique (diverticule du 3V),
Rétine Glutamate Amphibiens
Synapses provenant des
photorécepteurs,
Projections axonales vers la
couche plexiforme interne
Terminaison dendritique intra-
ventriculaire ciliée (9 + 0), NcLCR
glutamatergiques reçoivent des
Reptiles,
Organe Pinéal afférences axonales des
ACh (ACh estérase+), Amphibiens,
(organe circum photorécepteurs locaux. Les
Glutamate, GABA Lamproie,
ventriculaire) neurones GABAergiques forment
Téléostéen
des synapses intra-pinéales,
Présence de connections directes
vers le tronc cérébral

TABLEAU 3. 5. NcLCR DES AIRES PHOTORECEPTRICES CHEZ LES VERTEBRES NON MAMMIFERES. VIP : Vasoactive intestinal
peptide ; ACh : acétylcholine ; GABA : acide-γ-aminobutyrique. D'après Vigh & Vigh-Teichmann, 1998.

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce/Classe
exprimée Morphologique
NcLCR intraépendymaires,
Télencéphale bipolaires, Terminaison
(Ventricules Latéraux) dendritique intra-ventriculaire,
VIP, 5-HT, opsine Reptiles, Oiseaux
Septum latéral/Noyau Axones des NcLCR VIP+ forment
Accumbens une aire terminale dense dans le
septum latéral

TABLEAU 3. 6. NcLCR DANS LES REGIONS TELENCEPHALIQUES DES VERTEBRES NON MAMMIFERES. D'après Vigh & Vigh-
Teichmann, 1998.

TABLEAU 4. 1. NcLCR INTRA ET SOUS-EPENDYMAIRES CHEZ LES MAMMIFERES. D'après 1 : Vigh & Vigh-Teichmann, 1998 ;
2 : Zhang et al., 2003 ; 3 : Sancesario et al., 1996 ; 4 : Gorcs et al., 1985 ; 5 : Xiao et al., 2005. (+) ou (++) : traduit le niveau
d'expression. (Voir page suivante)

30
Introduction

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce
exprimée Morphologique
VIP Chat, Singe
L-acide aminé
aromatique
décarboxylase,
Souris
Met-Enk-Arg6-Gly7-
Leu8, Intra-, sous-épendymaires. Type
Zone bulbospinale1
GABA bipolaire. Terminaison
(partie distale du 4V
L-acide aminé dendritique intra-ventriculaire
jusqu’au filum terminal)
aromatique comportant un cil (9 + 2)
décarboxylase,
Rat
Met-Enk-Arg6-Gly7-
Leu8,
GABA
ND Lapin
Fibres et neurones 5-HT en +

pie mère au niveau contact avec le LCR sous-


ventral de la medulla 5-HT arachnoïdien. Rat
oblongata 4 NcLCR bipolaires (++) et
multipolaires (+)
Terminaison dendritique
intraventriculaire avec un cil (9 +
Noyau Arqué1 Rat, Cochon d’Inde,
CRF 0). Terminaisons axonales de type
(Hypothalamus) Hedgehog
neurohormonale dans l’éminence
médiane
Noyau
Rat, Opossum,
Périventriculaire1,3 NO (NADPH+) Intra-, sous-épendymaires
Hedgehog
(autour du 3V)
Intra-, sous-épendymaires et
3V5 (de la commissure
NO + Ocytocine (++) distaux. Soma de type
antérieure à la partie
magnocellulaire
postérieure du PVN : Rat
Intra-, sous-épendymaires et
comprenant les NSO et le NO + Vasoporessine
distaux. Soma de type
NPV) (+)
magnocellulaire
Cochon d’Inde,
Noyau Pré-optique Sous-épendymaires.
ND Chat, Hedgehog,
Parvocellulaire1 Présence d’un cil (9 + 0)
Opossum
Noyau du Septum
Latéral2,3 NO (NADPH+) Rat
NcLCR :
(autour des VL)
- Intra-épendymaires,
Corps Calleux3
NO (NADPH+) multipolaires Rat
(autour des VL)
- Sous-épendymaires, bipolaires
Noyau caudé et
ou multipolaires
Putamen3 NO (NADPH+) Rat
(autour des VL)

31
Introduction

Substance bioactive Caractéristique


Structure Espèce
exprimée Morphologique
Plancher du 4V ND NcLCR distaux Rat
Noyau Thalamique
ND NcLCR distaux Rat
antérodorsal
Noyau
ND NcLCR distaux Rat
Supramammillaire
NcLCR distaux,
Synapses
axodendritiques et
Noyau Raphé Dorsal1 5-HT, Substance P5 Rat
dendrodendritiques
provenant de neurones
non-NcLCR
Olive Latéral Supérieur ND NcLCR distaux Rat

TABLEAU 4.2. NcLCR DISTAUX AU SEIN DU SNC DE MAMMIFERES. D'après Zhang et al., 2003 ; 1 : Lu et al., 2009.

En plus des neurones qui contactent le LCR par leur terminaison dendritique, de

nombreux axones ou corps cellulaires intra-ventriculaires au contact du LCR ont été décrits

(Vigh & Vigh-Teichmann, 1998). Chez le chat, dans la lumière du récessus infundibulaire se

trouvent des neurones circulant librement tandis que chez le singe un plexus nerveux a été

décrit dans les ventricules. Des axones sont également trouvés dans la lumière du 3V, chez

différentes espèces de l’oiseau aux mammifères (Westergaard, 1972). Certains NcLCR du noyau

du raphé projettent leur axone dans les zones intra-ventriculaires (Vigh-Teichmann & Vigh,

1989). Ces axones contiennent divers types de granules de sécrétion et peuvent établir des

contacts synaptiques avec la surface de l’épendyme, les dendrites intra-ventriculaires des

NcLCR mais également au niveau du soma des neurones présents dans le parenchyme (Vigh &

Vigh-Teichmann, 1998) . Enfin, les terminaisons axonales des neurones présents dans les zones

neurohémales (la neurohypophyse, l'éminence médiane ou l’urophyse) contactent le LCR

externe au niveau des espaces sous-arachnoïdiens, ces neurones font donc également partie du

système des NcLCR.

Le système des NcLCR est donc très hétérogène et regroupe des populations neuronales

diverses tant sur leur localisation que sur leur phénotype ou leur morphologie (Figure 7). De

plus, cette variabilité est augmentée par l’existence d’une différence inter-espèce, qui fait qu’une

« même population neuronale », en termes de localisation, possède des spécificités

phénotypiques et/ou morphologiques. Chez les mammifères, seuls les NcLCR bulbo-spinaux

32
Introduction

semblent avoir conservé les critères morphologiques des NcLCR ancestraux (bipolarité et

émission d’un prolongement intraventriculaire dont la partie terminale est épaissie).

Dans la partie suivante concernant l’ultrastructure des NcLCR, nous focaliserons notre

attention uniquement sur les NcLCR bulbo-spinaux.

b) Ultrastructure des NcLCR bulbo-spinaux

Chez le rat, les NcLCR de la zone bulbo-spinale sont générés à partir de la zone

ventriculaire au stade embryonnaire E7 jusqu’au stade E22 (Figure 10. B), la majorité étant

produite à E14 (Marichal et al., 2009; Kútna et al., 2013). Ces neurones sont retrouvés dès la

naissance tout le long du canal central, de la partie distale du 4V jusqu’au filum terminal de la

moelle épinière (Shimosegawa et al., 1986; Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Stoeckel et al., 2003;

Huang et al., 2006). A ce niveau, les NcLCR sont de type intra/sous-épendymaux avec un soma

situé dans/sous la couche épendymaire constituant le canal central, au niveau de la medulla

oblongata, de la moelle épinière et du filum terminal. Chacune de ces cellules émet un

prolongement dendritique (Figure 8. A) vers le canal central, dont la partie terminale élargie

(bud ; Figure 8. C) porte généralement une structure ciliée (Figure 8. C-E) (Vigh et al., 1983).

Ces neurones sont majoritairement de type bipolaire (Shimosegawa et al., 1986; Stoeckel et al.,

2003), à l’exception d’une étude sur la moelle épinière de singe et de chat où les NcLCR de la

moelle thoracique et sacrée sont multipolaires (LaMotte, 1987). Ils émettent un prolongement

axonal dans le parenchyme (Figure 9), dont la cible, chez les mammifères, reste encore

inconnue. Vigh et collaborateurs ont montré dans leur étude sur les terminaisons axonales des

NcLCR spinaux, que celles-ci ne pouvaient être suivies sur de longues distances que chez les

reptiles et les oiseaux (Vigh et al., 1977), rendant plus difficile la mise en évidence de la nature

des cibles chez toutes autres espèces.

Ultrastructure du soma :
Au niveau de la moelle épinière du rat adulte, le soma des NcLCR se trouve soit inséré

dans la couche épendymaire (NcLCR intra-épendymaire), soit bordant la face basale de

l’épendyme (NcLCR sous-épendymaire). Le soma apparait, en général, de forme ronde ou

ovoïde et de manière plus spécifique (dépendante du marqueur utilisé pour révéler les NcLCR),

de forme triangulaire (NcLCR exprimant le récepteur à l’ATP P2X2 ; Figure 8. A) ou en forme de

33
Introduction

canne (NcLCR exprimant un dérivé de la pro-enképhaline, la Met-Enk-Arg6-Gly7-Leu8) (Barber

et al., 1982; Shimosegawa et al., 1986; Nagatsu et al., 1988; Stoeckel et al., 2003). De ce fait, une

nomenclature permettant de distinguer les différents sous-types de NcLCR (Figure 9. A) a été

établie. Quand le soma est ovale ou polygonal, les NcLCR sont dits de Type I et II, lorsqu’ils

sont longiformes et en forme de canne, on parlera alors de NcLCR de Type III. Ces catégories

prennent également en compte l’orientation du prolongement axonal (voir partie axone et

Figure 9. A) (Shimosegawa et al., 1986).

FIGURE 8. ULTRASTRUCTURE DES NEURONES QUI CONTACTENT LE LCR. A, Coupes coronales de moelle épinière thoracique
chez le rat marquée pour P2X2 montrant la présence de NcLCR localisés sous la couche épendymaire et qui projettent une
extension vers la lumière du cc (flèche). Dans la partie ventrale de l’épendyme, le marquage correspond à des faisceaux
d’axones sectionnés (triangles noirs). Barre d’échelle : 10 µm. D’après Stoeckel et al., 2003. B, Image en lumière transmise
montrant deux types de NcLCR exprimant nNOS (triangles noirs) autour du troisième ventricule : intra-épendymaire
(gauche) et sous-épendymaire (droite). Ces neurones émettent tous un prolongement (flèche) vers la lumière du troisième
ventricule (3V). Barre d’échelle : 50 µm. Adapté de Xiao et al., 2005. C, Micrographie en microscopie électronique montrant
un NcLCR de la moelle épinière de rat. N, noyau d’un NcLCR ; E, cellules épendymaires; cc, canal central; triangles noirs,
immunoréactivité pour la sous unité P2X2. Agrandissement en bas à gauche, contact synaptique sur le pôle basal du soma ; en
bas à droite, extension globulaire (bud) se terminant par un cil au niveau du canal central (flèches noires). Triangles noirs,
jonctions de type zonula adherens avec les épendymocytes. Echelle : 1 µm en haut et 0,5 µm en bas. Adapté de Stoeckel et al.,
2003. D, Coloration de golgi d’un NcLCR spinal chez la tortue révélant la présence d’un corps cellulaire (P) dans la couche
épendymaire d’où émerge un prolongement dendritique projeté dans le LCR et dont la terminaison possède des stéréocils
(large flèche). L’axone présente des varicosités (petites flèches) et s’étend en direction ventro-latérale. X 1200. D’après Vigh
et al., 1977. E, Visualisation des terminaisons dendritiques intra-ventriculaires de NcLCR (astérisques blancs, à gauche) chez
la tortue, caractérisées par la présence de stéréocils (S) et d’un kinocil (étoile, à droite). Les triangles montrent le cil des
cellules épendymaires (à gauche). X 10 000 (microscopie électronique à balayage). F, Fibre de Reissner (astérisques noirs) en
contact étroit avec les cils présents dans le canal central au niveau de la medulla oblongata chez la carpe. X 12 000
(microscopie électronique à balayage). Adapté de Vigh et al., 2004. (Voir page suivante).

34
Introduction

A B

cc

C D
cc

cc

Bud

cc

E F

FIGURE 8. ULTRASTRUCTURE DES NEURONES QUI CONTACTENT LE LCR

35
Introduction

Le soma des NcLCR est en général petit, de l’ordre d’une dizaine de micromètres de diamètre

(Barber et al., 1982; Stoeckel et al., 2003). Cependant, Shimosegawa et collaborateurs décrivent

des NcLCR dont le diamètre du corps cellulaire est plus important et varie entre 13 et 28 µm

(Shimosegawa et al., 1986). Cette différence peut s’expliquer par l’existence de différentes

populations de NcLCR au niveau spinal. En effet, Barber et collaborateurs, dans leur étude sur

la cytoarchitecture des neurones GABAergiques spinaux, décrivent deux types de NcLCR en

fonction de leur forme. Le premier a un soma de forme sphérique, dont le diamètre est de

l’ordre de la dizaine de micromètres, tandis que le deuxième de forme plus allongée, a un

diamètre plus petit (entre 5,3 et 9 µm) mais une longueur de 22 µm. Dans le cytoplasme des

NcLCR spinaux, se trouvent un abondant réticulum endoplasmique rugueux et de nombreux

ribosomes libres, signe de synthèse protéique importante à ce niveau. Le noyau des NcLCR

apparait plus sphérique que celui des cellules épendymaires et le patron de condensation de la

chromatine est similaire entre ces deux types cellulaires (Barber et al., 1982; Marichal et al., 2009).

Le soma contient des vésicules de sécrétion et reçoit de nombreuses synapses axo-somatiques

provenant d’afférences synaptiques d’origine inconnue contenant des vésicules de sécrétion

(diamètre de 65 nm) et des vésicules synaptiques (Barber et al., 1982; Vigh et al., 1983;

Shimosegawa et al., 1986). Des terminaisons axonales immunoréactives pour le peptide Met-

Enk-Arg6-Gly7-Leu8_like ainsi que pour l'enzyme de synthèse du GABA la "glutamic acid

decarboxylase" (GAD) ont été décrites au contact du soma des NcLCR et pourraient

correspondre en partie à ces afférences synaptiques (Barber et al., 1982; Shimosegawa et al., 1986;

Russo et al., 2004; Reali et al., 2011). Enfin, des nombreuses fibres immunoréactives pour les

enzymes de synthèse de la dopamine (DA) et de la noradrénaline (NA) sont situées autour du

canal central et pourraient également représenter ces afférences (Nagatsu et al., 1988).

Ultrastructure de la dendrite & Bud :


Les NcLCR bulbospinaux projettent un prolongement de type dendritique vers le canal

central dont le diamètre varie entre 1,4 et 2,9 µm (Shimosegawa et al., 1986). Cette extension

apicale des NcLCR est en contact étroit avec la couche épendymaire par l’intermédiaire de

jonctions adhérentes de type Zonula Adherens (triangles noirs Figure 8. C) (Stoeckel et al., 2003).

La terminaison dendritique ou bud est en général de forme ovoïde, son diamètre est compris

entre 2,1 à 7,1 µm chez le rat (Barber et al., 1982; Shimosegawa et al., 1986) et entre 4 et 5 µm

chez le chat et le singe, ce qui correspond environ au double du diamètre de la dendrite

36
Introduction

(LaMotte, 1987). Cette terminaison contient des éléments indispensables à une éventuelle

neurosécrétion telles que des vésicules de sécrétion (diamètre de quelques centaines de nm) et

de nombreuses mitochondries (Vigh et al., 1977; Vigh & Vigh-Teichmann, 1998). Classiquement,

le bud porte une structure ciliée (Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Stoeckel et al., 2003). Le nombre

de cils varie en fonction de l’espèce étudiée, mais de manière générale la structure du cil est de

type 9 + 2. Chez les vertébrés non-mammifères, le bud porte plusieurs stétéocils à l’exception de

la tortue où un kinocil se supplémente à de nombreux stéréocils (Vigh & Vigh-Teichmann,

1998). Chez les mammifères, la présence de ce cil est plus controversée. Ainsi chez le cochon

d’Inde et l’opossum, plusieurs stéréocils sont présents sur le bud tandis que chez la souris

seulement quelques stéréocils sont présents (Vigh-Teichmann & Vigh, 1983). Chez le rat, un cil

unique est parfois observé (Stoeckel et al., 2003) et sa présence est confortée par l'expression

d’une protéine constituant le centriole : PCM-1 (pericentriolar material 1) au niveau du bud

(Marichal et al., 2009). Enfin, chez le lapin, il semblerait que les NcLCR spinaux soient

dépourvus de cil (Vigh et al., 1977).

Ultrastructure de l’axone :
Un prolongement de type axonal part du soma des NcLCR et s’étend dans le

parenchyme. Proche du soma, quelques collatérales axonales sont décrites dont les cibles sont

inconnues (Figure 9. A) (Vigh et al., 1977). Une deuxième grande question qui semble

primordiale pour la compréhension de ce système neuronal est : où vont ces axones et qu’elles

en sont les cibles ? Bien qu’à l’heure actuelle ces cibles restent hypothétiques, quelques voies

neuronales ont été décrites. Communément, il est décrit que ces axones sont regroupés en

quelques faisceaux fins d’axones non myélinisés intrinsèques à la couche épendymaire (Vigh et

al., 1977; Stoeckel et al., 2003).

Chez les vertébrés non mammifères (reptiles, amphibiens, oiseaux), Vigh et collaborateurs,

décrivent des projections axonales qui traversent le parenchyme pour rejoindre la surface de la

moelle épinière et le tissu méningé. Ce trajet constitue la voie centro-superficielle (Figure 9. B et

C). Les axones des NcLCR s’étendent en faisceaux pairs, d’abord latéralement, puis tournent

ventro-latéralement jusqu’à la colonne dorsale. Ils traversent la substance grise, entrent dans la

substance blanche pour finir sur la surface ventro-latérale de la moelle épinière. A ce niveau, les

terminaisons axonales sont élargies, elles contiennent des granules de sécrétions (60 à 180 nm),

des vésicules synaptiques (20 à 40 nm) ainsi que de nombreuses mitochondries et s’immiscent

37
Introduction

entre les pieds astrocytaires. Ces substances neuroactives semblent pouvoir être déversées dans

le LCR sous-arachnoïdien et au niveau des vaisseaux méningés, de part les contacts étroits entre

les terminaisons axonales et la lame basale ou les vaisseaux de la lame basale. Ces terminaisons

sont attachées à la lame basale de la surface de la moelle épinière par des hémidesmosomes où

s'accumulent les vésicules synaptiques (Vigh et al., 1977). Ces terminaisons atypiques des

NcLCR spinaux sont retrouvées dans les zones neurosécrétrices (Vigh et al., 1977, 1983) ce qui

permet de suggérer que ces neurones représentent un système neurosécréteur spinal.

FIGURE 9. PROLONGEMENTS AXONAUX DES NCLCR ET VOIES DE PROJECTIONS. A, NcLCR spinaux immunoréactifs pour la
Met-Enk-Arg-Gly-Leu autour du cc x 1400. En fonction de la forme du corps cellulaire et du lieu d’émission de l’axone
(pointes de flèche), trois sous types sont définis (schéma du dessous). Le prolongement de type axonal émerge de différentes
zones cellulaires : de la partie basale (type I) ou latérale (type II) du corps cellulaire , à la base ou au milieu du prolongement
(type III) qui contacte le LCR (flèche). D’après Shimosegawa et al., 1986. Bb, Arrangement circulaire des NcLCR autour du
cc. x 480. Bc, Les axones des NcLCR (flèches larges) projettent vers la surface ventro-latérale de la moelle épinière (petites
flèches). C, Représentation schématique de l’organisation du système de NcLCR spinal. Les NcLCR reçoivent des synapses
sur leur corps cellulaire dont l’origine n’est pas identifiée, ont un prolongement dendritique qui se termine dans le LCR et
des terminaisons axonales accolées à la lame basale à la surface du tissu nerveux. Adapté de Vigh et al., 1977. D,
Immunoréactivité anti-GAP43 et GAD révélant des faisceaux d’axones autour du canal central (pointes de flèche) et contre
la fissure ventro-médiane (flèche) sur coupes de moelle épinière coronales (D1) et transversales (D2). Barre d’échelle 100 µm.
Adapté de Stoeckel et al., 2003. cc : canal central ; CST : trajet centrosuperficiel formé par les axones des NcLCR ; E :
épendymocytes ; F : filum moteur radiculaire ; FM : Fissure ventro-médiane ; Ft : Filum terminal ; Mo : medulla oblongata ;
N : NcLCR ; NTA : aire des terminaisons nerveuses formée par les axones des NcLCR ; R : fibre de Reissner ; S : différent
types d’hémidesmosomes synaptiques au niveau de la lame basale à la surface de la moelle épinière ; Ve : vaisseaux
méningés. (Voir page suivante).

38
Introduction

A
C.C.

Type I Type I’ I ’’ Type II Type III

B C

D1 D2
GAP-43 GAD GAP-43

GAD

FM

FM

FIGURE 9. PROLONGEMENTS AXONAUX DES NCLCR ET VOIES DE PROJECTIONS.

39
Introduction

Chez les mammifères, les études ont été majoritairement réalisées sur le rat.

Shimosegawa et collaborateurs ont décrit des projections axonales qui partent du soma dans

une direction dorsale puis tournent ventro-latéralement (Figure 9.A). Cependant, ne pouvant

suivre ces prolongements que sur de courtes distances (150 µm), les auteurs n’ont pas pu mettre

en évidence le site de projection. L'axone est émis à partir de différentes parties des NcLCR, leur

corps cellulaire et la neurite projetée vers le LCR (Figure 9.A). Ainsi, l'axone peut prendre

naissance à partir de la surface basale (Type I) ou latérale (Type I’ et I’’) du corps cellulaire, mais

également au niveau du prolongement émis vers le LCR, à son lieu d’émergence (Type II) où

dans le prolongement lui-même (Type III). Les NcLCR spinaux sont essentiellement de type I, le

type II et III étant observés beaucoup plus rarement (Shimosegawa et al., 1986).

Au niveau spinal de fins faisceaux axonaux regroupant environ 250 axones de 150 nm de

diamètre s’étendent de manière longitudinale (Figure 9. D2). Certains faisceaux bordent la

couche épendymaire ou s’insèrent dans la partie basale de cette couche (Figure 9. D1). Certains

prolongements axonaux établissent des contacts desmosomaux avec les cellules épendymaires,

d’autres contactent directement le LCR ou les extensions des vaisseaux sanguins localisées sous

la couche épendymaire. D’autres faisceaux axonaux s’étendent dans la partie ventro-latérale ou

au niveau de la fissure ventro-médiane de la moelle épinière thoracique et lombaire (Figure 9.

D1), bien que l'origine de ces faisceaux n'ait pas été confirmée (LaMotte, 1987; Stoeckel et al.,

2003). Au niveau de la fissure ventro-médiane de la moelle thoracique, ces faisceaux sont

localisés entre les espaces des axones myélinisés de la voie corticospinale (Figure 9. D1). Dans

les parties plus caudales, quelques faisceaux sont regroupés contre la fissure ventro-médiane et

sont séparés de la lame basale de la moelle épinière par une fine couche d’extensions gliales

(Stoeckel et al., 2003). Ces axones présentent des varicosités qui contiennent la synaptotagmine

suggérant la présence de boutons synaptiques pouvant être impliqués dans une libération

synaptique de type "en passant" (LaMotte, 1987; Stoeckel et al., 2003).

L’ultrastructure des NcLCR spinaux a donc été très étudiée chez les vertébrés mais celle

des NcLCR de la zone médullaire reste moins connue à ce jour. Il semble que plusieurs types de

NcLCR, différents dans leur morphologie et dans leur phénotype existent au sein de la moelle

épinière, même si en général, l’ensemble de ces neurones partagent des liens étroits avec la

couche épendymaire et le LCR (Vigh et al., 1983; Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Stoeckel et al.,

2003). De part ce contact étroit avec le LCR et de part la présence de vésicules de sécrétions au

40
Introduction

niveau du bud, une libération de substances neuroactives dans le canal central est suggérée

(Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Vígh et al., 2004). D’autre part, la présence de contacts

synaptiques sur le soma des NcLCR indique que ces neurones sont intégrés dans un réseau

neuronal. Mais la nature de ces afférences synaptiques est encore inconnue surtout sur un plan

fonctionnel. Un deuxième mystère, qu'il parait indispensable de résoudre pour la

compréhension de ce système neuronal est celui du lieu de projection ainsi que de la nature des

cibles des NcLCR.

Actuellement, sur la base des diverses caractérisations morphologiques, deux théories sont

proposées. D’une part, il est suggéré que les NcLCR puissent recevoir des informations

nerveuses et qu’ils émettent des substances neuroactives dans le LCR et non pas vers d’autres

neurones. Ainsi, ce système neuronal serait impliqué dans un transfert monodirectionnel

d’informations, qui irait dans le sens parenchyme-LCR (Zhang et al., 2003). D’autre part, du fait

de la morphologie spécialisée de la dendrite et du bud, ces neurones semblent être impliqués

dans une fonction sensorielle. Ainsi, le bud grâce aux structures ciliées qu’il porte, agirait

comme un récepteur sensoriel permettant de détecter des variations chimiques ou mécaniques

du LCR (Vigh et al., 1977, 1983).

c) Phénotype des NcLCR bulbo-spinaux

Comme nous l’avons vu précédemment, les NcLCR spinaux présentent plusieurs

phénotypes (Tableau 3 et 4) et les substances neuroactives exprimées varient d’une espèce à

l’autre. Ainsi, chez les vertébrés non mammifères, poissons et amphibiens, une grande partie

des neurotransmetteurs conventionnels y sont retrouvés (GABA, 5-HT, Glu, ACh,

catécholamine) ainsi que quelques neuropeptides (Urotensine II et Somatostatine) (Vigh &

Vigh-Teichmann, 1998). Chez les mammifères, les NcLCR actuellement décrits sont

principalement GABAergiques (expression de l’enzyme de synthèse du GABA : la GAD)

(Barber et al., 1982; Stoeckel et al., 2003; Kútna et al., 2013) ou expriment certains neuropeptides

tel que le dérivé de la pro-enképhaline, le peptide Met-Enk-Arg6-Gly7-Leu8_like (Shimosegawa

et al., 1986) ou le VIP (LaMotte, 1987). De manière intéressante, chez la tortue, les NcLCR

spinaux, sont tous immunoréactifs pour le GABA tandis que très peu le sont pour la GAD. Il se

pourrait que dans ces cellules, la synthèse de GABA soit réalisée de manière atypique à partir

de la putréscine, phénomène observable au cours du développement de la rétine lors duquel le

41
Introduction

GABA est d’abord synthétisé sous l’action de l’ornithine décarboxylase avant que cette synthèse

soit prise en charge par la GAD (Reali et al., 2011).

Chez la souris et le rat, certains NcLCR bulbo-spinaux expriment l’enzyme décarboxylase des L-

acide aminé aromatiques (AADC), intervenant dans la synthèse de la dopamine (DA) et de la

sérotonine (5-HT), mais sont immunonégatifs pour ces monoamines ainsi que pour les autres

enzymes de synthèse des catécholamines telle que la tyrosine hydroxylase (TH) (Nagatsu et al.,

1988). Ainsi, il est suspecté que ces neurones puisse être la source de trace amine comme par

exemple la tyramine ou la tryptamine.

Mais il semble également qu’il existe différents types de NcLCR au sein d’une même espèce

puisque chez le rat, certains NcLCR expriment la GAD et donc semblent être GABAergiques

tandis que d’autres sont immunoréactifs pour le peptide Met-Enk-Arg6-Gly7-Leu8_like. Si une

co-expréssion de ces deux substances pourrait sembler plausible, cette hypothèse a été écartée

puisque la forme et la distribution de ces divers types neuronaux ne correspondent pas. Enfin, il

semble aussi que les NcLCR de même phénotype puissent être regroupés en différentes sous-

populations neuronales puisqu’une distinction morphologique est souvent observée.

Les caractérisations phénotypiques des NcLCR bulbo-spinaux ont également permis de

mettre en évidence une propriété particulièrement intéressante dans ces neurones, qui est la

présence de nombreux marqueurs de plasticité qui sont exprimés du nouveau-né à l’âge adulte

(Tableau 5). Chez le nouveau-né, les NcLCR expriment la protéine PSA-NCAM (polysialylated-

neuronal cell ahdesion molecule), qui correspond à la forme polysialilée de la protéine

d’adhérence NCAM, la doublecortine (DCX) et HuC/D (Figure 10. A et B) (Marichal et al., 2009)

qui constituent des marqueurs des neurones immatures trouvés dans les cellules constituant les

niches neurogéniques (Marusich et al., 1994; Bonfanti, 2006; Knoth et al., 2010). Les protéines Hu

font partie des protéines les plus précocement exprimées dans les neurones nouveau-nés

(Marusich et al., 1994). Cependant, ces protéines sont également présentes chez l’adulte où elles

participent aux processus de plasticité (Deschênes-Furry et al., 2006). Chez l’adulte, PSA-NCAM

et DCX sont retrouvées dans les niches neurogéniques essentiellement, où elles sont exprimées

par les jeunes neurones post-mitotiques et dans les neurones néoformés, ces protéines sont

également impliquées dans le processus de migration cellulaire (Gleeson et al., 1999; Bonfanti,

2006; Ming & Song, 2011; von Bohlen und Halbach, 2011).

42
Introduction

A B E15 E21
DCX DCX

BrdU BrdU

Superposition Superposition

C D
Patch perforé
CC
Contrôle

Gabazine

CC
Cellule attachée

FIGURE 10. LES NCLCR SPINAUX : DES NEURONES CONSERVANT DES CRITERES D’IMMATURITES. A, Chez le rat à P2, les
NcLCR spinaux sont HuC/D+ (A1, flèches) et NeuN- (A2). Cependant, des cellules hors de la couche épendymaires sont
NeuN+ et HuC/D+ (pointes de flèche). Chez le rat à P5, ces neurones co-expriment DCX et PSA-NCAM (C1-3, pointes de
flèche). Adapté de Marichal et al., 2009. B, Administration de BrdU au stade embryonnaire (E15 : à gauche et E21 : à droite)
et évaluation du nombre de NcLCR BrdU+ et DCX+ dans la moelle épinière lombaire (L4) de rat à P8. La plupart des NcLCR
sont produits entre E14 et E15, mais un faible nombre de ces neurones sont dérivés de cellules du cc durant des phases plus
tardives autour de E21. (BrdU : rouge ; DCX : vert). Adapté de Kùtna et al., 2013. C, La plupart des NcLCR expriment
NKCC1 (rouge), tandis que KCC2 (vert) est fortement exprimé dans les neurones hors de la région du cc (flèche). Seuls
quelques NcLCR présentent une faible immunoréactivité contre KCC2 (pointes de flèche). Barre d’échelle : 20 µm. D, Les
images de gauche montrent les NcLCR enregistrés (tracés à droite) en configuration patch perforé (image du haut) ou
cellule entière (image du bas), visualisés par l’Alexa 488 (250 µM), introduite dans l’électrode d’enregistrement. L’Alexa ne

43
Introduction

diffuse pas dans le neurone enregistré en configuration patch perforé (image du haut). A la fin de l’enregistrement, le
passage en configuration cellule entière permet la diffusion de l’Alexa 488, et dévoile la morphologie du neurone. Ici la
présence du prolongement apical en contact avec le LCR confirme la nature NcLCR de la cellule enregistrée. Les tracés de
droites montrent que dans quelques NcLCR, le GABA induit une dépolarisation membranaire et l’émission de potentiel
d’action (trace du haut) enregistrées en configuration patch perforé (gramicidine, 5 µg/ml) ou cellule attachée (trace du bas)
et qui est bloquée par 20 µM de Gabazine (trace du milieu). Barre d’échelle : 10 µm. C et D : Etude réalisée sur les NcLCR
spinaux de tortue juvénile. Adapté de Reali et al., 2011. La ligne en pointillée délimite le canal central (cc) pour l’ensemble
de la figure.

Ce phénotype immature des NcLCR est conforté par l’absence d’expression de

marqueurs de maturité neuronale tels que NeuN (neuronal nuclei ; Figure 10. A) protéine

nucléaire retrouvée dans l'ensemble des neurones matures (Mullen et al., 1992) ou du

Neurofilament-M (NF-M) et du NF-200 (Russo et al., 2004; Marichal et al., 2009; Kútna et al.,

2013) qui sont des filaments intermédiaires du cytosquelette axonal (Hollenbeck, 1989; Lee &

Cleveland, 1996) présents dans les neurones matures (Perrot et al., 2008; Perrot & Eyer, 2009).

L’absence de NeuN observée dans ces études semble provenir du fait que l’expression de cette

protéine dans les NcLCR est très inférieure à celle retrouvée dans les autres neurones (≈ 6 % du

niveau d’expression de NeuN dans les motoneurones) ce qui rend son observation plus difficile

(Kútna et al., 2013).

Il est à noter que ces caractéristiques d’immaturité neuronale sont conservées chez l’adulte, où

les NcLCR spinaux sont PSA-NCAM+ et DCX+ de plus l’axone ne contient pas le filament

intermédiaire spécifiquement retrouvé dans les axones : le Neurofilament (NF) mais est GAP

43+ (growth associated protein ; Figure 9. D), protéine exprimée dans les axones en

développement (Stoeckel et al., 2003; Sabourin et al., 2009; Kútna et al., 2013). Il convient de

préciser que l’ensemble de ces marqueurs d’immaturité sont exprimés dans les neurones

néoformés post-mitotiques. Les NcLCR de moelle épinière de souris adultes sont visualisés par

le marquage anti-βIII-tubuline, une protéine du cytosquelette neuronal exprimée lors du

développement et de la neurogénèse adulte (Roskams et al., 1998; Kútna et al., 2013) et

expriment l’homéoprotéine Nkx6.1. Nkx6.1 est exprimée pendant le développement, dans la

partie ventrale de la moelle épinière et est impliquée dans la différenciation des pré-

motoneurones somatiques et des interneurones V2 et V3. Ce facteur reste fortement exprimé

autour du canal central, surtout dans les neurones de contact, chez l'adulte. Ainsi, l’expression

de cette protéine renforce l’idée que ces neurones conservent un phénotype immature et

44
Introduction

suggère qu’ils proviennent de progéniteurs communs aux pré-motoneurones somatiques et aux

interneurones V2 et V3 (Sabourin et al., 2009).

D’autre part, en 2006, le développement d’un modèle de souris transgénique permettant

l'expression sélective de l'EGFP (Enhanced green fluorescent protein) dans les cellules PKD2L1+

(polycystin kidney disease 2-like 1) a permis de mettre en évidence que les NcLCR bulbo-

spinaux expriment ce canal (voir méthodes, Figure 18. A) (Huang et al., 2006). La protéine

PKD2L1 est un canal de la famille TRP (Transient receptor potential) connu pour être modulée

par le pH, l’osmolarité et le voltage (Shimizu et al., 2009, 2011) (voir partie PKD2L1).

D’un point de vue fonctionnel, ces cellules dont la nature neuronale a été confirmée par

l’expression du marqueur dendritique MAP2, semblent être sensibles à l’ATP puisqu’elles

expriment la sous unité P2X2 du récepteur ionotropique à l'ATP à partir de P15 (Stoeckel et al.,

2003; Kútna et al., 2013) et qu'elles sont dépolarisées lors de l'application d'ATP (Marichal et al.,

2009). Enfin, bien que ces données soient à prende avec précaution, il semblerait que les NcLCR

expriment le récepteurs au neuropeptide Y (NPY) de type 1 (www.Gensat.org ; BAC : RP23-

426J22).

5-HT+, Glu+, ACh+, Catécholamine+ GABA (GAD+)


Neurotransmetteurs ; Enzymes de
Urotensine II+, Somatostatine+, VIP+, Met-Enk-Arg6-Gly7-
synthèse; Neuropeptides
Leu8_like +

Marqueurs d’immaturité/Plasticité chez


PSA-NCAM+, DCX+, HuC/D+
le nouveau-né
Marqueurs d’immaturité/Plasticité chez
PSA-NCAM+, DCX+, GAP 43+, Nkx6.1+
l’adulte
Marqueurs de maturité NeuN+, NF-M-
Marqueurs neuronaux βIII-tubuline+, MAP2+
Autres P2X2+, PKD2L1+, NPY1+

TABLEAU 5. RECAPITULATIF DES MARQUEURS ETUDIES DANS LES NcLCR BULBO-SPINAUX CHEZ LES VERTEBRES.

Ces études morphologiques permettent d’une part de confirmer la nature neuronale des

NcLCR et montrent d’autre part que malgré leur grande hétérogénéité, les NcLCR bulbo-

spinaux de rongeurs semblent partager comme critère commun la présence et la conservation

de marqueurs d’immaturité chez l’adulte. De part cette spécificité, il est suggéré que les NcLCR

bulbo-spinaux puissent faire partie de la niche neurogénique spinale (cf fonction des NcLCR).

45
Introduction

Ceci est renforcé par les études réalisées par l’équipe du Dr. Russo sur les propriétés

électrophysiologiques de ces neurones, qui révèlent la présence de différentes signatures

électrophysiologiques liées à l’existence de différents stades de maturité au sein des NcLCR

(voir ci-dessous 3d).

d) Propriétés électrophysiologiques des NcLCR spinaux

Très peu d’études ont été réalisées pour caractériser les propriétés électrophysiologiques

des NcLCR bulbo-spinaux. La plupart ont été faites par l’équipe du Dr. Russo au niveau de la

moelle épinière de rat nouveau né et de tortue juvénile.

Propriétés passives et décharge neuronale :


Au niveau spinal, il apparait que différents sous-types de NcLCR se distinguent de part

leur propriétés électrophysiologiques intrinsèques. Ces neurones répondent différemment lors

de l’injection de créneaux de courants dépolarisants. Ces réponses vont de la dépolarisation

lente calcique (rat) à l’émission de potentiel d’action (PA) de manière phasique ou tonique,

sous-tendue par des conductances sodiques voltage-dépendantes (Figure 11. A et B). Ces

cellules sont caractérisées par une forte résistance d’entrée comprise entre 3 et 6 GΩ et un

potentiel de repos allant de -50 à -70 mV. Les cellules qui déchargent de manière phasique ont

un potentiel de repos significativement plus dépolarisé et une décharge spontanée moins

fréquente que celles déchargeant de manière tonique (Russo et al., 2004; Marichal et al., 2009).

L’étude des conductances voltage-dépendantes à l’origine de ces diverses réponses actives

montrent que la réponse lente et persistante calcique est en fait sous-tendue par la sommation

de deux composantes associées à l'absence de courants potassiques repolarisants. Une mineure

due à la présence de conductance sodique voltage-dépendante (GNa) et une deuxième,

majoritairement responsable de cette réponse, due à l’ouverture de canaux calciques voltage-

dépendants de type T (Cav3) (Marichal et al., 2009).

La décharge phasique ou tonique, caractérisée par l’émission d’un PA unique ou d’un train de

PA respectivement, (voir tableau 6 résumant les caractéristiques du PA), impliquent des

conductances sodiques et potassiques voltage-dépendantes. La différence entre ces deux types

de décharge n’est pas due à l’expression de différents canaux voltage-dépendants puisqu’elles

sont sous-tendues par des courants de même nature (courant sodique : INa, courant potassique

46
Introduction

rectifiant retardé : IKD, courant potassique de type A : IA ; voir tableau 6). Par contre, l’amplitude

plus importante du PA lors de la décharge tonique laisse supposer une plus grande densité de

canaux sodiques voltage-dépendants (Nav) dans ces neurones (Figure 11. B1). A ces

conductances sodiques s’ajoutent des courants potassiques voltage-dépendants de type IKD et IA.

Les courants IKD, sont des courants potassiques sans inactivation contrairement aux courant IA.

L’absence de variation significative entre les courbes d’activation des courants IKD dans les deux

populations neuronales, montre que ceux-ci ne semblent pas être impliqués dans les différences

de patron de décharge. Par contre, dans les neurones à décharge tonique, le courant IA est de

plus faible densité, il s’active pour des potentiels plus dépolarisés et s’inactive deux fois plus

rapidement que dans les neurones à décharge phasique (Figure 11. B2 et B3) (Marichal et al.,

2009). Cette inactivation plus rapide de IA permettrait la génération de train de PA observés

dans les NcLCR à décharge tonique.

Décharge phasique
Paramètres Décharge tonique
(PA unique)
Amplitude, mV 38,27 ± 1,52 56,38 ± 2,1
Durée de ½ Amplitude, ms 6,21 ± 0,55 3,77 ± 0,35
AHP non oui
Courants du PA INa, IA, IKD INa, IA, IKD
IA, Constante de temps d’inactivation,
28,76 ± 2,3 12,7 ± 1,3
ms
IA, Potentiel de 1/2 inactivation, mV -66,96 ± 1,52 -65,7 ± 1,95
IA, Potentiel d’activation, mV 21,45 ± 1,3 26,67 ± 0,66
IKD, Potentiel d’activation, mV 8,44 ± 0,86 19,46 ± 1,74

TABLEAUX 6. CARACTERISTIQUES DES POTENTIELS D’ACTION EMIS PAR LES NcLCR SPINAUX DE RAT A P0-P5 ET DE LEURS

CONDUCTANCES.

47
Introduction

A
Contrôle

-60 -55
-80

TTX TTX

-80 -60 -55

B1 Potentiel membranaire, mV
Densité de courant, pA/pF

Décharge phasique ( un PA ; SS)

Décharge tonique (RS)

B2 Amplitude
B3 Activation/Inactivation
Densité de courant, pA/pF

G/Gmax
I/Imax

Potentiel membranaire, mV Potentiel membranaire, mV

C D
GABA Gabazine

Contrôle
ATP pH 6

FIGURE 11. PROPRIETES ELECTROPHYSIOLOGIQUES DES NCLCR SPINAUX CHEZ LE RAT NEONATAL.

48
Introduction

FIGURE 11. PROPRIETES ELECTROPHYSIOLOGIQUES DES NCLCR SPINAUX CHEZ LE RAT NEONATAL. A, Les NcLCR chez le rat
(P0-5), présentent trois types de décharge, de la dépolarisation lente calcique (trace du haut à gauche), au potentiel d’action
phasique (trace du haut au centre) ou tonique (trace du haut à droite). Les tracés en bas représentent les réponses à la
dépolarisation obtenue en présence de 1 µm de TTX. La dépolarisation lente (tracé du haut à gauche), est peu sensible à la
TTX (tracé du bas à gauche) avec le seul le pic transitoire (flèche) qui disparait et indique une faible contribution de canaux
sodiques voltage-dépendants. L’ajout de 3 mM de Mn++ bloque complètement la dépolarisation lente, révélant l’implication
des canaux calciques. B, Densité du courant sodique voltage-dépendant (B1) et du courant IA (B2) mesurée au pic en
fonction du potentiel membranaire dans les NcLCR qui émettent des potentiels d’action (PA) de manière phasique (SS,
rouge) ou tonique (RS, noir). Etude chez le rat âgé de P0 à P5. B3, Courbe d’activation et d’inactivation des courants IA dans
les NcLCR qui émettent un seul PA (SS, rouge) ou plusieurs PA (RS, bleu). Etude chez le rat âgé de P0 à P3. C, Les NcLCR
spinaux expriment des récepteurs GABA-A fonctionnels. L’application de 10 µM de gabazine bloque le courant induit pas
l’application de GABA (10 ms ; 100 µM). Etude chez le rat à P2. D, Modulation de l’activité des NcLCR par l’application
d’ATP et d'une solution acide à pH 6. Tracé de gauche : l’application d’ATP (100 ms ; 100 µM) induit une forte excitation des
NcLCR à décharge tonique chez le rat à P3. Tracé de droite : enregistrement obtenu sur un NcLCR à décharge phasique,
montrant la forte excitation sous-tendue par l’application d’une solution de Ringer tamponnée à pH 6 (NaHCO3 < 17,25 mM
et remplacement de l’HEPES par 10 mM de MES). D’après Marichal et al., 2009.

Ces études confirment tout d’abord la nature neuronale des cellules qui contactent le

LCR. Dans la moelle épinière, les NcLCR présentent différentes propriétés

électrophysiologiques sous-tendues par des différences dans les propriétés physiologiques des

courants IA et dans la densité des courants INa. Ces différences sont expliquées par les auteurs,

par l’existence de NcLCR présentant différents degrés de maturité. Ainsi, les neurones les plus

immatures présenteraient une dépolarisation lente calcique puis, lors de la maturation

neuronale un changement se produirait, avec l'expression d'une réponse rapide sodique.

Ensuite les neurones à décharge phasique acquerraient les propriétés électrophysiologiques à la

base des décharges toniques observées dans les NcLCR les plus matures. De plus, lors de cette

maturation neuronale, l’expression de canaux potassiques calcium-dépendants pourrait

expliquer la présence de la phase d’hyperpolarisation suivant la dépolarisation dans les

neurones à décharge tonique. Cette variation dans l’expression des conductances potassique

semble suivre celle observée dans les neurones nouveau-nés des niches neurogéniques adultes

(Russo et al., 2004; Marichal et al., 2009).

Cette hypothèse de l’existence de neurones présentant différents degrés de maturité, qui est

basée sur des données fonctionnelles, corrobore les données morphologiques citées

précédemment. De plus, Marichal et collaborateurs observent une différence phénotypique

accompagnant ces différences électrophysiologiques. Il semblerait que les NcLCR présentant

une réponse calcique lente aient une morphologie moins complexe, de type bipolaire tandis que

49
Introduction

les neurones émettant des PA présentent plus de ramifications neuritiques. De ce fait, il

semblerait que la maturation des PA soit accompagnée d’une maturation morphologique.

Réponses GABAergiques et afférences synaptiques :


Les NcLCR sont également caractérisés par l’expression de récepteurs GABA-A (R-

GABA-A) fonctionnels. De plus, l’enregistrement en patch perforé, par l’utilisation de

gramicidine (permettant de conserver la concentration intracellulaire physiologique d'ions

chlorures ([Cl]i)) montre qu’il existe deux populations de NcLCR (Marichal et al., 2009; Reali et

al., 2011). Une où le GABA exerce un effet hyperpolarisant et dans laquelle le potentiel

d’équilibre du chlore (ECl) physiologique avoisine les -70 mV. L’autre, où l’application de GABA

induit une dépolarisation membranaire pouvant amener à la genèse de PA (Figure 10. D). Dans

cette dernière population neuronale, la valeur physiologique de ECl est plus dépolarisée que Vr

et autour de -45 mV (Russo et al., 2004; Marichal et al., 2009; Reali et al., 2011). Ces effets

excitateurs ou inhibiteurs du GABA sont bloqués par des antagonistes sélectifs des R-GABA-A,

révélant qu’ils sont sous-tendus par l’activation des R-GABA-A. Cette dichotomie fonctionnelle

des effets du GABA, s’explique par des différences d’expression et d’activité des transporteurs

au chlore : NKCC1 impliqué dans une forte [Cl]i et un effet dépolarisant du GABA et KCC2 à

l’origine d’une baisse de ECl et d’un effet hyperpolarisant du GABA (Figure 10. C). Dans les

NcLCR où le GABA est dépolarisant, il y a une forte expression de NKCC1 tandis que le

rapport KCC2/NKCC1 augmente dans les neurones où le GABA exerce des effets

hyperpolarisants (Reali et al., 2011).

Ce changement de rapport entre les transporteurs au chlore est connu pour être impliqué dans

les divers effets du GABA durant le développement et dans les zones de neurogénèse adulte.

Ainsi, le GABA initialement excitateur dans les neurones nouvellement formés, devient

inhibiteur au cours de la maturation neuronale (Yamada et al., 2004; Stil et al., 2009; Boulenguez

et al., 2010). L’application de GABA induit une augmentation de la concentration intracellulaire

en calcium ([Ca++]i), phénomène bloqué par la gabazine, un antagoniste sélectif des récepteurs

ionotropiques au GABA de type A (R-GABA-A) ou par un milieu extracellulaire pauvre en

calcium. L’activation des R-GABA-A semble donc induire l’activation de canaux calcique

voltage-dépendants à l’origine de l’entrée de calcium à partir du milieu extracellulaire. De

manière étonnante, l’augmentation de la [Ca++]i lors de l’application de GABA est observée dans

les deux populations neuronales dont celle où le GABA est hyperpolarisant ce qui suggèrent

50
Introduction

également une potentielle participation des canaux TRP. (Transient receptor potential) dans cet

effet (Reali et al., 2011). Le couplage entre la signalisation GABAergique et calcique est un

phénomène observé durant le développement ainsi que dans les niches neurogéniques adultes

et est indispensable pour promouvoir la maturation neuronale (Root et al., 2008; Young et al.,

2010, 2014).

Enfin, l’enregistrement de l’activité synaptique spontanée dans ces neurones révèle la présence

de potentiel post-synaptiques excitateurs (PPSE) et inhibiteurs (PPSI). Les PPSE sont en partie

bloqués par des antagonistes sélectifs des récepteurs ionotropiques au glutamate tandis que les

PPSI sont totalement bloqués par l’antagoniste sélectif des R-GABA-A. Ainsi, les NcLCR

spinaux sont modulés par des afférences excitatrices dont la majorité est glutamatergique mais

également inhibitrices de type GABAergique.

La présence d’afférences synaptiques GABAergiques et glutamatergiques montrent que

les NcLCR spinaux sont intégrés dans un réseau synaptique. De plus, la double action du

GABA (excitatrice vs. inhibitrice) ainsi que son couplage avec des conductances calciques

conforte l’hypothèse de l’existence de NcLCR présentant différents degrés de maturité.

Régulation de l’excitabilité des NcLCR spinaux :


Chez le rat, en plus de l’expression du R-GABA-A (Figure 11. C) , les NcLCR spinaux

expriment la sous-unité P2X2 du récepteur ionotropique à l’ATP et sont dépolarisés par

l'appplication d'ATP (tracé de gauche, Figure 11. D). De plus, ils sont sensibles au pH acide

(tracé de droite, Figure 11. D). L’application d’une solution à pH 6 induit une forte activation

des NcLCR qui pourrait être due à l’activation des canaux PKD2L1 (Huang et al., 2006; Marichal

et al., 2009). L’augmentation de décharge neuronale semble être corrélée au niveau d’acidité du

pH extracellulaire. Ainsi un pH à 6,5 induit une plus forte augmentation de la fréquence de

décharge qu’un pH à 6,9 (Figure 17. E) (Huang et al., 2006). Toutefois, on ne peut exclure que

d'autres protéines canal pH-sensibles comme les ASICs participent à cet effet.

La caractérisation électrophysiologique des NcLCR spinaux montre que ces cellules

présentent des réponses régénératives indiquant leur appartenance à la lignée neuronale et

confirme donc que ces cellules sont différentes des cellules épendymaires (Corns et al., 2013).

Les différents phénotypes électrophysiologiques suggèrent la présence de populations

neuronales à différents stades de maturité. Il est cependant intéressant de noter, que même les

cellules présentant un phénotype électrophysiologique de neurones matures conservent

51
Introduction

l’expression de marqueurs d’immaturité tels que DCX, PSA-NCAM et HuC/D. Ainsi, le

phénotype électrophysiologique des NcLCR spinaux rejoint la caractérisation morphologique

détaillée précédemment, puisqu'il indique que cette population neuronale conserve des

caractéristiques d'immaturité chez l'adulte. Enfin, il est montré que ces cellules expriment le

récepteur P2X2 fonctionnel à l’ATP et le canal PKD2L1 qui leur confèrerait une sensibilité au pH

extracellulaire.

4. QUELS RESEAUX ET QUELLES FONCTIONS POUR LES NCLCR

Les fonctions physiologiques des NcLCR sont peu connues à ce jour et les hypothèses

sont proposées sur la base de données morphologiques. Ainsi, les fonctions sont suggérées de

par la localisation cérébrale des NcLCR d’intérêt et les marqueurs phénotypiques qu'ils

expriment. Il n’existe que très peu d’études fonctionnelles permettant de réellement connaître la

fonction cellulaire et physiologique de ces neurones. Enfin, il est important de rappeler que ce

système neuronal est très hétérogène, la possibilité que chaque population soit impliquée dans

une fonction propre n’est donc pas à écarter.

Dans cette partie sera résumé l’ensemble des fonctions suggérées à ce jour regroupées en

trois catégories : motrice, sensorielle et neurones en « standby ».

a) Physiologie motrice

En 2009, Wyart et collaborateurs ont montré l’implication d’un sous-type de NcLCR, les

cellules de Kolmer et Agduhr (cellules de KA) dans la nage du poisson zèbre au stade larvaire.

Ces cellules sont localisées autour du canal central de la moelle épinière et possèdent la

morphologie typique des NcLCR caractérisée par l’émission d’une dendrite vers la lumière du

canal et finie par un bud portant plusieurs cils baignant dans le LCR. Ces neurones

GABAergiques émettent un axone qui projette ipsilatéralement et dont la terminaison contacte

une série de deux à six segments consécutifs de la moelle épinière (Wyart et al., 2009).

Cette étude montre que l’activation spécifique par la technique d'optogénétique des cellules KA,

induit un mouvement rythmique et alterné de la queue de la larve, typique de celui observé lors

de la nage lente. Cet effet est aboli en présence d’antagoniste sélectif des R-GABA-A, indiquant

52
Introduction

que l’activation par photo-illumination des cellules de KA permet l’initiation, par un procédé

GABA-dépendant, du comportement de nage. Cette étude révèle également que ces neurones

sont impliqués dans la nage spontanée et qu’ils sont suffisants pour induire ce comportement.

En effet, une lésion au niveau du tronc cérébral n’affecte pas l’induction, par photo-stimulation,

du comportement de nage fictive (Wyart et al., 2009; Del Bene et al., 2010).

Ces travaux représentent la seule étude fonctionnelle existant à ce jour, qui montre de

manière directe et élégante la fonction des NcLCR spinaux. Chez le poisson zèbre au stade

larvaire, ces cellules sont nécessaires pour la nage spontanée de fréquence normale et sont

suffisantes pour activer le centre générateur du patron moteur localisé dans la moelle épinière.

Cette fonction est sous-tendue par l’action du GABA, qui est dépolarisante à ce stade du

développement. Lors de la maturation neuronale, l'action du GABA change et elle devient à

l'origine d'effets hyperpolarisants qui pourraient être associés à une fonction contraire des

cellules KA, de type inhibitrice, sur la nage de poisson zèbre adulte. Cependant, il peut

également être envisagé que cette modification de l'effet du GABA soit associée à un

changement fonctionnel de ces cellules KA. Enfin, si ces cellules possèdent des critères

d’immaturité similaires à ceux observés chez certaines espèces, il reste également envisageable

que certaines cellules conservent un effet dépolarisant du GABA au cours du développement et

pourraient ainsi conserver leur fonction chez l’adulte.

Chez d’autres vertébrés et plus particulièrement les mammifères, la présence de NcLCR

spinaux dont l’axone projetterait sur d’autres neurones n’a jamais été mise en évidence à ce

jour. Une éventuelle participation des NcLCR spinaux dans le réseau locomoteur semble donc

peu probable.

b) Physiologie sensorielle

Les études morphologiques du système des NcLCR ont révélé que dans la plupart des

espèces, la terminaison dendritique qui contacte le LCR est similaire à celles connues pour les

récepteurs sensoriels. De manière générale, la présence d’une structure ciliée sur le bud est

décrite, de plus, il est communément admis que les cils primaires sont des structures impliquées

dans des fonctions sensorielles mécaniques et chimiques (audition, vision, olfaction) (Abou

Alaiwi et al., 2009; Berbari et al., 2009; Temiyasathit et al., 2012). De ce fait, un rôle sensoriel

53
Introduction

analogue a été proposé pour les NcLCR. Ceux-ci pourraient signaler les variations du flux de

liquide (LCR) à l’image des cellules ciliées rénales dont le cil primaire signale, par une entrée

calcique, le sens du flux d’urine primitive au niveau des tubules rénaux (Nauli et al., 2003). Au

niveau spinal, le bud contient souvent plusieurs cils, sauf chez les mammifères et ressemble

plus précisément aux mécanorécepteurs trouvés dans l’oreille interne (Vigh et al., 1977). En

1921, Kolmer avait suggéré que les NcLCR spinaux pourraient être contactés par l'intermédiaire

au bud à la fibre de Reissner (Figure 8. F). La fibre de Reissner est le produit de sécrétion des

cellules épendymaires sécrétrices de l’organe subcommissural (OSC). L’OSC fait partie des

organes circum-ventriculaires et est situé entre le diencéphale et le mésencéphale sous la

commissure postérieure. La fibre de Reissner prend naissance à partir de l’OSC, s’étend dans la

lumière de l’acqueduc de Sylvius, le 4V et le canal central. Dans cette hypothèse, l’OSC, la fibre

de Reissner et les NcLCR spinaux forment un organe sensoriel capable de détecter les

mouvements de la colonne vertébrale. Les mouvements de la colonne induiraient un

déplacement de la fibre de Reissner détecté par la terminaison sensorielle des NcLCR spinaux

(Vigh & Vigh-Teichmann, 1998). Cette hypothèse est renforcée par la mise en évidence de

neurones mécanosensibles au sein de la moelle épinière de la lamproie (Grillner et al., 1984).

Dans le même ordre d’idée, le contact entre les NcLCR et la fibre de Reissner pourrait être

impliqué non plus dans la détection de mouvement de la colonne vertébrale mais dans la

détection du flux du LCR. Cette dernière hypothèse est également confortée par une étude

montrant que le flux du LCR au niveau du central canal est diminué chez des rats

immunologiquement dépourvus de fibre de Reissner (Cifuentes et al., 1994). Toutefois, bien que

la présence de contacts entre la fibre de Reissner et la terminaison dendritique des NcLCR a été

mis en évidence, la résultante fonctionnelle sur la physiologie des NcLCR spinaux n’a pas été

étudiée pour le moment (Vigh & Vigh-Teichmann, 1998).

Les NcLCR, de part leur morphologie, semblent avoir un rôle spécial dans la détection,

la transformation ou l’émission de signaux non synaptiques circulant dans le LCR (Vígh et al.,

2004). La plupart de ces neurones possède une structure ciliaire sur la terminaison dendritique

(Vigh & Vigh-Teichmann, 1998). En général, ce cil a une structure 9 + 0 caractéristique des cils

primaires (Figure 6. A). De ce fait, les NcLCR ressemblent morphologiquement aux cellules

chémoréceptrices (Vigh et al., 1977). De plus de nombreux récepteurs à différentes substances

bioactives sont exprimés au niveau des cils (Brailov et al., 2000; Berbari et al., 2008; Stanić et al.,

54
Introduction

2009; Abdul-Majeed & Nauli, 2011). Ainsi, la terminaison dendritique constituerait une

structure sensorielle capable de détecter des modifications de composition du LCR. Cette

hypothèse est supportée par le fait que l’expression de substances actives dans les NcLCR ainsi

que l’excitabilité de ces neurones sont modulées lors de variations de composition du LCR

(Vigh & Vigh-Teichmann, 1998). Ce rôle de chémosenseur pourrait conférer un rôle aux NcLCR

du 3V dans la régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire (Xiao et al., 2005). En effet de

nombreux NcLCR retrouvés autour du 3V, sont localisés dans les noyaux magno- et

parvocellulaires, impliqués dans la régulation osmotique (Vigh-Teichmann & Vigh, 1983; Vigh

& Vigh-Teichmann, 1998). Certains de ces neurones appartiennent au système magnocellulaire

localisé dans les noyaux paraventriculaire et supra-optique de l’hypothalamus et expriment

l’ocytocine (OT) ou la vasopressine (VP) (Taniguchi et al., 1988; Xiao et al., 2005) et projettent

leur axone dans la post-hypophyse (Taniguchi et al., 1988; Vígh et al., 2004). Il est donc possible

que les NcLCR participent à la régulation osmotique en détectant les variations d'osmolarité,

observées dans des conditions d’hypertension ou de déshydratation, directement dans le LCR

et en y répondant par une sécrétion d’OT ou de VP dans la circulation. Cette sécrétion peut

également se faire directement dans le LCR, puisqu’en plus de leurs dendrites, certains

neurones projettent leur axone dans la lumière ventriculaire (Vigh & Vigh-Teichmann, 1998;

Vígh et al., 2004). De plus, une forte augmentation des taux de VP et d’OT dans le LCR est

observée après une hypophysectomie (Dogterom et al., 1977).

Ces neurones co-expriment l'OT ou la VP avec le NO et pourraient également sécréter ces

substances lors de variation d’osmolarité plasmatique. Le NO est connu pour son action au

niveau des plexus choroïdes où il participe à la régulation de la sécrétion de LCR (Faraci &

Heistad, 1992; Chodobski et al., 1999). En effet, l’augmentation d’osmolarité plasmatique est

compensée dans le LCR par une augmentation de son taux de sécrétion (Balachandra & Anand,

1993; Pollay, 2010; Noda & Sakuta, 2013). Le NO est également connu, non seulement pour son

action vasodilatatrice inhibant l’hypertension, mais aussi comme étant un neurotransmetteur et

un neuromodulateur impliqué dans la régulation de la synthèse et de la sécrétion de l’OT et de

la VP (Ota et al., 1993; Goyer et al., 1994; Kadekaro et al., 1998; Kadekaro & Summy-Long, 2000;

Ventura et al., 2002).

Enfin, la plupart des axones des NcLCR du système magnocellulaire et parvocellulaire

projettent dans les zones neurohémales dont l’éminence médiane et la neurohypophyse (Vigh &

55
Introduction

Vigh-Teichmann, 1998; Vígh et al., 2004), ce qui renforce encore plus l’idée d’une possible

implication de ce système neuronal dans la régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire.

Ce rôle de chémodétecteur est également appuyé par le fait que les NcLCR au niveau

spinal expriment le canal PKD2L1 qui semble leur conférer une sensibilité aux variations de pH

extracellulaire (Huang et al., 2006; Marichal et al., 2009) ; voir propriétés électrophysiologiques).

Mais également par une étude montrant que le remplacement du LCR physiologique par du

LCR artificiel induit une très forte diminution de l’activité spontanée des NcLCR enregistrés,

signe de la sensibilité des NcLCR aux variations de composition du LCR (Vígh et al., 2004). La

présence de nombreuses terminaisons axonales projetant dans le LCR externe et interne (3V,

trajet centro-superficiel) ainsi que la présence d’axones intra-ventriculaires permet de penser

que les NcLCR peuvent également être impliqués dans la neurosécrétion de peptides et

neurotransmetteurs dans le LCR et/ou le sang. Cette capacité dépend énormément des espèces

étudiées (Vígh et al., 2004).

De par leur contact étroit avec le LCR, certains auteurs suggèrent que les NcLCR

détectent voir endocytent des substances chimiques circulant dans le LCR. Au niveau du noyau

du raphé, les NcLCR distaux (NcLCR-d) présentent une immunoréactivité pour la substance P

(SP) dont la synthèse est "up-régulée" dans les modèles de douleur inflammatoire persistante

(Lu et al., 2009). La plupart des NcLCR-d au niveau du noyau du raphé projettent dans la partie

caudale du noyau spinal trijéminal, qui, en plus de recevoir les afférences primaires du nerf

oral, intègre également les signaux nociceptifs descendants et ascendants. Cette hypothèse est

aussi basée sur le fait que lors de dommages tissulaires, la substance P agit comme substance

inflammatoire, stimule la synthèse de cytokines et amplifie localement la réponse

inflammatoire, participant ainsi aux processus de la douleur (Tracey, 2002). De plus, lors de

processus nociceptifs, l’augmentation de SP dans le LCR (Strittmatter et al., 1997; Zubrzycka &

Janecka, 2002), pourrait être détectée par les NcLCR-d du noyau du raphé qui intègreraient ce

signal et le transmettraient aux neurones du noyau spinal trijéminal. Enfin, cette étude suggère

non pas une synthèse locale de SP dans les NcLCR-d mais une endocytose à partir du LCR.

Ainsi les NcLCR-d du noyau du raphé seraient impliqués dans les processus nociceptifs (Lu et

al., 2009). Ceci est conforté par d’autres études montrant que ces mêmes neurones expriment

deux membres de la famille des "transient receptor potentiel" (TRP) thermosensibles, le

récepteur à la Mélastatine de type 8 (M8) et au Vanilloïde de type 1 (V1), tous deux pouvant

56
Introduction

également être impliqués dans les processus nociceptifs (Du et al., 2009; Xu et al., 2011).

Cependant, leur mode d’activation et leur fonctionnement durant les processus nociceptifs

centraux et donc leur implication dans l’intégration du signal par les NcLCR-d du noyau du

raphé restent à être élucidés. La fonction des NcLCR-d au niveau du noyau du raphé semble

multiple puisque le même groupe de chercheurs suggère également une implication de ces

neurones dans le processus de dépendance à la morphine et dans le syndrome de manque.

Cette théorie est basée sur le fait que la lésion chimique des NcLCR-d atténue les symptômes

dus au syndrome de manque à la morphine. Le syndrome de manque est induit par l’injection

sous cutanée de naloxone (antagoniste spécifique des récepteurs à la morphine) après

traitement des animaux à la morphine (injections de doses croissantes pendant 5 jours). La

lésion des NcLCR-d entraine également une diminution de l’expression de l’enzyme neuronal

de la synthèse du NO (nNOS) au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière, suggérant

que les NcLCR-d participent au syndrome de manque à la morphine en modulant le NO (Qin et

al., 2007). Il a été également montré que la dépendance chronique à la morphine et le manque

induisent l’activation de la protéine CREB dans les NcLCR-d (Zhang et al., 2009). Cette

implication de NcLCR-d dans l’addiction à la morphine semble également faire intervenir le

TRP Canonique de type 6 (TRPC6) dont l’expression augmente dans les NcLCR lors du

phénomène de dépendance à la morphine et lors du manque (Wu et al., 2011). Enfin, lors du

phénomène de manque, la protéine kinase ERK5 (extracellular signal-regulated kinase 5) est

fortement activée dans les NcLCR-d et l’injection intra-ventriculaire de son antagoniste sélectif

induit une diminution des symptômes observés lors du syndrome de manque (Wang et al.,

2013a).

Les NcLCR-d présents dans la partie ventrale au niveau de l’acqueduc de Sylvius du

noyau du raphé semblent avoir des implications dans des fonctions diverses. Cependant, ces

résultats sont à prendre avec précaution, en effet le noyau du raphé est un « carrefour

neuronal » impliqué dans des fonctions diverses. Le syndrome de manque est lui-même

accompagné de multiples symptômes dont l’agressivité liée à la souffrance et à la douleur

animale mais également des effets sur le sommeil et la vigilance qui sont des comportements

impliquant le noyau du raphé. De plus, si l’on considère les résultats concernant TRPC6, canal

également impliqué dans la transduction de la douleur (Kress et al., 2008), presque la totalité des

NcLCR expriment ce canal lors du phénomène de dépendance et de manque, indiquant qu’il

57
Introduction

doit y avoir un recouvrement entre les NcLCR et les neurones exprimant TRPV1, TRPM8 et la

SP potentiellement impliqués dans les phénomènes nociceptifs.

Bien qu’une implication dans diverses fonctions physiologiques, basée sur la détection de

modification de composition du LCR ne puisse être écartée, ces études ne permettent pas de

mettre clairement en évidence la fonction des NcLCR-d et leur réelle implication dans ces

fonctions physiologiques ou pathologiques.

Ainsi, nous pouvons suggérer qu’au sein du système des NcLCR, la grande

hétérogénéité neuronale dispersée au sein du SNC et caractérisée par l’expression de différents

médiateurs, permet de détecter divers paramètres du LCR et module grâce à leurs efférences,

l’activité de cibles nerveuses distribuées du télencéphale au filum terminal de la moelle

épinière.

c) Neurones en « Standby »

C’est en 2009 que l’équipe du Pr. Russo pose le terme de neurones en mode d’attente ou

« standby mode ». Cette hypothèse est basée sur le fait que les NcLCR spinaux conservent

l’expression de marqueurs d’immaturité et de plasticité à l’âge adulte et présentent des

propriétés électrophysiologiques (Figure 11) semblables aux neurones néoformés lors du

développement ou dans les niches neurogéniques adultes (Stoeckel et al., 2003; Russo et al.,

2004; Sabourin et al., 2009; Marichal et al., 2009; Reali et al., 2011). De plus, ces neurones

immatures sont localisés dans la zone épendymaire qui constitue une des niches neurogéniques

chez l’adulte et pourraient représenter un réservoir de cellules souches (Marichal et al., 2009).

Cependant, des études basées sur l'incorporation de BrdU révèlent qu'aucune prolifération de

ces neurones en condition physiologique n’a été observée après la naissance (Sabourin et al.,

2009; Marichal et al., 2009). L’étude de la nature des cellules souches de la zone épendymaire

spinale, a révélé que des cellules exprimant le marqueur de la glie radiale BLBP et GFAP+

formaient des neurosphères in vitro (Sabourin et al., 2009). Ces cellules gliales radiales forment

un réseau tridimensionnel qui enveloppe les NcLCR GABAergiques. Dans les niches

neurogéniques chez l’adulte, il a été mis en évidence que le GABA est impliqué dans la

régulation de la neurogénèse (Song et al., 2012, 2013). En effet il a été démontré que le GABA

provenant d’interneurones locaux (Song et al., 2012, 2013) et des neuroblastes (Nguyen et al.,

2003; Liu et al., 2005), dépolarise les cellules progénitrices, inhibe leur progression dans le cycle
58
Introduction

cellulaire et donc leur prolifération, et permet ainsi leur maintien dans un état de quiescence

(LoTurco et al., 1995; Liu et al., 2005; Song et al., 2012). Cette action dépolarisante du GABA,

passe par les récepteurs GABA-A constitués de la sous unité gamma-2 (Andäng et al., 2008;

Song et al., 2012) et est sous-tendue par une forte concentration intracellulaire en chlore dans les

cellules progénitrices (Yamada et al., 2004). Ce phénomène est également observé au niveau

spinal (Jean-Xavier et al., 2007; Bos & Vinay, 2012) et il serait dû à une forte expression du

transporteur au chlore NKCC1 (Plotkin et al., 1997; Sun & Murali, 1999; Yamada et al., 2004).

Ainsi, il parait plausible de suggérer que de part leur contact étroit avec les cellules

progénitrices spinales, les NcLCR spinaux, qui sont GABAergiques, participent à la régulation

de la prolifération des cellules BLBP+.

Enfin, bien que les NcLCR soient générés pendant la période embryonnaire de E7 à E22 (Figure

10. B) (Marichal et al., 2009; Kútna et al., 2013) et du fait qu'ils conservent un certain degré

d’immaturité et de plasticité chez l’adulte, il a été émis que ces neurones, au niveau de la moelle

épinière, représenteraient un réservoir de neurones immatures en mode "d’attente". Ces

neurones dans certaines circonstances, telles qu’une lésion ou une inflammation, pourraient se

dédifférencier et migrer vers la zone lésée.

Cette hypothèse fonctionnelle reste à être vérifiée. A ce jour aucune étude n’a déterminé l’effet

de ces variations pathologiques sur le phénotype des NcLCR, ni sur leur éventuelle

participation dans des processus de réparation.

59
Introduction

B. PKD2L1 UN PH- ET OSMOSENSEUR DE LA FAMILLE DES TRP

La protéine PKD2L1 forme des canaux qui appartiennent à la grande famille des canaux

TRP (Transient Receptor Potential) souvent impliqués dans des fonctions sensorielles

(Anderson et al., 2008; Abou Alaiwi et al., 2009). Comme nous l’avons vu précédemment, les

NcLCR bulbo-spinaux expriment la protéine PKD2L1 et c'est l'élaboration de souris

transgéniques PKD2L1:EGFP qui a permis d’identifier et de localiser ces neurones autour du

canal central de la moelle épinière (voir Figure 18. A partie Méthodes). De plus, l'expression de

ce canal pourrait leur conférer des capacités de senseur de variations de la composition du

milieu extracellulaire (MEC). Cette dernière partie introductive résumera l’ensemble des

caractéristiques fonctionnelles et structurales mises en évidence à ce jour sur le canal PKD2L1.

1. LA FAMILLE TRP

a) Généralités

Le canal PKD2L1 (polycystic-kidney-disease-like 1 ion channel) est un membre de la

superfamille des protéines canal TRP (transient receptor potential) (Figure 12) (Nilius et al.,

2007). Les canaux TRP ont été mis en évidence grâce à l’existence de mutants spontanés chez la

drosophile melanogaster. En 1969, Cosens et Manning ont isolé ces mutants qui présentaient un

électrorétinogramme anormal avec une réponse transitoire du potentiel bien que l'illumination

soit maintenue (Cosens & Manning, 1969). Le gène muté est alors nommé trp de part la réponse

transitoire à la lumière. Cette mutation induit un défaut dans l’entrée calcique observé lors de

l’activation des photorécepteurs. Ceci indique que la protéine TRP codée par le gène muté est

impliquée dans la formation des canaux calciques sous-tendant cet influx (Montell & Rubin,

1989; Hardie & Minke, 1992, 1993). La présence d’un nouveau canal calcique chez la drosophile

augmente l’intérêt de la recherche pour ces canaux et a conduit à la découverte d’homologues

chez les mammifères (Wes et al., 1995; Zhu et al., 1995, 1996).

Les canaux TRP représentent une grande famille qui comprend plus de cinquante canaux

perméables aux cations, exprimés chez de nombreux organismes multicellulaires, de la levure

aux mammifères dont l’homme (Venkatachalam & Montell, 2007; Vassort & Fauconnier, 2008).

Chez les mammifères, les protéines TRP sont codées par 28 gènes (voir Tableau B Figure 12)

(Flockerzi, 2007; Vassort & Fauconnier, 2008).

60
Introduction

A
TRPV TRPC
Vanilloide Canonical
C4 C5 C1
V6 V5
V3 C3
C7
V4 C6
V2 m TRPC2
V1
M1
TRPML ML1 (MCOLN1) M3
Mucolipine
ML3 (MCOLN3) M6 TRPM
ML2 (MCOLN2) M2 Mélastatine
P5 (PKD2L2) M2
M8
M4b
P3 (PKD2L1) M5
P2
(PC2; PKD2) A1

TRPP
Polycystine TRPA Ankyrine

B
Sous- Tunicier
familles Mouche Vers (chordé Poisson Souris Homme
TRP marin)

TRPC 3 3 8 8 7 6

TRPV 2 5 2 4 6 6

TRPM 1 4 2 6 8 8

TRPA 4 2 4 1 1 1

TRPN 1 1 1 / / /

TRPP 4 1 9 2 3 3

TRPML 1 1 1 4 3 3

Total 16 17 27 25 28 27

FIGURE 12. LA SUPER-FAMILLE DES CANAUX TRP. A, Arbre phylogénétique de la superfamille des « Transient Receptor
Potential » (TRP) comprenant les canaux TRPP ou polycystine. B, Tableau récapitulant le nombre de membres constituant
les sept sous- familles de canaux TRP chez divers espèces. D’après Flockerzi , 2007.

61
Introduction

Les différents membres de cette superfamille partagent des caractéristiques structurales, des

homologies de séquence et une perméabilité aux cations. Cependant, en dépit de ces

similitudes, les sous-familles possèdent également des distinctions importantes. En effet, les

divers canaux TRP présentent une hétérogénéité de sélectivité et de perméabilité aux cations

ainsi que des mécanismes d’activation spécifiques. Généralement, les canaux TRP sont des

senseurs biologiques qui détectent des variations environnementales et qui sont peu sensibles

aux variations du potentiel de membrane. Ainsi, l'ouverture des canaux TRP peut être induite

par une multitude de stimuli tels que des variations de températures, la présence d'agents

chimiques naturels (menthol, camphre, piment...), des variations mécaniques, des changements

osmotiques ou des changements dans la composition lipidique de la membrane plasmique

(Minke, 2006; Nilius et al., 2007; Vassort & Fauconnier, 2008). De par ces caractéristiques, les

canaux TRP sont impliqués dans une multitude de fonctions physiologiques telles que la vision,

l'olfaction, l'audition, le goût, la thermosensation, la perception de la douleur, le toucher, la

mécanosensation, la physiologie du calcium et du magnésium au niveau des reins, dans le

tonus des muscles lisses et dans la régulation de la pression sanguine (Venkatachalam &

Montell, 2007; Nilius et al., 2007).

La superfamille des canaux TRP comprend sept familles (Figure 12) divisées en deux groupes

en fonction de leurs homologies structurales et de leur séquence (Venkatachalam & Montell,

2007). Par contre, entre les deux groupes il existe peu d'homologies au niveau des séquences et

de la structure (Flockerzi, 2007). Le premier groupe consiste en cinq sous-familles qui partagent

la plus grande homologie de séquence avec la protéine TRP de la drosophile. On y trouve les

protéines TRPC pour canonique, TRPV pour vanilloïde, TRPM pour mélastatine, TRPA pour

ankyrine et TRPN pour NOMP ou non mécanosensible (Figure 12). En fonction de l’organisme

considéré, le groupe 1 comprend entre 11 à 22 membres. La protéine TRPN n’est pas retrouvée

chez les mammifères bien qu’elle soit exprimée chez certains vertébrés tels que le poisson zèbre

(Venkatachalam & Montell, 2007).

Le deuxième groupe comprend les protéines TRPP pour polycystine et TRPML pour

mucolipine. Ces protéines partagent des homologies de séquence au niveau des segments

transmembranaires et contiennent une large boucle extracellulaire entre le premier (S1) et le

deuxième segment transmembranaire (S2) (Venkatachalam & Montell, 2007).

62
Introduction

b) Unité structurale des canaux TRP

L'ensemble de ces protéines possède une unité structurale caractérisée par la présence de

six segments transmembranaires, structure classique des canaux ioniques (Figure 13). Les

parties N- et C-terminales sont localisées dans le milieu intracellulaire (MIC). Ces protéines

entrent dans la constitution d'un canal cationique de type tétramérique, leur association est de

type homomérique ou hétéromérique et s'effectue principalement entre les protéines d'une

même famille (Hoenderop et al., 2003; Schaefer, 2005; Nilius et al., 2007). Certaines études ont

également mis en évidence des interactions entre les protéines TRPP2 et TRPC1 ou TRPV4

(Tsiokas et al., 1999; Bai et al., 2008; Köttgen et al., 2008).

Le pore du canal est formé par l'association des boucles P dont chacune est localisée entre le

cinquième (S5) et le sixième segment transmembranaire (S6) (Voets & Nilius, 2003; Voets et al.,

2004; Liu et al., 2007; Vassort & Fauconnier, 2008) (Figure 13).

Tous les canaux TRP fonctionnels sont perméables au calcium, exceptés TRPM4 et TRPM5 qui

sont uniquement perméables aux cations monovalents. La plupart des canaux TRP sont peu

sélectifs au calcium avec un ratio relatif de perméabilité (en comparaison avec le sodium,

PCa/PNa) compris entre 0,3 et 10. Seul TRPV5 et TRPV6 présentent une forte sélectivité pour le

calcium avec un PCa/PNa > 100 (Flockerzi, 2007; Nilius et al., 2007; Vassort & Fauconnier, 2008).

Certains de ces canaux dont TRPP2 sont ouverts de manière constitutive tandis que d'autres,

comme les TRPC, sont activés en fonction de l'état de remplissage des réservoirs calciques

intracellulaires (Vassort & Fauconnier, 2008).

63
Introduction

PKD2L1 PKD1L3

Boucle-P Séquence riche en cystéine


Séquence riche en leucine
Séquence d’interaction avec les
signaux de stress
Séquence PKD répétée
Site protéolytique
RE des RCPG
RE
Motif EF-hand

Coiled-coil

Site d’activation
RE: signal de rétention au réticulum endoplasmique des protéines G
Coiled-coil
Motif EF-hand: domaine de fixation au calcium

(d’après Ishimaru et Matsunami, 2009) (d’après Delmas et al., 2004)

FIGURE 13. STRUCTURE PROTEIQUE DE PKD2L1 ET DE PKD1L3. Schémas représentant la structure d’une des quatre sous-
unités formant le canal PKD2L1 murin et la sous-unité de la protéine PKD1L3 à laquelle PKD2L1 a été montrée pouvant
s’associer.

c) TRPP (polycystine)

La famille TRPP est présente dans tout le règne animal de l'oursin à l'homme mais est

absente chez les organismes unicellulaires (Delmas et al., 2004b; Venkatachalam & Montell,

2007). Ces protéines sont retrouvées dans une grande diversité d'organes dont le rein, la rétine,

les testicules, le cerveau et le cœur où elles participent à diverses fonctions. Il existe trois

membres de canaux TRPP chez les mammifères, TRPP2, TRPP3 et TRPP5. L'archétype de cette

famille est TRPP2 qui a été mis en évidence de par son implication dans la polykystose rénale

autosomique dominante (APKD). Cette maladie génétique est due à une mutation somatique

dominante touchant deux protéines rénales : PKD1 (polykystose kidney disease type 1) et PKD2

(polykystose kidney disease type 2) (Parfrey et al., 1990; Ravine et al., 1992; Mochizuki et al.,

1996; Nilius et al., 2007; Chapin & Caplan, 2010). PKD2 correspond à TRPP2 et de par la

présence d'homologies de séquence et de structure, TRPP3 est également nommée PKD2-like1

ou PKD2L1 et TRPP5, PDK2L2 (Venkatachalam & Montell, 2007; Nilius et al., 2007). La protéine

PKD1 est constituée de 11 segments transmembranaires et ne semble pas former de canal

fonctionnel, mais de par ses homologies de séquence avec PKD2 (essentiellement dans les six

derniers segments transmembranaires) elle est également nommée TRPP1. Cette protéine

64
Introduction

interagit avec PKD2 pour la formation d'un canal fonctionnel localisé à la membrane plasmique

(Qian et al., 1997; Tsiokas et al., 1997; Hanaoka et al., 2000; Venkatachalam & Montell, 2007;

Nilius et al., 2007).

La fonction de ces protéines est encore mal connue. TRPP2 (PKD2) est la protéine la plus

étudiée et est fortement impliquée dans la mécanotransduction. La protéine TRPP2 est souvent

localisée au niveau de la membrane plasmique des cils primaires où elle joue un rôle important

dans le développement du cœur, des muscles squelettiques, des reins mais aussi dans

l'établissement de la symétrie gauche-droite chez l'embryon (Delmas et al., 2004b; Nilius et al.,

2007; Chapin & Caplan, 2010). Le transport de cette protéine à la membrane plasmique semble

dépendant de son association à TRPP1 (PKD1) (Hanaoka et al., 2000; Nauli et al., 2003; Delmas et

al., 2004a, 2004b). En général, TRPP2 est peu exprimée à la membrane plasmique mais est très

concentrée au niveau de la membrane des organites intracellulaires et plus particulièrement au

niveau du réticulum endoplasmique (RE) (Cai et al., 1999; Chen et al., 2001; Koulen et al., 2002;

Köttgen et al., 2005). Ceci est sous-tendu par la présence d'une séquence de rétention au RE au

niveau de l'extrémité C-terminale de la protéine (Delmas et al., 2004b; Tsiokas et al., 2007). A ce

niveau, TRPP2 agirait comme un canal calcique intracellulaire activé par la concentration

intracellulaire de calcium (Koulen et al., 2002; Delmas et al., 2004b). La présence du complexe

PKD2/PKD1 au niveau des jonctions cellulaires permet de suggérer une participation de ce

complexe dans la communication et l'adhésion cellulaire et dans l'interaction cellule-matrice

(Delmas et al., 2004b; Streets et al., 2009; Drummond, 2011). Enfin, TRPP2 pourrait participer aux

mécanismes de régulation de la prolifération et de la croissance cellulaire (Nilius et al., 2007;

Zhou, 2009; Chapin & Caplan, 2010).

Très peu d'études ont été réalisées sur les autres membres de la famille de canaux TRPP. Huang

et collaborateurs ont mis en évidence l'implication de TRPP3 (PKD2L1) dans la détection du

goût aigre (Huang et al., 2006). Ce canal est impliqué dans le développement de la rétine et des

poils (Vassort & Fauconnier, 2008). Il a été suggéré que TRPP3 est sensible au voltage, activé par

le calcium (Liu et al., 2002; Shimizu et al., 2009) et qu'il est impliqué dans la détection des

variations de pH et d'osmolarité du MEC (Huang et al., 2006; Shimizu et al., 2009, 2011).

L'ensemble des modulations et des fonctions suggérées pour TRPP3 sera détaillé plus loin.

65
Introduction

2. STRUCTURE DES CANAUX TRRP3

a) Caractéristiques structurales et Stœchiométrie des canaux PKD2L1

Le gène pkd2l1 a été identifié en 1998 et code pour la protéine PKD2L1 ou TRPP3 qui

partage 50 % d’identité et 71 % de similarité avec la protéine PKD2 (Nomura et al., 1998; Wu et

al., 1998a). Les canaux TRPP3 ou PKD2L1 sont cationiques non sélectifs perméables au calcium

(Chen et al., 1999; Li et al., 2002) et de type tétramérique (Owsianik et al., 2006a; Venkatachalam

& Montell, 2007; Yu et al., 2012). L'association peut être de type homomérique ou hétéromérique

(Ishimaru et al., 2006; Ishii et al., 2009; Yu et al., 2012). Lors d'interactions hétéromériques avec

PKD1L3, le complexe protéique est composé de trois protéines PKD2L1 et d'une protéine

PKD1L3 (Molland et al., 2011; Yu et al., 2012).

La protéine PKD2L1 constituant ces sous-unités est membranaire, est composée de 804

résidus d'acides aminés et contient six segments transmembranaires (Figure 13) (Nomura et al.,

1998). Le pore des canaux homomériques fait environ 7 angströms (Dai et al., 2006, 2007) et est

constitué par l'association de boucles P (segments extracellulaires) localisées entre S5 et S6 de

chaque sous-unité (Li et al., 2003a), tandis que le vestibule du pore fait environ 12 angström (Dai

et al., 2006). Au niveau des boucles P, les segments protéiques contiennent des acides aminés

chargés négativement contribuant aux propriétés de perméabilité et de sélectivité ionique du

canal (Nomura et al., 1998; Li et al., 2003a; Owsianik et al., 2006b). Parmi ces acides aminés il

semblerait que deux acides glutamiques jouent un rôle majeur puisque leur substitution par des

acides aminés neutres (sérine ou alanine) abolit le courant porté par le canal PKD2L1/PKD1L1

(DeCaen et al., 2013). De par l'homologie de séquence entre la boucle P et le segment

extracellulaire situé entre S10 et S11 des protéines de la famille PKD1, certaines études

suggèrent que ces protéines participent à la formation du pore du canal (Li et al., 2003a;

LopezJimenez et al., 2006; Fujimoto et al., 2011). Cependant, l'implication de ce segment

protéique dans la constitution du pore du canal reste ouverte à débat, puisque la délétion des

acides aminés chargés négativement de ce domaine, n'induit pas forcément de modification de

la perméabilité ni de la sélectivité ionique du canal PKD2L1 (Fujimoto et al., 2011; Yu et al.,

2012). Il semblerait que cet effet soit dépendant du système d'expression utilisé (ovocytes de

xénopes vs HEK293T).

66
Introduction

Les parties N- et C-terminales sont dans le milieu intracellulaire et possèdent divers domaines

de régulation (Figure 13). L'extrémité N-terminale de la protéine contient de nombreux sites de

N-glycosylation et de phosphorylation (Nomura et al., 1998; Wu et al., 1998a).

La partie C-terminale contient un domaine de fixation du calcium (EF-hand), deux séquences de

rétention au réticulum endoplasmique ER1 et ER2, localisées en amont du domaine EF-hand

(Figure 13) et divers sites de phosphorylation et de N-glycosylation (Nomura et al., 1998;

Ishimaru & Matsunami, 2009). Des expériences de mutation par substitution au sein des

domaines ER révèlent que ER1 joue un rôle majeur dans la rétention de PKD2L1 au sein du

réticulum endoplasmique (Murakami et al., 2005). La partie C-terminale contient également

trois domaines coiled-coil (CC1, CC2 et CC3) (Molland et al., 2010; Yu et al., 2012) et de

nombreux sites de phosphorylation. De par la présence de ces divers sites de régulation, cette

partie est communément appelée CDR pour "C-terminal regulatory domain" (Li et al., 2002).

Cette partie CDR semble impliquée dans l'oligomérisation et donc dans la formation d'un canal

ionique fonctionnel (Murakami et al., 2005). L'expression recombinante chez Escherichia coli du

domaine CDR a permis de montrer que l'association de ces domaines, au sein du canal PKD2L1,

se fait sous forme trimérique, que cette oligomérisation est essentiellement sous-tendue par le

domaine coiled-coil CC2 et qu'elle est indépendante du calcium (Molland et al., 2010). Ceci est

supporté par une étude montrant que la mutation par substitution des acides aminés impliqués

dans la formation de ce domaine, abolit l'oligomérisation ce qui indique que le domaine coiled-

coil jouerait un rôle crucial dans l'association des protéines PDK2L1 (Yu et al., 2012). Cependant,

ce résultat est en contradiction avec une étude montrant que les domaines transmembranaires

de la protéine PKD2L1 sont responsables des interactions homo- ou hétéromériques puisque la

délétion du domaine coiled-coil ne modifie pas l'oligomérisation (Ishimaru et al., 2010).

La différence de résultats peut néanmoins s'expliquer par le fait que ces études utilisent des

systèmes d'expression distincts (ovocytes de xénopes vs. cellules embryonnaires rénales

humaines : HEK293T) et réalisent des délétions ne touchant pas exactement les mêmes sites et

n'affectant donc pas les mêmes acides aminés de la protéine. Enfin, il convient de rappeler, que

les modifications de séquences entrainent des modifications de structure protéique, surtout si

l'on considère que les délétions réalisées touchent des acides aminés hydrophobes pouvant

potentiellement affecter les interactions de la protéine avec de nombreux partenaires. Ces

délétions peuvent modifier la structure tertiaire et quaternaire de la protéine. L'environnement

des protéines a également un impact sur la structure, ainsi l'utilisation de différents modèles
67
Introduction

d'expression, possédant chacun un environnement propre, peut également expliquer les

différences de résultats.

Enfin, plusieurs études montrent qu'il existe de nombreux partenaires protéiques ou lipidiques

(voir partie partenaires B2. b) qui entrent dans la formation et/ou dans la modulation du canal

PKD2L1 (Figure 16) (Ishimaru et al., 2006; Li et al., 2007; Yang et al., 2011; Demirkan et al., 2012).

b) Partenaires

De nombreux partenaires de PKD2L1 ont été décrits. Leur présence semble parfois

intervenir directement dans la formation du canal, son transport ou sa modulation. Dans cette

partie, nous verrons l'ensemble de ces partenaires, leurs modes d'interaction et la fonction de

ces interactions.

Famille des protéines PKD1 :


La famille des protéines PKD1 ainsi que ses homologues PKD1L (ou TRPP1-like) qui

sont représentés par quatre membres : PKD1L1, PKD1L2, PKD1L3 et PKDREJ (receptor for egg-

jelly) (Nilius et al., 2007). Si PKD1 est ubiquitaire et exprimée dans presque tous les tissus, ses

homologues ont une expression restreinte à certains tissus comme par exemple PKDREJ qui est

exprimée uniquement dans les testicules (Hughes et al., 1999).

Ces protéines sont constituées de 11 segments transmembranaires (Figure 13) (Li et al., 2003a).

La partie N-terminale est très large (constituée de 3000 acides aminés sur les 4302) et est située

dans le compartiment extracellulaire, elle contient une série de motifs protéiques dont deux

domaines riches en leucine et 16 domaines immunoglobulines appelés "PKD repeats". Certains

de ces motifs sont impliqués dans les interactions protéine-protéines, suggérant que les

protéines PKD1 fonctionnent comme un récepteur pour un ligand non défini. Proche de la

membrane se trouve un domaine REJ (receptor for egg-jelly ) et un site de clivage protéolytique

(domaine GPS : site protéolytique des récepteurs couplés aux protéines G) (Igarashi & Somlo,

2002; Li et al., 2003a; Delmas et al., 2004b; LopezJimenez et al., 2006; Nilius et al., 2007). Entre le

premier et deuxième segment transmembranaire, il y a une région similaire à celle des

lipoxygénases (domaine PLAT/LH2) (Bateman & Sandford, 1999; LopezJimenez et al., 2006) qui

pourrait être impliquée dans les associations protéiques intracellulaires. La région protéique

contenant les six derniers segments transmembranaires possède de fortes homologies avec

PKD2 et d'autres canaux calciques voltage-dépendants (Hughes et al., 1995). PKD1 contient

68
Introduction

donc des segments protéiques très conservés dans les canaux ioniques et une boucle P entre les

deux derniers segments transmembranaires, qui semble participer à la perméabilité et la

sélectivité ionique des canaux PKD2L1 (Li et al., 2003a; LopezJimenez et al., 2006; Yu et al., 2012).

Ces résultats permettent de penser que les protéines PKD1L3 pourraient avoir des fonctions de

canal ionique. De plus, il a été mis en évidence que la délétion de la seule partie C-terminale de

PKD1L3 perturbe la réponse du canal PKD2L1 en réponse à l'application d'un pH acide

(Ishimaru et al., 2010). Ceci suggère que PKD1L3 pourrait jouer un rôle plus actif que suspecté

dans la régulation et la perméabilité du canal PKD2L1.

La partie C-terminale des protéines de la famille PKD1 se trouve dans le compartiment

intracellulaire, elle est relativement courte et sa structure varie entre les différents homologues.

PKD1 contient un domaine coiled-coil (Figure 13), qui est absent chez PKD1L2 et plus restreint

chez PKD1L3 (Li et al., 2003a). Ce domaine permet des interactions protéines-protéines

notamment entre les protéines PKD (Qian et al., 1997; Tsiokas et al., 1997; Wu & Somlo, 2000). La

partie C-terminale contient également de nombreux sites de phosphorylation, et un site

d'interaction/activation des protéines G (Delmas et al., 2004b).

Divers membres de cette famille semblent interagir avec PKD2L1. Tout comme PKD2,

PKD2L1 semble pouvoir interagir avec PKD1 (Hanaoka et al., 2000; Bui-Xuan et al., 2006). Dans

des modèles d'expression hétérologue, il a été montré que cette interaction était nécessaire pour

le transport de PKD2L1 à la membrane plasmique et la formation d'un canal fonctionnel

(Murakami et al., 2005). Un autre membre de la famille PKD1, la protéine PKD1L3, est

également décrit comme partenaire de PKD2L1. Ceci a été démontré au niveau des bourgeons

du goût où PKD1L3 est coexprimée avec PKD2L1 (Ishimaru et al., 2006; Ishimaru & Matsunami,

2009; Ishii et al., 2009). L'interaction avec PKD1L3 serait impliquée dans l’adressage du canal

PKD2L1 à la membrane plasmique (Ishimaru et al., 2006, 2010) et dans la formation d'un canal

fonctionnel (Ishimaru et al., 2006). De manière intéressante, il est montré que le transport de

PKD1L2 à la membrane plasmique ferait intervenir les segments transmembranaires des deux

protéines tandis que la formation d'un canal fonctionnel semble dépendante de l'intégrité de la

partie C-terminale de PKD1L3 (Ishimaru et al., 2010). Le complexe protéique PKD2L1/PKD1L3

forme un canal cationique non sélectif, présentant une forte perméabilité au calcium (Ishimaru

et al., 2006; Inada et al., 2008). Leur co-expression dans les cellules HEK 293, induit la formation

d'un canal cationique présentant une réponse de type off lors de l'acidification du milieu

extracellulaire (Figure. 15) (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008). De plus, ces protéines
69
Introduction

colocalisent in vivo dans les cellules des bourgeons du goût activées par le pH acide

(LopezJimenez et al., 2006; Huang et al., 2006; Kawaguchi et al., 2010).

Enfin, plus récemment, il a été montré que PKD1L1 serait un nouveau partenaire de PKD2L1.

Cette interaction est retrouvée au niveau des cils primaires des cellules de l’épithélium

pigmentaire de la rétine et des fibroblastes embryonnaires (DeCaen et al., 2013; Delling et al.,

2013). Ce complexe constituerait un canal cationique non sélectif perméable au calcium. Si seul

PKD2L1 semble intervenir dans la formation du pore du canal, la formation du complexe

hétéromérique est indispensable pour l’intégrité du courant induit par l’ouverture de ce canal.

Enfin, la présence de ce complexe n’est pas indispensable à la formation du cil primaire mais

semble jouer un rôle important dans la physiologie du cil et plus précisément dans la

signalisation calcique intra-ciliaire (Delling et al., 2013).

Mécanismes d'interaction :
L'interaction PKD2L1/PKD1(-L) semble faire intervenir une caractéristique structurale

de ces protéines. Tous les membres de la famille protéique PKD2-Like (TRPP2-Like) possèdent

un domaine coiled-coil au niveau de leur extrémité C-terminale potentiellement impliqué dans

des interactions protéiques. Le complexe multiprotéique résultant de ces interactions participe à

la formation et à la modulation du canal ionique (Murakami et al., 2005; Ishimaru et al., 2006;

Nilius et al., 2007; Li et al., 2007). Cependant, l'implication de ce domaine coiled-coil dans

l'oligomérisation hétéromérique est controversée. En effet, certaines études montrent que la

délétion de la partie C-terminale de PKD2L1, contenant ce domaine, n'a pas d'impact sur

l'interaction hétéromérique, pas plus que sur la fonctionnalité du canal ionique ou sur sa

sélectivité (Li et al., 2002; Ishimaru et al., 2010). L'interaction entre PKD2L1 et PKD1L3 ferait

intervenir les segments transmembranaires des deux protéines et permettrait le transport du

canal hétéromérique à la membrane plasmique (Ishimaru et al., 2010). Ce résultat est conforté

par une étude montrant que si le domaine coiled-coil est nécessaire pour la trimérisation des

parties C-terminales de PKD2L1 et de la protéine entière, il ne l'est pas pour l'interaction de

PKD2L1 avec PKD1L3 (Yu et al., 2012).

Bien que certaines études montrent que l'expression unique de PKD2L1 conduit à la

formation d'un canal cationique non sélectif et perméable au calcium (Dai et al., 2007; Shimizu et

al., 2009, 2011; Yang et al., 2011), la présence de canaux hétéromériques pourrait permettre

d'accroitre la diversité des canaux PKD2L1. En effet, les canaux homomériques PKD2L1 et les

70
Introduction

canaux faisant intervenir PKD1L3 présentent une activité basale différente (constitutive vs

induite), des valeurs de conductance différentes et des réponses opposées au pH (Chen et al.,

1999; Li et al., 2002, 2007; Liu et al., 2002; Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008). Ainsi, il peut

être suggéré que la présence d’interaction entre PKD2L1 et PKD1/PKD1L3 permettrait la

formation de canaux ioniques possédant des caractéristiques fonctionnelles propres, que ce soit

en terme de localisation cellulaire, de conductance ou de sélectivité ionique pouvant amener à

des aspects fonctionnels variés. Cette diversité semble également être accentuée par le fait que

PKD1L3 est le fruit d'un épissage alternatif conduisant à la synthèse de différents transcrits

protéiques (Li et al., 2003a; LopezJimenez et al., 2006). Enfin, ce phénomène parait d'autant plus

plausible que ce mécanisme est déjà connu pour les autres membres de la famille TRP (Cheng et

al., 2010) ainsi que pour les canaux potassiques voltage-dépendants (Coetzee et al., 1999).

Autres partenaires de PKD2L1:


D'autres partenaires protéiques ou lipidiques ont été décrits pour interagir avec PKD2L1

et moduleraient l'activité du canal.

Dans des modèles d'expression hétérologue, il a été mis en évidence que PKD2L1 interagit avec

les différentes isoformes de la famille des troponines (I, II, et II) (Li et al., 2003b). La troponine

est une protéine participant à la constitution des filaments d'actine et joue un rôle important

dans la régulation de la contraction musculaire au niveau des muscles squelettiques et

cardiaques. L'interaction entre PKD2L1 et la troponine III est également retrouvée in vivo dans

le tissu cardiaque humain. Une ou plusieurs troponines semblent interagir avec l'extrémité C-

terminale de la protéine PKD2L1, cette interaction ferait intervenir les domaines coiled-coil de

PKD2L1 et de la troponine. Enfin, cette étude montre que l'interaction PKD2L1/troponine réduit

l'activation calcium-dépendante du canal probablement en agissant sur le domaine EF-hand de

PKD2L1 (Li et al., 2003b).

Une autre protéine associée aux filaments d’actine interagit avec PKD2L1. Il s’agit de l’alpha-

actinine, une protéine importante dans les associations protéiques avec l’actine et qui est

retrouvée de manière abondante dans un grand nombre de cellules. Cette association est

indépendante du calcium, elle implique les extrémités N- et C-terminales de PKD2L1 et induit

une augmentation de la probabilité d’ouverture (x 2 en moyenne) du canal sans affecter sa

conductance unitaire. Cette stimulation de l’activité canal, observée dans des enregistrements

électrophysiologiques sur bicouche lipidique, semble avoir une conséquence fonctionnelle

71
Introduction

physiologique puisque in vivo, PKD2L1 interagit avec l’alpha-actinine dans les cellules

humaines non musculaires rénales et musculaires cardiaques. L’alpha-actinine étant retrouvée

dans une grande diversité de tissu dont le cerveau, il est envisageable que cette interaction soit

également présente dans ces régions (Li et al., 2007).

La protéine RACK1 (receptor for activated C kinase 1), une protéine d'ancrage et d'échafaudage

impliquée dans diverses fonctions dont la croissance et forme cellulaire, la traduction des

protéines ainsi que dans des mécanismes de phosphorylation protéique grâce à l'activation de

protéines kinase telle que la PKC (protéine kinase C). De manière intéressante, une étude

montre que RACK1 interagit avec les parties N- et C-terminale de PKD2L1 (Yang et al., 2011).

Cette interaction est retrouvée in vivo dans les tissus rénaux et cardiaques mais son rôle

fonctionnel n'est pas établi. Dans des systèmes d’expression, l'enregistrement

électrophysiologique en configuration cellule entière, montre que cette interaction diminue de

65 % l'activité basale du canal PKD2L1 homomérique et réduit de 87 % l'activation calcium-

dépendante. Cet effet sur l'activité canal ne semble pas être lié uniquement à la diminution

d'expression à la membrane plasmique de PKD2L1 en présence de RACK1. Ainsi, l'inhibition de

l'activité canal serait sous-tendue par l'interaction de RACK1 avec la partie N-terminale (Met1-

Pro45) de PKD2L1. Ce mécanisme ne fait pas intervenir les sites de phosphorylation de PKD2L1

puisque la substitution des résidus phosphorylables de l'extrémité N-terminale n'altère pas

l'inhibition de l'activité canal par la protéine RACK1. Cependant, l'importance de cette

modulation in vivo dans le tissu cardiaque et rénal reste à être établie.

Enfin, une étude in silico a montré que PKD2L1 interagirait avec des phospholipides circulant

telle que la lysophophatidylcholine dont il influence le taux plasmatique (Demirkan et al., 2012).

PKD2L1 interagit avec diverses protéines (Figure 16) dont certaines sont impliquées

dans la formation des filaments d’actine (Li et al., 2003b, 2007). Des études ont montré que le

cytosquelette d’actine est important dans les fonctions sensorielles de TRPP2 (PKD2)

(Montalbetti et al., 2005; Christensen & Corey, 2007). Ainsi, nous pouvons donc suspecter que

ces protéines, interagissant avec PKD2L1 (ou TRPP3) et constituant le cytosquelette d'actine,

jouent un rôle sur la sensibilité de ce canal aux modifications environnementales. De plus, ces

études montrent que l'ensemble des partenaires protéiques décrits ont un effet sur l'activité

canal. De ce fait, même si la fonction in vivo de ces interactions n'est pas encore mise en

évidence, il parait envisageable que ces partenaires en modulant l'activité canal, modifient les

72
Introduction

fonctions sensorielles de PKD2L1 et qu'ils aient un impact important sur sa fonction

physiologique.

3. LOCALISATION

a) Localisation Tissulaire et types cellulaires

La protéine PKD2L1 est exprimée dans divers tissus et organes. Chez l’homme PKD2L1

est exprimée au niveau des muscles striés (cardiaque et squelettique), du cerveau, des reins, des

testicules, de la rétine et de la rate (Wu et al., 1998a; Delmas et al., 2004b). Chez les murins, la

protéine PKD2L1 est exprimée au niveau des reins, de la rétine, du cerveau, des bourgeons du

goût, du colon, de l'intestin et de l'aorte et une faible expression a été observée au niveau des

testicules, de la chaine ganglionnaire dorsale, du pancréas et dans les glandes surrénales

(Nomura et al., 1998; Murakami et al., 2005; Huang et al., 2006). Chez la souris, contrairement à

l'homme, PKD2L1 semble être présente au niveau de l'épicardium et des vaisseaux sanguins

ventriculaires plutôt que dans le myocarde (Basora et al., 2002). Le niveau d'expression de cette

protéine varie en fonction du stade de développement puisqu'elle est très présente dans les

tissus fœtaux et moins chez l'adulte (Nomura et al., 1998).

L’analyse de la localisation cellulaire des protéines PKD2L1 a permis de mettre en évidence que

si ces protéines sont exprimées dans une grande variété de tissus, dans chaque organe ce patron

d’expression ne concerne que quelques types cellulaires (Tableau 7). Ainsi, au niveau des reins,

ces protéines sont restreintes à la zone médullaire interne et plus précisément, elles se

retrouvent colocalisées avec le transporteur d’eau aquaporine de type 3 (AQP3) au niveau des

cellules principales du tube collecteur. Au niveau de la rétine, ces protéines sont exprimées par

les cellules ganglionnaires et les cellules de la couche nucléaire interne. Au niveau du foie, elles

sont retrouvées dans les canalicules biliaires, dans le pancréas, les protéines PKD2L1 sont

exprimées par les cellules épithéliales des conduits pancréatiques (principal et accessoires).

D’autres types cellulaires expriment ces protéines comme les spermatocytes au niveau

testiculaire ou encore les cellules réticulaires dans la pulpe rouge de la rate (Basora et al., 2002).

PKD2L1 est également retrouvé dans les bourgeons du goût. Les bourgeons du goût sont

localisés d'une part dans les papilles gustatives de la langue et d'autre part au niveau du palais

(Figure 17. A). Ce sont des structures en forme d'oignon constituées de différents types

73
Introduction

cellulaires (les cellules basales, les cellules gustatives de type I à IV) dont la partie apicale

constitue un pore, le pore gustatif, qui est en contact direct avec les molécules alimentaires

(Roper, 1989; Chandrashekar et al., 2006; Kataoka et al., 2008; Yoshida et al., 2009). PKD2L1 est

retrouvé au niveau de l'ensemble des aires du goût constituées par les papilles fongiformes, les

papilles caliciformes, les papilles foliées et le palais (Figure 17. B) (LopezJimenez et al., 2006;

Ishimaru et al., 2006; Huang et al., 2006) et plus précisément dans la partie apicale des cellules de

types III GABAergiques activées par le pH acide (Kataoka et al., 2008; Kawaguchi et al., 2010).

Ces cellules libèrent de la sérotonine (5-HT) sur les fibres gustatives lorsqu'elles sont activées

(Huang et al., 2008).

Enfin, dans le cerveau, PKD2L1 est retrouvé dans les NcLCR autour du canal central de la

moelle épinière (Huang et al., 2006). Mais cette protéine a également été décrite au niveau du

pont, du bulbe olfactif, de l'hippocampe et du thalamus (Li et al., 2007).

Le tableau 7 résume l’ensemble de types cellulaires où est décrite l’expression des protéines

PKD2L1.

Organe Types cellulaires


Reins Cellules principales du tube collecteur (zone médullaire)
Rétine Cellules ganglionnaires, cellules de la couche nucléaire interne
Foie Cellules des canalicules biliaires
Cellules épithéliales des conduits pancréatiques (principaux et
Pancréas
accessoires)
Testicules Spermatocytes
Rate Cellules réticulaires de la pulpe rouge
Système nerveux central NcLCR autour du canal central de la moelle épinière
Cellules de types III dans les papilles fongiformes, les papilles
Bourgeons du goût
caliciformes, les papilles foliées et le palais

TABLEAU 7. LOCALISATIONS TISSULAIRES ET CELLULAIRES DE LA PROTEINE PKD2L1.

74
Introduction

b) Localisation Membranaire et subcellulaire

Dans la cellule, la localisation de la protéine PKD2L1 est controversée et parait fortement

dépendante du modèle d’étude employé.

De manière similaire à son homologue PKD2, les études basées sur l'expression hétérologue de

PKD2L1 dans des cellules embryonnaires rénales humaines (HEK 293T) ont montré que la

présence de PKD2L1 à la membrane plasmique est dépendante de l’expression de protéines de

la famille PKD1 (PKD1 et PKD1L3) (Murakami et al., 2005; Ishimaru et al., 2006, 2010).

Lorsqu'elle est exprimée seule, la protéine PKD2L1 est majoritairement retrouvée dans les

organites intracellulaires et plus particulièrement dans le RE (Murakami et al., 2005; Ishimaru et

al., 2006). L’expression membranaire semble dépendante de la rétention de PKD2L1 dans le RE

et les protéines de la famille PKD1 joueraient un rôle clé dans le passage de PKD2L1 du RE à la

membrane. Cette présence au niveau du RE est confortée par le fait que lorsque PKD2L1 est

retrouvée au niveau intracellulaire, elle semble permettre une libération de calcium à partir des

stocks intracellulaires suite à l'application de la vasopressine (AVP, hormone antidiurétique)

(Geng et al., 2006).

Le transport et la localisation de PKD2L1 sont des phénomènes différents dans les études où

l'expression hétérologue de PKD2L1 est réalisée dans les ovocytes de xénope. Dans ce système

d’expression, le transport à la membrane plasmique de PKD2L1, s’effectue lors de l’expression

unique de cette protéine et ne semble pas faire intervenir les protéines de la famille PKD1 (Chen

et al., 1999; Liu et al., 2002; Dai et al., 2006). Inversement, dans ce système d’étude, c’est la

présence de PKD1L3 à la membrane plasmique qui est dépendante de l'expression de PKD2L1

(Yu et al., 2012).

Dans des études utilisant des systèmes d’expression native, la localisation subcellulaire

de PKD2L1 apparait toute aussi variée. Une étude immunocytochimique sur des cellules rénales

en culture montre que PKD2L1 est colocalisée avec la γ-tubuline au niveau des centrosomes et

aurait un rôle inhibiteur sur la prolifération cellulaire (Bui-Xuan et al., 2006). La présence d'une

protéine membranaire libre dans le cytoplasme parait tout de même énigmatique. Mais il peut

être envisagé que ce marquage soit lié au transport ciliaire de PKD2L1 plutôt qu'à la mise en

évidence de l'implication de PKD2L1 dans la constitution même du centrosome. Le transport

ciliaire de PKD2L1 est conforté par une étude récente, montrant qu’au niveau des cellules de

l’épithélium pigmentaire de la rétine et des fibroblastes embryonnaires, PKD2L1 est localisée


75
Introduction

sur le cil primaire où il est responsable d’un courant entrant à l’origine d’une augmentation de

la concentration calcique intra-ciliaire. Cette localisation fait appel à un autre partenaire

protéique de la famille de PKD1, PKD1L1 (DeCaen et al., 2013; Delling et al., 2013). Cette étude

contredit les travaux de Geng et collaborateurs qui montraient que lors de l’expression

hétérologue de PKD2L1 dans les cellules LLC-PK1 (cellules épithéliales rénale de porc),

PKD2L1 n’était pas transporté au niveau du cil (Geng et al., 2006). Cette étude stipule qu’un

motif présent dans l’extrémité N-terminale de PKD2 (S-x-R-V-x-P) mais absent dans PKD2L1

permet le transport protéique vers le cil. L’absence de séquence d’adressage au cil dans PKD2L1

permet de penser que son transport implique des mécanismes différents de ceux pour PKD2.

Ces mécanismes pourraient faire appel à des partenaires absents dans le modèle de cellules

utilisé pour cette étude.

L'impact de partenaires protéiques de la famille PKD1 dans le transport et l'adressage

membranaire de PKD2L1 apparait dépendant du type cellulaire considéré. Ceci est conforté par

le fait que dans les cellules polarisées, telles qu’au niveau des reins et de l’épicardium, PKD2L1

semble être majoritairement localisée au niveau de la membrane plasmique. Tandis que dans la

rétine et au niveau des cellules ganglionnaires, le marquage de PKD2L1 est essentiellement

intracellulaire (Basora et al., 2002). Toutefois, l'existence de partenaires protéiques autres que

ceux de la famille PKD1, ou l’implication de complexes protéiques intervenant dans le transport

de PKD2L1 à la membrane plasmique ne peut être écartée. En effet, la co-expression

hétérologue de la protéine RACK1 avec la protéine PKD2L1 induit la diminution de l'expression

de PKD2L1 à la membrane plasmique (Yang et al., 2011). De plus, in vivo il n'y a pas un

recouvrement total dans la localisation des protéines PKD2L1 avec les protéines de la famille

PKD1 (LopezJimenez et al., 2006; Huang et al., 2006).

Un autre point intéressant, mis en évidence par l'étude in vitro de la localisation subcellulaire

des protéines PKD2L1 dans les cellules rénales, est le fait que cette localisation pourrait

dépendre du stade de maturité cellulaire. Dans les cultures non confluentes, où les cellules

continuent de proliférer, PKD2L1 est retrouvé majoritairement dans le RE tandis que dans les

cultures confluentes, caractérisée par l'arrêt de la division et l'entrée dans la différentiation

cellulaire, PKD2L1 est retrouvé essentiellement au niveau du cil primaire mais aussi au niveau

de la membrane plasmique (Bui-Xuan et al., 2006).

76
Introduction

De plus, quel que soit l'état de la culture (confluente ou pas), PKD2L1 apparait toujours

colocalisée avec PKD1 et les expériences de co-immunoprécipitation révèlent que ces protéines

interagissent entre elles (Bui-Xuan et al., 2006). Cette co-localisation au niveau du RE va à

l'encontre de l'hypothèse selon laquelle les protéines de la famille PKD1 permettraient un

transport et une localisation de PKD2L1 dans la membrane plasmique. Ce mécanisme semble

être plus complexe et la participation d'un complexe protéique ou d'autres protéines ne peut

être exclue. De nombreuses études se sont intéressées à ces mécanismes, il est supposé que la

formation d'hétéromères est nécessaire à la formation d'un canal ionique fonctionnel localisé au

niveau de la membrane plasmique. Il est suggéré que la partie C-terminale de la protéine

PKD2L1 où est localisé le domaine coiled-coil ait un rôle clé dans cette fonction (Li et al., 2002;

Murakami et al., 2005; Yu et al., 2012). Cependant, Ishimaru et collaborateurs montrent que la

délétion de la partie C-terminale de PKD2L1 et de PKD1L3 n'affecte pas le transport du

complexe protéique à la membrane plasmique (Ishimaru et al., 2010). Ces différences peuvent

s'expliquer par l'utilisation de différents modèles d'expression (ovocytes vs cellules HEK).

Enfin, la localisation à la membrane du complexe PKD2L1/PKD1L3 est indépendante de

l'intégrité du pore du canal (Fujimoto et al., 2011).

Ainsi, il peut être envisageable, qu’en fonction du type cellulaire et du stade de maturité,

PKD2L1 soit impliquée dans différentes fonctions expliquant ces diverses localisations

subcellulaires. Le mécanisme déterminant ces localisations parait complexe et serait dépendant

de partenaires protéiques variant en fonction du type cellulaire considéré, ce qui expliquerait la

différence de résultats obtenus en fonction du modèle d’étude. De plus, ces études sont

majoritairement basées sur l'effet de la délétion d’acides aminés dans la partie C-terminale de

PKD2L1 conduisant à la formation d'une protéine tronquée. La structure d'une protéine étant

sous-tendue par sa séquence et son environnement, ces différences de résultats peuvent

également s'expliquer par les différences de protocoles. Enfin, il convient de rappeler que

PKD2L1 est le produit d’un épissage alternatif (Nomura et al., 1998; Wu et al., 1998a; Li et al.,

2007) conduisant à la formation de divers transcrits protéiques, ce qui peut également avoir une

conséquence sur la localisation subcellulaire de cette protéine.

77
Introduction

4. FONCTIONNALITE

a) Propriété canal (sélectivité ionique, conductance)

Les propriétés du canal PKD2L1 ont été essentiellement étudiées dans des systèmes

d’expression hétérologue (Figure 14). Il en résulte que celles-ci diffèrent en fonction du système

d’étude.

Propriétés dans les systèmes d'expression hétérologues :


Dans les ovocytes de xénope, l’expression de la forme humaine de PKD2L1 permet la

constitution d’un canal (Figure 14. A) homomérique, cationique non sélectif avec une

perméabilité (P) similaire pour les ions sodium (Na+), potassium (K+) et rubidium (Rb+) et une

faible perméabilité pour le lithium (Li+) (PNa : PK : PRb : PLi = 1 : 0,98 : 0,97 : 0,87). Le canal PKD2L1

est également perméable à l’ammonium (NH4+) et au césium (Cs+) et présente une perméabilité

plus importante pour le NH4+ que pour le Na+ (PNH4 : PCs : PNa = 2,2 : 1,02 : 1). Il est également

perméable aux cations divalents tels que le baryum (Ba++), le strontium (Sr++), et présente une

perméabilité majeure pour le calcium (Ca++) (PCa = 5 x PNa). En revanche, il est très faiblement

perméable au Mg++ (Chen et al., 1999; Liu et al., 2002). Le canal est par contre imperméable aux

cations de grosse taille tel que le N_méthyl_D_glucamine (NMDG), le tetraéthylammonium

(TEA) et la choline (Chen et al., 1999; Liu et al., 2002). La perméabilité ionique dépend fortement

de la taille du cation considéré, ainsi les cations dont la taille excède ≈ 7 angströms ne passe pas

le pore du canal (Dai et al., 2006). Le canal est imperméable à d’autres ions divalents tels que le

plomb (Pb++), le zinc (Zn++), le cadmium (Cd++) et le cobalt (Co++). L’ensemble des substances

étudiées est énuméré dans le tableau 8 (voir exemples Figure 14. B).

78
Introduction

A B

10 pA 40 pA
20 ms 1s

Courant, pA Courant, pA

10
Vm, mV
Vm, mV

-100 100
-10
Na 0

K0 -20

FIGURE 14. LE CANAL PKD2L1 EST CATIONIQUE NON SELECTIF. A, Traces du haut : enregistrement sélectif du courant
unitaire porté par PKD2L1 aux potentiels de membrane indiqués (mV) et en configuration cellule attachée et montrent que
le canal est perméable au Na+ et au K+. La ligne en pointillée représente l’état fermé du canal. En bas, les courbes
correspondent aux relations courant/potentiel moyennes obtenues en présence de 100 mM de Na + (Na0) ou de K+ (Ko) dans
l’électrode d’enregistrement (n=5). Adapté de Chen et al., 1999. B, PKD2L1 est perméable à des amines organiques et au
TMA. Traces en haut : Enregistrement en configuration cellule attachée et en mode potentiel imposé (à – 120 mV) du
courant unitaire porté par PKD2L1 en présence, dans l’électrode d’enregistrement, de 123 mM de K +, Cs+, méthylamine
(MA), diméthylamine (DMA), triéthylamine (TriEA) ou tétraméthylamine (TMA). En bas : représentation de la fonction
courant/potentiel moyenne obtenue pour ces mêmes cations.

79
Introduction

Substance Perméabilité Référence

Cations mono et divalents: Na+, K+, Rb+,


Perméable (Chen et al., 1999; Liu et al., 2002)
Li+, NH4+, Cs+, Ca++, Ba++, Sr++
Cations de grosse taille : TAA, TMA (5,5
Perméable (Dai et al., 2006)
à 6,4 Å),
Cations de grosse taille : NMDG, TEA
(Chen et al., 1999; Liu et al., 2002; Dai et al.,
(6,1-8,2 Å), TPA (9,8 Å), TBA (11,6 Å), Imperméable
2006)
TPeA (13,2 Å)

Amines : choline Imperméable (Chen et al., 1999; Liu et al., 2002)

Amines : MA, DMA, TriEA (de 3,8 à 6 Å


Perméable (Dai et al., 2006)
respectivement)

TABLEAU 8: SYNTHESE DE L’ENSEMBLE DES SUBSTANCES ETUDIEES POUVANT TRANSITER A TRAVERS LE PORE DU CANAL
PKD2L1 HOMOMERIQUE. TAA : tétra-alkylammonium ; TMA : tétra-methylammonium ; NMDG : N-méthyl-D-
glucamine ; TEA : tétraéthylammonium ; TPA : tétra-propylammonium ; TBA : tétra-butylammonium ; TPeA : tétra-
pentylammonium ; MA : méthylamine ; DMA : diméthylamine ; TriEA : triéthylamine.

La relation courant unitaire/voltage montre que le canal est de forte conductance (137 ± 7

pS, milieu extracellulaire contenant 100 mM de Na+) (Chen et al., 1999) (Figure 14). Le canal

PKD2L1 présente une activité basale témoignant d’ouvertures constitutives (Chen et al., 1999;

Liu et al., 2002). Des ouvertures avec des niveaux multiples d'amplitude sont observées; ce qui

pourrait traduire l'existence de plusieurs sous-états de conductance (Chen et al., 1999; Liu et al.,

2002; Li et al., 2007). Le canal présente une faible sensibilité au voltage puisque des ouvertures

sont observées à tous les potentiels mais que la probabilité d’ouverture (N.P0) est environ quatre

fois supérieure pour des potentiels membranaires (Vm) hyperpolarisés (Liu et al., 2002). Cette

dépendance au voltage concerne aussi la conductance du canal (Dai et al., 2007) puisque

l’amplitude des courants unitaires entrant entre -120 et -60 mV est plus importante que celle

enregistrée entre +60 et +120 mV. Ceci qui permet de qualifier ce courant de courant rectifiant

entrant. Cette dépendance au voltage n’affecte pas la cinétique des courants PKD2L1 globaux

suite à l’application de calcium, indiquant que l’activation du canal et sa durée d’ouverture sont

indépendants du voltage (Liu et al., 2002).

L’activité canal est modulée par de nombreux ions. Ainsi le calcium augmente cette activité

tandis que le magnésium (Mg++), les protons (H+), le gadolinium (Gd3+) et le La3+ l’inhibent

(Chen et al., 1999; Liu et al., 2002).

80
Introduction

Dans les cellules HEK293T (pour "human embryonic kidney cells"), l'expression de la

forme murine de PKD2L1 induit la formation d'un canal cationique non sélectif, perméable au

calcium et qui, comme la forme humaine exprimée dans les ovocytes, est ouvert de manière

constitutive (Shimizu et al., 2009). L'étude des perméabilités ioniques révèle une perméabilité

majeure pour le calcium (Pion/PNa = Ca (3,96) > Cs (1,02) ≈ Na (1) > NMDG (0,36)). De manière

similaire à la forme humaine de PKD2L1 exprimée dans les ovocytes, le courant cationique

porté par le canal est rectifiant entrant. Ainsi, la conductance du canal est supérieure pour des

potentiels membranaires négatifs (≈ 184 pS) que pour des potentiels membranaires positifs (≈

105 pS). Et l'activation du canal présente une sensibilité au voltage (Shimizu et al., 2009).

Cependant, contrairement à la forme humaine, la forme murine de PKD2L1 n'est pas activée

par le calcium. De plus, la forme humaine PKD2L1 semble plus perméable au calcium avec un

rapport PCa/PNa autour de 6,3 (DeCaen et al., 2013). Ces différences peuvent être liées aux

variations existant entre ces diverses formes de PKD2L1. En effet, il existe non seulement des

différences de longueur et de séquences entre les deux isoformes de la protéine humaine

(l'isoforme 2 correspond à une protéine plus courte de 758 acides aminé vs. 805 pour l'isoforme

1 ; numéro d’accession NP_057196.2 : isoforme 1 ; NP_001240766.1 : isoforme 2; base de données

GenBank ; NCBI ) mais également entre ces isoformes et la protéine murine (760 acides aminés ;

numéro d’accession NP_852087.2 ; base de données GenBank ; NCBI). Ces différences peuvent

avoir des effets sur les propriétés structurales et fonctionnelles de ces protéines, malgré la

grande similarité entre ces séquences (87 % d'identité entre la forme murine et l'isoforme 1 et 90

% avec l'isoforme 2). Une analyse plus précise des acides aminés et des sites de variations

permettrait de vérifier s'il existe des conséquences fonctionnelles liées à ces différences de

séquences.

Enfin, dans ce système d'expression, le canal PKD2L1 présente différents états : ouvert, fermé et

inactivé. L'état d'activation et d'inactivation du canal semble être modulé par le voltage mais

également par le pH extracellulaire (Shimizu et al., 2011).

La modulation de l'activité canal est essentiellement étudiée dans les cellules HEK293T où la

majorité des recherches concerne l'effet du pH acide sur les canaux hétéromériques

PKD2L1/PKD1L3. Ceci provient du fait que ces deux protéines semblent participer à la

détection de stimuli acides par les cellules gustatives mais également car la localisation

membranaire de PKD2L1 et donc la constitution d'un canal fonctionnel est dépendante de la

présence de PKD1L3 (Ishimaru et al., 2006; Huang et al., 2006; Inada et al., 2008; Ishii et al., 2009).
81
Introduction

Les résultats obtenus dans ce système d'expression montrent que le canal PKD2L1 est activé

après l'exposition à un pH acide, lors du retrait de ce stimulus, mais que l'exposition initiale à

l'acide reste essentielle ce qui qualifie cette réponse de "réponse de type off" ou en rebond

(Inada et al., 2008) (Figure 15. C-E). L'étude des propriétés du canal réalisée pendant la "réponse

off" à l'acide montre que le complexe PKD2L1/PKD1L3 constitue un canal qui partage de

nombreuses caractéristiques avec le canal PKD2L1. Ce complexe est de type cationique non

sélectif, est perméable au Na+, au K+ et au Ca++ avec une perméabilité majeure pour le calcium et

est inhibé par le Mg++ (Inada et al., 2008; Ishii et al., 2009). Les différences sont que d'une part, la

perméabilité calcique est doublée par rapport à celle calculée pour le canal homomérique,

d'autre part, ce canal présente une forte perméabilité au Mg++ (PNa : PK : PCa : PMg = 1 : 1,1 : 11,0 :

1,8) (Inada et al., 2008) et enfin que le canal homomérique présente une plus forte conductance

(198 ± 3 pS) que le canal hétéromérique constitué de PKD2L1/PKD1L1 (103 ± 3 pS) (DeCaen et

al., 2013).

Le complexe PKD2L1/PKD1L3 présente une rapide désensibilisation à l'acide qui dépend de

l'amplitude de la réponse lors de la première stimulation à l'acide. Ainsi, si une première

stimulation induit une forte réponse, un deuxième stimulus n'engendrera que peu ou pas de

réponse (Inada et al., 2008). Cet effet activateur de l'acide sur l'activité canal du complexe

PKD2L1/PKD1L3 n'est pas retrouvé dans le canal homomérique où le pH acide (pH 2,8) bloque

l'activité canal tandis que le pH basique (pH 9) l'active.

Propriétés dans des modèles natifs :


Une étude récente réalisée sur des cultures de cellules ciliées de l’épithélium

pigmentaire de la rétine (homme, souris) et sur les fibroblastes embryonnaires (souris) a permis

de mettre en évidence la présence d’un courant enregistré au niveau du cil (Icilia). Ce courant est

sous-tendu par l’ouverture de canaux hétéromériques PKD2L1/PKD1L1 localisés sur le cil

primaire de ces cellules. A ce niveau, PKD2L1 est à l’origine d’un courant activé de manière

constitutive. La relation courant/voltage montre que ce courant rectifiant sortant, est de type

cationique non sélectif avec une perméabilité majeure pour le calcium. Les perméabilités

relatives sont Ca++ ≈ Ba++ > Na+ ≈ K+ > NMDG. Ce courant peut être modulé par différents

facteurs, il est activé par l’uridine phosphate et l’adénosine phosphate (UDP, ADP, ATP) et

l’ajout d’ATP dans le bain multiplie par sept la probabilité d’ouverture du canal (N.P0). Les

auteurs suggèrent que cet effet n’est pas direct mais passe par l’intermédiaire de l’activation

82
Introduction

d’un récepteur purinergique de type métabotropique. L’activité canal est également augmentée

par les antagonistes de la calmoduline, elle est bloquée par le Gd3+ et le rouge de ruthénium

(DeCaen et al., 2013). Ce courant est également enregistré au niveau rénal, dans les cils des

cellules principales des tubes collecteurs de la zone médullaire interne, où l’expression de

PKD2L1 a également été mise en évidence (Basora et al., 2002). Le canal PKD2L1 pourrait donc

être responsable de ce courant au niveau des cellules épithéliales rénales.

Les résultats obtenus à ce jour montrent que les propriétés du canal sont modifiées en

fonction du système d'étude, de l'origine (humaine ou murine) de la protéine PKD2L1 utilisée et

de la présence ou non de partenaires protéiques. De manière générale, le canal constitué de la

protéine PKD2L1 est un canal cationique non sélectif présentant une perméabilité majeure pour

le calcium et doté d'une grande conductance. Ce qui diffère essentiellement, c'est la modulation

de son activité en fonction du système utilisé (voir ci-dessous).

b) Modulation du canal PKD2L1

Les canaux PKD2L1 semblent être ouverts de manière constitutive (Chen et al., 1999;

DeCaen et al., 2013) mais leur probabilité d'ouverture peut être modulée par des stimuli très

divers dont la fixation d’un messager extra/intracellulaire, des changements de température

ainsi que par un choc osmotique (Figure15).

Modulation par le calcium :


De nombreuses études montrent que l’activité du canal PKD2L1 est fortement

augmentée par la présence de calcium extracellulaire (Figure15. A) (Chen et al., 1999; Li et al.,

2002; Liu et al., 2002). L’enregistrement en configuration cellule entière du courant porté par le

canal PKD2L1 dans les ovocytes, montre que l’application de calcium dans le milieu

extracellulaire induit un courant entrant de forte amplitude (de l’ordre du µA) qui désensibilise

pendant l’application (Chen et al., 1999; Liu et al., 2002). L’effet du calcium sur l’activité du canal

PKD2L1 est un résultat constant qui est observé dans les différents modèles d’expression de

PKD2L1 (ovocytes de xénopes, cellules HEK293T). Seule une étude récente réalisée dans les

cellules HEK293T exprimant la forme homomérique de PKD2L1 ne montre pas d’effet

activateur du calcium sur le canal (DeCaen et al., 2013). Cette différence de résultat peut

provenir du fait que l'ensemble des études utilisant les cellules HEK293T, s'intéresse à la

83
Introduction

modulation du canal hétéromérique PKD2L1/PKD1L3. L’effet du calcium sur les canaux

homomériques est généralement observé lors de l’utilisation d’ovocytes comme système

d’expression. Ces différences de résultats peuvent donc s’expliquer par le type de modèle

expérimental utilisé.

Le mécanisme d’action du calcium sur l’activité canal n’est pas encore élucidé à ce jour.

La majeure partie des études sont basées sur l’effet de l’élévation de la concentration calcique

extracellulaire ([Ca++]e), ce qui laisse supposer qu’un site de modulation existe sur la partie

externe du canal. Une autre possibilité, serait que l'augmentation de la [Ca ++]e induit une

augmentation de la force efficace (Vm-ECa) à l'origine d'un courant entrant calcique (ICa) de forte

amplitude. Cette importante entrée de calcium pourrait alors moduler l'activité du canal par

une action sur un site de régulation intracellulaire de PKD2L1. En effet, des enregistrements en

configuration inside-out montrent que l’augmentation de la concentration intracellulaire de

calcium induit également un effet activateur sur le canal PKD2L1 (Chen et al., 1999). De plus, la

forte conductance des canaux PKD2L1 et leur forte perméabilité au calcium pourraient

expliquer l'augmentation de la concentration calcique intracellulaire à l’origine de cette

activation. Les expériences utilisant du calcium radiomarqué témoignent de cette augmentation

de la concentration calcique intracellulaire suite à l’application de calcium dans le bain (Li et al.,

2002, 2003b; Yang et al., 2011). Ce site de régulation intracellulaire semble être porté par le

domaine EF-hand, situé dans la partie C-terminale de PKD2L1 (Figure 13) (Chen et al., 1999;

Murakami et al., 2005; Nilius et al., 2007; Molland et al., 2010) et qui a la capacité de fixer le

calcium avec un Kd de 0,51 µM (Molland et al., 2010). Une étude montre que l'interaction de la

troponine I avec la partie C-terminale de PKD2L1 contenant le domaine EF-hand, réduit de 60

% l'activation du canal PKD2L1 par le calcium (Li et al., 2003b) indiquant que le blocage de

l'accessibilité du domaine EF-hand pourrait interférer avec le mécanisme d'activation calcium-

dépendante du canal PKD2L1. Il a également été suggéré que le domaine EF-hand est impliqué

dans une réduction de l'activité canal (Li et al., 2002), ainsi l'interaction entre ce domaine et la

troponine I pourrait augmenter l'effet inhibiteur du domaine EF-hand sur le canal PKD2L1.

Quoi qu'il en soit, à ce jour, si l'effet du calcium sur l'activité canal semble être établi,

l'implication du domaine EF-hand dans cette régulation parait plus incertaine. En effet,

l'utilisation de variants ne contenant pas le motif EF-hand ou des protéines chimériques

contenant le motif EF-hand muté montrent que ces modifications n'ont pas d'impact sur la

régulation de l'activité canal par le calcium (Zhou et al., 1997; Li et al., 2002). Ainsi, le mécanisme
84
Introduction

de régulation des canaux PKD2L1 par le calcium intracellulaire n'est pas encore élucidé à ce

jour. Il peut être envisagé que le mécanisme d'activation calcium-dépendante du canal PKD2L1

fasse intervenir d’autres partenaires protéiques agissant sur divers domaines de PKD2L1. Enfin,

puisque l’essentiel des études pour démontrer la modulation calcium-dépendante sont réalisées

suite à l'augmentation de la concentration extracellulaire en calcium, l’existence de divers sites

d’action du calcium, au niveau intra- et extracellulaire ne peut être écartée.

Modulation par le pH :
La première étude qui a montré l’effet du pH acide sur l’activité du canal PKD2L1 date

de 1999. Dans cette étude, l’expression hétérologue de PKD2L1 dans les ovocytes de xénope

conduit à la formation d’un canal homomérique inhibé par les protons. Les résultats révèlent

qu'une faible diminution du pH extracellulaire (pH 7,5 à pH 6) inhibe non seulement l'activité

basale du canal PKD2L1 mais également celle induite par l’application de calcium dans le

milieu extracellulaire (Figure 15. A) (Chen et al., 1999).

Dans les systèmes hétérologues et dans les cellules natives co-exprimant PKD2L1/PKD1L3, de

nombreuses études électrophysiologiques et d'imagerie calcique montrent qu'au contraire, ce

complexe protéique forme un canal calcique activé par le pH acide (Ishimaru et al., 2006; Huang

et al., 2006; Inada et al., 2008; Ishii et al., 2009; Yu et al., 2012). L'application d'une solution acide

de pH inférieur à 3 génère un courant entrant (Figure 15.C et D) qui s'inactive rapidement et qui

est corrélé à l'augmentation de la concentration calcique intracellulaire (Figure 15. E) (Inada et

al., 2008; Ishii et al., 2009; Kawaguchi et al., 2010). Cette réponse n'est pas spécifique de l'acide

utilisé puisqu'elle est observée aussi bien lors de l'application d'acides forts que d'acides faibles

(voir Tableau 9) (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008). La caractéristique majeure et atypique

de cette réponse est qu'elle n'est pas induite directement par l'acidification mais par le lavage de

l'acide lors de la neutralisation (Figure15. E) (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008; Ishii et al.,

2009; Kawaguchi et al., 2010; Yu et al., 2012). De ce fait, le terme de "réponse off" est utilisé pour

caractériser cette réponse du complexe PKD2L1/PKD1L3 au pH acide (Inada et al., 2008). De

manière surprenante, la "réponse off" est inhibée par la capsaïcine, un agoniste des récepteurs

TRPV1 (Ishii et al., 2012).

85
Introduction

A B
pH 7,5 pH 6

C E
Densité de courant, pA/pF

Contrôle Acide Neutralisation

PKD1L3/
PKD2L1
PKD2L1
pH
D

Δratio (F340/F380)
1 nA

5s

pH

F
pH 7,4
PDF, pA-1

F
F
O1
O1
N.P0

pH 8
PDF, pA-1

F
F
O1
O1
O2
O2

pH 9
PDF, pA-1

F
F
O1
O2 O3 O2 O1

O3
Courant, pA

G Hypotonicité
Hypertonicité
Courant, pA

Temps, min

FIGURE 15. MODULATION DES CANAUX PKD2L1 PAR LE CALCIUM, LE PH ET L’OSMOLARITE

86
Introduction

FIGURE 15. MODULATION DES CANAUX PKD2L1 PAR LE CALCIUM, LE PH ET L’OSMOLARITE. A, L’application de calcium (5
mM) à pH 7,5 induit un fort courant entrant porté par les canaux PKD2L1. L’acidification à pH 6 bloque l’ouverture
constitutive des canaux PKD2L1 et inhibe l’activation calcium-dépendante. Enregistrement en configuration cellule entière
et en mode voltage imposé à -50 mV. Ovocytes de xénopes transfectés avec la forme humaine de PKD2L1. Adapté de Chen
et al., 1999. B, L’application de solution d’acide citrique (pH 2, 7 ; 25 mM ; barre noire horizontale) inhibe la forme murine
du canal PKD2L1 (enregistrement en configuration cellule entière à -60 mV ; transfection dans les cellules HEK293T). Les
déflexions vers le bas observées en condition contrôle et lors du lavage correspondent à l’activité canal. D’après Shimizu et
al., 2009. C, Distribution de la densité de courant induit par différentes valeurs de pH. Les cellules exprimant
PKD2L1/PKD1L3 (cellules HEK293T) sont exposées à différentes valeurs de pH (2,5 ; 2,75 ; 3,0 ; 3,5 ou 4,0) pendant 5 s
(insert). D, Courant enregistré dans les cellules PKD2L1/PKD1L3+ après leur exposition à une solution acide à pH 2,5
pendant 5 s puis à une solution à pH 6 (trace du milieu) ou pH 3 (trace de droite) pendant 5 s chacune montrant que la
neutralisation de l’acide est indispensable à l’activation du complexe PKD2L1/PKD1L3, ce qui caractérise la réponse off. C-D
: PKD2L1 et PKD1L3 de souris. Adapté de Inada et al., 2008. E, En haut : images montrant l’évolution de la fluorescence
émise par des cellules chargées en Fura-2 en condition contrôle, lors de l’application d’acide (Acide citrique, pH 3 pendant
8s) et lors de la neutralisation de l’acide. La panneau du haut correspond aux résultats obtenus dans les cellules co-
transfectées pour PKD2L1 et PKD1L3. Le panneau du bas indique les images obtenues à partir de cellules transfectées pour
PKD2L1 seulement (cellules HEK293T ; PKD2L1 et PKD1L3 de souris). La courbe du bas, montre la pH-dépendance de la
réponse à l’acide mesurée lors de la neutralisation dans des cellules co-transfectées pour PKD2L1/PKD1L3. Chaque point
représente la moyenne ± SEM du ratio de fluorescence au cours d’essais indépendants (n=6). Adapté de Ishii et al., 2012. F,
Double effet du pH alcalin sur les canaux PKD2L1. A gauche sont représentées les traces de courant obtenues sous
différentes conditions d’alcalinisation (configuration cellule entière à -60 mV). Visualisation des différents états d’ouverture
du canal : fermé (F), ouverture unique (O1), deux (O2) ou trois (O3) canaux ouverts. L’histogramme de distribution
d’amplitude de chaque trace est représenté au centre. L’histogramme de droite montre l’effet des différents pH sur la
probabilité d’ouverture du canal à -60 mV (N.P0) (*p < 0,05). La trace en bas à droite, montre la pH-dépendance du rebond
d’activation du canal PKD2L1 après lavage de la solution à pH 10. L’application de pH 10 (barre noir) diminue l’activité
canal et l’application de la solution à pH 9 induit un rebond d’activité. Les courants sont enregistrés en configuration cellule
entière à -60 mV. Les applications de pH alcalins sont représentées par la barre horizontale noire. Cellules HEK293T
transfectées avec PKD2L1 de souris. Adapté de Shimizu et al., 2011. G, Effet du choc osmotique sur l’activité du canal
PKD2L1. Courant entrant enregistré à -60 mV en configuration cellule entière. Insert : Représentation de l’évolution de la
probabilité d’ouverture (N.P0) en fonction du temps. L’application pendant 5 min de solution hypotonique (260 mosmol/kg
H2O) ou hypertonique (350 mosmol/kg H2O) sont représentées par la barre noire horizontale. Forme murine de PKD2L1
transfectée dans les cellules HEK293T. Adapté de Shimizu et al., 2009.

87
Introduction

L'enregistrement en configuration cellule attachée ou outside-out, montre que la "réponse off"

est sous-tendue par une augmentation de la probabilité d'ouverture du canal (Inada et al., 2008).

Cette réponse n'est pas enregistrée en configuration inside-out et la présence intracellulaire de

tampon bloquant l'acidification ne modifie pas la réponse des cellules gustatives à l'acide (Inada

et al., 2008; Chang et al., 2010). Il peut donc être suggéré que le domaine senseur du pH se

trouve dans les parties extracellulaires des protéines PKD2L1 ou PKD1L3 et ne nécessite pas

d'acidification du milieu intracellulaire. L'absence de calcium dans le milieu extracellulaire

abolit également cette réponse (Ishii et al., 2009; Kawaguchi et al., 2010), ce qui suggère que suite

à l'application d'acide, l'augmentation de l'activité du canal PKD2L1/PKD1L3 qui est fortement

perméable au calcium, induit un fort flux calcique dans le milieu intracellulaire à la base de la

"réponse off".

Ces résultats montrent qu'en fonction du système d'expression utilisé, ovocytes ou

cellules HEK293T, le pH induit des effets opposés et la valeur de pH à l'origine de cet effet

passe de 6 pour les ovocytes à moins de 3 pour les cellules HEK293T. Cette différence de

résultats peut s'expliquer par la différence de constitution du canal puisqu'il est de type

homomérique dans les ovocytes et associé à PKD1L3 dans les cellules HEK293T. Ceci est vérifié

par une étude montrant que la co-expression de PKD2L1/PKD1L3 dans les ovocytes induit la

présence d'une "réponse off" lors de l'application d'une solution d'acide citrique à pH 2,8 (Yu et

al., 2012). Et inversement, l'expression unique de PKD2L1 dans les cellules HEK293T amène à

un effet inhibiteur du pH acide (2,8) sur le canal homomérique (Figure 15. B) (Shimizu et al.,

2009). De plus, les cellules gustatives PKD2L1+ des papilles fongiformes qui n'expriment pas

PKD1L3 ne présentent pas de "réponse off" à l'application de solution acide (Kawaguchi et al.,

2010). Il semblerait donc que l'environnement cellulaire et la présence de partenaires protéiques

aient un effet majeur sur la nature de la réponse au pH acide. Enfin, il peut également être

envisagé que lors de l'application du pH acide, l'absence d'effet direct sur l'activité canal dans

les cellules HEK293T soit comparable à l'effet inhibiteur observé dans les ovocytes. Inada et

collaborateurs ont montré que l'application d'une solution acide pendant la "réponse off" inhibe

cette réponse (Inada et al., 2008). L'effet de la solution acide sur le canal PKD2L1 pourrait donc

être de deux types, un effet inhibiteur passant par PKD2L1 à l'origine de la fermeture du canal,

suivit d'un effet activateur faisant appel à PKD1L3 et induisant l'effet activateur à la base de la

"réponse off".

88
Introduction

Enfin, il semble que le canal PKD2L1 ne soit pas impliqué que dans la détection du pH acide

mais serait un senseur de variation de pH, détectant également les pH basiques (Figure 15.F)

(Shimizu et al., 2009, 2011). Ainsi, l'application d'une solution de perfusion dont le pH est

compris entre 8 et 9 induit une forte augmentation de la probabilité d'ouverture du canal

PKD2L1 homomérique (Figure 15. F) de manière pH-dépendante sans modifier la conductance

du canal. Cependant, l'effet du pH alcalin est double puisqu'une solution à pH 10 induit l'effet

inverse et inactive le canal (Shimizu et al., 2011). Le canal PKD2L1 serait ainsi activé par des

alcalinisations modestes (passage d'un pH 7,4 à 8 ou 9) et inhibé par de fortes alcalinisations

autour de pH 10 (Figure 15. F). De plus, l'alcalinisation accélérerait les cinétiques du processus

d'inactivation/activation du canal.

L'ensemble de ces travaux montrent que le canal PKD2L1 constitue un senseur complexe

des variations du pH extracellulaire (impliqué dans les détections de pH acide et basique). Les

conséquences fonctionnelles physiologiques qui découlent de cette capacité sont encore

inconnues. L'ensemble de ces études pointe l'importance du modèle utilisé, puisque celui-ci

influe fortement sur les propriétés du canal PKD2L1 ainsi que sur ses modulations. Enfin, il en

ressort que les modulations du canal PKD2L1, dépendent de l'environnement cellulaire et de

partenaires protéiques, augmentant la complexité de cette étude. Il ne serait donc pas étonnant

que l'expression de PKD2L1 dans les systèmes natifs ait un impact fonctionnel propre et

spécifique de la structure cellulaire considérée.

Effet du choc osmotique sur l’activité du canal PKD2L1:


Les canaux PKD2L1 sont activés par l'application d'un choc hypo-osmotique de 40 à 100

mosmol/kg H2O, qui entraine une augmentation de la probabilité d'ouverture et de la

concentration calcique intracellulaire (voir un exemple de tracé Figure 15. G) (Murakami et al.,

2005; Shimizu et al., 2009). Au contraire, l'application d'une solution hyper-osmotique de 50

mosmol/kg H2O conduit à une diminution de l'activité canal (voir un exemple de tracé Figure

15. G) (Shimizu et al., 2009). Ces effets de la variation de la pression osmotique sur la probabilité

d'ouverture du canal n'apparaissent qu'après un certain délai (≈ 3 min) et sont par contre

synchrones avec les déformations cellulaires : gonflement (choc hypo-osmotique) ou

rétrécissement (choc hyper-osmotique). L'effet activateur du choc hypo-osmotique semble être

lié à l'activation de la voie de la phospholipase A2, connue pour être impliquée dans l'activation

du canal TRPV4 lors du gonflement cellulaire (Vriens et al., 2004). La participation de la

89
Introduction

phospholipase A2 est également supportée par le fait que l'application d'acide arachidonique

(produit lors de l'activation de cet enzyme) induit également une augmentation de l'activité

canal (Shimizu et al., 2009).

Autres modalités sensorielles :


D’autres modulateurs plus inattendus viennent récemment d’être mis en évidence.

L’enregistrement du courant porté par le canal hétéromérique PKD2L1/PKD1L1 au niveau du

cil primaire des cellules de l’épithélium pigmentaire de la rétine ou dans des systèmes

d’expression (cellules HEK293T) a montré que l’activité canal est augmentée sous l’application

de forte pression (80-100 mmHg ; 11-13 kPa) et par l’augmentation rapide de la température du

bain (de 22 à 37 °C) (DeCaen et al., 2013; Higuchi et al., 2014). Ces données suggèrent que

PKD2L1 pourait avoir un rôle dans la mécanodétection et dans la thermodétection au niveau

des cellules ciliées. Cependant, comme pour le pH, l'effet de la température sur l'ouverture du

canal est double, puisque des températures élevées et autour de 40 °C, induisent un effet

inverse et diminuent la probabilité d'ouverture du canal PKD2L1 (Higuchi et al., 2014).

Enfin, d’autre substances sont décrites comme augmentant l’activité du canal PKD2L1, telle que

l’uridine et l’adénosine phosphate (UDP, ADP et ATP) (DeCaen et al., 2013), ou la vasopressine

(Geng et al., 2006). La présence de partenaires protéiques intracellulaires tels que la troponine

(Li et al., 2003b), l'alpha-actinine (Li et al., 2007) et la protéine RACK1 (Yang et al., 2011)

participent également à cette modulation.

Pharmacologie des canaux PKD2L1:


La pharmacologie des canaux PKD2L1 est pauvre et à ce jour, il n'existe pas

d'antagonistes spécifiques. On dénote une grande diversité de cations parmi les bloqueurs du

canal PKD2L1, tels que le Mg++, La3+, le Gd3+ et le ruthenium, (Chen et al., 1999; Liu et al., 2002;

DeCaen et al., 2013). L’inhibition par le Mg++ extracellulaire est dépendante du voltage ainsi, le

pouvoir bloquant du Mg++ est d’autant plus important que le potentiel membranaire est

hyperpolarisé (IC50 à -120 mV < IC50 à -50 mV). Ceci montre que les potentiels négatifs

facilitent la liaison du Mg++ avec le canal PKD2L1. Ce phénomène est similaire à celui observé

lors du blocage des récepteurs glutamatergiques de type NMDA par le Mg++ (McBain & Mayer,

1994) et permet de suggérer que le mécanisme soit similaire. Ainsi, le Mg++ inhiberait le canal en

obstruant le pore et la dépolarisation membranaire induirait une répulsion de type

électrostatique. Cependant, un phénomène de compétition entre les ions Mg++ et les autres

90
Introduction

cations transitant à travers le pore du canal ne peut être écarté. Des cations de grosse taille

bloquent également l’activité canal PKD2L1, c’est le cas du N-méthyl-D-glucamine (NMDG), du

tétraéthylammonium (TEA ; 6,1-8,2 Å), du tétra-propylammonium (TPA ; 9,8 Å), du tétra-

butylammonium (TBA ; 11,6 Å) et du tétra-pentylammonium (TPeA ; 13,2 Å). Cette inhibition

est positivement corrélée à la taille du cation, qui est elle-même corrélée à l’hydrophobicité de la

molécule, ainsi plus le cation est de grosse taille, plus il est hydrophobe et plus il a un pouvoir

bloquant important (faible EC50) (Chen et al., 1999; Liu et al., 2002; Dai et al., 2006). Cette

inhibition agit essentiellement sur N.P0 et sur la durée moyenne d’ouverture du canal ce qui

laisse suggérer que le site d’action de ces ions est éloigné du pore du canal (Dai et al., 2006).

D’autres inhibiteurs non sélectifs bloquent l’activité du canal PKD2L1 comme le flufenamate

(Chen et al., 1999), l'amiloride et ses analogues (Dai et al., 2007; Shimizu et al., 2009), la capsaïcine

et les molécules associées telles que la dihidrocapsaïcine, et la nonivamide (Ishii et al., 2012)

(Tableau 9). L'application de ces composés dans le milieu extracellulaire inhibe l'activité canal

de manière réversible.

91
Introduction

Effet sur le
Substance Système d’étude Référence
canal
((Chen et al., 1999; Liu et al.,
Calcium Activateur Ovocytes, 2002; Li et al., 2003b; Dai et al.,
2006; Yang et al., 2011)
Cellules ciliées de la rétine,
UDP, ADP, ATP Activateur (DeCaen et al., 2013)
fibroblastes embryonnaires
AVP Activateur LLC-PK1 (Geng et al., 2006)
(Chen et al., 1999; Liu et al.,
Mg++, La3+, Gd3+ Inhibiteur Ovocytes
2002)
Flufenamate Inhibiteur Ovocytes (Chen et al., 1999)
H+, acide citrique, acide
(Chen et al., 1999; Shimizu et
acétique Inhibiteur Ovocytes ; HEK239T
al., 2009)
(pH 6)
(pH < 3)
acide acétique, acide
chlorhydrique, acide
citrique, acide malique, Activateur (Ishimaru et al., 2006; Inada et
HEK293T
acide sulfurique, acide (réponse off) al., 2008; Ishii et al., 2009)
phosphorique, acide
succinique ou acide
tartarique
Sans effet (sur
Amiloride, 100 µM la réponse off HEK293T (Ishimaru et al., 2006)
à l'acide)
Amiloride, phenamil,
(Dai et al., 2007; Shimizu et al.,
benzamil, EIPA (5-N-éthyl- Inhibiteur Ovocytes ; HEK293T
2009)
N-isopropyl)amiloride)
Capsaïcine,
dihidrocapsaïcine, Inhibiteur HEK293T (Ishii et al., 2012)
nonivamide
Troponine Activateur Ovocytes (Li et al., 2003b)
MDCK II
Alpha-actinine Activateur (Madin-Darby canine (Li et al., 2007)
Kidney)
RACK1 Inhibiteur Ovocytes (Yang et al., 2011)
Choc hyper osmotique
Inhibiteur HEK293T* (Shimizu et al., 2009)
(+50 mosmol/kg H2O)
Choc hypo osmotique (Murakami et al., 2005;
Activateur HEK293T*
(-40 à -100 mosmol/kg H2O) Shimizu et al., 2009)
pH basique (pH 8-9) Activateur HEK293T* (Shimizu et al., 2009, 2011)
pH basique (pH 10) Inhibiteur HEK293T* (Shimizu et al., 2011)

TABLEAU 9. SYNTHESE DES MODULATEURS REPERTORIES DE PKD2L1. Dans les cellules HEK293T, les études sont
réalisées sur le complexe PKD2L1/PKD1L3, excepté HEK293T* où PKD2L1 est exprimé seul, enfin dans les oocytes
seul PKD2L1 entre dans la constitution du canal.

92
Introduction

PKD2L1 est un canal cationique non sélectif, doté d'une large conductance et d'une perméabilité

majeure pour le calcium. Son activité est modulée par de nombreux stimuli sensoriels (pH,

osmolarité, température) et par la présence de partenaires protéiques (Schéma bilan, Figure 16).

Cependant, les études réalisées sont essentiellement basées sur des systèmes d'expression, et du

fait de la grande conductance de ce canal cationique perméable au calcium, il apparait

important d'analyser sa modulation dans des systèmes natifs, puisque cette modulation

pourrait entrainer des effets importants sur l'homéostasie calcique et par conséquent, sur la

physiologie cellulaire. La mise en évidence des modulateurs de ce canal est donc un premier

pas indispensable pour la caractérisation de sa fonction physiologique. Cependant, un des

manques majeurs dans ces études est l'absence de bloqueur spécifique des canaux PKD2L1

(TRPP3). En général, excepté pour TRPV1 et TRPM8 qui ont des activateurs et des bloqueurs

spécifiques, les autres canaux TRP en sont dépourvus. Les études utilisent donc essentiellement

des approches génétiques (mutations, knock-out) pour évaluer le rôle de ces canaux (Flockerzi,

2007). Mais ces approches peuvent entrainer des mécanismes de compensation ou des

modifications secondaires dans le système d'étude à la base de biais sur les résultats obtenus.

Enfin, ces études sont essentiellement réalisées sur des systèmes d'expression hétérologue qui

ne peuvent donner qu'une vision certes essentielle mais simplifiée de cette modulation.

93
Introduction

PKD2L1 PKD1L3
N-term
pH, osmolarité pH acide
Na+, Ca++, K+
+/- ?
-Expression à la membrane
-Réponse off au pH acide
-Participation à la formation du pore du canal

RACK1
+ C-term
N-term
α-actinine
+ + - Troponine

? Microfilament d’actine
pH acide
[Ca++]i

FIGURE 16. PARTENAIRES ET MODULATIONS DES CANAUX PKD2L1. Schéma représentant les divers partenaires protéiques
ainsi que les principaux modulateurs de PKD2L1. PKD2L1 est un canal cationique non sélectif, activé par le choc
hypotonique et inhibé par le choc hypertonique. Le pH acide peut être activateur (réponse off) ou inhibiteur, la présence de
partenaires protéiques dont PKD1L3 semble jouer un rôle majeur dans cette régulation. Le site d’action du pH acide est
encore non identifié, il pourrait agir dans le milieu intracellulaire ou extracellulaire. La présence de PKD1L3 semble être
impliquée dans le transport membranaire de PKD2L1 et la formation du pore du canal. L'effet du pH alcalin est double, il
est activateur autour de 9, tandis que les solutions à pH 10 inhibent l’activité canal. Le calcium est un autre activateur du
canal PKD2L1. D’autres protéines interagissent avec PKD2L1 et modulent son activité, c’est la cas de RACK1 et de l’alpha-
actinine qui activent le canal mais également de la troponine dont l’interaction inhibe l’activité de PKD2L1. Les effets
activateurs sur le canal sont représentés par le signe + et les inhibiteurs par le signe -.

94
Introduction

5. DU GENE A LA FONCTION

Les canaux PKD2L1 sont codés par un gène localisé sur le chromosome 10 chez l'homme

(Wu et al., 1998a) et 19 chez les murins (Murakami et al., 2005). La protéine PKD2L1 est le fruit

d'un épissage alternatif (Li et al., 2003a; LopezJimenez et al., 2006) donnant lieu à la formation de

divers transcrits. Le gène pkd2l1 humain code pour deux isoformes (numéro d’accession

NP_057196.2 : isoforme 1 ; NP_001240766.1 : isoforme 2; base de données GenBank ; NCBI)

partageant respectivement 87 % et 90 % d’identité avec la protéine PKD2L1 murine (numéro

d’accession NP_852087.2 ; base de données GenBank ; NCBI). L’isoforme 2 du gène pkd2l1

humain code pour une protéine plus petite que l’isoforme 1 (758 acides aminés vs. 805 ; base de

données GenBank ; NCBI) et que la forme murine qui est constituée de 760 acides aminés. Les

conséquences fonctionnelles de ces variations ne sont pas connues, il est juste établi que le

raccourcissement de l’isoforme 2 concerne la partie N-term de la protéine. A ce jour, aucune

étude ne s'est intéressée à d’éventuels phénomènes de régulation au niveau de la transcription

ou de la traduction. Même si l'étude de la séquence protéique à permis de mettre en évidence la

présence de nombreux sites de modification post-traductionnelles (Nomura et al., 1998; Wu et

al., 1998a), leur action sur la protéine ou sur le canal reste inconnue. De même, l'effet de la

présence de la séquence de rétention au RE sur l'homéostasie calcique intracellulaire n'est pas

établi. Toutefois, les études in vitro révèlent que la protéine PKD2L1 constitue un canal dont

l'activité peut être modulée par la variation de divers facteurs externes tels que le calcium, le

pH, l'osmolarité mais aussi la température et la pression. La présence d'un tel canal peut donc

donner des capacités de senseurs environnementaux aux cellules qui l'expriment.

Au cours de cette partie, nous verrons les fonctions suggérées du canal PKD2L1 ainsi que les

pathologies associées à cette protéine.

Rôle de PKD2L1 dans la détection et la transduction du goût aigre :


La plupart des études fonctionnelles portant sur PKD2L1 découlent des travaux réalisés

par l'équipe du Pr. Zuker, qui a montré en 2006 que cette protéine est exprimée au niveau des

cellules gustatives activées par le pH acide et représente un bon candidat pour la détection du

goût aigre (Figure 17. B et C) (Huang et al., 2006). Cette détection semble faire intervenir

PKD1L3 (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008; Ishii et al., 2009) puisque d'une part, les

protéines PKD1L3 sont associées à PKD2L1 dans les cellules gustatives au niveau des papilles

foliées et caliciformes (Figure 17. B) (LopezJimenez et al., 2006; Ishimaru et al., 2006; Huang et al.,

95
Introduction

2006; Kawaguchi et al., 2010). Et d'autre part, cette interaction est associée à la capacité de

PKD2L1, dans les cellules gustatives ainsi que des systèmes d'expression (cellules HEK293T)

qui co-expriment PKD2L1 et PKD1L3, à détecter et à répondre à l'acidification du milieu

extracellulaire (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008; Ishimaru & Matsunami, 2009; Ishii et al.,

2009; Kawaguchi et al., 2010). Dans les systèmes d'expression il est mis en évidence que le

complexe protéique PKD2L1/PKD1L3 est à l'origine d'une réponse de type "off" au pH acide qui

nécessite un pH seuil inferieur à trois (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008). Cette

caractéristique s'accorde avec les études physiologiques chez l'homme qui indiquent que la

détection du goût aigre est induite par des solutions contenant de l'acide chlorhydrique dont le

pH est autour de 3 (Taylor, 1928). L'implication de ce complexe protéique dans la détection du

goût aigre est également confortée par le fait que dans les bourgeons du goût, PKD2L1 et

PKD1L3 sont localisées spécifiquement dans les cellules sensibles au pH acide et sont absentes

au niveau des cellules gustatives détectant les autres modalités sensorielles (LopezJimenez et al.,

2006; Ishimaru et al., 2006). De plus, l'absence de PKD1L3 dans les cellules HEK293T exprimant

PKD2L1 seule est associée à la perte de la sensibilité au pH acide (Ishimaru et al., 2006; Inada et

al., 2008; Ishii et al., 2009). D'autres études réalisées chez l'homme et l'animal supportent

l'hypothèse d'une implication du complexe PKD2L1/PKD1L3 dans la détection du goût aigre.

Premièrement, les souris délétées pour PKD2L1 (knockout : KO-PKD2L1), présentent des

déficits dans la détection du goût aigre (Figure 17. D) (Horio et al., 2011) et l'ablation des cellules

gustatives PKD2L1+ abolit la réponse aux stimuli acides (Huang et al., 2006; Chandrashekar et

al., 2009). Deuxièmement, dans les cellules HEK293T transfectées pour PKD2L1 et PKD1L3, la

capsaïcine bloque la réponse off à l'acide, phénomène retrouvé au niveau des cellules gustatives

(Ishii et al., 2012). De plus, il a été montré que chez les patients atteints de perte du goût

(agueusie), PKD2L1, PKD1L3 et de nombreux autres canaux activés par l'acidité (canaux ASICs)

n'étaient pas exprimés au niveau de leurs cellules gustatives (Huque et al., 2009). Enfin, les

cellules gustatives exprimant PKD2L1 présentent une réponse à l'acide similaire à celle observée

dans les systèmes d'expression hétérologues exprimant le complexe PKD2L1/PKD1L3

(Kawaguchi et al., 2010).

96
Introduction

Cependant, de nombreuses études vont à l'encontre de l'implication de PKD1L3 dans cette

détection. En effet, si dans les modèles d'étude utilisant comme système d'expression les

cellules HEK293T, PKD1L3 semble nécessaire à la localisation membranaire de PKD2L1 et à la

formation de canaux fonctionnels sensibles au pH acide (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008),

dans les systèmes natifs le fonctionnement est différent. En outre, PKD1L3 n'est pas retrouvée

dans l'ensemble des cellules gustatives exprimant PKD2L1 et est absente dans les papilles

fongiformes et dans le palais (Ishimaru et al., 2006) où la réponse aux stimuli acides n'est pas

affectée (Horio et al., 2011), laissant ainsi supposer que PKD2L1 pourrait fonctionner

différemment dans ces cellules et avoir d'autres partenaires protéiques.

Ceci est conforté par les études réalisées dans les ovocytes de xénope, où l'expression de

PKD2L1 conduit à la formation d'un canal de type homomérique (sans PKD1L3) qui est inhibé

par le pH acide (Chen et al., 1999). Le rôle de PKD1L3 est également remis en question par le fait

que la délétion de cette protéine n'entraine pas d'effet significatif sur la détection du goût aigre

chez les souris (Nelson et al., 2010; Horio et al., 2011) et l'émission de potentiel d'action, dans les

cellules gustatives PKD2L1+ ou dans les nerfs contactant ces cellules, suite à l'acidification n'est

pas altérée (Nelson et al., 2010; Chang et al., 2010). Ainsi, le rôle de PKD1L3 dans la détection du

goût aigre ne peut être exclu, il est envisageable que d'autres protéines viennent compenser la

fonction de PKD1L3 dans les animaux KO-PKD2L1.

Il convient de noter que des études récentes suggèrent l'implication d'un autre type de

récepteur dans cette modalité sensorielle. Dans les cellules gustatives PKD2L1+, ce récepteur est

ionotropique et serait à l'origine d'un courant proton dont l'amplitude suffirait à induire

l'ouverture de canaux calciques voltage-dépendants à l'origine des résultats obtenus en

imagerie calcique (Chang et al., 2010). Cette hypothèse provient du fait que le courant entrant

dû à l'application d'acide (pH 5) n'est pas porté par le Na+ et le Ca++, deux ions jouant un rôle

majeur dans l'établissement des courants portés par les canaux PKD2L1 (Chen et al., 1999; Inada

et al., 2008). De plus, le potentiel de réversion du courant varie en fonction du pH de la solution

acide appliquée. Ce courant est maintenu en présence d'amiloride, un bloqueur non spécifique

des canaux TRP (Dai et al., 2007) mais est bloqué par le zinc, qui est un bloqueur des récepteurs

canaux aux protons (Decoursey, 2003; Ramsey et al., 2006; Sasaki et al., 2006).

97
Introduction

A B
Pore gustatif Caliciforme Papilles Caliciforme Foliée Fungiforme Palais

PKD2L1
Foliée

PKD1L3
Cellule Fongiforme
gustative

C Aigre Sucré Unami Amer Salé

WT
60 s
PKD2L1-
DTA
Ac. Citrique Ac. Acetique HCl Saccharine AceK Glutamate Quinine NaCl

D PA/10 s

WT
PKD2L1-/-

HCl, mM
PA/10 s

PA/10 s

Ac. citrique, mM Ac. acétique, mM

E
pH 7,4 pH 6,9
Cellule contrôle

NcLCR spinal PKD2L1+

40 pA

5s

FIGURE 17. MODULATION PAR L’ACIDE DES CANAUX PKD2L1 DANS LES TISSUS NATIFS : UN ROLE DANS LA DETECTION DU

GOUT AIGRE.

98
Introduction

FIGURE 17. MODULATION PAR L’ACIDE DES CANAUX PKD2L1 DANS LES TISSUS NATIFS : UN ROLE DANS LA DETECTION DU
GOUT AIGRE. A, Un bourgeon du goût (dessin de gauche) est constitué de 50 à 150 cellules gustatives (en fonction de
l’espèce), distribuées dans les différentes papilles gustatives (caliciformes, foliées et fongiformes) ainsi que dans le palais
(dessin au centre). A droite, sont représentées les localisations des différentes papilles gustatives. Les papilles caliciformes
sont localisées à l’arrière de la langue et contiennent des centaines (souris) à des milliers (homme) de bourgeons gustatifs.
Les papilles foliées sont présentes dans les parties latérales postérieures et contiennent une douzaine à une centaine de
bourgeons gustatifs. Les papilles fongiformes contiennent un ou très peu de bourgeons gustatifs et sont localisées dans la
partie antérieure de la langue. Les cellules gustatives projettent des microvillosités sur la face apicale du bourgeon du goût,
où elles forment le pore gustatif qui est le site d’interaction avec les molécules gustatives. Adapté de Chandrashekar et al.,
2006. B, PKD2L1 est exprimée dans les cellules gustatives. Hybridation in situ de PKD2L1 et de PKD1L3 au niveau des
papilles gustatives et du palais montrant la présence de PKD2L1 dans l’ensemble des bourgeons du goût et l’absence de
PKD1L3 dans les cellules gustatives des papilles fongiformes et du palais. La ligne en pointillée délimite la partie externe
d’un bourgeon du goût. Barre d’échelle : 25 µm. C, Les cellules gustatives exprimant PKD2L1 sont sensibles aux stimuli du
goût aigre. La délétion des cellules gustatives PKD2L1+ par l'expression sélective de la toxine diphtérique A (DTA) produit
des animaux (PKD2L1-DTA) ayant un déficit sélectif dans la détection du goût aigre. Les souris sauvages (WT) montrent
une réponse à l’ensemble des stimuli des diverses transductions sensorielles gustatives. Réponses enregistrées au niveau de
la chorde tympanique. B et C : Adapté de Huang et al., 2006. D, Enregistrement de la réponse à l’acide des cellules
gustatives GAD67-GFP constituant les bourgeons du goût des papilles fongiformes provenant de souris sauvages (WT,
photo de gauche) ou délétées pour PKD2L1 (PKD2L1-/- , photo de droite). Traces de gauche : réponses des cellules gustatives
à 10 mM d’acide chlorhydrique (HCl), 10 mM d’acide citrique (CA) et 30 mM d’acide acétique (AA). Barre rouge horizontale
: durée de la stimulation. A droite sont représentées les réponses des cellules gustatives GAD67-GFP en fonction de la
concentration d’acide utilisée pour chaque acide testé. Adapté de Horio et al., 2011. E, Au niveau spinal, PKD2L1 est
exprimée par les neurones qui contactent le LCR (NcLCR), qui répondent au stimulus acide par une augmentation de
l’émission de potentiel d’action. Enregistrements en configuration cellule attachée montrant la réponse d’un NcLCR à
l’application de solution à pH 7,4 et 6,9. Les traces montrent les potentiels d’action enregistrés dans une fenêtre de 25 s
environ au sein d’un NcLCR spinal d’animaux PKD2L1:EGFP. Adapté de Huang et al., 2006.

99
Introduction

Enfin, la présence de canaux calciques voltage-dépendants dans les cellules gustatives

exprimant PKD2L1 a été démontrée (Medler et al., 2003; DeFazio et al., 2006; Gao et al., 2009).

Cependant, ce système pose la question de la conservation de l'intégrité cellulaire en présence

de tels canaux ioniques dont l'activation peut conduire à de fortes acidifications intracellulaires

et ne permet pas d'expliquer la perte de transduction sensorielle dans les modèles KO pour

PKD2L1. Un autre récepteur ionotropique semble également impliqué dans cette transduction,

il s'agit du canal HCN4 (hyperpolarisation-activated and cyclic nucleotide gated type 4) (Gao et

al., 2009). Ce canal ne serait pas le premier senseur mais permettrait d'amplifier la

dépolarisation induite par le stimulus acide et d'activer les conductances voltage-dépendantes

indispensables à la libération de sérotonine.

Ces études montrent que même si la nature exacte du senseur à la base de la

transduction du goût aigre n'est pas encore élucidée, il en ressort que cette transduction semble

faire appel à plusieurs types de récepteurs. Il peut également être envisagé que ces divers

senseurs soient sensibles à différentes valeurs de pH. Ainsi, les cellules co-exprimant

PKD2L1/PKD1L3 dans les papilles foliées et caliciformes seraient dédiées à la détection de pH

très acide de type nocif, tandis que PKD2L1 seul et les canaux protons permettraient de détecter

des variations plus faibles de pH. Cependant, les cellules gustatives exprimant le complexe

PKD2L1/PKD1L3 présentent un seuil de déclenchement de la réponse off pour des valeurs de

pH plus élevées, autour de 5 (Kawaguchi et al., 2010). Ceci indique que des protéines autres que

PKD2L1/PKD1L3 doivent participer à l'élaboration de la réponse à l'acide. Quoi qu'il en soit,

cette réponse de type "off" mise en évidence dans des systèmes d'expression semble bien

adaptée aux phénomènes physiologiques connus en réponse aux stimuli acides. En effet, le goût

aigre induit une augmentation de la sécrétion de salive par les glandes salivaires ce qui permet

de neutraliser rapidement l'acidité et d'augmenter le pH (Hodson & Linden, 2006) et donc

d'induire l'activation du canal PKD2L1/PKD1L3.

La détection et les mécanismes de transduction du goût aigre semblent complexes et leur nature

exacte reste hypothétique. Il se pourrait que ces phénomènes fassent appel à la présence de

différents senseurs de pH qui seraient complémentaires et indispensables à l'élaboration du

"bon comportement" à adopter face aux différentes valeurs de pH présentes dans l'alimentation

et prévenir de l'ingestion de substances toxiques.

100
Introduction

PKD2L1 et Détection du CO2 :


La présence de PKD2L1 dans les cellules gustatives semble également être impliquée

dans le processus de détection du CO2 et plus précisément du CO2 contenu dans les boissons

pétillantes (Chandrashekar et al., 2009). Cette capacité est étroitement liée à la faculté des canaux

PKD2L1 à détecter le pH acide. En effet, à la surface des cellules gustatives PKD2L1+ se trouve

une enzyme : l'anhydrase carbonique de type 4 (Chandrashekar et al., 2009). Cette enzyme est

en contact direct avec le milieu extracellulaire de part son ancrage à la membrane plasmique par

un groupement glycosylphosphatidylinositol. Elle catalyse la réaction de dissociation du gaz

carbonique hydraté en proton et en bicarbonate (H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-).

De ce fait, lors de la présence de CO2 dans la bouche, l'anhydrase carbonique présente à la

surface des cellules gustatives PKD2L1+ convertit le CO2 en proton et bicarbonate, il en résulte

une acidification locale activant le canal PKD2L1. Cependant, cette étude est basée sur

l'enregistrement de la réponse des afférences nerveuses contactant les cellules gustatives

PKD2L1+, de plus, nous avons vu que des récepteurs canaux perméables aux protons pouvaient

être impliqués dans la détection de pH acide (Chang et al., 2010). Au niveau des bulbes olfactifs,

la détection fait également intervenir l'Anhydrase carbonique. A ce niveau, la détection de CO2

passerait par la diffusion de H+ et de HCO3- dans le milieu intracellulaire ce qui conduirait à

l'augmentation de GMPc et à l'activation de canaux sensibles aux nucléotides cycliques (CNG,

cyclic nucleotide-gated) (Hu et al., 2007).

De ce fait, la réelle implication du canal PKD2L1 dans cette fonction ne peut pas être établie et

d'autres études sur les modèles délétés pour PKD2L1 pourraient aider dans la compréhension

de ce phénomène.

Implication de PKD2L1 dans la Physiologie rénale :


Au niveau des reins, l’expression de PKD2L1 dans la région apicale de l’épithélium du

tube collecteur dans la région médullaire interne suggère un rôle de ces canaux dans la

réabsorption des ions sodium (Basora et al., 2002). Associée à ces données anatomiques, une

étude montre que cette réabsorption est assurée par un canal cationique non sélectif sensible à

l’amiloride (Ismailov et al., 1995; Vandorpe et al., 1997), caractéristiques communes à PKD2L1.

De plus, comme nous l’avons vu précédemment, le canal PKD2L1 présente une forte

perméabilité au NH4+ (Liu et al., 2002). Puisque les cellules de l’épithélium rénal dans la région

médullaire interne du tube collecteur jouent un rôle majeur dans l’équilibre acido-basique,

101
Introduction

PKD2L1 pourrait être impliquée dans cette régulation en participant à l’excrétion de NH4+ dans

les urines.

PKD2L1 et pathologies :
Contrairement à ce qu'on aurait pu attendre du fait de la forte homologie entre PKD2L1

et PKD2, la protéine PKD2L1 n'est pas impliquée dans la polykystose rénale autosomique

dominante, mais pourrait être liée aux déficiences rénales et visuelles dues à la mutation krd

(kidney and retinal defects) (Nomura et al., 1998). Cette pathologie est due à l'insertion d'un

transgène qui induit la délétion d'au moins 400 gènes localisés sur le chromosome 19 de la

souris et le chromosome 10 (10q) chez l'homme (Keller et al., 1994). Cette mutation affecte le

locus chromosomique contenant le gène pkd2l1 (Nomura et al., 1998). Cette pathologie induit

des déficits rénaux et rétiniens. Au niveau de la rétine elle touche les cellules ganglionnaires et

les cellules de la couche interne, exprimant la protéine PKD2L1 (Keller et al., 1994; Basora et al.,

2002). Les atteintes rénales observées lors de cette pathologie peuvent être expliquées par la

potentielle implication du canal PKD2L1 dans la physiologie des cellules principales des tubes

collecteurs de la zone médullaire interne, où sa présence au niveau des cils serait à l’origine du

courant cationique spécifique du cil (DeCaen et al., 2013). De ce fait, même si cette mutation

affecte un grand nombre de gènes, les atteintes touchent essentiellement les cellules exprimant

la protéine PKD2L1. Il semble ainsi que PKD2L1 représente un bon candidat dans la genèse de

cette pathologie.

Enfin, une autre pathologie impliquant la protéine PKD2L1 est le décollement de la

rétine. Lors de cette pathologie, le décollement de la rétine entraine l’interruption d’apport de

nutriments aux cellules, induisant un important dysfonctionnement dans le métabolisme

cellulaire à l’origine de la mort cellulaire par apoptose. Lors des stades tardifs de cette

pathologie, l’expression de la protéine PKD2L1 est diminuée. Cette diminution peut être liée

aux dommages importants observés dans la rétine à ce stade. Cependant, le rôle de la protéine

PKD2L1 dans la rétine est méconnu et son implication dans le décollement de la rétine reste

hypothétique (Delyfer et al., 2011).

102
103
Matériels et méthodes

II. MATERIELS ET METHODES

Cette étude a été réalisée en respectant strictement les règles établies par la « EC Council

Directive (2010/63/UE) » ainsi que par la Direction Départementale de la Protection des

Populations des Bouches-du-Rhône. Avant toute expérimentation, les animaux utilisés ont été

anesthésiés par un mélange xylazine/kétamine et euthanasiés. Tout a été mis en place pour

assurer le bien être des animaux, minimiser leur souffrance et réduire l’effectif d'animaux

utilisé. Les procédures expérimentales sont en accord avec le comité local d’éthique et de la

protection des animaux (comité éthique de Provence N°14) (licence N°13.435 de JT and

N°13.430 de NW).

Les animaux utilisés ont été hébergés dans une pièce à température constante (21°C) et sous

éclairage contrôlé (cycle 12h jour/12h nuit) ; ils ont eu accès à de l’eau et de la nourriture

fournies ad libitum (croquettes AO4, UAR, Villemoisson-sur-Orge, France).

A. ANIMAUX

L'ensemble de cette étude a été réalisée sur deux modèles de souris transgéniques

(décrites ci-dessous ; Figure 18), mâles ou femelles, au cours du développement (P0, P7, P14,

P21 et P28) et chez l'adulte âgé de 10 à 14 semaines.

Modèle 1 : Souris PKD2L1:EGFP, où les cellules PKD2L1+ expriment spécifiquement l’EGFP. Ce

modèle provient du croisement de deux lignées génétiques : la lignée PKD2L1-IRES-CRE

(fournie par Pr. Zuker, Hughes Medical Institute, University of California, La Jolla, USA, Figure

18. A) avec la lignée lacZ/EGFP. (fournie par Dr P. Durbec, IBDML, Aix-Marseille Université,

Marseille, France).

Modèle 2 : Souris invalidées pour PKD2L1 (KO-PKD2L1). La souris ayant incorporé le

transgène sur les deux allèles (Figure 18. B) exprime une forme tronquée et non fonctionnelle de

PKD2L1 : les exons 3 à 9 codant du gène pkd2l1, codant pour les 6 segments transmembranaires

de la protéine, ont été délétés conduisant à la formation d'une protéine PKD2L1 tronquée et non

fonctionnelle. Croisement de la lignée PKD2L1-IRES-CRE avec la lignée B6.Cg-Pkd2l1tm1.1Yuni/J

(016853, Jacskon laboratory « fournies par Dr. Yuzo Ninomiya) (Horio et al., 2011).

104
Matériels et méthodes

A
Souris PKD2L1 IRES-CRE Souris « reporter » Expression de PKD2L1
Z/EG (lacZ/EGFP) dans les NcLCR spinaux

pkd2l1 IRES-cre β-Gal EGFP


X

LoxP LoxP

Codon stop

Souris EGFP Expression de l’EGFP


transgènique dans les cellules
PKD2L1:EGFP exprimant PKD2L1

B
+/+ -/-
Protéine
PKD2L1

Gène
pkd2l1

+/- -/- +/+


Transgène
725 pb
575 pb

FIGURE 18. MODELE TRANSGENIQUE UTILISES ET LOCALISATION DE LA PROTEINE PKD2L1. A, Gauche Schéma illustrant la
construction de la lignée PKD2L1:EGFP. Le gène IRES-CRE est inséré en aval du gène codant pour le canal PKD2L1
permettant ainsi l’expression de la CRE-recombinase dans les cellules PKD2L1+. Le croisement de la lignée PKD2L1-CRE
avec des souris « reporter » LacZ/EGFP va induire l’expression sélective de la EGFP dans les cellules PKD2L1 + via l’excision
CRE-dépendante du codon stop situé en amont du gène de la EGFP (adapté de Huang et al., 2006). Droite, Visualisation en
hybridation in situ (en haut) et par immunohistochimie (en bas) de l’expression de PKD2L1 au niveau de neurones autour
du canal central de la moelle épinière en coupe coronale (a,b) et sagittale (f,g). La présence de cellules PKD2L1+ a été
suggérée au niveau du tronc cérébral et de l’hypothalamus par Huang et collaborateurs (2006), points jaunes sur le schéma
(e). B, Gauche Schéma illustrant la construction de la lignée de souris délétées pour PKD2L1. A droite, hybridation in situ
révélant l’absence d’expression de PKD2L1 dans les bourgeons du goût des papilles caliciformes. Adapté de Horio et al.,
2011. En bas, illustration d'un gel d'électrophorèse du génotypage des souris PKD2L1 +/+ et PKD2L1-/-.

105
Matériels et méthodes

Le génotypage de chaque lignée est effectué après amplification par PCR de séquences

spécifiques d'ADN (codant pour la CRE, l’EGFP, ou pour le gène tronqué de PKD2L1) (voir

tableau 10). Ces séquences d’ADN sont extraites à partir de prélèvements de queue des souris

étudiées. Les prélèvements sont réalisés lors du sevrage des animaux à l’âge de 3 à 4 semaines.

Gène CRE eGFP KO-PKD2L1

5’-CGT ACT GAC GGT 5’-GCC ACA AGT TCA 5'-GAT CTG CAA TGC
Séquence amorce sens
GGG AGA AT-3’ GCG TGT CC-3’ AAT GAA CC-3'
Mutant : 5'-ACA CCG GCC
Séquence amorce anti- 5’-CCC GGC AAA ACA 5’-GCT TCT CGT TGG GGT TTA TTC CAA G-3'
sens GGT AGT TA-3’ CTT TGC-3’ Sauvage : 5'-GAC CCT CTG
CCT TGT GTC TC-3'
Dénaturation initiale
7 min, 95 °C 5 min, 95 °C 5 min, 95 °C
(durée, température)
Dénaturation (durée,
40 s, 95 °C 30 s, 95 °C 30 s, 95 °C
température)
Hybridation des
amorces (durée, 40 s, 62 °C 30 s, 62 °C 30 s, 62 °C
température)
Elongation (durée,
40 s, 72 °C 40 s, 72 °C 30 s, 72 °
température)
Elongation Finale
6 min, 72 °C 7 min, 72 °C 7 min, 72 °C
(durée, température)

Nombre de cycles 35 36 36

Taille amplicon, paire Allèle mutant = 575


166 573
de base (pb) Allèle sauvage = 725

TABLEAU 10. : CONDITIONS GENERALES DES PCR DE GENOTYPAGE DES DEUX LIGNEES TRANSGENIQUES UTILISEES.

B. ETUDE IMMUNOHISTOCHIMIQUE

1. PREPARATION DES COUPES HISTOLOGIQUES

Les souris adultes (sauvages ou EGFP+ provenant de la lignée PKD2L1:EGFP) sont

anesthésiées par l’injection intra-péritonéale d’un mélange xylazine (Puteau, France)/kétamine

(Carros France) (15 mg/kg et 100 mg/kg respectivement), puis sont successivement perfusées

avec 4 ml d’un tampon phosphate salin (PBS 0,1 M. PBS: Na2HPO4 0,08 M ; NaH2PO4 0,02 M ;

NaCl 0,154 M) supplémenté d’héparine (500 U/ml), 50 ml de PBS, et 50 ml de paraformaldéhyde

4% (PFA 4 %). Le système nerveux central (cerveau et moelle épinière) est ensuite prélevé et

106
Matériels et méthodes

post-fixé par immersion dans du PFA 4 % pendant 1h, puis rincé dans du PBS 0,1 M durant une

nuit à 4 °C avant d’être finalement plongé dans une solution de déshydratation contenant 30 %

de sucrose pendant 24h. Le système nerveux central ainsi cryoprotégé est ensuite congelé par

immersion rapide dans de l’isopentane à -40 °C et stocké à -20 °C. Après inclusion dans une

matrice (TissuTek), des coupes coronales ou sagittales de 40 µm d’épaisseur sont réalisées à

l’aide d’un cryostat (-23 °C ; Leica, CM3050). Les coupes sériées ainsi obtenues sont placées dans

du PBS 0,1 M en vue des différents marquages immunohistochimiques.

Les souris au stade P0 sont décapitées, le système nerveux central est récupéré, fixé dans

du PFA (4 %, pendant une nuit à 4 °C), rincé dans du PBS (0,1 M, 12h à 4 °C), cryoprotégé par

une solution de sucrose (30 % pendant 24 à 48h à 4 °C) et congelé dans l’isopentane (-40 °C). Les

coupes coronales sériées (30 µm) sont faites au cryostat et sont placées soit dans des puits

contenant du PBS, soit directement sur lame.

Pour uniformiser l’analyse des marquages et simplifier leur représentation, les zones cérébrales

d’intérêts ont été subdivisées en quatre niveaux établis en accord avec les coordonnées

stéréotaxiques de l'atlas Paxinos (Figure 19, schéma de gauche) :

Niveau 1 : moelle épinière cervicale, coordonnées stéréotaxiques antéro-postérieures inférieures

à -8,20 mm par rapport au Bregma

Niveau 2 : de -8,20 à -7,90 mm par rapport au Bregma

Niveau 3 : de -7,90 à -7,65 mm par rapport au Bregma

Niveau 4 : de -7,65 à -7,35 mm par rapport au Bregma

2. IMMUNOMARQUAGES

Différents marquages ont été réalisés, la majorité en coupes flottantes ou sur lame pour

le stade P0. Les modalités techniques sont conservées pour chaque marqueur, seuls le temps

d’incubation des anticorps primaires ainsi que le tampon de blocage et de perméabilisation,

dans lequel les anticorps (primaires et secondaires) sont dilués, varient en fonction du

marqueur. L’ensemble est récapitulé dans le tableau 11. De même, les protocoles de marquage

sont conservés entre le marquage sur coupes flottantes ou sur lame.

107
Matériels et méthodes

Les coupes sont rincées au PBS puis traitées pendant 1h avec une solution de perméabilisation

et de blocage (sous agitation à température ambiante) avant d’être incubées avec l’anticorps

primaire à 4 °C sous agitation pendant 24h ou 48h (temps dépendant du marquage réalisé).

L’anticorps primaire est dilué dans la même solution tampon que celle utilisée pour la

perméabilisation et le blocage. Après rinçage au PBS, les coupes sont incubées pendant 2h à

température ambiante et sous agitation, avec un anticorps secondaire couplé avec l'Alexa 594 ou

488 (1: 400 dilution conservée pour tous les marquages, Invitrogen). Pour les double marquages,

les coupes ont toujours été incubées avec chacun des anticorps spécifiques de manière

séquentielle, après l'anticorps primaire soit anti-PKD2L1 (souris PKD2L1:EGFP-), ou anti-GFP

(souris PKD2L1:EGFP+). L'anticorps primaire anti-GFP de lapin a été généreusement fourni par

Dr T. Doan (Laboratoire de Chimie Bactérienne - CNRS, Marseille, France) et a été produit

comme décrit précédemment par Rudner et Losick (2002).

Dans les cellules identifiées comme étant des NcLCR-PKD2L1+, la présence d'immunoréactivité

contre différents marqueurs a été analysée (Tableau 11): Protéine Associée aux Microtubules 2

(MAP2), Neurofilament de 160 kDa (NF-160), Protéine Neuronale Humaine C et D (HuC/D),

Doublecortine (DCX), protéine « Neuronal Nuclei » (NeuN), Tyrosine Hydroxylase (TH), 5-

Hydroxytryptamine ou sérotonine (5-HT), Acide γ-Aminobutyrique (GABA), isoforme 67 de

l'Acide L-Glutamique Décarboxylase (GAD 67), Adenylate cyclase de type 3 (AC3), forme

Polysialilée de la protéine NCAM (PSA-NCAM, polysialiled-neuronal cell adhesion molecule)

et la protéine nucléaire codée par le gène homéo-domaine Nkx6.1. L'Anticorps Nkx6.1 a été

gracieusement fourni par Pr. J-P. Hugnot (INM, Montpellier, France). Pour déterminer si les

NcLCR étaient cholinergiques, un marquage anti-PKD2L1 a été réalisé sur des coupes de

cerveaux de souris adultes exprimant l'EGFP dans les cellules synthétisant la Choline

acétyltransférase (ChAT), qui ont été fournies par Pr. M. Cordero-Erausquin (INCI, Strasbourg,

France).

Après plusieurs rinçages au PBS, les coupes sont alors déposées sur lames gélatinées (4 %) puis

laissées à sécher avant d’être montées entre lame et lamelle dans un milieu de montage anti-

blanchiment (moviol) et stockées dans le noir à 4 °C.

108
Matériels et méthodes

AC Temps
Sérum Fournisseur
Antigène Hôte primaire d'incubation AC secondaire
(dans PBS) Référence
Dilution (4 °C)
Triton (0.3%), Ane anti-lapin 488
Polyclonale Millipore
PKD2L1 Lapin BSA (1%), HS 1 nuit Chèvre anti-lapin
1:700 AB9084
(3%) 488
Triton (0.3%),
Monoclonale Sigma Chèvre anti-souris
MAP2 Souris HS (3%), BSA 48 h
1:600 M-1406 594
(1%)
Triton (0.3%),
Monoclonale Chèvre anti-souris
NF-160 Souris HS (3%), BSA Sigma 1 nuit
1:80 594
(1%)
Molecular
Monoclonale Triton (0.1%), Chèvre anti-souris
HuC/D Souris probes 1 nuit
1:1000 NGS (5%) 594
A-21271
Polyclonale Triton (0.1%), Santa Cruz
DCX Chèvre 48 h Ane anti-chèvre 594
1:100 HS (5%) sc-8066
Triton (0.3%),
Monoclonale Millipore Chèvre anti-souris
NeuN Souris BSA (4%), NGS 1 nuit
1:800 MAB377 594
(2%)
Monoclonale Triton (0.3%), Millipore Chèvre anti-souris
TH Souris 1 nuit
1:1000 NGS (3%) MAB318 594
Polyclonale Triton (0.3%), Immunostar
5-HT Chèvre 1 nuit Ane anti-chèvre 594
1:400 HS (5%) 20079
Polyclonale Triton (0.3%), Immunostar Chèvre anti-lapin
GABA Lapin 48 h
1:250 HS (5%) 20094 594
Monoclonale Millipore Chèvre anti-souris
GAD-67 Souris NGS (3%) 48 h
1:500 MAB5406 594
Monoclonale Triton (0.1%), ABCAM Chèvre anti-souris
Souris 48 h
1:500 HS (3%) ab38689 488
EGFP
Polyclonale Triton (0.05%), Chèvre anti-lapin
Lapin Dr. T DOAN 1 nuit
1:7500 HS (5%) 488
Triton (0.3%),
Polyclonale Santa Cruz Chèvre anti-lapin
AC 3 Lapin BSA (1%), NGS 1 nuit
1:500 sc-588 594
(3%)
Triton (0.1%), Dev. Stud
Monoclonale Chèvre anti-Ig M
Nkx6.1 Souris BSA (1%), NGS Hybrid.Bank 1 nuit
1:100 souris 594
(3%) F55A10
Triton (0.1 à
PSA- Souris Monoclonale Millipore Chèvre anti-souris
0.3%), BSA 1 nuit
NCAM Ig M 1:250 MAB5324 594
(1%), HS (3%)

Tableau 11. LISTE DES ANTICORPS PRIMAIRES ET DES CONDITIONS EXPERIMENTALES (dilution, solution de blocage et
temps d'incubation) des différentes séries d'expériences réalisées sur les NcLCR. Le nom du fournisseur et le numéro
de catalogue sont également indiqués ainsi que l'anticorps secondaire et le fluorophore associé. L'anti-GFP de lapin a
été purifié comme décrit par Rudner et Losick (Rudner et al., 2002) et qui a été fourni par Dr. T Doan (Laboratoire de
Chimie Bactérienne - CNRS, Marseille, France). L'anticorps anti-Nkx6.1 est un don du Pr. JP Hugnot, (INM,
Montpellier, France).

109
Matériels et méthodes

PKD2L1 : polycystin kidney disease 2-like 1; MAP2 : microtubule-associated protein 2; NF : neurofilament;


HuC/D : Human Neuronal Protein HuC/HuD; DCX : doublecrotin; NeuN : neuronal nuclei, TH : tyrosine
hydroxylase; 5-HT : 5-hydroxytryptamine or serotonin, GABA : gamma aminobutyric acid; GAD 67 : L-glutamic
acid decarboxylase 67; (E)GFP : (enhanced) green fluorescent protein; AC3 : type 3 adenylyl cyclase; Nkx6.1 :
homeobox gene, PSA-NCAM : polysialiled-neuronal cell adhesion molecule.

3. OBSERVATIONS, ACQUISITION ET TRAITEMENT DES IMAGES

Les observations (résolution entre 512 x 512 et 1024 x 1024 pixels) ont été réalisées à

l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (Zeiss LSM700) équipé d’un laser argon (488

nm) pour la fluorescence EGFP et d’un laser He/Ne (543 nm, 633 nm) pour la fluorescence

Alexa 594. L'ensemble des images a été acquis avec soit un objectif 20x (ouverture numérique de

0,8 ; épaisseur optique de ≈ 2 µm), soit un objectif, à immersion dans l’huile, 63x (ouverture

numérique 1,4 ; épaisseur optique de ≈ 0,8 µm). Lors de l'acquisition séquentielle des différents

plans optiques d'une section (dans l'épaisseur de la section en Z), chaque plan recouvre en

partie le prochain plan afin de s'assurer de la continuité de l'image. La reconstitution de l'image

illustrant toute l'épaisseur de la coupe a été réalisée sur les logiciels Image J ou Zen light Edition

2009 en utilisant la routine "maximum intensity Z projection". Pour les expériences de double

fluorescences, combinant des fluorophores ayant des spectres d’excitation/émission différents,

les images ont été acquises de manière séquentielle pour chaque canal (488 nm : vert et 594 nm :

rouge) avec des filtres et des tubes photomultiplicateurs adaptés afin d’optimiser la qualité des

images et de diminuer au mieux l’interférence entre les spectres. La superposition des canaux a

ensuite été réalisée à l’aide du programme Zen light Edition 2009 (logiciel Zeiss) et ImageJ 1,45

(NIH).

Afin de visualiser la morphologie complète (corps cellulaire et bud) des NcLCR, les images

présentées montrant des co-expressions de marqueurs correspondent à des mini projections de

2-3 ou 10-20 plans optiques acquis au 20x ou au 63x respectivement. Pour chaque coupe, des

mosaïques d'images de faible résolution (128x128 pixels, généralement 4 x 5 images/mosaïque)

ont également été réalisées, afin d'identifier, à l’aide de repères anatomiques spécifiques, la

position caudo-rostrale et dorso-ventrale de chaque coupe. Dans l'ensemble des images

illustrant des coupes coronales ou sagittales, le canal central (cc) et le quatrième ventricule (4V)

ont été délimités et représentés par une ligne pointillé blanche.

110
Matériels et méthodes

4. ANALYSES MORPHOLOGIQUES ET COMPTAGE

De manière générale, les différents marquages ont été réalisés à partir de tissus

provenant de trois animaux (mâles et femelles) de même âge (P0, 2-3 mois, 6 mois ou 1 an) et

issus de portées différentes provenant toutes de la lignée PKD2L1 : EGFP. L'ensemble des

comptages a été répété sur 3 coupes non successives et cela pour chacun des niveaux décrits

précédemment (Figure 19).

A B

Niveau1 2 3 4

FIGURE 19. NIVEAUX ANALYSES ET SUBDIVISION AUTOUR DU CANAL CENTRAL. A, Schéma du cerveau et de la moelle épinière
de souris en vue sagittale illustrant les régions sélectionnées pour l’analyse morphologique et phénotypique et qui ont été
subdivisées en 4 niveaux (carré noir à blanc). Barre d’échelle du dessus : coordonnées stéréotaxiques dans l’axe antéro-
postérieur à partir du Bregma (0 mm ; Atlas Paxinos du cerveau de souris). B, Dessin d’une coupe coronale de tronc cérébral
(niveau 3) où sont représentés les quatre quarts (ligne pointillé qui se croisent et cercle) utilisés pour l’analyse de la
distribution des NcLCR PKD2L1+ autour du canal central (point noir). L’insert montre des cellules PKD2L1+ distribuées
dans les 4 quarts (croix blanche).

111
Matériels et méthodes

L'analyse, le comptage cellulaire et la détermination de l'expression de marqueurs co-exprimés

ont été réalisés sur chaque plan d’une pile d'images avec une identification cellule par cellule.

Les analyses ont été réalisées sur des coupes non consécutives. Les images ont été analysées et

préparées par l'utilisation de Zen 2009 light Edition (logiciel Zeiss), ImageJ 1,45 (NIH), Adobe

illustrator et Photoshop. Aucune correction des images n'a été réalisée et pour une meilleure

visualisation, seuls la luminosité et le contraste des images utilisées pour les figures ont été

modifiés.

a) Distribution & Densité cellulaire

Pour chaque niveau d'intérêt (Figure 19. A), l'analyse a été réalisée sur 3 à 10 coupes par

animal et répétée chez 3 à 4 animaux. Pour cette étude, seul un marqueur a été analysé, soit

PKD2L1, soit la GFP (visualisation de l’axone). Pour chaque coupe, le nombre de cellules

PKD2L1+ a été compté manuellement sur chaque plan constituant l'image (14 à 24 plans, de 15 à

26 µm d'épaisseur) en utilisant la routine "cell counter" sur ImageJ. Ensuite, le nombre total de

cellules a été divisé par l'épaisseur de la coupe analysée et la densité cellulaire a été exprimée

par 10 µm d'épaisseur de tissu. Pour analyser la distribution des NcLCR PKD2L1+ autour du

canal central, chaque plan optique de l'image a été orienté selon l'axe ventro-dorsal. L'image a

ensuite été subdivisée en quatre parties centrées sur le canal central (Figure 19. B). Pour chaque

plan optique, les cellules de chaque quart ont été comptées en utilisant une routine de comptage

du logiciel ImageJ (cell counter). Dans toutes les analyses, pour le côté gauche-droite, nous

parlerons plus généralement de position latérale puisque ceux-ci n'ont pas été différenciés.

Cette analyse a été réalisée par niveau pour chaque coupe (Figure 19. A) et le pourcentage

moyen de la distribution des cellules dans chaque quart a été calculé. La position du corps

cellulaire par rapport au canal central, correspond à la mesure de la distance entre le bord du

canal central et la base de la dendrite des NcLCR PKD2L1+ (ligne directe). Pour déterminer la

longueur de la neurite des NcLCR en fonction de leur position dans chaque quart pour chaque

niveau, une ligne segmentée (ImageJ) a été utilisée pour suivre sur plusieurs plans le chemin de

la neurite du soma jusqu'au bud.

112
Matériels et méthodes

b) Comptage cellulaire pour les double marquages

Pour l'analyse de l'expression des marqueurs GABA, GAD 67, DCX et Nkx 6.1 dans les

NcLCR PKD2L1+/EGFP+, nous avons compté manuellement, dans un premier temps le nombre

de cellules exprimant PKD2L1/(E)GFP puis le nombre de cellules PKD2L1+/(E)GFP+ exprimant

le marqueur d’intérêt. Ensuite, le pourcentage de cellules co-exprimant les deux marqueurs a

été calculé. Dans les expériences où NeuN et HuC/D sont analysés, nous avons tout d’abord

créé une région d’intérêt (ROI) de la taille du corps cellulaire des NcLCR sur ImageJ. Cette ROI

a été utilisée pour mesurer sur chaque plan optique de l’image, d’une part, l’intensité du bruit

de fond dans les régions ne contenant ni fibre ni corps cellulaire et d’autre part l’intensité de

fluorescence émise par les NcLCR PKD2L1+/EGGP+. Après avoir calculé l’intensité moyenne du

bruit de fond de chaque image (gamme allant de 0-255, Tableau 12), le calcul de l’intensité

moyenne de fluorescence émise dans les cellules PKD2L1+ a été réalisé (Tableau 12). Ensuite, la

moyenne de l’intensité du bruit de fond de toutes les images d’un marqueur a été calculée (pour

chaque marqueur nucléaire) et seulement les NcLCR PKD2L1+ dont l’intensité moyenne de

fluorescence émise était supérieure de 30 % par rapport au bruit de fond moyen ont été

considérés comme positifs pour NeuN ou HuC/D.

Pour les animaux de 2-3 mois, l’intensité de fluorescence émise dans le noyau des cellules du

parenchyme, lors du marquage NeuN, est de 104,0 ± 0,6 c’est-à-dire quatre fois plus intense que

dans les NcLCR PKD2L1+ (p < 0,0001).

Marqueur d’intérêt NeuN HuC/D

Age 2-3 mois 2-3 mois


Intensité moyenne du bruit de
12,1 ± 0,6 8,2 ± 0,6
fond
Intensité moyenne de
27,7 ± 1,5 15,5 ± 0,8
fluorescence
N (cellules) 673 9 coupes
p < 0,001 < 0,01

TABLEAU 12. INTENSITE DE FLUORESCENCE MOYENNE OBTENUE LORS DE L'ANALYSE DES MARQUAGES NEUN ET HUC/D.

113
Matériels et méthodes

5. STATISTIQUES

Toutes les données sont exprimées sous la forme moyenne ± SEM et la significativité

statistique des différences a été testée en utilisant des tests statistiques non paramétriques : le

test Kruskal-Wallis combiné avec au test de Dunn pour la comparaison multiple des différentes

conditions, le test de Wilcoxon et de Mann-U Witney pour la comparaison dans deux conditions

de "pairées" et "non-pairées", respectivement. Les données ont été considérées comme

significatives quand la valeur de p était inférieure à 0,05. Les analyses ont été effectuées sous

Excel 2007 (Microsoft) et Prism (Graphpad).

C. ETUDE ELECTROPHYSIOLOGIQUE

Cette étude a été réalisée uniquement sur deux des trois modèles expérimentaux, les

souris PKD2L1:EGFP et les souris délétées pour PKD2L1 (ainsi que les souris sauvages ou WT

pour "wild type issues" des mêmes portées). Pour le modèle PKD2L1:EGFP, le nombre de souris

doubles positives (CRE+, EGFP+) obtenus étant relativement faible (environ 20 %), les études ont

également été menées sur des animaux EGFP- et la morphologie des neurones enregistrés a été

confirmée suite à la dialyse de l’Alexa Fluor 595 lors du passage en configuration cellule entière.

L’étude des propriétés passives, de décharge et des courants globaux a été effectuée

uniquement sur le modèle PKD2L1:EGFP. L’analyse du courant unitaire, de sa modulation et de

son intégration cellulaire, provient d’enregistrements obtenus sur les deux modèles génétiques

précédemment cités (Figure 18).

1. PREPARATION DES TRANCHES DE TRONC CEREBRAL

Une souris adulte de 2-3 mois est anesthésiée par un mélange xylazine (15 mg/kg ;

Puteau, France)/kétamine (100 mg/kg ; Carros, France) injecté en intra-péritonéal, puis sacrifiée

par décapitation. Le cerveau est prélevé et la partie bulbaire est récupérée puis, sous loupe

binoculaire, débarrassée de ses méninges à l’aide de pinces fines. Le tronc cérébral est collé à

l’aide de colle cyanocrilate sur la plateforme de coupe contre un bloc d’agar afin d’augmenter la

stabilité. Des tranches coronales de 200 à 300 µm d’épaisseur sont réalisées au vibratome (Leica

114
Matériels et méthodes

VT1000S). Seules les parties « postrémales » et « sous postrémales » sont récupérées. L’ensemble

de ces étapes (chirurgie et coupe) est effectué à 0 °C, dans un milieu de coupe oxygéné dont la

composition est la suivante (en mM): NaCl 130, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26, KCl 3, CaCl2 0,5,

MgCl2 7, glucose 15, sucrose 16, acide ascorbique 2, Na-pyruvate 2, myo-inositol 3, acide

kynurénique 1. pH = 7,3‒7,4 à 0°C ajusté avec un mélange 95% O2 et 5% CO2 ; osmolalité ≈ 310

mosmol/kg. Les tranches sont ensuite mises dans une chambre de récupération contenant du

liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa) oxygéné et chauffé à 30 °C. LCRa (en mM) : NaCl

115, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, glucose 15, acide ascorbique 2, Na-

pyruvate 2, myo-inositol 3, ± acide kynurénique 1. pH = 7,4 à 30°C ajusté avec un mélange 95%

O2 et 5% CO2 ; osmolalité ≈ 315 mosmol/kg. Enfin, les tranches sont laissées pendant une heure

dans la chambre de récupération contenant du LCRa dont la température revient à la

température ambiante, et dont l’oxygénation reste fixe et continue. Les tranches sont conservées

dans cette chambre jusqu’à leur transfert individuel dans la chambre d’enregistrement (Figure

20) où elles sont perfusées en continu à un taux de 2,5 ml/min avec une solution standard de

LCRa oxygéné, de composition (en mM) : NaCl 130, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26, KCl 3, CaCl2 2,

MgCl2 2, glucose 15, acide ascorbique 0,5, Na-pyruvate 2, myo-inositol 3, ± acide kynurénique 1.

pH = 7,3-7,4; osmolalité ≈ 310 mosmol/kg et maintenu à température ambiante (≈ 20 °C).

115
Matériels et méthodes

A
Caméra
Harpe de platine CoolSnap
Electrode de Ordinateur:
avec fils de nylon HQ2
pression Logiciel
Tranche MetaVue

Em 508 nm Em 617 nm
LED
Miroir dichroïque Ex 590 nm
500 nm/600 nm
Ex 495 nm
Objectif
immersion
Electrode de
Chambre Patch-clamp pression
Pipette de patch d’enregistrement (Alexa 595)

Canal central aspiration


Perfusion Tranche
générale Éclairage
(2 ml/min) infra-rouge
B
IR-DIC (Obj. x5) EGFP (Obj. x5)

TS AP
NTS CC

DMNX
200 µm 200 µm
CC bud soma

EGFP (Obj. x63)


C 20 µm

IR-DIC EGFP AlexaFluor-595

20 µm
Pipette de Patch

FIGURE 20. VISUALISATION ET ENREGISTREMENT DE NEURONES DANS UNE TRANCHE DE TRONC CEREBRAL. A, Schéma
illustrant, à gauche, la chambre d’enregistrement sous le microscope dans laquelle est maintenue, grâce à une harpe, une
tranche de tronc cérébral. A droite, schéma représentant le système d’enregistrement, d’illumination par épifluorescence et
d’acquisition d’images. B, Tranche de tronc cérébral au niveau de l’area postrema (AP) visualisée en contraste interférentiel
sous lumière infra-rouge (IR-DIC) avec les principales structures : NTS, noyau du tractus solitaire; TS, tractus solitaire;
DMNX, noyau moteur dorsal du nerf vague; cc, canal central. A droite, la même tranche visualisée en épifluorescence
(excitation à 495 nm/émission à 508 nm) pour repérer les NcLCR EGFP +. L’insert montre à plus fort grossissement des
NcLCR avec le bud au contact du canal central. C, Images montrant de gauche à droite la séquence d’enregistrement d’un
NcLCR : repérage d’un neurone prés du cc sous lumière infra-rouge, visualisation sous épifluorescence de l’expression de
l’EGFP dans le neurone, enregistrement du neurone avec une solution contenant de l’Alexa Fluor 595 pour confirmer sa
morphologie.

116
Matériels et méthodes

2. ENREGISTREMENTS ELECTROPHYSIOLOGIQUES SUR TRANCHES

Les enregistrements d'électrophysiologiques de cette étude ont été réalisés sur tranches

de tronc cérébral (du niveau 2 à 4, voir figure 19) à l’aide de la technique de patch clamp

(Hamill et al., 1981). L'ensemble des résultats présentés ont été obtenus uniquement et

spécifiquement au niveau de cellules identifiées comme étant des NcLCR.

Lors de cette étude, les enregistrements ont été effectués soit en configuration cellule entière soit

en configuration patch perforé (pour l'étude du potentiel de réversion physiologique du chlore :

ECl).

a) Dispositif expérimental

En début de chaque expérience, une tranche est transférée dans la chambre

d’enregistrement, positionnée sur la platine d’un microscope droit (Zeiss Axioskop FS). La

tranche est maintenue en place par une harpe en platine (Figure 20. A) et perfusée avec du

LCRa oxygéné (débit 2 ml/min) maintenu à température ambiante. La tranche est éclairée en

lumière infrarouge (IR) et observée à l’aide d’un objectif à immersion à eau (x63) en contraste

interférentiel (IR-DIC). Les cellules EGFP+ sont détectées lors d’une illumination à 495 nm à

l’aide d’un système d’épifluorescence LED Precisexcite (CooLED, Roper) (Figure 20. B et C). La

cellule sélectionnée est «patchée» à l’aide d’une électrode contenant 10 µM d’Alexa fluor 595

(Figure 20. B et C). Cette procédure permet d’introduire dans la cellule l’Alexa fluor 594 et ainsi

de confirmer que la cellule enregistrée correspond bien à la cellule EGFP+ présélectionnée. De

plus, l’introduction d’Alexa 594 dans la cellule enregistrée, nous permet d’enregistrer également

des cellules provenant de tranches de tronc cérébral de souris PKD2L1:EGFP, mais n’exprimant

pas l’EGFP, et de vérifier après dialyse du milieu intrapipette, la nature de la cellule enregistrée.

Les images sont réalisées à l’aide d’une caméra CCD CoolSnap HQ2 (Photometrics) connectée

par une carte d’acquisition numérique (carte d’interface CoolSnap LVDS, Photometrics) à

l’ordinateur et pilotée par le logiciel MetaVue (Molecular Device Inc., Sunnyvale, CA, USA).

Les pipettes de patch sont étirées en deux temps (étireuse Narishige PC10) à partir de capillaires

en verre borosilicatés (GC150F-10, Harvard Apparatus, Les Ulis, France). Nous avons utilisé

plusieurs milieux intrapipettes d'enregistrement dont les compositions sont données dans le

tableau 13. Les résistances d’électrode sont comprises entre 3,5 et 5,5 mégohms. Les signaux

117
Matériels et méthodes

électriques sont amplifiés (multiclamp 700B) et filtrés (2,4 kHz) puis digitalisés (de 10 à 20 kHz ;

digidata 1320A) et traités à l’aide du logiciel pCLAMP 9.2 (Molecular Devices). L'électrode

d'enregistrement remplie du milieu intracellulaire artificiel est amenée à la cellule à l'aide d'un

micromanipulateur motorisé (Luigs & Neumann SM-5).

Composition,
KCl KGlu KGlu ClCs AcCs
mM
NaCl 10 8 10 10 4 10
KCl 135 10 20 / / /
ClCs / / / 135 / 20
AcCsc / / / / 135 120
K-gluconate / 120 115 / / /
MgCl2 2
CaCl2 1 2 1 1 1 1
[Ca++]i libre 13 nM
EGTA 5
Hepes 10
Phosphocréatine 10
Na2-ATP 4
Potentiel de réversion des ions (Eion) à 20 °C, mV
ENa +55 +58 +55 +55 +65 +55
EK -96 -99 -96 nd nd nd
ECl +2 -49 -34 +2 -67 -34
pH 7,3-7,35
Ajustement du
KOH 1 M KOH 1 M KOH 1 M CsOH 50 % v/v
pH
Osmolalité Fixée à ≈ 290 mosmol.kg-1

TABLEAU 13. COMPOSITION DES SOLUTIONS D'ENREGISTREMENT INTRACELLULAIRE. KCl : Chlorure de potassium ; KGlu :
Potassium-gluconate ; ClCs : Chlorure de césium : AcCs : Acétate de césium.

118
Matériels et méthodes

b) Modes d’enregistrement et Configurations

Pour l’étude de la décharge et de l’excitabilité neuronale, les enregistrements ont été

réalisés en mode courant imposé soit sans injection de courant (Iinj = 0, analyse de la décharge

spontanée), soit en injectant un courant (positif ou négatif) suffisant pour déclencher la

décharge neuronale, lors d’absence totale de décharge et pour permettre une comparaison de la

fréquence de décharge pour des potentiels de membrane équivalents.

Les enregistrements en mode voltage imposé (VC pour "Voltage Clamp") ont été réalisés lors de

l’analyse des courants macroscopiques (endogènes ou induits) et de l’activité canal. En général,

le potentiel de maintien a été fixé à -80 mV.

De manière générale, l’ensemble des enregistrements a été effectué en configuration

cellule entière. Le passage dans cette configuration a été réalisé lorsque la résistance de "seal"

était supérieure ou égale à 1 GΩ. Au début de chaque enregistrement, un saut de de potentiel

de -20 mV pendant 100 ms (test capacité) a été réalisé afin de déterminer les propriétés passives

des cellules à partir du courant capacitif (capacité membranaire : cm ; résistance membranaire :

rm et constante de temps tau : τ) ainsi que les paramètres d’enregistrement (résistance d’accès,

résistance série). Ces sauts de potentiel ont été régulièrement appliqués au cours des

acquisitions afin de contrôler la qualité de l’enregistrement. Lorsque la résistance d’accès variait

de plus de 25 %, les enregistrements étaient arrêtés. En configuration cellule entière, la

résistance d’accès était de 10 à 20 MΩ et n’a pas été compensée. Dans cette configuration, les

enregistrements ont été effectués en mode potentiel imposé et courant imposé en utilisant

l’amplificateur Multiclamp 700B (Molecular Devices).

Afin de déterminer la valeur physiologique du potentiel de réversion des ions chlorure

(ECl), dans les NcLCR du tronc cérébral, nous avons réalisé des enregistrements en

configuration patch perforé qui permettent le maintien de la concentration intracellulaire en

chlore ([Cl]i). En effet, lors de la configuration cellule entière, la dialyse dans le milieu

intracellulaire du milieu intrapipette modifie la [Cl]i et ne permet donc pas de conserver la

valeur physiologique de ECl. Cette étude a été menée uniquement sur les NcLCR provenant de

souris PKD2L1:EGFP CRE+ et EGFP+ et la configuration patch perforé a été obtenue en ajoutant

au milieu intrapipette un antibiotique : la gramicidine. Ce composé forme des pores dans les

membranes qui sont perméables aux cations monovalents ainsi qu'aux petites molécules non

119
Matériels et méthodes

chargées mais imperméables aux ions chlore (Kyrozis & Reichling, 1995). Ce mode

d'enregistrement permet ainsi d'avoir un accès électrique à l'intérieur de la cellule tout en

conservant le gradient physiologique du chlore (Ebihara et al., 1995). Une solution stock de

concentration de 100 mg.ml-1 a été préparée chaque jour en dissolvant (dissolution aux

ultrasons) la gramicidine dans le diméthylsulphoxide (DMSO). La gramicidine a été ajoutée

(concentration finale entre 0,1 et 0,15 mg.ml-1 ; Sigma-Aldrich, St Louis) à la solution intrapipette

(dissolution par un bais à ultrasons). Comme le DMSO perturbe la réalisation du "seal", la

pointe de l'électrode a tout d'abord été remplie, pendant 15 à 20 s, par la même solution

intrapipette ne contenant pas d'antibiotique : "tip-filled" ensuite, le remplissage "back-filled" du

capillaire a été réalisé avec la solution contenant la gramicidine. Suite à la formation du "seal", la

cellule est laissée en configuration cellule-attachée et le potentiel de membrane maintenu à -80

mV jusqu'à ce que la perméabilisation membranaire soit maximale. La progression du niveau

de perforation est suivie par l'augmentation de l'amplitude des courants capacitifs en réponse à

un saut de potentiel hyperpolarisant de 10 mV. Classiquement, après 10 à 20 min, une

résistance d'accès final entre 15 et 25 MΩ était obtenue. Le maintien de la configuration patch

perforé a été suivi tout au long des enregistrements, par l'observation de la taille des courants

capacitifs et par la présence dans le milieu intrapipette d'Alexa 594 qui ne peut pas diffuser à

travers les pores formés par le gramicidine. Ainsi toute présence de fluorescence 594 dans le

soma du neurone enregistré traduit la diffusion du milieu intrapipette dans la cellule et donc un

passage intempestif en configuration cellule entière. A chaque fin d'enregistrement, la présence

d'Alexa 594 dans le milieu intrapipette à permis, suite à la rupture de la membrane et au

passage en configuration cellule entière, de confirmer que la cellule enregistrée est bien un

neurone de contact.

120
Matériels et méthodes

3. APPLICATION DES DROGUES ET SOLUTIONS

Les drogues utilisées au cours de cette études ont été diluées dans le milieu

extracellulaire à la concentration voulue et sont appliquées soit dans le bain (pour les

antagonistes sélectifs et les bloqueurs), par le système de perfusion générale, soit par pression à

l’aide d’une pipette d’éjection positionnée à environ 50 µm du soma du neurone enregistré

(pour les agonistes ainsi que les modulateurs du canal PKD2L1) permettant une application

rapide et locale ainsi qu’un lavage rapide (Tableau 14). Pour s’assurer de la spécificité des

réponses enregistrées et de l’absence d’artéfact d’application, les expériences ont également été

réalisées en appliquant par pression du LCRa ne contenant aucune drogue. Lors de ces

contrôles, aucune réponse ni modification du potentiel de membrane n’ont été observées

confirmant la spécificité de l’effet des drogues ou des solutions appliquées.

Dans les expériences visant à caractériser la nature de la transmission synaptique de

faible fréquence, un LCRa contenant 500 mM de sucrose (osmolalité finale de 800 mosmol/kg) a

été appliqué (10-30 s) afin d’augmenter la probabilité de libération de vésicules synaptiques.

La modulation de l’activité canal par le pH a été déterminée par l’application par

pression de la solution test tamponnée à différents pH. La solution alcaline à pH 8,8 était

composée de (en mM) : NaCl 115, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, glucose 15, sucrose 10, Hepes 10,

(acide N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonique (TAPS) 10 (pH = 8,8 ajusté

avec du NaOH 1 м, osmolalité ≈ 310 mosmol/kg). La solution d’acide chlorhydrique à pH 2,8

était composée de (en mM) : NaCl 145, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, glucose 15, sucrose 10, Hepes 10

(pH ajusté à 2,8 avec de l’HCl 1 м ; osmolalité ≈ 310 mosmol/kg). Pour la solution d’acide

citrique, le pH final (6,3 ; 6,0 ; 5,5 ; 5,0 et 2,8) a été ajusté en faisant varier la concentration

respective d’acide citrique et de citrate de sodium (osmolalité ≈ 310 mosmol/kg). Pour connaitre

l’effet de l’osmolarité sur l’activité canal, nous avons utilisé une solution d’enregistrement

contrôle modifiée dont la composition était (en mM) : NaCl 110, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26, KCl

3, CaCl2 2, MgCl2 2, sucrose 45, acide ascorbique 1, Na-pyruvate 2, myo-inositol 3, acide

kynurénique 1. pH = 7,3-7,4; osmolalité ≈ 315 mosmol/kg. Le choc osmotique a consisté en

l’application par pression (3 min) soit d’une solution hypotonique correspondant à la solution

d’enregistrement modifiée sans sucrose (osmolalité ≈ 265 mosmol/kg), soit d’une solution

hypertonique dont la concentration en sucrose a été augmentée à 90 mM (osmolalité ≈ 355

121
Matériels et méthodes

mosmol/kg). L’osmolalité de toutes les solutions a été mesurée par un micro-osmomètre

précédemment calibré (Roebling MessTechnick).

122
Matériels et méthodes

Concentration Type
Drogue Cible(s) Référence
d’utilisation d’application
Acide Antagoniste R-Glu (R- : NMDA, Perfusion
1 mM K3375, Sigma
Kynurénique AMPA, Kaïnate) générale
Antagoniste R-Glu Perfusion
MSOP 100 µM 0803, Tocris
métabotropiques de type III générale
Antagoniste R-Glu Perfusion
MCPG 500 µM Asc-033, Ascent
métabotropiques de type I, II générale
Gabazine, Perfusion
Antagoniste R-GABA-A 10 µM Asc-042, Ascent
SR95531 générale
Perfusion
Strychnine Antagoniste R-Gly 1-10 µM S 2280, Sigma
générale
Perfusion
Picrotoxine Antagoniste R-GABA-A 100 µM P1675, Sigma
générale
dTC Perfusion
Antagoniste R-ACh nicotiniques 100 µM 2820, Tocris
(d-tubocurarine) générale
Perfusion
Atropine Antagoniste R-ACh muscarinique 1 µM A0132, Sigma
générale

Amiloride Bloqueur PKD2L1/ASIC 2 mM Pression A7410, Sigma

PcTX1 Perfusion Drs. Diochot et E.


Bloqueur ASIC 40 nM
(psalmotoxine 1) générale Lingueglia

GABA Agoniste R-GABA 1 mM Pression A5835, Sigma

Glycine Agoniste R-Gly 1 mM Pression G 7126, Sigma

Agoniste R-Glu
Glutamate 100 µM Pression Asc-049, Ascent
(R- : NMDA, AMPA, Kaïnate)

NMDA Agoniste R-NMDA 100 µM Pression 0114, Tocris

AMPA Agoniste R-AMPA 100 µM Pression 1074, Tocris

Kaïnate Agoniste R- Kaïnate 100 µM Pression 0222, Tocris

ACh Agoniste R- cholinergiques 100 µM Pression A6625, Sigma

ATP Agoniste R-purinergiques 100 µM Pression A9187, Sigma

Agoniste R- purinergiques non


2-Me-S-ATP 100 µM Pression 1062, Tocris
hydrolysable

TABLEAU 14. RECAPITULATIF DE L'ENSEMBLE DES DROGUES UTILISEES. Pour chaque droque sont indiqués la cible, la
concentration, le mode d'administration et le fournisseur.

123
Matériels et méthodes

4. ANALYSES ET TESTS STATISTIQUES

L'ensemble des analyses a été réalisé à l’aide des logiciels Clampfit (Axon Instrument, version

10.0), Excel, minianalysis, Origin et GraphPad.

L’ensemble des résultats est exprimé sous la forme de moyenne ± SEM. La significativité des

différences issues de résultats ne suivant pas une distribution gaussienne a été déterminée par

le test non paramétrique de Kruskal-Wallis. Les résultats obtenus à partir de groupes cellulaires

distincts ont été analysés par le test non paramétrique de Mann-Whitney, tandis que pour la

comparaison de résultats au sein d’une même cellule, nous avons utilisé le test de Wilconxon.

Les différences ont été considérées comme significatives lorsque p < 0,05. Les analyses

statistiques ont été réalisées à l’aide du logitiel Prism 5.0.4 (GraphPad).

a) Propriétés passives

Chaque enregistrement débute par l’application d’un saut de potentiel de -20 mV afin

d’induire un courant capacitif permettant de déterminer les propriétés passives de la cellule

enregistrée. Le courant capacitif décroit lors de ce saut de potentiel et suit l’équation I(t) = Imax.

(1-e-t/ τ) où τ désigne une constante de temps. τ est une caractéristique du neurone et permet

d’estimer la valeur de la capacité membranaire (cm), qui constitue un indice de la surface

membranaire et donc de la taille de la cellule : τ = cm x (rs x rm) / (rm + rs) où rm désigne la

résistance membranaire et rs la résistance série. La valeur de τ est déterminée en assujettissant

une fonction mono-exponentielle aux points expérimentaux.

b) Décharges neuronales

L'analyse de la décharge neuronale a été réalisée de manière automatisée par l'utilisation

de la routine de détection d'évènements du logiciel Clampfit. Le seuil de détection a été placé à

0 mV et le pré et post trigger ont été fixés à 0 ms. La fréquence de décharge correspond au

nombre de décharges détectées sur une période d’analyse de 1 min et la durée correspond à la

durée de l'overshoot. Enfin, l'amplitude correspond à la variation de potentiel de membrane

entre la ligne de base (potentiel de membrane) et le pic du potentiel d'action.

124
Matériels et méthodes

c) Courants globaux

Deux types de courants macroscopiques ont été analysés : les courants synaptiques et les

courants évoqués. L'analyse de la fréquence et de l'amplitude des courants synaptiques

spontanés et évoqués a été réalisée de manière automatique à l'aide de la routine "event

détection" du logiciel Clampfit. Afin de déterminer la constante de temps du décours des

courants (τ) une fonction exponentielle a été utilisée pour assujettir les données expérimentales.

Pour comparer les évènements synaptiques GABAergiques et glycinergiques, les courants ont

été normalisés par rapport à l'amplitude du courant au pic.

Les courants évoqués par l'application d'agonistes exogènes ont été analysés par la mesure du

courant au pic. La nature et la spécificité de la réponse enregistrée ont été vérifiées en présence

d'antagoniste spécifique.

d) Courant unitaire

Pour déterminer les effets du pH sur l’activité du canal mesurée en configuration cellule

entière, nous avons procédé de deux manières.

Pour l'analyse de l'amplitude du courant unitaire en fonction du potentiel : une trace courant

d’une durée fixe (de 10 à 60 s) a été sélectionnée. Nous réalisons un histogramme de

distribution des amplitudes pour tous les points (Figure 21, trace en noir). A l’aide du logiciel

Clampfit, nous assujettissons deux fonctions Gaussiennes (Figure 21) qui permettent d’estimer

l’amplitude moyenne du bruit membranaire et du courant unitaire.

Pour l'analyse de la probabilité d'ouverture du canal (N.P0) et de ses variations, la routine

"single event detection" de la suite Clampfit a été utilisée. Un premier niveau de détection a été

placé sur la ligne de base et un deuxième niveau autour de -10 pA (amplitude moyenne du

courant unitaire à Vh = -80 mV), les évènements plus courts que 0,5 ms ainsi que les déflexions

artéfactuelles ne correspondant pas au courant unitaire ont été rejetés afin d'augmenter la

spécificité de cette détection. Dans la mesure où le nombre de canaux impliqués est inconnu, la

probabilité d'ouverture du canal est exprimée sous la forme N.P0. Cette probabilité d'ouverture

correspond à la somme des durées d'ouverture du canal divisée par la durée de la période

analysée. L'amplitude du courant unitaire correspond à la variation de courant entre la ligne de

base et le plateau du courant unitaire.

125
Matériels et méthodes

10 s

ligne de base

canal
Vh, -80 mV
ligne de base : -38 pA

20

Nombre de points Amplitude canal unitaire


10 canal estimée à -12 pA

-50 pA

0
-60 -50 -40 -30 -20
amplitude (pA)

FIGURE 21. HISTOGRAMME DE DISTRIBUTION D’AMPLITUDE DU COURANT UNITAIRE. Le courant au niveau de la ligne de
base (fonction gaussienne, trace bleue) se situe autour de -38 pA, tandis que l’amplitude moyenne de courant induit lors de
l’ouverture du canal est de l’ordre de -50 pA (fonction gaussienne, trace rouge). L’amplitude du courant unitaire est donc
estimée à -12 pA (-50 - +38). Le nombre de points sous la « gaussienne » rouge dans l’histogramme de distribution est une
évaluation de l’activité du canal. Plus le nombre de points est important, plus l’activité est grande et inversement.

126
127
Résultats

III. RESULTATS

Dans cette étude, en combinant des approches immunohistochimiques et

électrophysiologiques, nous avons réalisé la première caractérisation, chez la souris, des NcLCR

localisés autour des zones épendymaires bordant le canal central au niveau du tronc cérébral.

Les enregistrements électrophysiologiques ont tous été réalisés sur cette population neuronale

au niveau des zones médullaires tandis que les expériences immunohistochimiques ont porté

sur les zones bulbo-spinales (moelle épinière cervicale et tronc cérébral).

La première partie de ces résultats traitera la caractérisation morphologique et les propriétés

électrophysiologiques intrinsèques des NcLCR du tronc cérébral. Puis, nous montrerons que ces

neurones sont intégrés dans un réseau synaptique et que leur activité est modulée par des

facteurs environnementaux agissant sur le canal PKD2L1. Enfin, nous nous intéresserons à l'état

de maturité de ces neurones.

A. DISTRIBUTION & CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE ET

PROPRIETES ELECTROPHYSIOLOGIQUES GENERALES DES NcLCR

1. DISTRIBUTION DES CELLULES PKD2L1+ DANS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL, ET

CARACTERISATION GENERALE DANS LES ZONES BULBO-SPINALES

a) L'expression de PKD2L1 dans les zones bulbo-spinales et hypothalamiques

Afin de déterminer le stade et la localisation des cellules exprimant la protéine PKD2L1

dans le SNC, une étude immunohistochimique a été réalisée sur des coupes coronales de

l’ensemble du SNC, sur des souris à différents âges post-nataux (P0, P7, P14, P21, P28) et

adultes (2-3 mois). Les résultats montrent qu’à P0, les cellules PKD2L1+ sont retrouvées

uniquement au niveau bulbo-spinale (Figure 22 A). Au niveau de la moelle épinière (niveau 1,

Figure 22. A1) et dans le tronc cérébral (niveau 2, 3, Figure 22. A2), ces cellules sont localisées

majoritairement dans la zone épendymaire, où elles semblent essentiellement réparties dans les

portions latérales du canal central. Certaines cellules PKD2L1+ sont également observées dans le

parenchyme, où leur distribution est particulière formant des demi-arcs de cercle de part et

d'autre du canal. Ces arcs de cercle partent des régions latérales du canal central, s’étendent

latéralement sur de courtes distances puis tournent ventralement pour venir au contact des

128
Résultats

cellules PKD2L1+ de la ligne ventro-médiane qui partent de la portion ventrale du canal central

(Figure 22. A1 et A2). Dans les parties plus caudales du tronc cérébral, où apparait le 4V, les

cellules PKD2L1+ sont toutes retrouvées le long de la ligne médiane, seules quelques cellules

sont retrouvées dans la zone épendymaire (Figure 22. A3). A ce stade du développement, nulle

autre région du SNC ne présente une immunoréactivité (IR) pour PKD2L1. A P7, les cellules

PKD2L1+ bulbo-spinales sont toujours présentes (Figure 23. A) mais en plus apparaissent

quelques cellules IR pour PKD2L1 dans le noyau arqué (ARC) de l’hypothalamus (Figure 22. B).

Plus tardivement, à P14, les cellules PKD2L1+ sont retrouvées dans diverses zones

hypothalamiques, au niveau du noyau paraventriculaire (PVN), du noyau périventriculaire (Pe)

(Figure 22. C1), le noyau pré-optique ventro-latéral (Figure 22. C2), la pia (Figure 22. C3), le

noyau supra-optique (Figure 22. C4) et le plancher du 3V (Figure 22. C5). Au cours du

développement postnatal, à P21 et P28, aucune évolution dans le marquage de PKD2L1 n’a été

observée et aucune autre aire du SNC ne présente une IR pour PKD2L1. Sur le plan

morphologique, seules les cellules localisées autour du canal central possèdent la morphologie

classique des neurones de contact, avec l’émission d’un prolongement neuritique vers le canal

central et fini par une structure ampoulée (bud) dans le LCR. Dans les zones du cerveau

antérieur, cette structure n’est pas retrouvée. Les cellules PKD2L1+ sont localisées dans des

zones qui peuvent être éloignées des cavités ventriculaires telles que l’ARC et le PVN (Figure

22. B et C1). Cependant, certaines fibres localisées proches du 3V tel que le Pe, ou de l’espace

subarachnoïdien tel que la Pia, le SON présentent une IR pour PKD2L1 (Figure 22. C). Cette

étude ne permet pas de définir si ces fibres qui contactent les espaces liquidiens proviennent

des corps cellulaires IR pour PKD2L1 dans ces mêmes régions. Quoi qu’il en soit ces résultats

montrent que seules les cellules PKD2L1 de la région bulbo-spinale possèdent la morphologie

classique des NcLCR, de ce fait, pour le reste de cette étude, nous nous sommes focalisés sur les

cellules PKD2L1+ de ces régions.

129
Résultats

A1 A2 A3
P0 4V

cc cc

MEC 20 µm TC

B C1 C2
P7 P14
3V

ARC VLPO
PVN

3V

Pe
20 µm

C3 C4 C5

Pia SON 3V

Plancher
Opt
EM
20 µm

FIGURE 22. DISTRIBUTION DES CELLULES PKD2L1+ APRES LA NAISSANCE. A, Immunohistochimie anti-PKD2L1 sur coupe
coronale de moelle épinière cervicale (A1) et de tronc cérébral (A2, 3) de souris à P0 montrant la présence de cellules
PKD2L1+ autour du canal central (cc) et du quatrième ventricule (4V). B, Immunohistochimie anti-PKD2L1 sur coupe
coronale de cerveau antérieur au niveau du noyau arqué (ARC) à P7. C, Localisation de cellules PKD2L1 positives à P14 au
niveau du noyau paraventriculaire hypothalamique (PVN), du noyau périventriculaire (Pe), du noyau pré-optique ventro-
latéral (VLPO), de la Pia (pie-mère dans la région hypothalamique), du noyau supra-optique (SON) et du plancher du
troisième ventricule (3V).

130
Résultats

Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à l’évolution de l’organisation

des cellules PKD2L1+ dans les régions bulbo-spinales de P0 à l’âge adulte afin de mettre en

évidence si ce système cellulaire subissait une maturation postnatale. A P0, les cellules PKD2L1+

ont une organisation très particulière caractérisée par la présence de demi-arc de cercle dans les

parties latéro-ventrales (Figure 22 A1 et A2). Dès P7, cette organisation n’est plus retrouvée quel

que soit le niveau observé (Figure 23 A) et au niveau du 4V, seules quelques rares cellules

PKD2L1+ sont encore présentes (non représentée). De P7 à P21, il n’y a pas de réorganisation

apparente des cellules PKD2L1+ bulbo-spinales (Figure 23). Les cellules sont regroupées autour

du canal central et très peu de cellules sont localisées dans le parenchyme et où elles sont alors,

essentiellement réparties le long de la ligne ventro-médiane (flèches Figure 23). L’organisation

dans les portions latérales du canal central observée à P0 (Figure 22 A1, 2) est retrouvée que

dans les parties rostrales du tronc cérébral de P7 (niveau 3, Figure 23) à l'âge adulte (Figure 26.

D). Au niveau de la moelle épinière (niveau 1, Figure 23. A1, B1 et C1) les cellules sont localisées

tout autour du canal central. Ces résultats suggèrent que les cellules PKD2L1+ se réorganisent

vers les parties latérales du canal central le long de l'axe caudo-rostral (Figure 23). Cette

organisation des cellules PKD2L1+ bulbo-spinal est conservée chez les souris adultes (Figure 23.

C et Figure 26).

La caractérisation immunohistochimique de l’expression de la protéine PKD2L1 au

cours du développement postnatal, montre que les cellules PKD2L1+ sont déjà présentes autour

du canal central à P0, ce qui indique qu'elles sont générées antérieurement et sûrement lors du

stade embryonnaire. L’apparition des cellules PKD2L1+ dans le cerveau antérieur est plus

tardive, elle commence à P7 mais est vraiment établie à P14 et est restreinte aux zones

hypothalamiques. A ce niveau, les cellules PKD2L1+ présentent une morphologie distinctes de

celles observées au niveau bulbo-spinal. Notamment, elles sont plus éloignées des zones

ventriculaires et ne présentent pas de contact visible avec le LCR.

Les cellules PKD2L1+ bulbo-spinales subissent une réorganisation de leur localisation et de leur

distribution très précoce entre P0 et P7 et possèdent en majorité les caractéristiques typiques des

NcLCR. De part ces distinctions développementales et morphologiques, le système des NcLCR

bulbo-spinal parait différent des cellules PKD2L1+ du cerveau antérieur. Pour ces raisons, le

reste de cette étude a été réalisée sur les cellules PKD2L1+ bulbo-spinales de souris adultes (≈ 14

semaines).

131
Résultats

A1 Niveau 1 A2 Niveau 2 A3 Niveau 3


P7
PKD2L1

20 µm

B1 B2 B3
P14

20 µm

C1 C2 C3
P21

20 µm

FIGURE 23. EVOLUTION DE LA DISTRIBUTION AUTOUR DU CC DES CELLULES PKD2L1+ DE P7 A P21. Immunohistochimie anti-
PKD2L1 réalisée sur coupes coronales de moelle épinière cervicale (niveau 1) et de tronc cérébral (niveau 2 et 3) à P7 (A),
P14 (B) et P21 (C). La plupart des cellules PKD2L1+ sont localisées autour du canal central (ligne en pointillé) et quelques
cellules sont retrouvées dans le parenchyme (flèches blanches).

132
Résultats

b) Propriétés générales des cellules PKD2L1+ qui contactent le LCR dans les zones bulbo-

spinales

Par une approche immunohistochimique combinée à l’enregistrement

électrophysiologique sur tranches de tronc cérébral de souris adultes, nous avons déterminé les

propriétés générales des cellules PKD2L1+ du tronc cérébral.

La figure 24 illustre des coupes coronales de moelle épinière cervicale (niveau 1, Figure 24,

gauche) et de tronc cérébral caudal (niveau 2, Figure 24, droite) où les cellules PKD2L1+ sont

retrouvées autour du canal central (Figure 24. A). L’immunoréactivité pour PKD2L1 révèle une

morphologie classique des NcLCR de mammifères dans ces zones (Figure 24. C). Ce type de

morphologie concerne la majorité des cellules PKD2L1+ étudiées (93,2 ± 0,8 %, comprenant 1549

des 1703 cellules PKD2L1+ analysées). Ces cellules ont un petit corps cellulaire avec un diamètre

moyen de 8,0 ± 0,1 µm (336 cellules) et projettent une neurite vers le canal central qui se finit par

une protubérance ou bud (diamètre moyen 3,1 ± 0,1 µm, 315 cellules) (Figure 24. E). Au cours

de cette analyse morphologique, nous avons aussi noté la présence d’élargissements sur la

neurite qui sont plus facilement visibles en coupes sagittales (Triangles, Figure 24. C et Figure

27. A et C).

Cependant, nous avons parfois observé, la présence de cellules PKD2L1+ présentant une

morphologie de type bipolaire dont la neurite ne semble pas projeter directement vers le canal

central ou en contact avec lui (Figure 24. C). Puisque l’ensemble de cette étude s’intéresse à la

caractérisation morpho-fonctionnelle des NcLCR PKD2L1+, les cellules possédant cette

morphologie ont été exclues des analyses immunohistochimiques et électrophysiologiques.

Ainsi, l’ensemble de cette étude est basée sur l’analyse des cellules PKD2L1 + présentant la

morphologie classique des NcLCR.

Ces cellules sont localisées majoritairement au niveau sous-épendymaire, aucune cellule intra-

épendymaire n’a été observée et la distance moyenne entre leur soma et le canal central est de

23,3 ± 0,2 µm (Figure 24. E, 1407 cellules). L'absence de cellules de contact dans la couche

épendymaire, a également été confirmée lors du marquage anti-MAP2 sur coupes coronales de

tronc cérébral (Figure 27. A). De ce fait, nous pouvons dire que les NcLCR PKD2L1+ du tronc

cérébral sont exclusivement de type sous-épendymaire et seront nommés : NcLCR-S.

133
Résultats

A Niveau 1 Niveau 2

PKD2L1

20 µm

B C

5 µm

D
Longueur
Paramètre Diamètre soma, µm Diamètre bud, µm
prolongement, µm

Valeur 8,0 3,1 25,0

SEM 0,1 0,1 0,3

n 336 315 851

E F
200
Paramètre rm, GΩ cm, pF Vr , mV
Nombre de
cellules

100 Valeur 2,1 3,4 -40,9

SEM 0,3 0,2 1,3


0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
n 70 70 42
Distance soma-canal central, µm

FIGURE 24. PROPRIETES GENERALES DES CELLULES PKD2L1+ QUI CONTACTENT LE LCR AU NIVEAU DU CC CHEZ L’ADULTE.

134
Résultats

FIGURE 24. PROPRIETES GENERALES DES CELLULES PKD2L1+ QUI CONTACTENT LE LCR AU NIVEAU DU CC CHEZ L’ADULTE. A,
Coupe coronale représentative du niveau 1 (gauche) et 2 (droite) montrant la présence de cellules PKD2L1 + localisées sous la
couche épendymaire autour du canal central (ligne en pointillé). La majorité de ces cellules présentes la morphologie
typique des NcLCR avec une projection émise vers le LCR terminée par un bud (triangles blancs). Quelques cellules
PKD2L1+ présentent également une morphologie de type bipolaire mais ne contactent pas le LCR (flèches). Illustration à
plus fort grossissement des cellules PKD2L1+ qui contactent (B) ou ne contactent pas le LCR (C). Sur certains NcLCR, nous
pouvons observer des élargissements au niveau de la neurite (triangles). D, Tableau récapitulant les propriétés
morphologiques des NcLCR. E, Histogramme de fréquence montrant le nombre de NcLCR PKD2L1 + en fonction de la
distance en µm entre le soma et le canal central. F, Propriétés passives des NcLCR déterminées par des enregistrements en
configuration cellule entière et en mode voltage imposé (rm : résistance membranaire ; cm : capacité membranaire) ou courant
imposé (Vr : potentiel de repos).

L’analyse des propriétés électrophysiologiques passives de ces cellules au niveau du tronc

cérébral, montre qu'elles ont un potentiel de repos assez élevé autour de -40 mV (-40,9 ± 1,3 mV

; 42 cellules), une faible capacité membranaire (3,4 ± 0,2 pF ; 70 cellules) liée à la petite taille de

ces cellules et une forte résistance membranaire (2,1 ± 0,3 GΩ ; 70 cellules) (Tableau F Figure 24).

Ces résultats indiquent que les cellules PKD2L1+ en contact avec le LCR sont des petites

cellules, très résistives qui présentent une morphologie homogène avec un corps cellulaire

localisé principalement sous la couche épendymaire, position caractéristique des NcLCR sous-

épendymaux. Ces cellules PKD2L1+ peuvent donc être qualifiées de cellules sous-épendymaires.

2. PATRON DE DECHARGE ET ACTIVITE SPONTANEE DES NCLCR PKD2L1+

L’enregistrement en configuration cellule entière et en mode courant imposé à -60 mV

(par l’injection de courant entre -10 et -20 pA) montre que les cellules PKD2L1+ sont capables de

générer des potentiels d’action (PA) ce qui confirme la nature neuronale de ces cellules ainsi

que leur appartenance au système des NcLCR (Figure 25. A). L’analyse du patron de décharge

indique que les NcLCR PKD2L1+ du tronc cérébral peuvent être divisés en deux groupes : les

neurones à décharge tonique (41 %) où l’émission répétitive de PA à lieu durant toute la

stimulation et les neurones à décharge phasique (59 %) où seul un ou quelques PA sont

observés en début de stimulation (Figure 25. A ; ECl = 2 mV). L’analyse statistique des propriétés

passives de ces deux types neuronaux montre qu’ils ne présentent pas de différence

significative ni dans leur résistance membranaire (p = 0,587), ni dans leur capacité membranaire

(p = 0,332) pas plus que pour leur potentiel de repos (p = 0,818) (Tableau B Figure 25). Enfin, au

135
Résultats

potentiel de repos, l’enregistrement de l’activité spontanée des NcLCR PKD2L1+, montre la

présence d’évènements dépolarisants similaires à des potentiels post-synaptiques, accompagnés

par, ou déclenchant, la genèse de PA préalablement observée (Figure 25. C). Ces résultats

permettent de suggérer que ces neurones reçoivent des afférences synaptiques. Cette hypothèse

est confirmée par les résultats obtenus lors des enregistrements en mode voltage imposé à -80

mV, où la présence de courant entrant présentant un retour de type exponentiel typique des

événements synaptiques spontanés (flèches trace du bas, Figure 25. D). Dans ces conditions, les

enregistrements révèlent également un autre type de courant entrant de forme carrée (rond

trace du bas, Figure 25. D) caractéristique des courants unitaires établis lors de l’ouverture d’un

canal ionique unique. L’analyse plus fine de l’activité spontanée des NcLCR indique que la

plupart des courants entrant enregistrés correspond en fait à l’ouverture de canaux unitaires. En

moyenne, l’amplitude du courant unitaire, enregistrée à -80 mV, est quatre fois plus petite que

celle des courants macroscopiques de type synaptique (amplitude du courant synaptique : -44 ±

3 pA vs. amplitude du courant unitaire : -12,0 ± 0,8 pA ; ECl = 2 mV ; Figure 25. D).

Ainsi, l'un des objectifs de mon travail de thèse a consisté à caractériser et analyser ces

deux types d'activité. Cette question sera traitée dans les parties B.3 et B.4 des résultats.

136
Résultats

A B
Décharge tonique Décharge phasique
Décharge Décharge
Paramètre
tonique phasique
20 mV 20 mV
0,5 s 0,2 s Proportion,
41 59
%
+40
pA rm SEM,
2,5 0,8 2,0 0,4

cm SEM,
+20 4,1 0,4 3,6 0,3
pF
pA
Vr SEM,
Courant -42 2 -43 2
mV
injecté

* * *
C
Courant imposé, Vr -53 mV 20 mV
0.2 s

D
Voltage imposé, Vh -80 mV

20 pA

5s

10 pA
20 ms

FIGURE 25. PROPRIETES INTRINSEQUES DES NCLCR PKD2L1+. A, Illustration des deux patrons de décharge observés dans les
NcLCR : tonique (dans 41 %, traces de gauche) ou phasique (dans 59 %, traces de droite) lors de l’injection de créneaux de
courant dépolarisants. B, Tableau résumant les propriétés électrophysiologiques de base des NcLCR « toniques » et «
phasiques ». rm, résistance membranaire; cm, capacité membranaire; Vr, potentiel membranaire au repos. C, Tracés
représentatifs de l’activité électrique spontanée enregistrée dans un NcLCR en courant imposé au potentiel de repos (‐53
mV) montrant la présence de dépolarisations (flèches) et d'émissions de potentiel d’action (étoile). D, Activité spontanée du
même NcLCR enregistrée en configuration cellule entière et en mode voltage imposé à -80 mV révélant la présence de
courant entrant (trace du haut) correspondant à la fois à une activité canal (rond noir, tracés du bas) et à une activité
synaptique (flèches, tracés du bas). Enregistrements réalisés avec le milieu intracellulaire KCl. ECl = 2 mV.

137
Résultats

3. CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE DES NcLCR PKD2L1+ BULBO-SPINAUX

Pour effectuer cette analyse morphologique, nous avons utilisé une approche

immunohistochimique réalisée sur coupes coronales ou sagittales du tronc cérébral et de moelle

épinière cervicale de souris adultes (2-3 mois). Seules les cellules répondant aux critères

morphologiques précédemment cités ont été étudiées et l’ensemble des cellules PKD2L1+ ne

répondant pas à ces critères a été exclu.

a) Les NcLCR présentent une distribution et une organisation différentielle le long du canal

central

Nous avons examiné de manière plus approfondie la localisation et la distribution des

NcLCR PKD2L1+ autour du canal central de la moelle épinière cervicale (niveau 1) jusqu’au

tronc cérébral (niveau 2 à 4 ; Figure 26. A et 19, Méthodes). Le marquage anti-PKD2L1 sur

coupes sagittales bulbo-spinales (Figure 26. A), montre que les NcLCR PKD2L1+ sont présents

tout le long du canal central mais que leur densité diminue progressivement du niveau 1 (le

plus caudal) au niveau 4 (le plus rostral) pour devenir très faible voire nulle au niveau du 4V.

Cette observation qualitative est retrouvée lors du comptage, sur coupes coronales, du nombre

de NcLCR PKD2L1+ compris dans une épaisseur de tissu de 10 µm, nous avons trouvé : 10 ± 1

cellule dans le niveau 1, 8 ± 1 et 7 ± 1 aux niveaux 2 et 3 respectivement et seulement 3 ± 1 au

niveau 4 (Figure 26. B).

L’analyse de l’organisation des NcLCR sous-épendymaux autour du canal central

dépend du niveau (1 à 4) le long de l’axe rostro-caudal et varie dans l’axe dorso-ventral (voir

Méthodes et Figure 26. C et 26. D ; p < 0,05). Au niveau 1, les NcLCR PKD2L1+ sont

principalement localisés dans les parties ventrales (en moyenne 35 ± 2 %) et dorsales (en

moyenne 33 ± 2 %) et moins présentes dans les parties latérales (en moyenne 16 ± 1%) (Figure

26. D, E). La figure 26 D, E (de gauche à droite) montre que cette organisation change

progressivement avec un déplacement d’une position dorso-ventrale vers une position latérale

dans les niveaux plus rostraux (en moyenne de 46 ± 6 % à 47 ± 4 % latéralement et seulement 3 ±

2 % et 4 ± 2 % dorsalement et ventralement, respectivement au niveau 4 ; Figure 26. D, E ; p <

0,05).

138
Résultats

A
A P
D PKD2L1 AP
4V

50
-8,20 mm Niveau 2 -7,90 mm Niveau 3 -7,65 mm Niveau 4 -7,35 mm µm

B 12 * *** **** C
10 ns
PKD2L1 + /10 µm

**** CVD
d’épaisseur

* D
8 L L
6 V
4
2
0
Niveau 1 2 3 4
n 684 506 407 59

D Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Niveau 4

PKD2L1

20 µm

E Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Niveau 4


D
32 2% 18 2% 8 2% 3 2%
L
16 1% 16 2% 31 2% 34 1% 43 2% 40 2% 47 4% 46 6%
L
35 2% 17 1% 10 1% 4 2%
V

F
ns **
Longueur Neurite,

40 40 40 ns ** 40
**** **** **
30 30 30 **** 30
**
µm

20 20 20 20
10 10 10 10
0 0 0 0
V D L V D L V D L V D L
FIGURE 26. LES NCLCR ONT UNE DISTRIBUTION ET UNE ORGANISATION QUI VARIENT LE LONG DU CANAL CENTRAL.

139
Résultats

FIGURE 26. LES NCLCR ONT UNE DISTRIBUTION ET UNE ORGANISATION QUI VARIENT LE LONG DU CANAL CENTRAL. A,
Coupe sagittale représentative de la région bulbo-spinale montrant la distribution des cellules PKD2L1+ autour du canal
central de la partie caudale du tronc cérébral au quatrième ventricule (4V). Les crochets sous l’image délimitent les 3
niveaux du tronc cérébral (du niveau 2 à 4) analysés ainsi que leurs coordonnées stéréotaxiques (en mm). La double blèche
verticale indique l’axe dorso-ventral (D-V) tandis que la double blèche horizontale indique l’orientation antéro-postérieur
(A-P) de la coupe. AP : area postrema. B, Histogramme montrant le nombre moyen de NcLCR PKD2L1 + dans 10 µm
d’épaisseur de tissu pour chaque niveau (1 à 4). ns : non significatif ; * : p < 0,05 ; *** : p < 0,001 ; n : nombre de cellules
analysées. C, Dessin d’une coupe coronale de tronc cérébral (niveau 3) illustrant les quatre sous-régions (croix en pointillés
et cercle) utilisées pour l’analyse de la distribution des NcLCR PKD2L1 + autour du canal central (point noir). L’insert montre
la répartition des NcLCR dans ces sous-régions (croix noire). D, Coupes coronales représentatives des niveaux 1 à 4 et
illustrant la densité et la distribution des NcLCR PKD2L1+ autour du canal central. E, Pourcentage moyen des NcLCR
PKD2L1+ au niveau des parties ventrales (V), dorsales (D) et latérales (L) du canal central. F, Histogrammes résumant la
longueur moyenne des neurites émises vers le canal central des NcLCR PKD2L1 + localisés dans les parties ventrales (V),
dorsales (D) et latérales (L) du canal central au niveau bulbo-spinal (niveau 1 à 4). ns : non-significatif ; ** : p < 0,01 ; *** : p <
0,001. Les données issues des régions latérales ont été regroupées.

Ces résultats indiquent également que les NcLCR PKD2L1+ avec une position ventrale dans les

niveaux 1 et 2 et latérale dans les niveaux 3 et 4 projettent des neurites de plus grande longueur

(Figure 26. F). En effet, au niveau 1, les neurites des NcLCR-S ventraux mesurent en moyenne

31,7 ± 1,3 µm de long (n = 81) tandis que celles-ci mesurent environ 20 µm dans les autres

régions autour du canal central (dorsal : 23,0 ± 0,4 ; n = 107 ; latéral : 20,3 ± 0,6 µm ; n = 114 ; p <

0,0001 ; Figure 26. F, gauche). Le long de l’axe caudo-rostral (de gauche à droite, Figure 26. F), la

longueur de la neurite des NcLCR PKD2L1+ sous-épendymaux ventraux diminue

progressivement pour atteindre 23,0 ± 0,4 µm (n = 115) et en parallèle, la longueur des neurites

des NcLCR-S PKD2L1+ latéraux augmente à 32,5 ± 2,3 µm (n = 22) au niveau 4 (dorsal : 24,5 ± 1,1

; n = 14 ; p < 0,01 ; Figure 26. F, droite).

140
Résultats

b) Les NcLCR sont des cellules polarisées qui possèdent un cil primaire sur leur soma

Pour définir la polarité cellulaire et mettre en évidence la présence d’un compartiment

dendritique et axonal, nous avons réalisé des doubles marquages PKD2L1/MAP2 et

PKD2L1/NF-160 sur coupes coronales de tronc cérébral de souris adultes. MAP2 est une

protéine associée aux microtubules neuronaux sélectivement exprimée dans le compartiment

somato-dendritique (Kosik & Finch, 1987) tandis que NF-160 est associé aux microtubules

axonaux dans les neurones matures (Perrot et al., 2008; Perrot & Eyer, 2009) (Figures 27 et 28).

La présence d’immunoréactivité MAP2 dans la neurite des NcLCR-S PKD2L1+ révèle la nature

dendritique de ce prolongement (Figure 27 A2 et A3). Cette dendrite co-exprime fortement

PKD2L1 avec une intensité de fluorescence maximale au niveau du bud (Figure 27 A1 et A3).

De manière intéressante, ces résultats montrent également qu’il n’y a pas de cellules MAP2+

localisées dans la couche épendymaire et que l’ensemble des projections émises vers le LCR co-

expriment PKD2L1, ce qui suggère que l’ensemble des neurones MAP2+ projetant vers le canal

central sont les NcLCR-S PKD2L1+ (Figures 27 et 28). La nature dendritique de la neurite est

également confirmée par l’absence de marquage NF-160 à ce niveau (flèches, Figure 27. B). Ces

résultats montrent également la présence de nombreuses fibres axonales autour du canal central

et au niveau des NcLCR-S, mais ne permettent pas d’identifier des structures axonales NF-160+

émergeant du corps cellulaire de ces neurones ou exprimant PKD2L1 (Figure 27. B). Afin de

mettre en évidence la présence d’un prolongement axonal, nous avons réalisé des coupes

sagittales de tronc cérébral de souris PKD2L1:EGFP+ où l’EGFP, une protéine cytosolique, est

exprimée sélectivement dans les cellules PKD2L1+ et peut diffuser librement dans l’ensemble du

cytoplasme des cellules étudiées. Le signal fluorescent intrinsèque de l’EGFP a été amplifié par

immunomarquage à l’aide d’anticorps anti GFP. Les résultats obtenus rejoignent ceux observés

avec le marquage anti-PKD2L1, c'est-à-dire que l’on retrouve la morphologie classique des

NcLCR avec le prolongement émis vers le canal central et permettent également de mettre en

évidence la présence de projections de type axonal (axone-lik) qui s’étendent dans le

parenchyme (triangles blancs, Figure 27. C, E et 28).

141
Résultats

A
PKD2L1 MAP2 Superposition

10 µm

B
PKD2L1 NF-160 Superposition

10 µm

C D E

10 µm GFP 50 µm GFP/PKD2L1 10 µm
GFP

FIGURE 27. LES NCLCR PKD2L1+ SONT POLARISES ET EXPRIMENT PKD2L1 SUR LE CORPS CELLULAIRE ET LA DENDRITE MAIS
PAS SUR L’AXONE. A, Double marquage sur coupe coronale de tronc cérébrale à l’aide d’anticorps contre PKD2L1 (vert) et
MAP2 (rouge). La superposition des images (à droite) montre que les NcLCR expriment MAP2 au niveau du corps
cellulaire, de la neurite (flèches) et du bud et révèle également l’absence de cellules MAP2 + dans la couche épendymaire. B,
Co-marquage de PKDL21 (vert) et de NF-160 (rouge) sur coupe coronale de tronc cérébral. La superposition des images
indique la présence de nombreuses fibres de type axonal NF-160+ dans la coupe autour du canal central et à proximité des
NcLCR PKD2L1+. Et montre l’absence d’immunoréactivité dans neurite des NcLCR (flèches). Cependant, l’abondance de
fibres NF-A60+ autour du canal central rend difficile la visualisation d’axones émergeant du corps cellulaire des NcLCR. C,
Immunomarquage anti-GFP réalisé sur coupe sagittale de tronc cérébral de souris PKD2L1:EGFP+ révélant la présence de
fins prolongements de type axonal (triangles blancs) émis à partir du corps cellulaire des NcLCR. D, Immunomarquage
anti-GFP réalisé sur coupe horizontale de moelle épinière montrant la présence de faisceaux EGF + de part et d’autre de la
fissure ventro-médiane. E, Double marquage dirigé contre PKD2L1 (rouge) et la GFP (vert) sur coupe sagittale de tronc
cérébral montre que les NcLCR émettent un fin prolongement de type axonal dans le parenchyme (pointes de flèche
blanches) mais que PKD2L1 est exclusivement localisé au niveau du compartiment somato-dendritique.
L’immunoréactivité contre PKD2L1 et la GFP révèlent la présence d’élargissements au niveau de la neurite (triangles). La
ligne en pointillé délimite le canal central.

142
Résultats

L’étude du trajet de ces axones-like a révélé que ces prolongements s’étendent tout d’abord

ventralement dans le parenchyme sur de courtes distances puis entrent dans le tissu. Puisque

les études précédentes réalisées sur la moelle épinière de rat adulte ont mis en évidence la

présence de faisceaux axonaux pouvant provenir des NcLCR et s’étendant de manière

tangentielle à l’axe du canal central le long de la fissure ventro-médiane (Stoeckel et al., 2003),

nous avons réalisé un marquage anti-GFP sur coupes horizontales de moelle épinière. En accord

avec les résultats de Stoeckel et collaborateurs, nous avons observé des faisceaux axonaux GFP +

qui pourraient être issus des cellules PKD2L1+ et localisés de part et d'autre de la fissure ventro-

médiane (Figure 27. D). Enfin, le marquage de PKD2L1 sur coupes sagittales de tronc cérébral

de souris PKD2L1:EGFP+ a révélé que la protéine PKD2L1 est seulement exprimée au niveau du

compartiment somato-dendritique et qu'au niveau du prolongement de type axonal aucune

immunoréactivité n'est observée (Figure 27. E).

Pour examiner plus finement la polarité des NcLCR-S, le marquage MAP2 et NF160 a

été reproduit sur des coupes sagittales de tronc cérébral de souris PKD2L1:EGFP+. Les résultats

confirment que la neurite qui projette vers le canal central est positivement marquée contre

MAP2 (Flèche, Figure 28. A) mais ne présente pas d’immunoréactivité pour NF-160 (Flèche,

Figure 28. B) tandis que les prolongements de type axonal sont immunonégatifs pour MAP2

(triangles blancs, Figure 28. A). Bien que ces prolongements dans le parenchyme ne soient pas

marqués par l’anticorps anti-MAP2, ils ne sont pas non plus révélés par l’utilisation de

marqueur axonal tel que NF-160 (triangles blancs, Figure 28. B, voir partie immaturité). De ce

fait, ces expériences immunohistochimiques n’ont pas permis de confirmer la nature axonale de

ce prolongement. Toutefois, comme ces prolongements ont une morphologie de type axonal et

n’expriment pas de marqueurs dendritiques, nous appellerons ces prolongements des fibres

"axone-like".

143
Résultats

A1 B1
GFP MAP2 Superposition GFP NF-160 Superposition

10 µm 10 µm

A2 B2
GFP MAP2 Superposition GFP NF-160 Superposition

10 µm 10 µm

FIGURE 28. LES NCLCR PROJETTENT UNE DENDRITE VERS LE CANAL CENTRAL ET UNE FIBRE DE TYPE AXONAL DANS LE
PARENCHYME. A1 et 2, Immunomarquage des NcLCR-S contre GFP (vert) et MAP2 (rouge) dans deux coupes sagittales de
tronc cérébral distinctes obtenues d’animaux PKD2L1:EGFP+. L’immunoréactivité anti-GFP (à gauche en A1 et A2 et voir
aussi B1 et B2) révèle la morphologie complète des NcLCR-S avec l’émission du côté apical d’une neurite projetée vers le
canal central et finie par un bud et du côté basal, l’émission d’une fibre de type axonal dans le parenchyme. La
superposition des images (à droite) montrent que la neurite est immunoréactive pour MAP2 tandis que la fibre projetée
dans le parenchyme ne l’est pas. Ces images permettent également de visualiser une structure ciliée au niveau du bud en
A1, B1 et B2. B1 et B2, Immunomarquage des NcLCR-S contre GFP (vert) et NF-160 (rouge) dans deux coupes sagittales de
tronc cérébral distinctes obtenues d’animaux PKD2L1:EGFP+. L’absence de marquage de NF-160 dans la neurite MAP2+
confirme la nature dendritique de ce prolongement. Le marquage NF-160 est observé dans le parenchyme et permet de
visualiser de nombreuses fibres. Cependant, les superpositions des images (à droite) montrent que les fibres émises à partir
du corps cellulaire des NcLCR-S dans le parenchyme ne sont pas marquées par l’anticorps anti-NF-160. Flèche :
prolongement neuritique apical (dendrite). Triangle blanc : fibre de type axonal.

144
Résultats

Au niveau spinal, la présence d’un cil sur le bud des NcLCR a été mise en évidence chez

différentes espèces (Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Stoeckel et al., 2003; Vígh et al., 2004;

Marichal et al., 2009; Alfaro-Cervello et al., 2012), mais la nature de ce cil, primaire ou mobile n’a

pas été démontrée. Afin de répondre à cette question, un double immunomarquage PKD2L1/α-

tubuline acétylée (α-Tub. Ac.), sur coupes coronales de moelle épinière cervicale et de tronc

cérébral, a été réalisé. L‘α-Tub. Ac. est un constituant des filaments de microtubule des cils et

permet donc le marquage des cils primaires et mobiles. La figure 29 montre que le marquage

anti- α-Tub. Ac. marque fortement d’une part les NcLCR-S PKD2L1+ (étoiles) révélant ainsi leur

morphologie et d’autre part de nombreuses structures ciliées localisées autour du canal central

(Figure 29. A). A plus fort grossissement, les résultats montrent la présence de cils bordant la

surface du canal central correspondant vraisemblablement aux cils mobiles des épendymocytes

(Figure 29 a et c). Une observation plus fine des NcLCR-S PKD2L1+ suggère la présence de

structures ciliées α-Tub. Ac.+ sur leur bud (triangles blancs, Figure 29 b et d) et qui apparaissent

négatives pour PKD2L1. Ces résultats sont confirmés par ceux obtenus lors du marquage anti-

GFP, où ces structures ciliées peuvent également être visualisées sur le bud (Figure 29. B). Il

convient de noter que le marquage GFP semble indiquer qu'il y ait plusieurs structures ciliées

sur le bud, plus précisément, il apparait que deux cils soient présents à ce niveau.

Puisque l’adénylate cyclase de type 3 (AC3) est un marqueur connu et sélectif des cils primaires

(Bishop et al., 2007), nous avons réalisé un co-marquage AC3/GFP sur coupes coronales de tronc

cérébral de souris PKD2L1:EGFP afin de déterminer si le cil présent sur le bud est un cil

primaire (Figure 29. C). Les résultats obtenus montrent la présence de petits bâtonnets AC3+

dans le parenchyme et autour du canal central à tous les niveaux étudiés (Figure 29. C). La

figure 29. D illustre des NcLCR-S GFP+ représentatifs avec un cil AC3+ observé au niveau du

soma (triangles blancs) mais pas sur le bud (triangles). Nous avons observé ces cils primaires

sur le soma de tous les NcLCR-S GFP+ analysés. Ces cils ont une longueur moyenne de 3,4 ± 0,2

µm (n = 153) et un diamètre inférieur au micromètre.

Ces résultats montrent l'existence de multiple stuctures ciliées sur le bud, qui ne

correspondent vraissemblablement pas à un cil primaire, qui lui se situe sur le corps cellulaire

des NcLCR-S bulbo-spinaux.

145
Résultats

A Niveau 1 Niveau 2

PKD2L1/α tub. Ac PKD2L1/α tub. Ac


a c

*
5 µm
b
* d c
* b d *
* *
a
10 µm

B
EGFP

5 µm

C Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3


EGFP/AC3

20 µm

EGFP/AC3

10 µm

FIGURE 29. LES NcLCR PKD2L1+ POSSEDENT UNE STRUCTURE CILIEE SUR LE BUD ET UN CIL PRIMAIRE SUR LE SOMA. A,
Immunomarquages réalisés sur coupes de niveaux 1 et 2, dirigés contre PKD2L1 (vert) pour identifier les NcLCR-S et contre
l’α-tubuline acétylée (α-tub. Ac, rouge), un marqueur sélectif du cytosquelette constituant les structures ciliées. La
superposition des images montre que le soma (étoile), la dendrite et le bud des NcLCR-S PKD2L1+ sont marqués par l’ α-
tub. Ac et révèle également la présence d’une grande densité de cils dans la lumière du canal central provenant, pour la
plupart, certainement des cellules épendymaires. Aa à d, A un plus fort grossissement les cils α-tub. Ac+ peuvent être
observés dans la lumière du canal central (a : niveau 1 ; c : niveau 2), de plus de petits appendices similaires aux cils peuvent
également être visualisés au niveau du bud (b : niveau 1 ; d : niveau 2, triangles blancs). B, Images à plus fort grossissement
de bud provenant de souris PKD2L1:EGFP+ et immunomarquées pour GFP, indiquant la présence de structure de type cilié
au niveau du bud (triangles blancs). C, Coupes coronales provenant de souris PKD2L1:EGFP+ montrant le résultat de co-
marquage GFP (vert) et AC3 (rouge). Nous pouvons noter la présence de marquage AC3 sur les NcLCR GFP+ mais
également au sein du parenchyme (images du haut). En bas, images à plus fort grossissement montrant la présence de cils
AC3+ (triangles) sur le soma des NcLCR-S GFP+. Il n’y a pas d’immunoréactivité AC3 sur le bud bien que des structures
ciliées GFP+ y soient présentes (triangles blancs).

146
Résultats

L’ensemble de cette étude morphologique a permis de révéler que les NcLCR PKD2L1+

sont présents tout le long du canal central et qu’ils présentent une position exclusivement sous-

épendymaire (NcLCR-S). Leur morphologie est homogène et caractéristique de la morphologie

classique des neurones de contact bulbo-spinaux, avec une dendrite projetée vers le canal

central qui finit par une protubérance ou bud sur laquelle on peut observer plusieurs structures

ciliées qui ne sont pas primaires. Par contre, ces cellules présentent un cil primaire AC3 + qui est

observé sur le corps cellulaire des NcLCR-S. De plus, ces cellules présentent une forte

expression de PKD2L1 avec une localisation somato-dendritique exclusive. Les cellules

immunoréactives pour PKD2L1 sont essentiellement des NcLCR-S, ce qui fait de cette protéine

un marqueur spécifique de cette population neuronale. L’analyse de la distribution des NcLCR-

S PKD2L1+ de la moelle épinière au tronc cérébral indique que leur densité diminue le long de

l’axe caudo-rostral. Enfin, la position de ces cellules autour du canal central ainsi que la

longueur de leur dendrite changent également le long de cet axe.

147
Résultats

B. CARACTERISATION PHENOTYPIQUE ET FONCTIONNELLE DES NcLCR

PKD2L1+ DU TRONC CEREBRAL

La deuxième partie de cette étude s’intéresse à la caractérisation phénotypique et

fonctionnelle des NcLCR-S PKD2L1+ chez la souris adulte afin de répondre à trois questions

majeures :

 Quel est le phénotype de ces neurones ?

 Sont-ils intégrés dans un réseau synaptique ?

 La présence de PKD2L1 a-t-elle un impact sur la fonction des NcLCR-S PKD2L1+

1. LES NcLCR PKD2L1+ SONT GABAERGIQUES

Des études précédentes ont montré que chez le rongeur, les NcLCR spinaux sont

GABAergiques (Barber et al., 1982; Stoeckel et al., 2003; Marichal et al., 2009). Afin de déterminer

le phénotype des NcLCR-S bulbo-spinaux, un double marquage GABA/GFP a été réalisé sur

des coupes coronales de tronc cérébral et de moelle épinière d’animaux PKD2L1:EGFP+. Les

résultats indiquent qu’une grande partie des NcLCR-S EGFP+ du tronc cérébral sont marqués

pour le GABA (86 ± 3 % de cellules GABA+ et GFP+ ; 124 cellules GABA+ sur les 140 NcLCR-S

GFP+ ; Figure 30. A1). Des résultats similaires ont été observé pour les NcLCR-S du niveau 1,

avec 118 cellules GABA+ sur les 131 NcLCR-S GFP+ (Figure 30. A2). De plus, en considérant

l’ensemble des niveaux, nous avons trouvé que 88 ± 2 % des NcLCR-S GFP+ sont marqués par

l’anticorps anti-GABA (242 cellules GABA+ sur les 271 NcLCR-S GFP+).

Afin de confirmer le phénotype GABAergique des NcLCR-S PKD2L1+, un double

marquage PKD2L1/GAD67 a été réalisé dans les différents niveaux bulbo-spinaux. La figure 30.

B illustre que 78 ± 3 % des NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral co-expriment l’enzyme GAD67

(286 cellules GAD67+ sur les 356 NcLCR-S PKD2L1+ ; Figure 30. B1 pour le niveau 3). La même

analyse réalisée dans le niveau 1 (Figure 30. B2) montre que 86 ± 2 % des NcLCR-S PKD2L1+

spinaux sont GAD67+ (210 cellules GAD67+ sur les 250 NcLCR-S PKD2L1+). Enfin, tous niveaux

confondus, l’analyse de ces résultats immunohistochimiques indique que 79 ± 2 % des NcLCR-S

bulbo-spinaux sont PKD2L1+ et GAD67+ (niveau 1-4 : 577 cellules GAD67+ sur les 733 NcLCR-S

PKD2L1+). Dans ces cellules le marquage GAD67+ délimite le soma et le bud des NcLCR-S

PKD2L1+ (triangles blancs ; Figure 30. B). De plus, les résultats montrent la présence d’un

148
Résultats

marquage GAD67+ de type punctiforme, retrouvé sur l’ensemble de la coupe pour chaque

niveau analysé et également proche ou au contact du soma des NcLCR-S PKD2L1+ (Figure

30.B). La sélectivité des marquages GABA/GAD67 a été confirmée par la présence de cellules

GABA+ et GAD67+ dans des régions cérébrales connues pour être GABAergiques : la corne

dorsale de la moelle épinière, le noyau du tractus solitaire et le cervelet (résultats non montrés).

De plus nous avons vérifié que les cellules GABA+ sont également immunoréactivent pour la

GAD67 (résultats non montrés), et nous avons trouvé que 95 ± 2 % des cellules GABA+

localisées autour du canal central sont aussi GAD67+ (175 cellules GAD67+/GABA+ sur les 183

cellules GABA+ ; résultats non montrés).

Enfin, ces résultats montrent que même si la grande majorité des NcLCR-S PKD2L1+ sont

GABAergiques, environ 15 % sont GABA/GAD67 négatifs. Nous avons donc recherché quel

pouvait être le phénotype de ces neurones. Cependant, aucun des NcLCR-S PKD2L1+ ne

semblent être sérotoninergiques (5-HT ; Figure 30. C), ni catécholaminergiques (TH ; Figure 30.

D). Ces 15 % de NcLCR-S PKD2L1+ non GABAergiques ne semblent pas non plus être

cholinergiques puisque qu’il n’y a pas de co-expression de PKD2L1 avec l’EGFP observée dans

les coupes de tronc cérébral provenant de souris ChAT:EGFP (Figure 30. E).

Ces résultats indiquent que les NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral, tout comme ceux

de la moelle épinière, sont majoritairement GABAergiques. De plus, il apparait que ces

neurones sont entourés de terminaisons GAD67+. Enfin, de nombreuses fibres cholinergiques et

monoaminergiques sont en contact étroit ou apposées contre le corps cellulaire des NcLCR-S

PKD2L1+.

149
Résultats

A1 Niveau 2 A2 Niveau 1
GFP GABA Superposition GFP GABA Superposition

20 µm 20 µm

B1 Niveau 3 B2 Niveau 1
PKD2L1 GAD67 Superposition PKD2L1 GAD67 Superposition

20 µm 20 µm

C PKD2L1/5-HT D PKD2L1/TH E PKD2L1/ChAT-EGFP

10 µm 20 µm 10 µm

FIGURE 30. LES NcLCR PKD2L1+ SONT GABAERGIQUES ET EN CONTACT ETROIT AVEC DES FIBRES GABAERGIQUES,
CHOLINERGIQUES ET AMINERGIQUES. A1, Co-marquage de NcLCR-S avec des anticorps anti-GFP (gauge, vert) et anti-GABA
(milieu, rouge) dans une coupe coronale de tronc cérébral (niveau 2). La superposition des images montre la présence
d’immunoréactivité pour GABA et GFP et indique que les NcLCR-S GFP+ sont aussi positifs pour le GABA (triangles
blancs). A2, Des résultats similaires ont été également observés dans les coupes au niveau 1 où les NcLCR GFP + (gauche,
vert) spinaux sont aussi marqués par l’anticorps anti-GABA (milieu rouge et droite, superposition). B1, Co-marquage de
NcLCR-S avec des anticorps anti-PKD2L1 (gauche, vert) et anti-GAD67 (milieu, rouge) dans une coupe coronale de tronc
cérébral (niveau 3). La superposition des images (droite) indique que la plupart des NcLCR-S PKD2L1+ sont aussi GAD67+
(triangles blancs). B2, De même, des résultats similaires ont été également observés dans les coupes au niveau 1 où les
NcLCR-S spinaux co-expriment PKD2L1 et GAD67. Il convient de constater que le marquage GAD67 est présent dans le
cytoplasme des NcLCR-S (triangles blancs en B1 et 2) mais également dans le parenchyme. L’immunomarquage contre 5-HT
(C, rouge) et TH (D, rouge) montre que les NcLCR-S PKD2L1+ (vert) du tronc cérébral ne sont ni sérotoninergiques ni
catécholaminergiques. E, Marquage à l’aide d’anticorps anti-PKD2L1 de coupe coronale de tronc cérébral provenant de
souris adultes choline acétyltransférase (ChAT):EGFP qui indique que les NcLCR-S PKD2L1+ (rouge) ne sont pas
cholinergiques (vert). Nous pouvons observer que les NcLCR-S PKD2L1+ sont en contact étroit avec des fibres
sérotoninergiques (C), catécholaminergiques (D) et cholinergiques (E) (flèches).

150
Résultats

2. LES NcLCR PKD2L1+ EXPRIMENT DIVERS RECEPTEURS IONOTROPIQUES

FONCTIONNELS

Les précédents résultats indiquent que des fibres GABAergiques, sérotoninergiques et

monoaminergiques sont en contact étroit avec les NcLCR-S PKD2L1+, ce qui laisse suspecter la

présence de contacts synaptiques. Afin de mettre en évidence la présence et la nature des

afférences synaptiques des NcLCR-S PKD2L1+, nous avons tout d’abord testé l’effet de

l’application par pression de plusieurs neurotransmetteurs à action rapide, afin de caractériser

l’expression de récepteurs ionotropiques fonctionnels dans ces neurones. Dans un deuxième

temps, nous avons identifié la nature de la transmission synaptique observée. Les résultats

obtenus proviennent d’enregistrements électrophysiologiques sur tranche de tronc cérébral

d’animaux PKD2L1:EGFP en configuration cellule entière et en mode voltage imposé (Vh, -80

mV) ou courant imposé.

a) Récepteurs GABA-A et gylcinergiques

Une précédente étude chez le rat, a montré que les NcLCR spinaux présentent un

courant induit par l’application de GABA exogène et porté par le récepteur ionotropique au

GABA (type A) perméable au chlore : R-GABA-A (Marichal et al., 2009). De plus, le marquage

ponctiforme GAD67+ observé autour des NcLCR au cours de notre étude immunohistochimique

(Figure 30. B) supporte cette hypothèse. Nous avons donc recherché dans un premier temps la

présence de R-GABA-A fonctionnels dans les NcLCR-S du tronc cérébral grâce à l’application

par pression de GABA (1 mM, 50 ms).

Au potentiel de maintien de -80 mV, l’application par pression de GABA induit dans tous les

neurones testés un large courant entrant dont l’amplitude moyenne au pic est de -3,3 ± 0,5 nA

(voir un exemple, en haut à gauche, Figure 31. A ; n = 7 ; ECl = 2 mV).

La relation courant/voltage du courant GABA enregistré, déterminée à des potentiels de

maintien (Vh) variant entre -80 à + 20 mV (incrément de 20 mV), indique que le potentiel de

réversion (Erev, GABA ) du courant GABA est égal à de -11 ± 7 mV (n = 4 cellules) lorsque le

potentiel d’inversion des ions chlorures (ECl) est fixé à +2 mV, tandis qu'il est moins dépolarisé

et égal à -38 ± 9 mV lorsque ECl est fixé à -49 mV (n = 2 cellules ; milieu intracellulaire

d’enregistrement : KGlu). Ces résultats montrent que le courant GABA s'inverse pour des

151
Résultats

potentiels de membrane proche de la valeur calculée pour le potentiel d’équilibre du chlore

(ECl). De plus, comme indiqué par la figure 31. B, le courant GABA est rapidement inhibé à 94 ±

1 % par la perfusion de 10 µM de gabazine (n = 3), un antagoniste des R-GABA-A (En bas à

droite, Figure 31. B).

Par une approche similaire, nous avons recherché la présence de récepteurs de la glycine sur les

NcLCR. Les cellules ont été enregistrées en présence de gabazine (10 µM) et d’acide

kynurénique (1 mM). L’application par pression de glycine (1 mM, 100 ms) sur les NcLCR

entraine un courant entrant dans l’ensemble des cellules testées dont l’amplitude moyenne est

de -174 ± 45 pA (n = 7 ; Vh, -80 mV). La relation courant/voltage de la réponse glycine indique un

potentiel d’inversion moyen de -27 ± 3 mV (n = 5) proche de ECl, fixé à -34 mV (voir un exemple

figure 32. A). Ces résultats vont dans le sens d’un courant glycine porté par les ions chlorures,

une hypothèse confirmée par le fait que le courant, induit par l’application de glycine, est

totalement bloqué par 10 µM de strychnine, un antagoniste compétitif des récepteurs

glycinergiques (Voir un exemple figure 32. B ; inhibition à 86 ± 4 % ; 5/5 cellules testées).

L’ensemble de ces résultats nous permet de conclure que les NcLCR expriment des

récepteurs GABA-A et glycinergiques fonctionnels.

152
Résultats

A
GABA, 1 mM Amplitude du courant au pic, nA
20 mV
E Cl = + 2 mV 3
I GABA

1
Vh ,mV
1 nA -60 -20 20
-1
1s

-80 mV GABA -3
+20 E rev,GABA = -22 mV

Vh, mV r = 0,994
-80 -5

B
GABA, 1 mM Gabazine, 10 µM
0,0
1
Amplitude au pic (nA)

-0,5 3

-1,0
0,5 nA
400 ms -1,5 2
2
-2,0
1
-2,5
0 1 2 3 4 5
3 Temps (min)

FIGURE 31. LES NcLCR EXPRIMENT DES RECEPTEURS GABA-A FONCTIONNELS. A, Tracés représentatifs du courant enregistré
entre -80 mV et +20 mV (incréments de 20 mV) dans un NcLCR suite à l’application par pression de GABA (1 mM, 50 ms;
flèche). A droite, graphique de la relation intensité/potentiel obtenue à partir des traces courant à gauche. La droite
représente la relation linéaire obtenue en utilisant la fonction suivante : Amplitude = aVoltage + b assujettie aux données
expérimentales. Le point d’intersection de la droite avec l’axe des abscisses permet de calculer un potentiel d’inversion de -
22 mV (Erev) pour le courant enregistré alors que le potentiel d’équilibre du chlore est de +2 mV (E Cl = 2 mV, milieu
intracellulaire d’enregistrement : KCl). B. L’application de 10 µM de gabazine (barre noire sur le graphique à droite)
entraîne la disparition du courant induit à -80 mV par l’application de GABA (1 mM, 50 ms; flèche).

153
Résultats

A
Gly, 100 ms Amplitude du courant au pic, nA
-10 mV E Cl = -34 mV I Gly 0,2

0,1

0,0
-80 -60 -40 -20
-0,1

-0,2
0,1 nA
Gly
-10 0,2 s E rev,Gly = -18 mV -0,3

-80 mV Vh, mV r = 0,993 -0,4


-80

B + Strychnine, 10 µM
Gly, 1mM Gly, 1 mM

Vh, -80 mV

20 pA

0,2 s

FIGURE 32. LES NcLCR EXPRIMENT DES RECEPTEURS A LA GLYCINE FONCTIONNELS. A, Tracés représentatifs du courant
enregistré entre -80 mV et -10 mV (incréments de 10 mV) dans un NcLCR suite à l’application par pression de Glycine (1
mM, 100 ms; flèche). A droite, graphique de la relation intensité/potentiel obtenue à partir des traces courant à gauche. La
droite représente la relation linéaire obtenue en utilisant la fonction suivante : Amplitude = aVoltage + b assujettie aux
données expérimentales. Le point d’intersection de la droite avec l’axe des abscisses permet de calculer un potentiel
d’inversion de -18 mV (Erev, Gly) pour le courant enregistré alors que le potentiel d’équilibre du chlore est de -34 mV (ECl = -34
mV, milieu intracellulaire d’enregistrement : KGlu). B, L’application de 10 µM de strychnine (trace de droite) entraîne la
disparition du courant induit à -80 mV par l’application de Glycine (1 mM, 100 ms, flèche, Trace de gauche).

154
Résultats

b) Récepteurs cholinergiques de type nicotinique mais pas de récepteur à l'ATP ni de récepteur

5-HT3

Les résultats immunohistochimiques obtenus sur les coupes coronales de tronc cérébral

de souris ChAT:EGFP+ laissent suspecter la présence de fibres en contact avec les NcLCR-S

PKD2L1+ (Figure 30). Pour vérifier si ces neurones pouvaient être sensibles à l'acétylcholine

(ACh), nous avons tout d'abord recherché si les NcLCR-S PKD2L1+ expriment des récepteurs

cholinergiques de type nicotinique fonctionnels. L’application par pression d’ACh (1 mM ; 5 s)

en présence de 1 µM d’atropine, un antagoniste sélectif des récepteurs muscariniques, induit un

courant entrant de -34 ± 4 pA accompagné d'une augmentation du bruit membranaire (n = 20

sur 20 cellules testées) à -80 mV (Figure 33. A). Ce courant et ce bruit sont entièrement bloqués

par l’application de 10 µM de d-tubocurarine, un antagoniste compétitif des récepteurs

nicotiniques de l’acétylcholine (Figure 33. A; 73,7 ± 12,6 % d'inhibition après 6-9 min

d'application de la drogue dans le bain; n = 4)

Dans la moelle épinière, des études réalisées sur les NcLCR spinaux chez le rat ont

montré la présence de récepteurs purinergiques de type P2X2 (Stoeckel et al., 2003) à l'origine

d'un courant entrant rapide suite à l'application d'ATP (Marichal et al., 2009). Nous avons donc

testé l'effet sur les NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral de l'application par pression d'ATP (100

µm; 1-5 s ; n = 3), un agoniste des récepteurs P2X2. Cependant, contrairement aux résultats

obtenus sur les NcLCR spinaux, dans nos conditions expérimentales, aucune variation de

courant n’a été observée suite à l'application d'ATP (Figure 33.B, tracé de gauche). Pour écarter

la possibilité que l'absence de réponse soit due à l'hydrolyse rapide de l'ATP dans la tranche,

nous avons ensuite testé l'effet du 2-MeSATP, un analogue non hydrolysable de l'ATP. Malgré

cela, l'application par pression du 2-MeSATP (100 µM ; 1-5 s ; n = 3), n'induit aucune réponse

dans l'ensemble des NcLCR-S enregistrés (Figure 33.B, tracé de droite). Enfin, pour s'assurer de

l'efficacité des drogues testées : ATP et 2-MeSATP, nous avons testé l'application de ces

composés sur les neurones du noyau moteur du nerf vague (DMNX), présents dans les mêmes

tranches de tronc cérébral et qui expriment des récepteurs purinergiques fonctionnels

(Nabekura et al., 1995). Ces applications induisent un courant entrant autour de -60 pA dans les

cellules testées (résultat non illustré).

155
Résultats

A
+ dTubocurarine, 100 µM
ACh, 100 µM
ACh, 100 µM ACh, 100 µM

3 6
min min 10 pA
0,4 s

dTubocurarine, 100 µM
Amplitude moyenne au pic, pA

-10

-20

-30
(n = 4)
-40
0 5 10 15 20
Temps (min)

B
ATP, 100 µM
Vh, -80 mV 2-MeSATP, 100 µM

20 pA
1s

FIGURE 33. EFFETS DE L’ACETYLCHOLINE ET DE L’ATP SUR LES NCLCR. A, Trace courant d’un NcLCR enregistré à -80 mV
suite à l’application par pression d’acétylcholine (ACh, 1 mM, 5 s toutes les 3 minutes) en présence d’atropine, 1 µM.
L’application de dTubocurarine, 100 µM (trace à droite) entraîne la disparition du courant induit par l’ACh. Le graphique
en bas illustre la diminution en fonction du temps de l’amplitude moyenne du courant induit par l’ACh en présence de
dTubocurarine, 100 µM (n = 4). B, Traces courant d’un NcLCR enregistré à -80 mV suite à l’application par pression d’ATP
(100 µM, 5 s ; à gauche) ou de 2-MeSATP (100 µM, 5 s ; à droite), montrant l’absence de récepteurs P2X2 fonctionnels
exprimés par les NcLCR-S. En A et B, enregistrements avec le milieu intracellulaire KCl, ECl = 2mV.

156
Résultats

Enfin, la présence de fibres sérotoninergiques apposées sur le corps cellulaire des

NcLCR-S observées lors du double marquage PKD2L1/5-HT (Figure 30) laisse également

suspecter la présence de modulation par ce neurotransmetteur. L’application par pression de 5-

HT (1 mM ; 1-10 s ; milieu intracellulaire d’enregistrement : KCl) n’induit pas de réponse

rapide, pas plus que des variations de l’émission de potentiels d’actions (PA) dans les NcLCR-S

(n = 4 ; résultat non illustré).

L’ensemble de ces résultats montrent que les NcLCR-PKD2L1+ du tronc cérébral

possèdent des récepteurs ionotropiques fonctionnels pour l’ACh mais pas pour l’ATP ou la 5-

HT. Ici nous avons recherché des effets rapides des neurotransmetteurs médiés par des

récepteurs ionotropiques, aussi, nous ne pouvons pas exclure l'existence de récepteurs

métabotropiques pour la 5-HT, l'ATP, l'ACh ou le GABA.

c) Réponse atypique au glutamate

Comme illustrée par la figure 34. A, l’application de glutamate 100 µM pendant 1 s,

induit à – 80 mV, un courant entrant de -23,2 ± 2,6 pA (n = 18) Ce courant se développe

lentement, présente peu de désensibilisation en réponse à des applications répétées, et un retour

lent (10 s). Ce courant est diminué de manière non significative par l’ajout de 1 mM d’acide

kynurénique, un bloqueur classique des récepteurs glutamatergiques ionotropiques, dans le

milieu de perfusion (-19,4 ± 2,9 pA ; p > 0,099 vs. contrôle ; n = 14 ; voir un exemple Figure 34. A

et histogramme en C). Ceci suggère que le courant glutamatergique observé dans notre étude

n’est pas porté par les récepteurs glutamatergiques ionotropiques ou qu'il est porté par des

récepteurs ionotropiques résistants à l'action de l'acide kynurénique. Le potentiel d’inversion de

courant a été déterminé dans 8 cellules et est en moyenne de -12 ± 3 mV (Figure 34. B). Le

développement du courant en fonction du temps est relativement lent ce qui laisse penser que

les récepteurs métabotropiques (R-mGlu) pourraient être impliqués. Pour tester cette

hypothèse, nous avons testé l’effet du MSOP (100 µM) un antagoniste sélectif des R-mGlu du

groupe III et du MCPG (500 µM) un antagoniste non sélectif des R-mGlu du groupe I et II.

Toutefois, la présence de ces drogues dans le milieu de perfusion ne modifie pas la réponse à

l’application par pression de glutamate (MSOP : -18,1 ± 4,4 pA ; n = 5 ; MCPG : -19,2 ± 4,4 pA ; n

= 5 ; Figure 34. C).

157
Résultats

A B
Contrôle Amplitude moyenne au pic, pA
Vh, -80 mV 40
Glutamate, 100 µM

Erev = -12 3 mV
20
r = 0,978
20 pA
Vh, mV
2s
Acide kynurénique, 1 mM -80 -40 40 80
Glutamate, 100 µM
-20

-40

C -30
Amplitude moyenne
au pic, pA

-20

-10

D E Contrôle Ac. kynurénique


Kaïnate, 100 µM
ns
ns
-40
Amplitude moyenne

AMPA, 100 µM Vh, -80 mV


-30
au pic, pA

-20
NMDA, 100 µM
Vh, -60 mV
-10
20 pA
0
1s AMPA Kaïnate

FIGURE 34. EFFETS DU GLUTAMATE SUR LES NCLCR. A, Trace courant d’un NcLCR enregistré à -80 mV suite à l’application
par pression de glutamate (100 µM, 1 s) en contrôle (en haut à gauche) et en présence d’acide kynurénique, 1 mM (en bas à
gauche). B, relation intensité/potentiel moyenne du courant enregistré suite à l’application de glutamate et déterminée dans
8 cellules. La droite représente la relation linéaire moyenne obtenue en utilisant la fonction suivante : Amplitude = aVoltage
+ b assujettie aux données expérimentales. Le potentiel d’inversion moyen (Erev), pour les courants enregistrés, est de -12 ± 3
mV. C, Histogramme résumant l’amplitude moyenne de courant induit par l’application de glutamate (100 µM, 1 s) en
condition contrôle (barre noire ; n = 18), een présence de 1 mM d’acide kynurénique (Ac. kynurénique, barre gris foncé ; n
=14), de 100 µM de MSOP (barre gris clair ; n = 5) et de 500 µM de MCPG (barre blanche ; n = 5). Les données obtenues en
présence de chacune de ces drogues ont été comparé aux valeurs de courant contrôle montrant l’absence de différence
significative (p > 0,005). Le courant induit par l’application de glutamate est donc insensible à l’acide kynurénique et aux
bloqueurs des récepteurs glutamatergiques de type métabotropique : MSOP ou MCPG. D, Traces de courant
représentatives, enregistées en mode voltage imposé, en réponse à l’application par pression de Kaïnate (100 µM, 1 s ; Vh = -
80 mV), d’AMPA (100 µM, 1 s ; Vh = -80 mV) et de NMDA (100 µM, 1 s ; Vh = -60 mV). E, Histogrammes résumant
l’amplitude moyenne courant induit par l’application d’AMPA (barres de gauche, n = 7) ou de Kaïnate (barres de droite, n =
3) en condition contrôle (barres noires) ou en présence de 1 mM d’acide kynurénique ((barres blanches). Nous pouvons
noter que ces applications induisent des courants qui sont diminués en présence d’acide kynurénique, mais de manière non
significative (p > 0,05) ce qui témoigne d’une faible sensibilité des récepteurs impliqués à cette drogue. Enregistrements avec
le milieu intracellulaire KCl, ECl = 2 mV.

158
Résultats

Nous avons donc testé indépendamment les différents sous types d’agonistes

spécifiques de chacun des trois récepteurs ionotropiques. Ainsi, l’application par pression de

Kaïnate (100 µM ; 1 s) et d’AMPA (100 µM ; 1 s) induit un courant entrant à – 80 mV dans toutes

les cellules testées (Kaïnate : -32,7 ± 3,2 pA ; n = 3 ; AMPA : -32,9 ± 7,4 pA ; n = 6 ; Figure 34. D et

E). Par contre, l’application par pression de NMDA (100 µM ; 1 s) n’induit pas de réponse dans

les NcLCR du tronc cérébral (n = 5 ; Figure 34. D) même a des potentiels de maintien plus

dépolarisés permettant de lever le bloc magnésium. Les courants induits par l’application

d’AMPA ou de Kaïnate sont diminués par l’acide kynurénique mais là encore, de manière non

significative (AMPA : -32,9 ± 7,4 pA n = 3 en condition contrôle vs. -19,7 ± 2,8 pA en présence

d’acide kynurénique, n = 8 ; Kaïnate : -32,7 ± 3,2 pA ; n = 3 en condition contrôle vs. -22,5 ± 2,4 en

présence d’acide kynurénique ; n = 3).

Ces résultats suggèrent que les NcLCR-S du tronc cérébral présentent des réponses au

glutamate atypiques portées par des récepteurs AMPA et Kaïnate faiblement sensibles à l'acide

kynurénique.

Le tableau ci-dessous résume l’ensemble des résultats obtenus dans cette première partie.

Neurotrans-
GABA Glycine ACh Glu AMPA Kaïnate NMDA ATP 5-HT
metteur

Amplitude
moyenne, -3467 -174 -34 -23 -33 -33 0 0 0
pA
% cellules
100 100 60 100 100 100 0 0 0
réactives
Ac.
Antagoniste Ac. Ac.
kynu-
testé Gabazine Strychnine dTC kynu- kynu-
rénique / / /
(Inhibition, (94 ± 1) (86 ± 4) (74 ± 13) rénique rénique
MSOP
%) (40 ± 14) (31 ± 2)
MGPG
MIC KCl KGlu KCl KCl KCl KCl KCl KCl KCl

TABLEAU 15 : SENSIBILITE DES NcLCR AUX DIFFERENTS NEUROTRANSMETTEURS A ACTION RAPIDE.

Connaissant les récepteurs fonctionnels présents sur les NcLCR-S médullaires, nous

nous sommes ensuite intéressés à la mise en évidence de leur implication dans l’activité

synaptique spontanée enregistrée préalablement.

159
Résultats

3. LES NCLCR PKD2L1+ DU TRONC CEREBRAL SONT INTEGRES DANS UN RESEAU

SYNAPTIQUE

Pour identifier la nature des afférences synaptiques innervant les NcLCR-S du tronc

cérébral, nous avons réalisé des enregistrements en configuration cellule entière et en mode

voltage imposé (Vh, -80 mV) en condition contrôle et en présence d’antagonistes sélectifs des

récepteurs ionotropiques mis en évidence.

a) Présence d'afférences synaptiques GABAergiques et glycinergiques

Comme nous l’avons vu précédemment, l’enregistrement en mode voltage imposé à -80

mV des NcLCR-S révèle la présence de courants entrants similaires à de l’activité synaptique

spontanée (Figure 25. D). Cette activité spontanée est de faible fréquence (0,5 ± 0,1 Hz ; n = 11).

A -80 mV, le courant synaptique enregistré avec un milieu intracellulaire de KCl (ECl fixé à 2

mV) à une amplitude moyenne de -44 ± 3 pA (amplitude minimale : -5 pA ; amplitude

maximale : -248 pA ; n = 7 cellules et 262 évènements), un temps de montée de 1,2 ± 0,1 ms et

une constante de temps de retour de 11,4 ± 2,1 ms (Tableau B Figure 35). Finalement ces

évènements synaptiques semblent être de nature GABAergique puisqu’ils sont bloqués par

l’ajout, dans le LCRa, de 10 µM de gabazine, un antagoniste des R-GABA-A (Figure 35. A).

Cependant, dans quelques cellules de rares courants synaptiques peuvent encore être

enregistrés en présence d’acide kynurénique et de gabazine. Afin de les caractériser, nous avons

utilisé un protocole classique d’induction d’événements synaptiques qui consiste à effectuer un

choc osmotique à l’aide d’une application locale d’une solution hypertonique (voir Méthodes).

En présence de 1 mM d’acide kynurénique et de 10 µM de gabazine, une situation bloquant les

récepteurs ionotropiques GABAergiques et glutamatergiques, l’application pendant 10 s d’un

LCRa hyper-osmotique induit une forte augmentation de la fréquence des évènements

synaptiques qui sont abolis par 10 µM de strychnine démontrant ainsi la nature glycinergique

de ces courants synaptiques (Figure 35. C, gauche ; n = 6). Ces évènements glycinergiques ont

une amplitude au pic moyenne de -27 ± 4 pA et une constante de temps de décroissance

moyenne de 3,6 ± 0,7 ms (Figure 35. D ; n = 6 cellules, 35-80 évènements par cellule).

160
Résultats

A B
Acide kynurénique
Vh, -80 mV
Fréquence, Amplitude,
Paramètre
Hz pA
20 pA
2s Valeur 0,5 44

SEM 0,1 3
20 pA
11 262
n
+ Gabazine, 10 µM 50 ms (traces) (évènements)

C Acide kynurénique + Gabazine Acide kynurénique + Strychnine

500 mM Sucrose 500 mM Sucrose

20 pA 20 pA

5s 5s

20 pA
+ Strychnine, 1 µM 100 ms + Gabazine, 10 µM

D E GABA Glycine
 = 13,6 ms  = 4,0 ms
Amplitude du courant, pA

-35 15
Constante de temps, ms

-25 10 pA
10
10 ms
-15 Courant normalisé au pic
5 **

-5 Glycine
0 0 GABA

FIGURE 35. LES NcLCR POSSEDENT DES RECEPTEURS SYNAPTIQUES FONCTIONNELS GABA-A ET GLYCINES. A, Activité
synaptique spontanée enregistrée en mode courant imposé à -80 mV en présence de 1 mM d’acide kynurénique, un
antagoniste à grand spectre des récepteurs glutamatergiques de type ionotropique. L’agrandissement temporel montre que
cette activité synaptique (trace du milieu) est bloquée par 10 µM de gabazine (trace du bas) et révèle ainsi sa nature
GABAergique. B, Tableau indiquant la fréquence et l’amplitude moyennes des évènements synaptiques spontanés
enregistrés dans les NcLCR. C, Au-dessus à gauche, en présence de 1 mM d’acide kynurénique et de 10 µM de gabazine afin

161
Résultats

de bloquer la transmission glutamatergique et GABAergique, l’application par pression d’un LCRa dans lequel 500 mM de
sucrose ont été ajoutés (10 s, barre grisée) induit à -80 mV une forte augmentation des évènements synaptiques. Trace du
milieu à gauche, illustre une partie de la trace du haut à plus fort agrandissement temporel et montre des courants
synaptiques entrant représentatifs. Trace du bas à gauche, cette activité synaptique induite par le sucrose est complètement
bloquée en présence de 10 µM de strychnine additionnée à l’acide kynurénique et à la gabazine. Trace du haut à droite, en
présence de 1 mM d’acide kynurénique, et de 1 µM de strychnine pour bloquer la transmission glutamatergique et
glycinergique, un protocole similaire que celui utilisé pour la trace de gauche (durée d’application : 30 s, barre grisée)
évoque une forte augmentation de l’activité synaptique comme il est visualisé sur le tracé du milieu (partie du tracé du haut
à plus fort agrandissement temporel ; Vh = -80 mV). Cette activité synaptique induite par le sucrose est complètement
bloquée par 10 µM de gabazine additionnée à l’acide kynurénique et à la strychnine. D, Histogramme de l’amplitude
(gauche) moyenne des courants GABA (barre noire ; n = 4) et glycine (barre blanche ; n = 6) et de la constante de temps
moyenne (droite). Dans chaque cellule la constante de temps a été obtenue en assujettissant une fonction mono-
exponentielle à la trace de courant moyen. ** : p < 0,01. E, Courants synaptiques moyens représentatifs de type
GABAergique (gauche) et glycinergiques (droite) sur lesquels sont représentés les fonctions mono-exponentielles (ligne
grise) obtenues par assujettissement et permettant le calcul de la constante de temps (τ). Traces du dessous, pour une
meilleure comparaison de la cinétique de retour entre les courants GABAergiques (noir) et glycinergiques (gris), les
courants montrés au-dessus ont été normalisés sur le pic d’amplitude du courant et superposés. A-B, Milieu intracellulaire
d’enregistrement : KCl, ECl = 2 mV. C-E, Milieu intracellulaire d’enregistrement : AcCs, ECl = -36 mV.

Afin de comparer les évènements GABAergiques et glycinergiques, nous avons analysé

les évènements GABAergiques induits dans les mêmes conditions d’enregistrement et avec le

même choc hyperosmotique (Figure 35. C, droite).

Les courants GABAergiques ont été isolés par l’ajout dans le LCRa de 1 mM d’acide

kynurénique et de 10 µM de strychnine (Figure 35. C). Dans ces conditions d’enregistrement,

l’application de la solution hyper-osmotique induit dans l’ensemble des cellules testées une

forte augmentation de l’activité synaptique qui est totalement bloquée par l’ajout de 10 µM de

gabazine dans la solution de perfusion (Figure 35. C, droite ; n = 4 ; milieu intracellulaire :

AcCs). Les évènements synaptiques GABAergiques induits ont une amplitude moyenne de -25

± 2 pA, similaire à celle mesurée pour les courants synaptiques glycinergiques induits (p = 0,392

pour le GABA vs. évènements glycine). Cependant, la constante de temps de décroissance des

courants synaptiques GABAergiques est significativement plus lente que celle mesurée pour les

courants synaptiques glycinergiques (Figure 35. D ; 10,4 ± 0,5 ms pour les évènements GABA; n

= 4 cellules et entre 60 et 150 évènements par cellule vs. 3,6 ± 0,7, n = 6 pour les évènements

glycine ; p = 0,004) comme il l’est illustré par la superposition des traces de courants normalisés

(figure 35. E).

Ces résultats indiquent donc que l’activité synaptique enregistrée dans les NcLCR-S du

tronc cérébral est due à l’activation des récepteurs GABA-A et glycinergiques. Enfin, il est

important de noter, qu’en présence de gabazine et de strychnine seules (sans acide

162
Résultats

kynurénique), il n’y a pas d’activité synaptique enregistrée ni spontanément ni en réponse au

choc hyper-osmotique (n = 4 ; résultat non illustré). Ces résultats montrent donc que les NcLCR-

S reçoivent exclusivement des courants synaptiques de type inhibiteur sous-tendus par les

récepteurs GABA-A et glycinergiques.

4. LES NcLCR SONT DES SENSEURS ENVIRONNEMENTAUX VIA PKD2L1

Dans cette partie, nous nous sommes intéressés à l'activité canal enregistrée

spontanément en configuration cellule entière et en mode voltage imposé dans les NcLCR

(Figure 25. D). Nos résultats immunohistochimiques indiquent que les NcLCR-S bulbo-spinaux

expriment la protéine PKD2L1. Nous avons donc émis l'hypothèse que l'activité canal

enregistrée est portée par ce membre de la famille TRP. Cependant, il n'existe pas de bloqueur

sélectif de ce canal, nous avons donc initialement caractérisé les propriétés de cette activité ainsi

que ses modulations afin de voir si les propriétés du courant unitaire enregistré dans les

NcLCR-S sont en accords avec celles des systèmes d'expression. Dans cette première partie,

l'étude a été réalisée sur le modèle de souris transgénique PKD2L1:EGFP, nous permettant de

visualiser les NcLCR-S (Huang et al., 2006). Dans un deuxième temps, pour confirmer nos

résultats, nous avons réalisé des enregistrements à partir des souris délétées pour PKD2L1 (KO-

PKD2L1) (Horio et al., 2011)

Pour l'ensemble de cette étude, nous avons réalisé des enregistrements

électrophysiologiques sur tranches de tronc cérébral, en configuration cellule entière et en mode

voltage imposé (Vh, -80 mV) et en courant imposé (I = 0). Les évènements synaptiques ont été

écartés par l'ajout d'acide kynurénique (1 mM) et de gabazine (10 µM).

a) Présence d'une activité canal porté par un canal cationique non sélectif de grande

conductance

Dans les systèmes d'expression la caractérisation du canal PKD2L1 a montré qu’il

présente une forte conductance, qu’il est de type cationique non sélectif et qu’il est modulé par

le pH extracellulaire et l'osmolarité (voir modulation, Introduction). Nous avons donc analysé

163
Résultats

ces différents critères pour voir si l'activité canal enregistrée (Figure 25. D) partage ces

propriétés.

Les enregistrements en mode voltage impose (VC) montrent que tous les NcLCR-S

présentent spontanément un courant unitaire caractéristique d’une activité canal (Figure 25. D

et 36). Cette activité canal est une signature des NcLCR-S puisqu'elle n'a jamais été enregistrée

dans les cellules EGFP négatives localisées à proximité du canal central. Dans la plupart des

cellules analysées, un seul niveau d'ouverture du canal est observé. Dans ces cellules, à un

potentiel de maintien de -80 mV, l'activité canal unitaire est caractérisée par un courant entrant

d'amplitude moyenne de -11,6 ± 0,4 pA et une probabilité d'ouverture (N.P0) de 0,028 ± 0,004

(Figure 36. A et B ; n = 28). Cependant, dans environ la moitié des NcLCR-S enregistrés (16/28),

un second niveau d’ouverture a été observé (Amplitude moyenne -10,3 ± 0,6 ; n = 16) mais avec

une faible probabilité (N.P0 = 0,005 ± 0,001 ; n = 16 ; Figure 36. A et B). Cependant, ces

enregistrements ont été obtenus en configuration cellule entière, ce qui peut représenter une

limite dans la précision de l'analyse de l'amplitude et de la cinétique de l'activité canal. Pour

analyser ce point plus précisément, nous avons tenté des enregistrements de l'activité canal en

configuration outside-out. Nous n’avons pas pu observer d’activité canal dans ces conditions,

certainement du fait de la faible expression de canal fonctionnel à la membrane plasmique.

Pour déterminer la sélectivité ionique de ce canal et sa conductance, nous avons

enregistré le courant unitaire à différents potentiels afin de déterminer la relation

courant/voltage. La figure 36. C illustre les traces représentatives de courant unitaire obtenues

pour des potentiels de maintien allant de -80 mV à +40 mV (incréments : 20 mV ; Figure 36. C,

droite). Pour chaque potentiel de maintien, l'amplitude a été mesurée (Figure 36. C) et a été

reportée sur la fonction courant/potentiel (Figure 36. C, droite). Dans la cellule représentée

(Figure 36. C), le potentiel de réversion du courant unitaire (Erev, canal) ainsi que la conductance

du canal unitaire (γ), ont été déterminés par l'assujétissement d'une fonction linéaire à

l'ensemble des points expérimentaux, et sont de +6 mV et de 169 pS respectivement (Figure 36.

C, droite). Cependant, comme dans ces enregistrements le potentiel d'équilibre du chlore (ECl)

est fixé à +2 mV (milieu intracellulaire d’enregistrement : ClCs), il n'est pas possible de

déterminer si le canal est perméable aux cations ou aux anions puisque dans cette condition le

courant enregistré s’inverserait également autour de 0 mV

164
Résultats

A B
Vh, -80 mV 1er niveau
F
2ème niveau
O1
O2 -25 ***

Amplitude, pA
-20 2 0,04

Ratio (A2/A1)
F -15

N.PO
O1
O2 -10 1 0,02

10 pA -5 ***
10 ms 0 0 0

C
Vh, +40 mV Amplitude du courant
PDF, pA-1

+40 mV 0,2 unitaire, pA


0,1 20

0 mV 0 Erev,Canal = +6 mV
60 70 80 90
 = 169 pS
Vh, -40 mV 10
PDF, pA-1

-20 mV r = 0,99
0,2
0,1
Vh , mV
-40 mV 0
-60 -50 -40 -30 -80 -40 40
Vh, -80 mV
PDF, pA-1

0,2
-10
-80 mV
0,1
0
10 pA -90 -80 -70 -60
-20
100 ms Amplitude, pA

D
GABA, 1 mM Amplitude du courant
normalisé au pic, pA
IGABA 4
ICanal
Activité canal
Erev,GABA = -51 2 mV
-20 mV 2
ECl = -68 mV
r = 0,93
-40 mV

-60 mV -80 -20 20


Vh, mV
-80 mV

50 pA Erev,Canal = +17 5 mV
20 pA -2
 moyenne = 141 7 pS
0,5 s 50 ms r = 0,96

FIGURE 36. LES NcLCR-S PRESENTENT UNE ACTIVITE CANAL SPONTANEE DONT LES PROPRIETES SONT SIMILAIRES A PKD2L1.
A, Traces de courant enregistrées à un potentiel de maintien de -80 mV (Vh) montrant l’activité canal unitaire spontanée
dans un NcLCR-S. La ligne pointillé représente l’état fermé du canal (F), le premier niveau d’ouverture (O1) et le second

165
Résultats

niveau d’ouverture (O2). B, Gauche, histogramme résumant l’amplitude moyenne de courant lors de l’ouverture d’un canal
unique (1er niveau, barre noire ; n = 16) ou de deux canaux (2ème niveau, barre blanche ; n = 16). Au milieu, ratio moyen de
l’amplitude de courant mesurée à partir du second niveau d’ouverture (A2) divisée par celle mesurée pour le premier
niveau (A1). Ce ratio est proche de 2 ce qui suggère une ouverture simultanée de deux canaux. Droite, histogramme
résumant la probabilité d’ouverture du canal (N.P0) pour une ouverture unique (1er niveau, barre noire ; n = 16) ou deux
ouvertures (2ème niveau, barre blanche ; n = 16). Il convient de noter qu’il y a une faible probabilité d’apparence d’ouvertures
multiples. *** : p < 0,001. C, Gauche, traces de courant unitaire spontané représentatif enregistrées à un potentiel de maintien
de -80 mV à +40 mV (incréments de 20 mV). La ligne pointillé indique l’état fermé du canal. Milieu, histogramme de
distribution d’amplitude de tous les points d’une trace obtenue lors des enregistrements effectués à des potentiels de
maintien de + 40, - 40 et -80 mV (du haut vers le bas). Les flèches indiquent l’amplitude du courant unitaire pour chaque
potentiel de maintien. Droite, droite représentant l’amplitude du courant unitaire pour chaque potentiel de maintien
correspondant aux traces de gauche et calculée grâce à l’histogramme de distribution d’amplitude montré au milieu. Le
potentiel d’inversion du courant unitaire (Erev,Canal) et la conductance du canal (γ) ont été obtenus à partir de
l’assujettissement des points expérimentaux par une fonction linéaire (ligne noire). D, Gauche, traces de courant
représentatif enregistrées entre de -80 mV à +40 mV (incréments de 20 mV) montrant dans un même NcLCR-S, le courant
induit par l’application par pression de GABA (1 mM, 50 ms, flèche) et le courant unitaire. Droite, fonctions
courant/amplitude du courant du GABA-A (ronds blancs, n = 6) et du courant unitaire (ronds gris, n = 6) obtenues à partir
des traces de courant dont un exemple est illustré à gauche. Pour une meilleure comparaison des deux fonctions
courant/amplitude, les données expérimentales ont été normalisées pour chaque cellule en fonction du courant enregistré à -
80 mV (carré noir). Les potentiels d’inversion des courants GABA-A (Erev,GABA) et du courant unitaire (Erev,Canal) ont été
obtenus par l’assujettissement linéaire des points expérimentaux. Les valeurs indiquées sur le graphique correspondent aux
valeurs moyennes ± SEM. Nous observons que Erev,GABA moyen tend vers ECl tandis que Erev,Canal est plus positif. A–C, Milieu
intracellulaire d’enregistrement ClCs, ECl = 2 mV. D, Milieu intracellulaire d’enregistrement : AcCs, ECl = -67 mV.

Pour résoudre ce problème, nous avons réalisé une nouvelle série d'expériences où dans une

même cellule, le courant chlore induit par l'application de GABA (application par pression de 1

mM de GABA pendant 50 ms) et le courant unitaire ont été enregistrés simultanément pour

différentes valeurs de potentiel de maintien (de -80 mV à -20 mV avec 20 mV d'incrément ;

Figure 36. D, gauche). A partir des points expérimentaux, nous avons établi la relation

courant/voltage du courant unitaire et l'avons comparée à celle obtenue pour le courant induit

par l'application de GABA, enregistré dans les mêmes NcLCR-S (Figure 36. D, droite). Pour

différentier les courants cationiques des courants anioniques (essentiellement portés par les ions

chlorures), le potentiel de réversion du chlore ECl a été fixé à -67 mV (milieu intracellulaire

d'enregistrement : AcCs). Dans ces conditions, le potentiel de réversion obtenu à partir des

données expérimentales pour le courant GABA-A (Erev, GABA) est de -51 ± 2 mV (n = 6 cellules),

proche de ECl tandis que le potentiel de réversion obtenu pour le courant unitaire Erev, canal est

plus positif en moyenne de +17 ± 5 mV (Figure 25. D, droite ; n = 6 cellules). La détermination de

la pente de la droite de la fonction courant/voltage du courant unitaire, nous permet d'estimer

une conductance moyenne du canal unitaire de 141 ± 7 pS (n = 6 cellules ; Figure 25. D, droite).

166
Résultats

Pour une meilleure comparaison des relations courant/voltage obtenues, les courants GABA et

le courant unitaire ont été normalisés par rapport à la valeur au pic du courant obtenu à -80 mV.

Ces résultats montrent que l'activité canal enregistrée dans les NcLCR-S PKD2L1+

partagent deux caractéristiques du canal PKD2L1 : il est cationique non sélectif et présente une

forte conductance. Afin de compléter la caractérisation de cette activité canal, nous nous

sommes, dans un deuxième temps, intéressés à l'analyse de la modulation de ce courant

unitaire enregistré dans les NcLCR-S du tronc cérébral.

b) Modulation de l'activité canal et de l'excitabilité des NclCR par des variations de la

composition du milieu extracellulaire

Dans les systèmes d'expression hétérologue, l'activité du canal PKD2L1 est modulée par

les variations du pH extracellulaire (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008; Shimizu et al., 2009,

2011; Ishii et al., 2009; Yu et al., 2012). De ce fait, nous avons recherché quel était l'effet de la

variation de pH extracellulaire sur le courant unitaire enregistré.

Effet du pH acide sur l'activité canal :


Nous avons tout d'abord testé l'effet de l'acidification extracellulaire sur l'activité canal.

L'application par pression pendant 10 s d'une solution d'acide citrique 30 mM (pH 2,8) induit

dans toutes les cellules enregistrées (n = 6/6 ; Figure 37. A) une réponse biphasique. Cette

réponse est caractérisée tout d'abord par un courant entrant qui désensibilise rapidement

(Figure 37. A ; maximum : -190 pA, minimum : -126 pA, amplitude moyenne au pic -170 ± 12

pA) Ce courant transitoire est suivi par un courant entrant persistant (dure tout le long de

l'application de l'acide) de faible amplitude. En accord avec les résultats reportés par Shimizu et

collaborateurs (2009) durant cette phase de plateau, l'activité canal est totalement bloquée

(Figure 37. A, haut et 37. D et Tableau 16 ; n = 6). Pendant cette phase plateau et en présence

d'acide citrique à pH 2,8, on observe un blocage du courant unitaire qui est réversible

puisqu'après 20 s de lavage, N.P0 revient aux valeurs contrôles (Figure 37. A et C ; N.P0 pendant

le lavage : 0,023 ± 0,005 vs. 0,037 ± 0.014 en situation contrôle, p = 0.250 ; n = 6). Ce bloquage de

l'activité canal n'est pas dû directement à l'acide citrique mais à l'acidification extracellulaire

puisque la solution d'acide citrique/citrate de sodium tamponnée à pH 6,3 n'a pas d'effet sur

N.P0 (Tableau 16 ; n = 4 ; p = 0,006 vs. acide citrique à pH 2,8). De plus, le blocage de l'activité

167
Résultats

canal est reproduit par l'application d’une solution de HCl à pH 2,8 (contrôle : 0,025 ± 0,008 vs.

HCl pH 2,8 : 0,008 ± 0,004 ; pourcentage d'inhibition : 67 ± 16 % ; n = 10 ; p = 0,008, p = 0,125 vs.

acide citrique pH 2,8). L'effet de la solution d'acide citrique (n = 6) sur l'activité canal étant

similaire à celui de HCl (n = 10) et comme il n’y a pas de différence significative entre ces deux

effets, nous avons regroupé pour les analyses ultérieures, les 16 NcLCR-S qui répondent à

l'acidification. Dans ces conditions, N.P0 moyen est de 0,035 ± 0,006 en condition contrôle et est

réduit de 77 ± 11 % lors de la perfusion de LCRa acide.

L'acidification du milieu extracellulaire avec une solution d'acide citrique à pH 2,8, en

mode courant imposé, induit tout d'abord une large dépolarisation sur laquelle se greffent des

PA, suivis par une dépolarisation plus faible maintenue tout le long du stimulus acide (Figure

37. B, trace du haut). Ces deux phénomènes représentent l'image en miroir de ce qui est observé

en mode voltage imposé pendant l'acidification extracellulaire (Figure 37. A et B, traces du

haut). De manière intéressante, à la fin de l'acidification, l'enregistrement révèle une

augmentation de l'excitabilité avec la présence de larges évènements dépolarisants de plusieurs

dizaines de millivolts (Figure 37. B, traces 4 et 5 ; n = 3).

Les études portant sur la modulation par l'acide du canal PKD2L1 dans des modèles

d'expression ont proposé que ces cellules présentent une « réponse off » à l'acide, caractérisée

par un rebond d'activité à la fin de la stimulation (Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008;

Kawaguchi et al., 2010; Ishii et al., 2012). Nous avons donc analysé le comportement du canal

unitaire quelques secondes après la fin de l'application d'acide afin de déterminer la présence

éventuelle d'une "réponse off". Cette analyse a montré que seulement 9 des 16 cellules testées

présentent un rebond d'activité du canal unitaire à la fin de la stimulation par l'acide (Figure 37.

C). Dans ces 16 cellules, l'activité du canal unitaire est fortement réduite pendant l'application

extracellulaire de la solution acide à pH 2,8 (acide citrique et HCl à pH 2,8) et dans 9 de ces 16

cellules, une fois l'application terminée, l'activité du canal unitaire est augmentée de 100 ± 25 %

(Figure 37. C) avec une augmentation de N.P0 qui passe de 0,026 ± 0,004 en situation contrôle à

0,052 ± 0,006 dans les dix premières secondes de lavage (n = 9 ; p = 0,009) sans modification de

l'amplitude du courant unitaire.

168
Résultats

A
Ac. Citrique, pH 2,8
Vh, -80 mV

20 pA
10 s
Contrôle Ac. Citrique, pH 2,8 Lavage

10 pA

200 ms

B
2 3
1 4 5
Vr , -50 mV

Ac. Citrique, pH 2,8 20 mV


Contrôle, 1
10 s
2

Ac. Citrique, pH 2,8 3

20 mV
Lavage
200 ms
4 5

C D 120
300 #
Inhibition N.PO , %

*** *
**
200 80
N.PO , %

100 40
*
0
Temps, s 15 35 45 65 85 pH

FIGURE 37. L’ACIDIFICATION BLOQUE LE COURANT UNITAIRE ET MODULE L’EXCITABILITE DES NcLCR-S. A, Trace de courant
représentatif enregistrée à -80 mV dans un NcLCR-S avant, pendant et après l’application de 30 mM de solution d’acide
citrique à pH 2,8 (10 s, barre grisée). Dessous, traces de courant correspondant à des agrandissements temporels de la trace
du dessus et issues d’un enregistrement avant (contrôle), pendant (acide citrique, pH 2,8) et après (lavage) l’acidification
extracellulaire. La ligne pointillé représente l’état fermé du canal. B, traces représentatives de potentiel enregistré en mode
courant imposé au potentiel de repos (Vr = -50 mV) dans le même NcLCR-S qu’illustré en A avant, pendant et après
l’acidification extracellulaire d’acide citrique à pH 2,8 (10 s, barre grisée). Dessous, traces de potentiel correspondant à des
agrandissements temporels de régions numérotées de la trace du dessus et issues d’un enregistrement avant (contrôle 1),
pendant (acide citrique, pH 2,8) et après (lavage 3 à 5) l’acidification extracellulaire. Nous pouvons remarquer que
l’acidification extracellulaire induit d’une part, l’émission de PA au début de l’application de l’acide citrique (2),
probablement due au courant entrant observé en mode voltage imposé (voir trace du haut en A) et d’autre part, une
augmentation des dépolarisations à la fin de l’exposition à l’acide (3). De manière intéressante, sur les traces 4 et 5 les
évènements dépolarisant avec une cinétique similaire aux potentiels post-synaptiques (flèches) ainsi que les évènements

169
Résultats

« de forme carrée » (ronds noirs). C, Histogramme résumant le pourcentage de variation moyen de la probabilité
d’ouverture (N.P0) avant (CTR ; barre noire), pendant (pH 2,8 ; barre blanche) et après (Lavage ; barres grises) l’application
par pression d’une solution acide à pH 2,8. On peut noter une augmentation de l’activité canal à la fin de l’application de
l’acide. Les valeurs de N.P0 ont été obtenues à partir de l’enregistrement de 9 cellules sur des périodes d’enregistrement de
10 s au temps indiqué dans l’histogramme. D, Histogramme résumant le pourcentage d’inhibition moyen de N.P 0 suite à
l’application d’acide citrique à différents pH : 6,3 (n = 4), 6,0 (n = 5), 5,5 (n = 4), 5,0 (n = 5) et 2,8 (n = 6). Pour chaque condition
de pH, N.P0 obtenue suite à l’application d’acide a été comparée à la valeur contrôle de N.P 0 correspondante et le
pourcentage d’inhibition a été calculé. *** : p < 0,001 ; ** : p < 0,01 ; * : p < 0,5. Le pourcentage total à pH 2,8 le test statistique
n’a pas pu être réalisé. Milieu intracellulaire d’enregistrement KGlu, ECl = -34 mV.

Finalement, pour tester si le niveau d'inhibition de l'activité canal est dépendant du pH

extracellulaire, nous avons appliqué par pression des solutions d'acide citrique dont la valeur

de pH varie entre 6,3 et 2,8. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 16 et dans la

figure 37. D et montrent que la réduction significative de N.P0 s'observe quand le pH

extracellulaire est inférieur ou égal à 5,5.

Il a été montré dans les neurones que l'exposition à un pH acide induit l'activation de

courant cationique de large conductance, non sensible au voltage et avec une grande sensibilité

aux protons, ce sont les canaux ioniques sensibles à l'acide ou ASICs (Acid sensing ionic

channels) (Waldmann et al., 1997; Deval et al., 2010). En réponse à l'acidification extracellulaire,

l'activation des ASICs induit un courant entrant rapide qui désensibilise rapidement et qui en

fonction des sous-unités exprimées, peut être accompagné ou non d'un courant de plus faible

amplitude soutenu pendant toute la stimulation (Deval et al., 2010). Dans le but de déterminer si

le courant entrant induit par l'acidification du milieu extracellulaire est porté par les ASICs et

surtout afin d'exclure la participation de PKD2L1 dans cette réponse, nous avons analysé la

sensibilité des courants induits par le pH acide à la Psalmopeus cambdridgei toxine de type 1

(PcTx 1), un bloqueur sélectif des canaux homomériques ASIC1a et hétéromérique ASIC1a/2b

(Diochot et al., 2007; Baron et al., 2008; Sherwood et al., 2011).

170
Résultats

A
Ac. Citrique, pH 2,8 -400
Vh, -80 mV

Amplitude, pA
PcTx1, 40 nM -300
50 pA
-200
Contrôle
1s
-100
+ Amiloride, 2 mM ***
50 pA **
Ac. Citrique, pH 2,8 0
2s

Vh, -80 mV

B + PcTx1, 40 nM
Ac. Citrique, pH 2,8
Vh, -80 mV

20 pA
10 s
Contrôle Ac. Citrique, pH 2,8 Lavage

10 pA
200 ms
0,020 -15
Amplitude, pA

0,015
-10
N.PO

0,010
-5
0,005

0,000 0

C
Amiloride, 2 mM
Vh, -80mV

10 pA
10 s
Contrôle Amiloride Lavage

10 pA

20 ms

FIGURE 38. DANS LES NcLCR-S L’ACIDIFICATION EXTRACELLULAIRE INDUIT L’ACTIVATION DES ASICS AINSI QUE
L’INHIBITION DE PKD2L1.

171
Résultats

FIGURE 38. DANS LES NcLCR-S L’ACIDIFICATION EXTRACELLULAIRE INDUIT L’ACTIVATION DES ASICS AINSI QUE
L’INHIBITION DE PKD2L1. A, Gauche, courant représentatif de la réponse enregistrée à -80 mV (Vh) dans un NcLCR-S lors
de l’application par pression d’acide citrique à pH 2,8 (1 s, barre grisée). Les traces noire et grise représentent
respectivement les enregistrements obtenus en condition contrôle et en présence de 40 nM de PcTx1, un bloqueur des
canaux homomériques ASICs 1a et hétéromériques ASICs 1a/2b. La trace du dessous indique qu’en présence continue
d’amiloride (2 mM), le courant entrant induit par l’acide ainsi que le courant unitaire sont bloqués. Droite, histogramme
résumant l’amplitude moyenne du courant induit par l’acide en condition contrôle (CTR, barre noire, n = 14) en présence de
40 nM de PcTx1 (barre grise, n = 6) et en présence de 2 mM d’amiloride (barre blanche, n = 4). *** : p < 0,001 ; ** : p < 0,01. B,
La trace du dessus représente le courant représentatif enregistré à -80 mV (Vh) en présence de 40 nM de PcTx1 avant,
pendant et après l’application de solution d’acide citrique à pH 2,8 (10 s, barre noire). Nous constatons que, bien que le
courant entrant rapide induit par l’acide soit fortement réduit en présence de PcTx1, le courant unitaire peut toujours être
enregistré. Les traces du milieu correspondent à des régions de la trace du dessus à un plus fort agrandissement temporel,
sélectionnées avant (Contrôle), pendant (Ac. Citrique, pH 2,8) et après (Lavage) l’acidification extracellulaire. La ligne
pointillé indique l’état fermé du canal. Les histogrammes du dessous indiquent la moyenne de N.P 0 (gauche) et de
l’amplitude du courant unitaire (droite) déterminée dans trois différentes cellules avant (Contrôle, barre noire n = 3) et en
présence de 40 nM de PcTx1 (barre blanche n = 3). C, Trace de courant représentative enregistrée à un potentiel de maintien
de -80 mV (Vh) dans un NcLCR-S montrant le blocage réversible de l’activité canal spontanée suite à l’application par
pression de 2 mM d’amiloride (20 s, barre grisée). Dessous, traces de courant qui correspondent à des régions de la trace du
dessus à un plus fort agrandissement temporel, sélectionnées avant (Contrôle), pendant (amiloride) et après (Lavage)
l’application d’amiloride. La ligne pointillé indique l’état fermé du canal. Milieu intracellulaire d’enregistrement KCl, E Cl = 2
mV.

Comme il a été mentionné précédemment, l'application par pression d'acide citrique à pH 2,8

induit dans tous les NcLCR-S enregistrés, un courant entrant qui désensibilise rapidement

(Figure 37. A). Ce courant est réduit de 87 % en présence de 40 nM de PcTx1 (Figure38. A et B ;

maximum : -882 pA, minimum : -120 pA, moyenne : -316 ± 55 pA en condition contrôle ; n = 14

vs. maximum : -74 pA, minimum : -16 pA, moyenne : -40 ± 9 pA en PcTx1 ; n = 6 ; p = 0,0006). De

plus, l'application de PcTx1 bloque également la phase plateau observée lors d'exposition

prolongée à l'acide (Figure 38. B). Ces résultats indiquent donc que les NcLCR-S du tronc

cérébral expriment des ASICs fonctionnels qui sont responsables de la réponse biphasique

(courant rapide transitoire et courant plateau) observée pendant le stimulus acide. Bien que le

courant biphasique induit pas l'acide soit bloqué par la PcTx1, la toxine n'a pas d'effet sur N.P0

(Figure 38. B, histogramme de gauche ; 0,014 ± 0,006 en condition contrôle vs. 0,014 ± 0,002 en

PcTx1 ; n = 3 ; p = 1,000) ni sur l'amplitude (Figure 38. B, histogramme de droite ; -9,5 ± 0,4 pA

en condition contrôle vs. -10,2 ± 0,4 pA en PcTx1 ; n = 3 ; p = 0,182) du courant unitaire enregistré

dans les NcLCR-S PKD2L1+. De plus, pendant le blocage des ASICs en présence de 40 nM de

PcTx1, l’inhibition de l’activité canal par l’application d'acide est toujours observée (Figure 38.

B, traces du dessus et du milieu). Nous avons ensuite testé l'effet de l'amiloride, une substance

non spécifique qui bloque à la fois les ASICs (Holzer, 2009) et le canal PKD2L1 (Dai et al., 2007;
172
Résultats

Shimizu et al., 2009). Comme attendu après l'ajout de 2 mM d'amiloride dans le milieu de

perfusion, aucun courant n'est enregistré en réponse à l'application de solution acide (Figure 38.

A, trace du bas ; -8 ± 3 pA en amiloride ; n = 4 ; p = 0,003 vs. condition contrôle) et aucune

activité canal n'est observée (Figure 38, trace du bas). Enfin, dans les quatre NcLCR-S

enregistrés, l'activité canal spontanée est bloquée de manière réversible par l'application de 2

mM d'amiloride seul (Figure 38. C).

Ces résultats indiquent que les NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral expriment des

ASICs fonctionnels, responsables de la réponse rapide induite par l'acide et un canal de type

PKD2L1 inhibé par l'exposition au pH acide extracellulaire.

Effet du pH alcalin sur l'activité canal :


Contrairement au pH acide, l’application par pression à -80 mV en mode voltage clamp

d’une solution alcaline (pH 8,8, tampon TAPS) augmente réversiblement la probabilité

moyenne d’ouverture du canal de 88 ± 25 % sans affecter l’amplitude du courant unitaire (voir

un exemple Figure 39. A et Tableau 16 ; n = 7). Dans le tableau 16, nous pouvons constater que

dans toutes les expériences où le pH extracellulaire a été modifié, l’amplitude du courant

unitaire n’a jamais été affectée. L’effet activateur de l’alcalinisation sur l’activité canal est

réversible puisque 10 s après le lavage de la solution TAPS, la valeur de N.P0 retourne à celle

observée en situation contrôle (Figure 39. A ; Lavage : 0,035 ± 0,006 vs. en situation contrôle :

0,026 ± 0,004 ; n = 7 ; p = 0,310). Finalement, en mode courant imposé, l’application de solution

alcaline à pH 8,8 induit une forte augmentation de l’émission de PA dans les trois NcLCR-S

testés (voir un exemple Figure39. B). Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’activité

canal induite par l’alcalinisation extracellulaire est à l’origine de l’augmentation de l’excitabilité

neuronale observée.

L’ensemble de ces résultats indique que les NcLCR-S expriment des ASICs fonctionnels,

responsables du courant rapide induit par l’acidification extracellulaire. Deuxièmement, les

travaux de recherche ont permis de montrer que l’acidification diminue et que l’alcalinisation

augmente l’activité canal. Ces résultats sont des arguments supplémentaires qui suggèrent que

le courant unitaire enregistré dans les NcLCR-S du tronc cérébral est porté par le canal PKD2L1.

173
Résultats

A TAPS, pH 8,8
Vh, -80 mV

20 pA
10 s
Contrôle TAPS, pH 8,8 Lavage

10 pA

200 ms

B TAPS, pH 8,8

Vr , -45 mV 20 mV

10 s

Contrôle
TAPS, pH 8,8

20 mV

200 ms
Lavage

FIGURE 39. L’ALCALINISATION AUGMENTE L’ACTIVITE CANAL ET L’EXCITABILITE DES NCLCR-S. A, Courant représentatif
enregistré en mode voltage imposé à -80 mV (Vh) dans un NcLCR-S avant, pendant et après l’application par pression d’une
solution alcaline à pH 8,8 (TAPS, 30 s, barre grisée). Les traces du dessous correspondent à des régions de la trace du dessus
à un plus fort agrandissement temporel, sélectionnées avant (Contrôle), pendant (TAPS, pH 8,8) et après (Lavage)
l’alcalinisation extracellulaire. La ligne pointillé indique l’état fermé du canal. Nous observons que l’activité canal est
augmentée pendant l’alcalinisation extracellulaire. B, Trace de potentiel représentatif, enregistré en mode courant imposé
(Vr = -45 mV) dans le même NcLCR-S que représenté en A, avant, pendant et après l’alcalinisation extracellulaire (TAPS, pH
8,8, 30 s, barre grisée). Les traces du dessous correspondent à des régions de la trace du dessus à un plus fort
agrandissement temporel, sélectionnées avant (Contrôle), pendant (TAPS, pH 8,8) et après (Lavage). Il convient de noter que
l’alcalinisation extracellulaire induit une augmentation de l’émission de PA. Milieu intracellulaire d’enregistrement KGlu,
ECl = -34 mV.

174
Résultats

TAPS Acide citrique


pH pH pH pH pH pH
Condition CTR CTR CTR CTR CTR CTR
8,8 6,3 6,0 5,5 5,0 2,8
n, cellules 7 4 5 4 4 6
Amp, pA -12,7 -12,8 -10,8 ± -10,7 -9,3 ± -10,0 -10,1 -11,9 -9,7 ± -11,5 -10,6
/
± SEM ± 0,7 ± 0,7 0,3 ± 0,6 0,8 ± 1,2 ±0 ,6 ± 2,4 0,4 ± 1,3 ± 0,9
p 0,672 0,875 0,765 0,865 0,665 nd
0,025 0,048 0,030 0,012 0,008 0,016 0,004 0,023 0,004 0,037
N.P0 ± 0,037 ±
± ± ± ± ± ± ± ± ± ± /
SEM 0,014
0,003 0,006 0,009 0,004 0,003 0,001 0,002 0,001 0,001 0,009
p 0,031* 0,062 0,298 0,022* 0,0001*** nd
Variation
88 ± 25 -18 ± 23 -37 ± 26 -72 ± 14 -82 ± 5 100
N.P0, %

TABLEAU 16. Tableau résumant les valeurs moyennes d'amplitude (Amp, pA) et de probabilité d'ouverture (N.P 0) du
courant unitaire lors de variation de pH extracellulaire comparé aux mesures obtenues en condition contrôle (pH 7,3
à 7,4). Alcalinisation extracellulaire : TAPS pH 8,8 (n = 7) ; Acidification extracellulaire : solution d'acide citrique pH
entre 6,3 et 2,8. Une inhibition totale a été observée en présence d'acide citrique (pH 2,8), où l'amplitude du courant
unitaire n'a pas pu être mesurée. Il n'y a pas de variation de l'amplitude du courant unitaire en fonction du pH
extracellulaire. * : p < 0,05 ; *** : p < 0,001. CTR : contrôle ; TAPS : acide N-tris(hydroxyméthyl)méthyl-3-
aminopropanesulfonique. nd: non déterminé ; ns : non significatif

Effet du choc osmotique sur l'activité canal :


Un rôle de mécanodétecteur pour PKD2L1 a été suggéré par certaines études qui

montrent que l’activité de ces canaux est modulée par des variations d’osmolarité du milieu

extracellulaire et plus précisément que l’activité canal est augmentée par les chocs hypo-

osmotiques tandis que les chocs hyper-osmotiques la diminue (Murakami et al., 2005; Shimizu et

al., 2009). Afin d’apporter une preuve supplémentaire que les NcLCR-S expriment le canal

PKD2L1 et qu’il est à l’origine du courant unitaire enregistré, nous avons testé l’effet de

variations osmotiques sur l’activité du canal unitaire.

Nous avons tout d’abord exposé les NcLCR-S pendant 3 min à une solution

hypertonique (Figure40. A ; choc hypertonique : de ≈ 310 à 355 mosmole/kg, voir Méthodes).

Dans toutes les cellules testées, cette application n’affecte ni l’amplitude du courant unitaire (-

8,9 ± 0,3 pA en condition contrôle vs. -9,0 ± 0,3 pA en condition d’hypertonicité ; n = 5 ; p = 0,733)

ni la probabilité d’ouverture (Figure 40. A ; 0,0012 ± 0,004 en condition contrôle vs. 0,009 ± 0,002

en condition hypertonique ; n = 5 ; p = 0,291).

175
Résultats

A
Choc Hypertonique
Vh, -80 mV

20 pA
60 s 0.06
Contrôle
0.04

N.Po
Choc
Hypertonique 0.02

0.00
Lavage 3 6 9 12 15

10 pA
200 ms Temps, min

B Choc Hypotonique
Vh, -80 mV

20 pA

60 s
0.06
**
Contrôle **
0.04
N.Po

Choc 0.02
Hypotonique
0.00
Lavage 3 6 9 12 15

10 pA

200 ms Temps, min

FIGURE 40. UN CHOC HYPO-OSMOTIQUE EXTRACELLULAIRE AUGMENTE FORTEMENT L’ACTIVITE CANAL DES NcLCR-S. A,
Courant représentatif enregistré en mode voltage imposé à -80 mV (Vh) dans un NcLCR-S avant, pendant et après
l’application par pression d’un choc hypertonique (3 min, barre grisée). Les traces du dessous à gauche correspondent à des
régions de la trace du dessus à un plus fort agrandissement temporel, sélectionnées avant (Contrôle), pendant (choc
hypertonique) et après (Lavage) l’exposition à un choc hypertonique extracellulaire. La ligne pointillé indique l’état fermé
du canal. Dessous à droite, histogramme résumant N.P0 moyen déterminé avant (CTR, barre noire), pendant (Choc, barre
blanche), et après (Lavage, barres grises) l’exposition à un choc hypertonique (n = 5). B, Courant représentatif enregistré en
mode voltage imposé à -80 mV (Vh) dans un NcLCR-S avant, pendant et après l’application par pression d’un choc
hypotonique (3 min, barre grisée). Les traces du dessous à gauche correspondent à des régions de la trace du dessus à un
plus fort agrandissement temporel, sélectionnées avant (Contrôle), pendant (choc hypotonique) et après (Lavage)
l’exposition à un choc hypotonique extracellulaire. La ligne pointillé indique l’état fermé du canal. Dessous à droite,
histogramme résumant N.P0 moyen déterminé avant (CTR, barre noire), pendant (Choc, barre blanche), et après (Lavage,
barres grises) l’exposition à un choc hypotonique (n = 3). En A et B, les traces de courant illustrées ne représentent que les 9
premières minutes d’enregistrement. Dans les histogrammes, les valeurs moyennes de N.P0 représentées sont calculées sur
des périodes de 3 minutes aux temps indiqués sous les barres d’histogramme. ** : p < 0,01. Milieu intracellulaire
d’enregistrement ClCs, ECl = -2 mV.

176
Résultats

Cependant, une diminution de 28 % de N.P0 est observée bien qu’elle ne soit pas significative

(Figure 40. A, droite).

Au contraire, en présence de la même solution d’enregistrement, l’application pendant 3

min d’une solution hypotonique (de ≈ 310 à ≈ 265 mosmol/kg, voir Méthodes) induit une forte

augmentation de la probabilité d’ouverture en moyenne de 237 ± 69 % dans les trois cellules

testées (Figure 40. B ; 0,014 ± 0,003 en situation contrôle vs. 0,046 ± 0,009 en condition hypo-

osmotique ; n = 3 ; p = 0,009) sans affecter l’amplitude du courant unitaire (-9,3 ± 0,4 pA en

condition contrôle vs. -9,8 ± 0,4 pA en condition hypo-osmotique ; n = 3 ; p = 0,250 ; milieu

intracellulaire d’enregistrement : ClCs). Cette augmentation de N.P0 est réversible puisque dans

l’ensemble des cellules testées, N.P0 retourne à sa valeur contrôle après 10 min de lavage (Figure

40. B, droite ; 0,014 ± 0,003 en condition contrôle vs. 0,014 ± 0, 004 après lavage ; n = 3 ; p = 0,820).

La modulation de l’activité canal par le choc hypotonique est un argument supplémentaire en

faveur de l’expression du canal PKD2L1 fonctionnel dans les NcLCR-S du tronc cérébral.

Les résultats montrent également que l’effet du choc hypotonique sur l’activité canal

n’est pas direct et n’est observé que plusieurs minutes après l’application (Figure 40. B). Ces

résultats rejoignent ceux obtenus par Shimizu et collaborateurs (Shimizu et al., 2009). Cette

étude démontre que l’activation du canal est corrélée à des variations de forme (gonflement ou

rétrécissement) de la cellule, de plus l’effet du choc hypotonique sur le canal semble faire

intervenir l’acide arachidonique. Nos conditions expérimentales ne permettent pas d'analyser si

les chocs osmotiques appliqués sont associées à des variations de taille de la cellule, cependant,

la cinétique de la réponse enregistrée argue en faveur d'un effet non direct du choc osmotique

sur l'activité canal pouvant passer par l'activation de composés sous l'influence de

modifications membranaires. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons testé l’effet de

l’application par pression d’acide arachidonique (10 µM ; 30 s ; Figure 41) sur le courant

unitaire. L’application d’acide arachidonique induit une augmentation non réversible de N.P0

dans 5 des 8 NcLCR-S testés (voir un exemple Figure 41. A et B). Cependant, cette augmentation

n’est pas significative (0,0016 ± 0,006 en condition contrôle vs. 0,061 ± 0,040 avec l’acide

arachidonique ; n = 5 ; p = 0,062). Ces résultats indiquent que l’acide arachidonique à lui seul ne

peut expliquer l’effet du choc hypotonique sur l’activité canal.

177
Résultats

A
Ac. arachidonique, 10 µM
Vh, -80mV

20 pA

10 s

B C
0.3 0.15
AA, 10 µM

0.2 0.10
N.Po

N.Po
0.1
0.05

0.0
0.00
0 1 2 3 4
Temps, min

FIGURE 41. MODULATION DE L’ACTIVITE CANAL PAR L’ACIDE ARACHIDONIQUE. A, Courant représentatif enregistré en mode
voltage imposé à -80 mV (Vh) dans un NcLCR-S avant, pendant et après l’application par pression de 10 µM d’acide
arachidonique (AA, 30 s, barre grisée). B, Evolution en fonction du temps de la probabilité d’ouverture du canal (N.P0)
avant, pendant et après application d’acide arachidonique (AA, 30 s, barre noire) de la cellule illustrée en A. Nous pouvons
noter que dans cette cellule, l’application par pression d’acide arachidonique augmente de manière non réversible, la valeur
de N.P0. C, Histogramme résumant N.P0 moyen déterminé avant (CTR, barre noire), pendant (AA, barre blanche), et après
(Lavage, barre grise) l’application par pression d’acide arachidonique (n = 5). Sur les 8 cellules testées, seules 5 ont répondu
à cette application par une augmentation de N.P0 (sur une des cellules observées N.P0 diminue et dans les deux autres aucun
effet n’a été observé). La variation de N.P0 n’est pas significativement différente lorsque l’on compare N.P 0 en présence
d’acide arachidonique à la situation contrôle (0,016 ± 0,006 en contrôle vs. 0,061 ± 0,040 lors de l’application acide
arachidonique ; n = 5 ; p = 0,062).

178
Résultats

c) L'activité canal enregistrée est portée par la protéine PKD2L1

Les études réalisées sur les souris PKD2L1:EGFP ont permis de mettre en évidence que

l'activité canal observée partage de nombreux points communs avec les caractéristiques

connues pour le canal PKD2L1 enregistré dans les systèmes d’expression. Cependant, l'absence

de bloqueur spécifique de ce canal fait qu'il n'est pas possible de réellement affirmer que le

courant unitaire enregistré est porté par le canal PKD2L1. Pour pallier à ce problème, nous

avons réalisé une autre série d'expériences en utilisant le modèle de souris invalidées pour

PKD2L1(KO-PKD2L1) développé et fourni par le Pr. H. Matsunami (Horio et al., 2011).

L'ensemble des expériences a été réalisé sur des tranches de tronc cérébral de souris adultes (2-3

mois) préalablement "génotypées" (Figure 42. A, voir Méthodes) et les résultats obtenus dans les

NcLCR-S de souris KO-PKD2L1 ont été comparés à ceux provenant de NcLCR-S de souris

sauvages (WT) issues de la même lignée. L'absence d'expression du canal PKD2L1 a été

confirmée par le double marquage immunohistochimique PKD2L1/MAP2, où l'AC anti-MAP2

permet de révéler la morphologie des NcLCR-S autour du canal central chez WT et les KO-

PKD2L1 (Figure 42. C). La présence d'Alexa 594 dans la solution intra-pipette nous a permis de

confirmer sur des critères morphologiques que le neurone enregistré est bien un NcLCR-S.

L'ensemble des enregistrements a été réalisé en configuration cellule entière (Vh, -80 mV) en

présence de 1 mM d'acide kynurénique et de 100 µM de picrotoxine afin de bloquer toute

activité synaptique des NcLCR-S.

L'étude des propriétés passives des NcLCR-S montre qu'il n'y a pas de différence

significative entre les NcLCR-S KO-PKD2L1 et les WT, ces neurones sont très résistifs et ont un

potentiel de repos autour de -50 mV (rm : 1,5 ± 0,1 GΩ pour les KO-PKD2L1 vs. 1,3 ± 0,0 GΩ

pour les WT ; cm : 5,3 ± 0,3 pF pour les KO-PKD2L1 vs. 4,9 ± 0,2 pF pour les WT ; Vr : -50,4 ± 1,5

mV pour les KO-PKD2L1 vs. -52,1 ± 0,8 mV pour les WT ; Tableau B Figure 42).

L'enregistrement en configuration cellule entière en mode voltage imposé à -80 mV montre que

l'activité canal observée spontanément chez les WT n'est plus présente dans les NcLCR-S KO-

PKD2L1, ce qui permet de confirmer que le courant unitaire est porté par le canal PKD2L1

(Figure 42. D). Les deux types de populations neuronales : celle à décharge phasique et celle à

décharge tonique décrites précédemment sont également présentes et retrouvées dans les

mêmes proportions dans les NcLCR-S KO-PKD2L1 (38 % de neurones à décharge tonique vs. 63

% de neurones à décharge phasique ; n = 8 ; voir un exemple Figure 42. E). Afin de déterminer si

179
Résultats

le canal PKD2L1 pouvait influer sur l'excitabilité des NcLCR-S, nous avons analysé la décharge

spontanée des NcLCR-S. Les enregistrements en mode courant imposé, montrent d'une part

que la fréquence de décharge est diminuée dans les NcLCR-S KO-PKD2L1 où seulement 7 des

15 cellules enregistrées présentent une décharge spontanée tandis que 69 % des NcLCR-S WT

déchargent spontanément (n = 35). D'autre part, la fréquence de décharge des NcLCR-S KO-

PKD2L1 est trois fois inférieure à celle retrouvée dans les NcLCR-S WT (KO : 0,13 ± 0,004 PA/s,

n = 7 vs. WT : 0,35 ± 0,10 PA/s, n = 24 ; Figure 42. F).

Ces résultats montrent que le courant unitaire enregistré dans les NcLCR-S du tronc

cérébral est dû à l'ouverture du canal PKD2L1 dont l'activité participe à la modulation de

l'excitabilité neuronale mais pas à l'élaboration des deux types de décharge.

Nous avons démontré précédemment, sur le modèle PKD2L1:EGFP, que l'activité canal

est modulée par des variations de pH et d'osmolarité du milieu extracellulaire. Afin de

confirmer que ces effets passent par PKD2L1 et pour analyser l'impact de cette modulation sur

l'excitabilité neuronale, nous avons réitéré ces expériences sur le modèle de souris délétées pour

PKD2L1, en nous focalisant sur l'effet des variations de pH extracellulaires.

180
Résultats

A B
+/- -/- +/+
Paramètre rm, GΩ cm, pF Vr , mV

725 pb Génotype KO WT KO WT KO WT

575 pb Valeur 1,5 1,3 5,3 4,9 -50,4 -52,1


SEM 0,1 0,0 0,3 0,2 1,5 0,8

n 22 47 22 47 22 43

C D
WT MAP2 PKD2L1

cc cc

20 µm

10 pA
KO
0,1 s

cc cc

20 µm

E F 0,5
Fréquence de décharge
20 mV 20 mV spontanée (PA/s)
0,4
0,1 s 0,1 s
0,3
-62.1 mV -61.1 mV
0,2

+40 pA +40 pA 0,1

0,0
KO WT

FIGURE 42. DANS LES NcLCR, L’ACTIVITE CANAL EST PORTEE PAR PKD2L1. A, Illustration d’un gel d’électrophorèse
montrant le résultat du génotypage des souris sauvages (+/+), délétées pour PKD2L1 (-/-) et hétérozygotes. B, Tableau
résumant les propriétés passives déterminées par des enregistrements en mode voltage imposé (résistance membranaire :
rm ; capacité membranaire : cm) de NcLCR provenant d’animaux délétés pour PKD2L1 (KO, n = 22) et sauvages (WT, n = 47)
ou d’enregistrements en mode courant imposé (potentiel de repos : Vr ; KO : n = 22 ; WT : n = 43). L’analyse statistique
indique qu’il n’y a pas de variation significative de ces propriétés entre les animaux sauvages vs. délétés pour PKD2L1 (rm :
p = 0,163 ; cm : p = 0,703 ; Vr : p = 0,546). C, Double marquage MAP2 (rouge) / PKD2L1 (vert) sur coupes coronales de tronc
cérébral provenant d’animaux sauvages (WT) ou délétés pour PKD2L1 (KO). On peut noter que l’anticorps anti-MAP2
révèle la présence de NcLCR-S autour du canal central de coupes de tronc cérébral, d’animaux WT et KO. Cependant chez
les KO, l’absence d’immunoréactivité pour PKD2L1 dans les NcLCR-S indique que ces neurones n’expriment plus cette
protéine. D, Les enregistrements en configuration voltage imposé à -80 mV (Vh) montrent que le courant unitaire observé
dans les NcLCR-S provenant d’animaux sauvages (traces du haut) n’est plus constaté dans les neurones d’animaux délétés
(traces du bas). E, Patrons de décharge représentatifs, enregistrés en mode courant imposé lors de l’injection d’un créneau
de courant dépolarisant (+ 40 pA) dans les NcLCR-S d’animaux délétés pour PKD2L1. Nous observons que les deux patrons
de décharge (phasique, trace de gauche et tonique, trace de droite) sont conservés. F, Histogramme résumant la fréquence
de décharge spontanée moyenne de NcLCR-S provenant d’animaux délétés (KO, barre noire ; fréquence : 0,13 ± 0,04 ; n = 7
cellules) ou sauvages (WT, barre blanche ; fréquence : 0,35 ± 0,10 ; n = 24 cellules). Nous observons que chez les animaux
délétés pour PKD2L1 (KO) la fréquence de décharge est fortement diminuée mais de manière non significative (p > 0,005).
Milieu intracellulaire d’enregistrement KCl, ECl = 2 mV.

181
Résultats

d) Modulation de l'excitabilité neuronale par le canal PKD2L1

Les enregistrements en configuration cellule entière et en mode voltage imposé à -80 mV

montrent, qu'en condition contrôle l'activité canal enregistrée dans les NcLCR-S WT n'est pas

observée chez les KO-PKD2L1. L'application par pression d'un pH acide (pH 5, 10 s), entraine la

réponse biphasique déjà décrite ci-dessus, dans tous les NcLCR-S WT et KO-PKD2L1

enregistrés (Figure 43. A), ce qui confirme que le canal PKD2L1 n'est pas impliqué dans cette

réponse qui est donc bien uniquement portée par des ASICs. Pendant la phase de plateau de

cette réponse, l'activité canal est bloquée en moyenne de 73,0 ± 11,8 % dans les NcLCR-S WT

(N.P0 : 0,0037 ± 0,0008 en condition contrôle vs. 0,0007 ± 0,0004 ; n = 10 ; Figure 43. A, trace de

gauche). Ce bloquage est réversible et l'activité canal lors du lavage retourne à des valeurs

similaires de celles obtenues en condition contrôle (N.P0 : 0,004 ± 0,001 ; n = 10 ; Figure 43. A,

trace de gauche). Nous pouvons noter également que si la composante ASIC est conservée dans

les NcLCR-S KO-PKD2L1, aucune activité canal n'est enregistrée à chaque moment de

l'expérience et dans tous les NcLCR-S analysés (Figure 43. A, trace de droite ; n = 5).

De plus, l'augmentation de l'activité canal observée lors de l'application par pression de

solution alcaline (TAPS, pH9, 30 s, augmentation moyenne : 638 ± 284 % ; n = 7, Figure 43. C) sur

les NcLCR-S-WT (N.P0 en contrôle : 0,003 ± 0,001 vs. 0,02 ± 0,01 lors de l'application de TAPS,

pH9 ; n = 7) est absente dans les NcLCR-S-KO (Figure 43. D, Traces du haut). L'augmentation de

l'activité canal enregistrée en mode voltage imposé est corrélée à l'augmentation de la fréquence

d'émission de PA observée en mode courant imposé dans les NcLCR-S WT (augmentation de la

fréquence de décharge moyenne de 63,6 ± 33,0 % ; n = 9, Figure 43. B trace su bas à gauche et 43.

D). Cet effet du pH alcalin sur la fréquence de décharge n'est pas retrouvé dans les 6 NcLCR-S

KO-PKD2L1 analysés qui présentent de plus, très peu de décharge spontanée (n = 2, voir un

exemple Figure 43. B, trace du bas à droite). L'effet de la solution alcaline sur l'activité canal et

sur la fréquence de décharge des NcLCR-S WT est réversible, cependant il convient de noter

que le retour à la situation contrôle se fait lentement (Figure 43. C et D). Ainsi après 120 s de

lavage, la N.P0 moyenne correspond à 189 ± 56 % de la valeur contrôle (n = 7) et la fréquence de

décharge à 158 ± 50 % (n = 9), il faut attendre 150 s de lavage pour que la fréquence d'émission

de PA corresponde à 108 ±49 % (n = 6) de la situation contrôle.

Enfin, nous avons testé l'application par pression d'une solution hypotonique (même

protocole que précédemment, de ≈ 310 à ≈ 265 mosmole/kg, 3 min ; voir Méthodes). Les

182
Résultats

enregistrements en mode voltage imposé à -80 mV montrent que l'augmentation de l'activité

canal observée dans les NcLCR-S WT (N.P0 normalisée par rapport à la situation contrôle : 543,4

± 89,7 %) n'est plus retrouvée dans les NcLCR-S des souris délétées pour PKD2L1, où aucune

activité canal n'est observée.

L'ensemble de ces résultats montre tout d'abord que l'activité canal observée lors de

l'enregistrement de l'activité spontanée et lors de modification de pH et d'osmolarité du milieu

extracellulaire est portée par PKD2L1. Le pH acide est à l'origine d'une réponse plus complexe

passant par l'activation de canaux ASICs et par l'inhibition réversible du canal PKD2L1. Du fait

de la faible fréquence de décharge spontanée dans les NcLCR-S KO-PKD2L1, nous n'avons pas

pu analyser si les dépolarisations observées lors de la réponse off à l'acide dans les NcLCR-S des

modèles PKD2L1 : EGFP sont sous tendues par l'augmentation de l'activité canal. De plus, la

"réponse off" n'a pas été retrouvée dans ces expériences. Nous montrons également que

l'alcalinisation et la diminution de l'osmolarité du milieu extracellulaire sont détectées par les

NcLCR-S du tronc cérébral grâce au canal PKD2L1. Enfin, les NcLCR-S semblent coder ces

messages sensoriels par une variation de la fréquence d'émission de PA.

183
Résultats

A WT KO
Ac. Citrique, pH 5 Ac. Citrique, pH 5
Vh, -80 mV
1 2 3
1 2 3
2 2
3 3
10 pA 100 pA 10 pA
100 pA
10 s 0,1 s 10 s 0,1 s

B TAPS, pH 9 TAPS, pH 9
Vh, -80 mV

20 pA
10 s
CTR

TAPS

Lavage
10 pA
TAPS, pH 9 TAPS, pH 9 0,1 s

Vr, -55 mV Vr, -50 mV


20 mV 20 mV
10 s 10 s
C D 300
1200 * *
Fréquence de décharge

1000 250
N.Po normalisée %

normalisée, %

800 200

600 150

400 100

200 50
0 0
Temps, s 30 60 90 120 Temps, s 30 60 90 120 150 180
Lavage Lavage

FIGURE 43. LES VARIATIONS DE PH EXTRACELLULAIRES MODULENT L’ACTIVITE DE PKD2L1 ET L’EXCITABILITE DE NcLCR-S.
A, Trace de courant représentatif enregistrée à -80 mV dans un NcLCR-S provenant d’animaux sauvages (WT, traces de
gauche) et délétés pour PKD2L1 (KO, traces de droite) avant, pendant et après l’application de solution d’acide citrique à
pH 5 (30 s, barre grisée). Dessous, traces de courant correspondant à des agrandissements temporels de régions indiquées
par des flèches, de la trace du dessus et issues d’un enregistrement avant (1), pendant (2) et après (3) l’acidification
extracellulaire. Nous pouvons noter que le courant entrant rapide induit par l’application d’acide est conservé chez les KO
où le courant unitaire n’est plus observé. B, Courant représentatif enregistré en mode voltage imposé à -80 mV (Vh) dans un

184
Résultats

NcLCR-S provenant d’animaux sauvages (WT, traces de gauche) et délétés pour PKD2L1 (KO, traces de droite), avant,
pendant et après l’application par pression d’une solution alcaline à pH 9 (TAPS, 30 s, barre grisée). Les traces du dessous
correspondent à des régions de la trace du dessus à un plus fort agrandissement temporel, sélectionnées avant (Contrôle),
pendant (TAPS) et après (Lavage) l’alcalinisation extracellulaire. Dessous, traces de potentiel représentatif, enregistré en
mode courant imposé (WT : Vr = -55 mV ; KO : Vr = -50 mV) dans le même NcLCR-S que représenté en A, avant, pendant et
après l’alcalinisation extracellulaire (TAPS, pH 8,8, 30 s, barre grisée).Nous pouvons noter que chez les animaux délétés
l’activité canal n’est plus enregistrée même lors de l’alcalinisation et la fréquence de décharge ne semble pas modulée. C,
Histogramme résumant le pourcentage moyen de variation de N.P 0 normalisée par rapport à la condition contrôle,
déterminé chez les animaux sauvages avant (CTR, barre noire), pendant (TAPS, barre blanche), et après (Lavage, barres
grises) l’alcalinisation extracellulaire (n = 7). La variation de N.P0 est significativement différente lorsque l’on compare N.P0
en présence de TAPS à la situation contrôle (0,003 ± 0,001 en contrôle vs. 0,02 ± 0,01 lors de l’application de TAPS ; n = 7 ; * : p
= 0,02). D, Histogramme résumant le pourcentage moyen de la fréquence de décharge normalisée par rapport à la condition
contrôle, déterminé chez les animaux sauvages avant (CTR, barre noire), pendant (TAPS, barre blanche), et après (Lavage,
barres grises) l’alcalinisation extracellulaire (n = 9). * : p < 0,05. Nous pouvons noter que chez les animaux sauvages,
l’alcalinisation extracellulaire induit une augmentation de la probabilité d’ouverture du canal (B et C) corrélée à une
augmentation de la fréquence de décharge (B et D) cependant il convient de noter que l’augmentation significative de la
décharge est retardée puisqu’elle a lieu pendant les premières secondes de lavage. Ces effets de l’alcalinisation ne sont plus
observés suite délétion de PKD2L1 (B, traces de droite). Milieu intracellulaire d’enregistrement KCl, E Cl = 2 mV.

185
Résultats

C. STADE DE MATURITE DES NcLCR BULBOSPINAUX CHEZ L'ADULTE

De nombreuses études se sont intéressées à l’état de maturité des NcLCR spinaux et

montrent que ces neurones conservent des marqueurs et des propriétés de neurones immatures

du nouveau né à l’âge adulte (Stoeckel et al., 2003; Kútna et al., 2013). Cette caractéristique est à

l’origine d’une des fonctions suggérées pour ces neurones, dans les processus de réparation

après lésion. Le terme de neurones en « mode d’attente » sert de ce fait à désigner cette

population neuronale.

1. LES NcLCR PRESENTENT UN ETAT DE MATURITE TRANSITOIRE CHEZ L'ADULTE :

MARQUEURS IMMUNOHISTOCHIMIQUES

Chez les jeunes animaux, les NcLCR localisés autour du canal central expriment des

marqueurs de neurones immatures et sont NeuN négatifs (Marichal et al., 2009). Chez l’animal

adulte, la plupart des informations recensées sur le degré de maturité des cellules péri-

canalaires concerne essentiellement les cellules localisées dans la couche épendymaire (Stoeckel

et al., 2003) et à ce jour, il existe peu de données sur les NcLCR du tronc cérébral. Dans ce but,

nous avons réalisé une série d’expériences pour analyser quantitativement le degré de maturité

des NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral et l’avons comparé aux résultats obtenus pour les

NcLCR-S PKD2L1+ spinaux.

Nous avons tout d’abord regardé l’expression de NeuN, un marqueur classique des

neurones matures, dans les NcLCR-S PKD2L1+ de souris adultes âgés de 3 mois. Dans la partie

caudale du tronc cérébral (niveau 2), 66 ± 3 % des NcLCR-S PKD2L1+ expriment NeuN (262

cellules NeuN+ sur les 361 NcLCR-S PKD2L1+ ; Figure 44. A et 45). Toutefois, il faut souligner

que le niveau apparent d’intensité de fluorescence est environ 4 fois plus faible que dans les

cellules voisines PKD2L1 négatives (intensité de marquage dans le corps cellulaire : 100 ± 5, 100

cellules du parenchyme et 28 ± 2 dans les 262 NcLCR-S PKD2L1+ ; p < 0,0001). De plus, les

résultats indiquent que la proportion des NcLCR-S PKD2L1+ exprimant NeuN augmente

progressivement de 54 ± 4 % au niveau 1 à 100 % dans les régions du canal central les plus

rostrales (niveau 4 ; Figure 45 ; p < 0,001). Parallèlement, l’intensité apparente du marquage

186
Résultats

NeuN semble également augmenter dans les NcLCR-S PKD2L1+ le long de l’axe caudo-rostral

(Figure 45. B).

A1 A2 A3

PKD2L1 10 µm NeuN Superposition

B1 B2 B3

PKD2L1 10 µm Nkx6.1 Superposition

C1 C2 C3

PKD2L1 10 µm DCX Superposition

D1 D2 D3

PKD2L1 10 µm HuC/D Superposition

FIGURE 44. CHEZ LA SOURIS ADULTE, LES NcLCR-S PKD2L1+ EXPRIMENT NEUN AINSI QUE DES MARQUEURS CLASSIQUES
D’IMMATURITE NEURONALE.

187
Résultats

FIGURE 44. CHEZ LA SOURIS ADULTE, LES NcLCR-S PKD2L1+ EXPRIMENT NEUN AINSI QUE DES MARQUEURS CLASSIQUES
D’IMMATURITE NEURONALE. A1 à D1, Marquages de coupes de tronc cérébral (niveau 2), provenant du même animal, à
l’aide d’anticorps anti-PKD2L1 (vert) avec soit NeuN (A2, rouge), Nkx6.1 (B2, rouge), DCX (C2, rouge) ou HuC/D (D2,
rouge). A3, La superposition des images montre que sur les 4 NcLCR-S PKD2L1+, seulement un seul n’exprime pas NeuN
(flèches, A1-3). B3, La superposition des images révèle que tous les NcLCR-S PKD2L1+ sont Nkx6.1+. Il faut noter la forte
intensité de fluorescence du marquage Nkx6.1 dans le noyau des NcLCR-S. C3, La superposition des images montre que
tous les NcLCR-S PKD2L1+ sont DCX+. D3, La superposition des images montre que seulement un NcLCR-S PKD2L1+
n’exprime pas HuC/D (flèches, D1-3).

Dans un second temps, nous avons analysé l’expression de marqueurs d’immaturité par

une étude immunohistochimique réalisée sur des coupes de tronc cérébral et de moelle épinière

provenant des mêmes animaux que ceux utilisés pour l’analyse de NeuN. Dans la moelle

épinière de jeunes rongeurs, des cellules ayant la morphologie typique des NcLCR expriment

Nkx6.1, une protéine homéodomaine présente dans les neurones en cours de différentiation de

la moelle épinière ventrale et également un marqueur classique d’immaturité (Fu et al., 2003;

Müller et al., 2003; Sabourin et al., 2009; Marichal et al., 2009; Hugnot & Franzen, 2011). Comme il

est illustré sur la figure 44. B, les NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral de souris adultes

expriment fortement Nkx6.1 (98 ± 1 % ; 52 cellules Nkx6.1+ sur les 53 NcLCR-S PKD2L1+ au

niveau 2). Toute la population des NcLCR-S PKD2L1+ de la moelle épinière au tronc cérébral

rostral expriment également fortement Nkx6.1 (99 ± 1 % des cellules co-expriment Nkx6.1 et

PKD2L1, tout niveau confondu ; 111 cellules Nkx6.1+ sur les 112 cellules PKD2L1+). Il est à noter

que Nkx6.1 est sélectivement exprimé dans les NcLCR. Dans un deuxième temps, nous avons

réalisé un marquage contre la protéine DCX. Nous démontrons également, que 90 ± 1 % des

NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral (niveau 2) co-expriment DCX (277 cellules DCX+ sur les

294 cellules PKD2L1+ ; Figure 44. C et 45. A) et que le pourcentage de co-expressions est

similaire dans tous les niveaux analysés (94 ± 2 % ; 468 cellules DCX+ sur les 524 NcLCR-S

PKD2L1+ ; Figure 45. A). Nous avons également observé au cours de cette étude que 63 ± 4 %

des NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral (niveau 2) expriment HuC/D (159 cellules HuC/D+ sur

les 262 NcLCR-S PKD2L1+ ; Figure 44. D et 45. A). Enfin, dans les jeunes rats, autour du canal

central, la présence d’immunoréactivité dirigée contre PSA-NCAM a été observée (Stoeckel et

al., 2003; Marichal et al., 2009). Nous avons donc recherché la présence de cette protéine dans les

NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral de souris adultes.

188
Résultats

A NeuN
ns ***
100 DCX

les NcLCR-S PKD2L1 + , %


** HuC/D

Co-expression dans
80

60

40

20

0
Niveau 1 2 3 4

B Niveau 1 Niveau 2

10 µm

Niveau 3 Niveau 4

FIGURE 45. PATRON D’EXPRESSION DES MARQUEURS D’IMMATURITE ET DE NEUN DANS LES NcLCR-S PKD2L1+ BULBO-
SPINAUX. A, Histogramme montrant le pourcentage de co-expression moyen de NeuN (barres noires), DCX (barres
blanches) et HuC/D (barres grises) dans les NcLCR-S PKD2L1+ le long de l’axe rostro-caudal (niveau 1 à 4). Les données
indiquent que l’expression de NeuN dans les NcLCR-S augmente le long de l’axe rostro-caudal tandis que le patron
d’expression de DCX reste stable et similaire à tous les niveaux. L’expression de HuC/D montre une tendance à la
diminution le long de l’axe rostro-caudal. Nombre de cellules total utilisées pour l’analyse de chaque marqueur : NeuN : 296
cellules au niveau 1 ; 208 cellules au niveau 2 ; 153 cellules au niveau 3 et 16 cellules au niveau 4. DCX : 213 cellules au
niveau 1 ; 156 cellules au niveau 2 ; 138 cellules au niveau 3 ; 17 cellules au niveau 4. HuC/D : 173 cellules au niveau 1 ; 144
cellules au niveau 2 ; 218 cellules au niveau 3 et 26 cellules au niveau 4. ns : non significatif ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001. La
superposition des images montre l’immunoréactivité de PKD2L1 (vert) et de NeuN (rouge) dans des coupes du niveau 1 à 4
et illustre l’augmentation du pourcentage de NcLCR-S PKD2L1+ exprimant NeuN. Les NcLCR-S PKD2L1+ qui n’expriment
pas NeuN sont indiqués par les triangles blancs.

189
Résultats

Cependant, bien que le marquage de PSA-NCAM soit observé dans les niches neurogéniques

adultes telles que la zone sous ventriculaire et le gyrus denté de l’hippocampe, dans les mêmes

conditions, nous n’avons pas pu détecter de marquage anti-PSA-NCAM dans les NcLCR-S

PKD2L1+ bulbo-spinaux (résultat non illustré).

Finalement, bien que le nombre de NcLCR-S PKD2L1+ exprimant DCX apparaisse similaire

dans les 4 niveaux d’intérêt, il y a une tendance à la diminution du nombre de NcLCR-S

PKD2L1+ exprimant HuC/D le long de l’axe caudo-rostral (Figure 45. A).

L’analyse présentée ici, démontre que les NcLCR-S PKD2L1+ expriment NeuN et HuC/D

ainsi que DCX et Nkx6.1, deux marqueurs indicatifs d’immaturité neuronale. De plus, suivant

l’axe caudo-rostral du canal central, il apparait que le nombre de NcLCR-S exprimant DCX est

constant tandis que le nombre de NcLCR-S PKD2L1+ / NeuN+ augmente vers les niveaux

rostraux tandis que celui de NcLCR-S PKD2L1+ HuC/D+ tend à diminuer.

2. LES NcLCR PRESENTENT UN ETAT DE MATURITE TRANSITOIRE CHEZ L’ADULTE : UN

MARQUEUR ELECTROPHYSIOLOGIQUE, LE POTENTIEL DE REVERSION DU CHLORE

La valeur physiologique du potentiel de réversion des ions chlorure (E Cl) représente un

autre marqueur de neurone immature à l'origine de l'effet excitateur du GABA et de la glycine

au cours du développement (Wu et al., 1992; Gao & Ziskind-Conhaim, 1995; Ben-Ari, 2002). En

effet, les neurones immatures présentent une forte concentration intracellulaire en chlore ([Cl]i),

induisant une valeur de ECl supérieure au potentiel de membrane (Vm) et une force

électromotrice négative (Vm - ECl) à l'origine de l'effet dépolarisant du GABA et de la Glycine,

neurotransmetteurs inhibiteurs dans le SNC adulte. De plus, il a été précédemment démontré

que chez la tortue juvénile, 39 % des NcLCR spinaux ont une valeur de ECl plus dépolarisée que

Vm, autour de -35 mV, à l'origine d'un effet dépolarisant du GABA dont l'application induit

l'émission de potentiel d'action (Reali et al., 2011). Nous avons donc analysé la valeur

physiologique de ECl dans les NcLCR-S du tronc cérébral. Pour cela, nous avons réalisé des

enregistrements électrophysiologiques sur tranche de tronc cérébral de souris PKD2L1:EGFP+

adulte (2-3 mois) en configuration patch-perforé par l'ajout de gramicidine (0,1-0,15 mg/ml)

dans l'électrode d'enregistrement. Nous avons également incorporé de l'Alexa 594 dans

l'électrode d'enregistrement afin de confirmer que la membrane n'était pas rompue lors des

190
Résultats

enregistrements en patch-perforé et pour vérifier la morphologie du neurone enregistré après

passage en configuration cellule entière (Figure 46. A et B, image au centre). Pour mettre en

évidence la valeur de ECl, nous avons enregistré le courant induit par l'application par pression

de GABA (1mM, 50 ms) de -100 à +20 mV (incréments 10, Figure 46. A1, 2 et B. 1,2).

En configuration patch perforé, les NcLCR-S PKD2L1+ ont un potentiel de repos proche

de celui trouvé en configuration cellule entière (Vr : -60,8 ± 1,7 mV en patch-perforé vs. -52,6 ±

2,5 mV en configuration cellule entière ; n = 6). De plus, nous observons la présence de deux

types de réponses, suite à l'application par pression de GABA : un courant qui s'inverse autour

de -80 mV dans certains NcLCR-S (Erev, GABA ≈ -83 mV, n = 3 ; voir un exemple Figure 46. A1) ou

pour des valeurs de potentiels de membrane plus dépolarisées, autour de -55 mV, dans 3 des six

NcLCR-S enregistrés (Erev, GABA ≈ -53 mV, n = 3 ; voir un exemple Figure 46. B1). Le courant

GABA enregistré étant dû au passage d'ions chlorures à travers les R-GABA-A suite à leur

ouverture, la valeur du potentiel d'inversion du courant GABA donne indication de la valeur

physiologique de ECl. Ainsi, la représentation de la fonction courant/voltage pour chacun des

deux types de réponses GABA a permis d'identifier deux populations de NcLCR-S qui diffèrent

par la valeur de ECl physiologique (-83,4 ± 5,8 mV, n = 3 vs. -53,1 ± 1,3, n =3 ; Figure 47 A). La

dépendance du courant GABAergique à ECl est confirmée lors du passage en configuration

cellule entière puisque dans cette condition le courant induit par l'application par pression de

GABA, s'inverse pour un potentiel de membrane de 3,6 ± 1,3 (n = 6 ) proche de la valeur de ECl

fixée à 2 mV pour la solution intra-pipette utilisée (Figure 46. A2 et B2 et 46. A).

FIGURE 46. LES NcLCR-S PRESENTENT DEUX REPONSES AU GABA. A1 et B1, Traces représentatives du courant induit par
l’application par pression de GABA (1 mM, 50 ms) à différentes valeurs de potentiel de maintien enregistré en configuration
patch perforé. Il faut noter que le courant s’inverse autour de -80 mV (A1) ou de -50 mV (B1) . La production de la fonction
courant/voltage a permis de calculer le potentiel d’inversion du courant GABA au niveau du NcLCR représenté qui est de -
83 mV (A1) ou de -53 mV (B1). A2 et B2, Illustration du NcLCR-S enregistré en A (A2) ou B (B2), sur tranche de tronc
cérébral de souris adulte PKD2L1:EGFP+. En configuration patch perforé (image du haut), l’Aexa 594 (rouge) est localisée
dans l’électrode d’enregistrement, tandis que lors du passage en configuration cellule entière, la rupture de la membrane
permet la dialyse du milieu intrapipette, phénomène visualisé par la diffusion de l’Alexa 594 (rouge) dans le NcLCR-S GFP+
(vert) enregistré. A3 et B3, Enregistrement en configuration cellule entière et mode voltage imposé du courant induit par
l’application de GABA (1 mM, 50 ms) à différentes valeurs de potentiel de membrane. Il faut noter que dans cette
configuration, le courant GABA s’inverse pour des potentiels plus dépolarisés : à -4 mV (A3) ou +3 mV (B3) , donc proche de
la valeur de ECl fixé par le milieu intrapipette (milieu intracellulaire d’enregistrement KCl, E Cl = 2 mV). A4 et B4,
Enregistrement en configuration patch-perforé et en mode courant imposé montrant l’effet de l’application de GABA (1
mM, 50 ms) sur le potentiel d’un NcLCR-S PKD2L1:EGFP+. L’application de GABA (1 mM, 50 ms) bloque la décharge
spontanée du NcLCR-S (A4 et B4) et induit une soit une hyperpolarisation (~ 30 mV, A4), soit une dépolarisation (~ 14 mV,
B4). Ces résultats montrent qu’il existe un double effet du GABA : un dépolarisant et un hyperpolarisant. Il convient de
noter que dans ces deux effets le GABA exerce un effet général de type inhibiteur, puisque son application est toujours
corrélée à un arrêt de l’émission de PA. (Voir page suivante).

191
Résultats

A1 A2 A3
Patch Perforé Cellule entière
GABA, 1 mM Patch Perforé GABA, 1 mM
Erev,GABA = -83 mV Erev,GABA = -4 mV
20 mV
100 pA
1s cc 0 mV
-40 mV EGFP / Alexa 594
-40 mV
Cellule entière
-60 mV
-80 mV
-80 mV
-90 mV
-100 mV 0.2 nA
1s

A4 GABA, 1 mM

20 mV
Vr, -55 mV
10 s

B1 Patch Perforé B2 B3 Cellule entière


GABA, 1 mM Patch Perforé GABA, 1 mM
Erev,GABA = -53 mV Erev,GABA = 3 mV
20 mV
0 mV
-40 mV
EGFP / Alexa 594 -40 mV
-50 mV
-60 mV Cellule entière
-80 mV
-80 mV

50 pA 1 nA
1s 1s

B4 GABA, 1 mM

20 mV

Vr, -63 mV 10 s

FIGURE 46. LES NCLCR-S PRESENTENT DEUX REPONSES AU GABA.

192
Résultats

A B
20 Vr = -61 ± 2 mV (n=6) 30
Potentiel de réversion pour IGABA

0 10 Hyper.

Force électromotrice
(Vr – Erev,GABA, mV)
4 ± 1 mV
-20
(Erev,GABA ,mV)

-10
Dépol.
-40
-30
-53 1 mV
-60
-50
-80
-83 ± 6 mV -70
-100

FIGURE 47. LA DOUBLE ACTION DU GABA EST SOUS-TENDUE PAR DEUX VALEURS PHYSIOLOGIQUES DE ECL DANS LES NcLCR-
S DE SOURIS ADULTE. A Graphique représentant la distribution du potentiel d’inversion pour le courant GABA (Erev,GABA)
calculés à partir d’enregistrements en configuration patch perforé dans 6 cellules et après passage en configuration cellule
entière dans les mêmes cellules Cette analyse montre que les cellules se répartissent en deux groupes où Erev, GABA est soit
inférieur (points rouges) soit supérieur (points verts) au potentiel de repos (Vr). B, Graphique illustrant la force
électromotrice pour les ions chlorures calculée comme la différence entre V r et Erev,GABA. Ces données expliquent les effets
opposés du GABA (dépolarisant et hyperpolarisant) sur l’excitabilité des NcLCR-S. En A et B, les moyennes pour chaque
groupe de points sont représentées sur la droite. Enregistrements en configuration patch (points rouges et verts) et en
configuration cellule entière (points bleus).

En mode courant imposé, l'application par pression de GABA (1 mM, 10 s) produit également

deux effets opposés. La moitié des NcLCR-S enregistrés présentant un ECl autour de -83 mV,

sont inhibés par le GABA (voir un exemple Figure 46. A3). La valeur de ECl étant inférieure à Vm

(≈ -61 mV, n = 6), il en résulte une force électromotrice positive (Figure 47. B) induisant

l'hyperpolarisation membranaire observée dans le tracé A3 de la figure 46. Cette

hyperpolarisation est maintenue tout au long de l'application, traduisant une faible

désensibilisation des R-GABA-A, et entraine l'arrêt de l'émission de PA (voir un exemple Figure

46. A3). Au contraire, dans les NcLCR-S où, le courant induit par l'application de GABA

s'inverse pour des potentiels plus dépolarisés que Vr, autour de -53 mV, la force électromotrice

sur les ions chlorures est négative (Figure 47. B) et explique l'effet excitateur produit par le

GABA, qui se caractérise par une dépolarisation membranaire maintenue au cours de la

193
Résultats

stimulation et par l'émission d'un potentiel d'action en début d'application (voir un exemple

Figure 46. B3).

Ainsi, ces résultats démontrent l'existence de deux sous types de NcLCR-S PKD2L1+

dans le tronc cérébral de souris adultes, qui sont caractérisés par des valeurs distinctes de ECl.

Selon les neurones enregistrés, cette valeur de ECl est soit supérieure soit inférieure au Vr,

induisant des variations dans le sens du flux net d'ions chlorures lors de l'activation des

récepteurs GABA-A, qui sont à l'origine des effets excitateurs ou inhibiteurs du GABA. La

présence d'effets excitateurs induits par le GABA témoigne du caractère immature de ces

NcLCR-S et rejoint les résultats obtenus au cours de l'étude immunohistochimique.

194
195
Discussion

IV. DISCUSSION

L'ensemble de cette étude représente la première caractérisation morpho-fonctionnelle

des neurones qui contactent le LCR au niveau bulbo-spinal chez la souris adulte et constitue la

première analyse de l’activité canal portée par PKD2L1 dans un système natif.

A. MORPHOLOGIE, DISTRIBUTION ET PROPRIETES GENERALES DES

NcLCR PKD2L1+ BULBO-SPINAUX

1. LOCALISATION ET ORGANISATION DES NcLCR PKD2L1+ AUTOUR DU CANAL

CENTRAL

Par une approche immunohistochimique, nous avons étudié la distribution et

l’organisation des NcLCR PKD2L1+ au sein du SNC chez la souris de P0 à l’âge adulte. Les

résultats montrent que les NcLCR PKD2L1+ sont présents dès P0 autour du canal central au

niveau bulbo-spinal. Ces résultats rejoignent ceux obtenus lors de précédentes études

s'intéressant aux capacités de proliférations post-natales de ces cellules, par l’analyse de

l’incorporation de BrdU, et qui ont démontré que les NcLCR spinaux sont générées durant la

phase embryonnaire (entre E7 et E22) à partir de la zone ventriculaire (Marichal et al., 2009;

Kútna et al., 2013). Ainsi, les NcLCR du tronc cérébral et de la moelle épinière constitueraient

une seule et même population neuronale provenant de précurseurs communs. Dans cette

analyse, nous avons également recherché la présence de NcLCR PKD2L1+ dans d’autres régions

du SNC. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence que des cellules PKD2L1+ sont retrouvées

dans les régions hypothalamiques qui bordent soit le 3V, soit l’espace sous-arachnoïdien au

niveau de la pie-mère. Cependant, contrairement à ce qui avait été proposé par les travaux de

Huang et collaborateurs, nous n'avons pas visualisé de cellules PKD2L1+ ayant la morphologie

classique des neurones de contact au niveau de l'hypothalamus ou d'autres régions du SNC

(Huang et al., 2006). Certaines de ces cellules, notamment celles localisées dans le noyau

paraventriculaire hypothalamique sont situées à distance du ventricule, et de manière générale,

la présence de contact entre l’ensemble de ces cellules PKD2L1+ et le LCR (3V ou dans l’espace

sous-arachnoïdien) n’a pas été visualisée. Il semblerait donc que ces cellules PKD2L1+

hypothalamiques correspondent à une autre population neuronale que celles localisées au

196
Discussion

niveau bulbo-spinal. Enfin, même si chez les mammifères, il a été montré que les NcLCR

localisés autour du 3V présentent une morphologie distincte des NcLCR spinaux (Vigh & Vigh-

Teichmann, 1998; Zhang et al., 2003; Xiao et al., 2005), d’autres études basées sur des marquages

spécifiques des neurones de contact (Lu et al., 2008) semblent nécessaires pour confirmer la

nature de ces cellules PKD2L1+ des régions hypothalamiques. Pour ces raisons, nous nous

sommes consacrés à l'étude des cellules PKD2L1+ au niveau bulbo-spinal.

L'organisation de ces cellules subit une maturation précoce puiqu'à p7 leur organisation

autour du canal central est similaire à celle retrouvée à l'âge adulte et ne semble plus subir de

modification au cours du développement. Ces résultats sont en accord avec l’étude récente de

Kùtna et collaborateurs qui montre une redistribution cellulaire des NcLCR spinaux entre P0 et

P8 (Kútna et al., 2013) attribuée à l’élongation de la moelle épinière ayant lieu dans cette même

période (Sabourin et al., 2009). Ainsi, il semblerait que la maturation de ce système neuronal, au

niveau bulbo-spinal, soit réalisée au cours du développement post-natal de la moelle épinière.

Chez la souris adulte, ces neurones sont localisés tout le long du canal central, de la

moelle épinière sacrée jusqu'au tronc cérébral en aval du 4V où seules quelques rares cellules

sont encore observées. Dans les différents niveaux d'intérêt (de la moelle épinière cervicale :

niveau 1 au tronc cérébral rostral : niveau 4), le marquage PKD2L1 a permis de mettre en

évidence deux groupes de cellules PKD2L1+ autour du canal central : un prédominant qui

partage les caractéristiques morphologiques classiques des neurones de contact (Barber et al.,

1982; Jaeger et al., 1983; Vigh-Teichmann & Vigh, 1989; Stoeckel et al., 2003) et l'autre plus

restreint, comprend une population neuronale dont la morphologie est de type multipolaire et

qui ne présente pas de projection apparente vers le canal central. La présence de ces deux sous-

types cellulaires PKD2L1+ localisées à proximité du canal central, pose la question de l’existence

de populations neuronales communes qui diffèreraient de part leur état de maturité. En effet, il

peut être envisagé que lors de leur maturation, les NcLCR PKD2L1 + de type bipolaire perdent

leur prolongement en contact du LCR, migrent dans le parenchyme et adoptent une

morphologie plus complexe de type multipolaire, phénomène observé lors de la maturation

neuronale (Mérot et al., 2009; Hong et al., 2013). Cependant, nous n'avons pas testé cette

hypothèse dans cette étude qui est basée spécifiquement sur l'analyse des cellules PKD2L1+

présentant la morphologie typique des NcLCR et au cours de laquelle nous avons exclu les

cellules appartenant au deuxième groupe.

197
Discussion

Au niveau bulbo-spinal, les cellules PKD2L1+ sont essentiellement localisées sous la

couche épendymaire et contrairement à ce qui est observé chez le rat (Shimosegawa et al., 1986;

Nagatsu et al., 1988; Stoeckel et al., 2003; Marichal et al., 2009), chez lesquels les NcLCR sont

essentiellement intra-épendymaires, aucune cellule n'a été observée dans l'épendyme. Cette

différence semble plutôt provenir d’une distinction inter-espèce que d’une différence de

population neuronale puisque l'immunoréactivité contre MAP2 confirme l'absence de NcLCR

intra-épendymaire. L'ensemble des NcLCR-S MAP2+ co-expriment PKD2L1, ce qui conforte

l’idée de l’existence d’une seule population de NcLCR au niveau bulbo-spinal. Ainsi chez la

souris, PKD2L1 apparait donc être un marqueur spécifique des NcLCR-S bulbo-spinaux, qui

dans cette espèce, présentent tous exclusivement une position sous-épendymaire (NcLCR-S).

Nous avons démontré que les NcLCR-S PKD2L1+ sont présents en forte densité (5-10

cellules/10 µm d'épaisseur de tissu) autour du canal central et que cette densité dépend du

niveau dans l'axe rostro-caudal. Ainsi, la plus forte densité est retrouvée au niveau de la moelle

épinière cervicale, puis celle-ci diminue progressivement vers les niveaux rostraux, pour être

presque nulle au niveau du 4V où seuls quelques rares NcLCR PKD2L1+ sont parfois observés.

De manière intéressante, en plus de la densité cellulaire, l'organisation des cellules autour du

canal central apparait également dépendante de la position dans l'axe rostro-caudal. En effet,

dans les régions rostrales du tronc cérébral, les NcLCR-S sont majoritairement situés dans les

portions latérales du canal, tandis que dans le tronc cérébral caudal (niveau 2) et dans la moelle

épinière cervicale (niveau 1), le corps cellulaire est surtout retrouvé dans les portions dorso-

ventrales du canal central. Au niveau de la moelle épinière cervicale (niveau 1), les NcLCR-S

PKD2L1+ en position ventrale par rapport au canal central, possèdent les plus longs

prolongements dendritiques, tandis qu'au niveau du tronc cérébral ce sont ceux qui ont une

position latérale.

Les conséquences fonctionnelles d'un tel réaménagement le long de l'axe rostro-caudal, n'est pas

établi, mais nous pouvons supposer qu'il y a une ségrégation cellulaire permettant d'assurer

une spécificité de cible ou de fonction de manière similaire à l'organisation somatotopique des

motoneurones spinaux (Bácskai et al., 2014). Ainsi, il se pourrait que même s’il n’existe qu’une

seule population de NcLCR PKD2L1+ bulbo-spinaux sur le plan morpho-phénotypique, cette

différence de localisation permette une spécificité fonctionnelle. Ainsi, il y aurait un codage

198
Discussion

tenant compte de la position rostro-caudale mais également autour du canal central et qui serait

à la base d’une intégration différentielle des NcLCR au sein de réseaux neuronaux particuliers.

2. MORPHOLOGIE DES NcLCR PKD2L1+ : DES CELLULES POLARISEES

Si l'organisation des NcLCR suggère la présence d'une spécialisation fonctionnelle,

l'ensemble de ces neurones présente une morphologie homogène qui est caractéristique de celle

retrouvée chez d'autres espèces (Barber et al., 1982; Jaeger et al., 1983; Vigh & Vigh-Teichmann,

1998; Stoeckel et al., 2003). Ces neurones présentent une morphologie simple, avec un corps

cellulaire rond et de faible diamètre (≈10 µm). Ils émettent un prolongement dendritique

(MAP2+ et NF-160-) à travers la couche épendymaire qui se finit par une structure ampoulée ou

bud de diamètre constant (≈3 µm) plongeant dans le LCR. Sur le sommet du bud, nous avons

parfois observé une ou plusieurs structures ciliaires qui ne sont vraisemblablement pas de

nature primaire et dont la nature reste indéterminée. Il existe cependant quelques différences

morphologiques, avec les NcLCR de vertébrés non mammifères où notamment le bud contient

souvent plusieurs cils (Dale et al., 1987; Russo et al., 2004; Barreiro-Iglesias et al., 2009), qui

peuvent être dues à une variation inter-espèces ou à différents états de développement comme

le suggère une récente étude réalisée chez le rat (Kútna et al., 2013). Nous avons également

observé la présence d'épaississement présentant une forte immunoréactivité contre PKD2L1 au

niveau de la dendrite. Dans l'hypothalamus et la glande pinéale, où des NcLCR sont également

présents, la présence de structure similaire a également été décrite et celle-ci semble

correspondre à des gouttes lipidiques (Vigh et al., 2002; Kokel et al., 2013). Nous ne pouvons pas

confirmer cette hypothèse et des études supplémentaires sont nécessaires pour identifier la

nature de ces élargissements dendritiques dans les NcLCR-S PKDL21+.

De plus, les NcLCR bulbo-spinaux apparaissent polarisés puisqu'ils émettent un

prolongement de type axonal dans le parenchyme qui est essentiellement révélé par la

fluorescence GFP sur coupes sagittales. En effet ceci s'explique par le fait que PKD2L1 est un

canal protéique localisé dans des compartiments membranaires spécifiques tandis que l'EGFP

est cytosolique et peut librement diffuser dans l'ensemble des compartiments neuronaux. Nos

résultats montrent que ce prolongement n'est pas une dendrite (MAP2 -), cependant la nature

axonale de ce prolongement doit être vérifiée puisqu'il n'exprime pas non plus le NF 160, un

199
Discussion

marqueur sélectif des filaments intermédiaires trouvés dans les axones matures (Perrot et al.,

2008; Perrot & Eyer, 2009). L'absence d'expression de ce marqueur axonal est en accord avec les

résultats issus de NcLCR spinaux chez le rat, où les axones sont NF- mais expriment la protéine

GAP 43+ (Stoeckel et al., 2003) retrouvée dans les axones de neurones immatures (Morita &

Miyata, 2013). De plus, les prolongements que nous avons observés décrivent un trajet similaire

aux faisceaux ventro-médian d'axones GAP 43+ décrits chez le rat (Stoeckel et al., 2003), ce qui

nous permet de supposer que ces prolongements sont de nature axonale. Il nous faut toutefois

rester prudents, puisque lors de la description de cette voie de projection, l’origine des fibres

axonales GAP43+ ou P2X2+, n’a jamais été clairement établie. De ce fait, il peut être envisagé que

ces projections ne soient pas émises par les NcLCR. De même, dans nos conditions

expérimentales, même si la plupart des cellules EGFP+ sont PKD2L1+ et contactent le LCR, il

existe également quelques cellules EGFP/PKD2L1+ dans le parenchyme qui ne présentent pas de

contact visible avec le LCR. Nous ne pouvons donc pas affirmer, dans ces conditions

expérimentales, que les fibres EGFP+ observées proviennent uniquement des NcLCR bulbo-

spinaux. La difficulté majeure pour la détermination des voies de projection, également

soulevée lors des travaux de Vigh et collaborateurs provient du fait que ce prolongement de

type axonal EGFP+ ne peut être suivi que sur de courtes distances dans le parenchyme, ce qui ne

permet pas de déterminer les sites de projection ainsi que les cibles de ces neurones. Mettre en

évidence la nature et le lieu des régions innervées par les NcLCR-S représente une étape clé

dans la détermination de leur rôle physiologique et représente une future étape indispensable

dans la compréhension de ce système neuronal.

Finalement, puisque de nombreuses études montrent que les NcLCR possèdent un cil

sur le bud qui baigne dans le LCR (Dale et al., 1987; Stoeckel et al., 2003; Marichal et al., 2009;

Alfaro-Cervello et al., 2012), nous avons recherché s'il était également présent sur le bud des

NcLCR-S. Généralement, l'organisation et la composition protéique des cils permettent de

différentier les cils primaires (non mobiles) des cils mobiles (Satir & Christensen, 2008). Les

cellules épendymaires constituant la paroi des cavités ventriculaires et séparant le LCR du

MEC, possèdent des cils mobiles impliqués dans la circulation du LCR (Banizs et al., 2005;

Sawamoto et al., 2006). Les cils primaires sont présents sur le soma de la plupart des neurones

du SNC (Fuchs & Schwark, 2004). Bien que leur rôle soit peu connu, il a été proposé qu'ils

puissent agir comme des chémo- et mécano-détecteurs de la composition et du mouvement des

fluides (Fuchs & Schwark, 2004) et qu'ils soient impliqués dans le développement du tube
200
Discussion

neural (Bay & Caspary, 2012). De même, le rôle des cils présents sur le bud des NcLCR est

encore inconnu, mais du fait de sa position, il est supposé qu'il agit comme un senseur de la

composition ou du mouvement du LCR (Vigh & Vigh-Teichmann, 1998; Vígh et al., 2004). La

plupart des études montrant la présence d'un cil sur le bud est basée sur des études de

microscopie électronique du bud lui même, de ce fait la nature primaire ou mobile n'est pas

déterminée. Il convient de rappeler, que la caractérisation de la structure du cil issu d'un

NcLCR-S est très difficile de part l'environnement cellulaire de ces neurones. En effet, les

cellules épendymaires portent de nombreux cils mobiles, de ce fait la visualisation d'un cil sur le

bud devient plus complexe.

Dans cette étude nous montrons que les NcLCR-S PKD2L1+ possèdent une structure ciliaire

marquée par l'alpha-tubuline acétylée (α-tub. Ac) de quelques micromètres de longueur (1 à 3

µm) émergeant du bud. Cependant, quand nous avons testé son immunoréactivité pour

l'adenylate cyclase de type 3 (AC3), un marqueur sélectif des cils primaires (Bishop et al., 2007),

nous avons observé de nombreuses structures AC3+ dans l'ensemble de la coupe, mais au

niveau des NcLCR-S, la présence de cils AC3+ a été visualisée au niveau du corps cellulaire et

non pas sur le bud. Il s'agit de la première démonstration de la présence d'un cil sur le soma des

NcLCR-S bulbo-spinaux. Ce résultat est en accord avec une étude récente utilisant la technique

de microscopie électronique sur la moelle épinière de souris et montrant que des cellules autour

du canal central dont la morphologie est similaire, aux NcLCR présentent un cil unique dont la

nature n'est pas spécifiée et qui émerge du soma (Alfaro-Cervello et al., 2012). Il est supposé que

les cils primaires jouent un rôle lors du développement (Lehtinen & Walsh, 2011) et qu'ils soient

impliqués dans la fonction chémodétectrice permettant entre autres, de détecter les substances

bioactives (peptides, hormones, neurotransmetteurs) diffusant du LCR vers le MEC (Fuchs &

Schwark, 2004). Il peut donc être supposé que grâce à la présence du cil sur le corps cellulaire,

les NcLCR-S PKD2L1+ pourraient être capables de détecter des modifications mécaniques ou

chimiques du milieu interstitiel. De manière intéressante, la protéine PKD2 est présente sur la

région basale du cil primaire des cellules épithéliales rénales et des cellules endothéliales

vasculaires où elle confère, respectivement, un rôle de mécanodétection du flux d'urine

primitive ou de sang (Abou Alaiwi et al., 2009). De plus, récemment des études ont montré que

PKD2L1 est localisée avec PKD1L1 sur la membrane des cils primaires où ce canal est

responsable d'un courant cationique et d'un signal calcique intra-ciliaire participant aux

processus de transport protéiques dans le cil (DeCaen et al., 2013; Delling et al., 2013). La
201
Discussion

présence de PKD2L1 n'est pas indispensable à la formation du cil mais semble importante pour

la fonction physiologique du cil (Delling et al., 2013). Ces résultats posent la question du rôle de

la dendrite et du bud. En effet, si la fonction sensorielle portée par le cil primaire est localisée au

niveau du corps cellulaire, l’implication du bud dans cette fonction est ouverte à débat. Nous

pouvons penser d’une part, que la présence de ces deux structures : le cil primaire et le bud en

contact direct soit avec le MEC soit avec le LCR, permette une meilleure discrimination des

variations environnementales par la détection de modifications entre ces deux milieux

liquidiens. D’autre part, il ne peut être écarté que le bud soit impliqué dans une toute autre

fonction ce qui est supporté par le fait que de précédentes études, qui se sont intéressés à la

morphologie du bud des NcLCR spinaux de souris et de rats, ont montré qu'il était de forme

ronde (entre 3 et 5 µm de diamètre) et généralement dépourvu de structure microtubulaire de

type centrosomique constituant la base du cil (Bruni & Reddy, 1987; Bjugn et al., 1988). Il serait

intéressant de compléter et de confirmer nos résultats par une étude dédiée à l'ultrastructure du

bud afin de d’identifier la fonction de cette spécialisation cellulaire. Cependant, nos résultats

sont en accord avec de précédentes études (Stoeckel et al., 2003; Marichal et al., 2009), et vont

dans le sens de la présence d'un cil α-tub. AC+ et AC3- sur cette protubérance dendritique ce qui

indique la présence d'un cil sur le bud baignant dans le LCR et qui argue en faveur d'un rôle

sensoriel assuré par cette structure.

3. PKD2L1 EST UN MARQUEUR SPECIFIQUE DES NcLCR-S BULBO-SPINAUX :

IMPLICATION FONCTIONNELLE

PKD2L1 est un membre de la super famille des canaux TRP qui a tout d'abord était

décrit au niveau des reins (Nomura et al., 1998; Basora et al., 2002) puis au niveau des bourgeons

du goût (Huang et al., 2006; Nelson et al., 2010) où il semble être impliqué dans la détection du

goût aigre (Huang et al., 2006; Horio et al., 2011). Le développement de souris transgéniques

PKD2L1:EGFP a permis de mettre en évidence la présence de NcLCR exprimant le canal

PKD2L1 au niveau de la moelle épinière et a supposé la présence de ces neurones PKD2L1+

dans le tronc cérébral et l'hypothalamus (A. L. Huang et al. 2006). Par l'utilisation de ce même

modèle expérimental, nous avons confirmé la présence de NcLCR PKD2L1+ au niveau du tronc

202
Discussion

cérébral et avons montré que tous les NcLCR-S sont positifs pour PKD2L1. PKD2L1 semble

donc représenter un marqueur spécifique des NcLCR-S bulbo-spinaux.

L'expression de PKD2L1 semble polarisée puisque cette protéine est uniquement retrouvée sur

le compartiment somato-dendritique des NcLCR-S, avec une plus forte immunoréactivité au

niveau du bud, mais n'est jamais observée au niveau du prolongement de type axonal. La

présence du canal PKD2L1 sur une structure en contact direct avec le LCR permet de penser

que ce canal agit comme un senseur afin de détecter des variations de la composition du LCR

ou du MEC. Cette localisation subcellulaire particulière supporte également l'idée d'une

polarisation fonctionnelle des NcLCR-S où le compartiment somato-dendritique (intégrant le

bud) représenterait le site d'intégration du signal (présence des molécules bioactives,

modifications de la composition du LCR ou du MEC). Les informations collectées par les

NcLCR-S PKD2L1+ seraient intégrées sous forme d'émission de PA qui se propageraient le long

du prolongement de type axonal pour agir à distance sur des partenaires. Ceci est supporté par

le fait que nous avons noté une plus grande immunoréactivité pour PKD2L1 au niveau du bud.

Cependant, ces études immunohistochimiques ne permettent pas de réaliser une analyse

quantitative et fonctionnelle, de ce fait, la réalité de cette observation a été investiguée par la

réalisation d'enregistrements en configuration cellule entière et outside-out au niveau du bud.

En configuration cellule entière, les enregistrements n'ont révélé aucune différence avec ceux

effectués au niveau du soma et seules quelques ouvertures de canal pouvant provenir de

l’ensemble du compartiment somato dendritique (de part la grande résistance et la petite taille

de ces cellules) ont été enregistrées. Et lors des enregistrements en configuration outside-out,

nous n'avons jamais observé d'activité canal, témoignant de la faible proportion de canaux

fonctionnels à ce niveau. Ces résultats posent la question de la présence de canal PKD2L1

fonctionnel au niveau du bud et renforcent l’idée que cette structure puisse avoir une fonction

différente que celle de senseur environnemental. De plus, une étude récente montre que le canal

PKD2L1 est localisé au niveau des cils primaires (DeCaen et al., 2013; Delling et al., 2013), qui

pour les NcLCR se trouvent sur le corps cellulaire. Enfin, cette forte immunoréactivité contre

PKD2L1 pourrait également être due à la présence de cette protéine dans le compartiment

cytosolique et notamment au niveau du RE, où elle pourrait de manière similaire à son

homologue PKD2 être impliquée dans le phénomène de « calcium induced-calcium release »

(Cantiello, 2004; Delmas et al., 2004b). Identifier la localisation subcellulaire du canal PKD2L1

dans les NcLCR bulbo-spinaux et rechercher son rôle dans l'homéostasie calcique représentent
203
Discussion

deux points importants pour la compréhension de la physiologie et de la fonction de cette

population neuronale.

4. PROPRIETES ELECTROPHYSIOLOGIQUES GENERALES DES NcLCR PKD2L1+ DU TRONC

CEREBRAL

L'enregistrement des NcLCR sur tranche de tronc cérébral de souris adulte

PKD2L1:EGFP montre également que cette population neuronale présente des propriétés

passives homogènes caractérisées par une forte résistance membranaire et une faible capacité en

relation étroite avec leur petite taille. L'analyse de l'activité de décharge de ces cellules révèle la

présence de deux populations neuronales, une présentant une décharge tonique (émission de

PA tout au long de la stimulation), et une autre où seulement un ou quelques PA sont générés

en début de stimulation (décharge phasique). Ces résultats tout d’abord confirment la nature

neuronale des NcLCR et d’autre part, sont en accord avec ceux retrouvés dans les NcLCR

spinaux (Russo et al., 2004; Marichal et al., 2009). Cependant, nous n'avons jamais observé la

réponse lente calcique, caractéristique des neurones immatures, décrite dans les NcLCR spinaux

de rats néonataux. Cette différence est probablement due à la différence d'âge des animaux

entre les souris adultes (P50-70) et les jeunes rats à différents âges (néonataux : P0-P5, juvéniles :

P15-P18). Ainsi, chez les souris adultes ces neurones seraient dans un état de maturité plus

poussé qu’en période néonatale. Cependant, de nombreux résultats vont en faveur de variations

inter-espèces existant au sein de cette population neuronale et qui pourraient également

expliquer cette différence de résultats.

Ces deux types de décharge ne sont pas liées au canal PKD2L1, puisqu'elles sont toujours

présentes suite à sa délétion, ni à des variations dans les propriétés passives de ces neurones.

Nous pouvons cependant supposer que tout comme les NcLCR spinaux de rat néonataux, ces

différences dans le patron d'émission de PA soient sous-tendues par des variations dans les

conductances voltage-dépendantes (Marichal et al., 2009). Il serait donc intéressant d'identifier

la nature des conductances voltage-dépendantes dans les NcLCR PKD2L1+ du tronc cérébral,

afin de déterminer si elles sont impliquées les deux types de patron d’émission de PA mis en

évidence dans cette étude.

204
Discussion

Enfin, l’enregistrement de l’activité spontanée des NcLCR, montre la présence de décharge en

courant imposé et la présence de deux types de courant, un courant unitaire porté par PKD2L1

(voir partie B. 2 de la discussion) et des courants synaptiques provenant d’afférences

majoritairement GABAergiques (discussion partie B. 1).

B. MODULATION ET CARACTERISATION FONCTIONNELLE DES NCLCR

PKD2L1+ DU TRONC CEREBRAL

1. LES NCLCR SONT GABAERGIQUES ET REÇOIVENT DES AFFERENCES SYNAPTIQUES

GABA/GLYCINE

De nombreuses études ont montré que chez les vertébrés non mammifères (Wyart et al.,

2009; Barreiro-Iglesias et al., 2009; Reali et al., 2011) ainsi que chez les mammifères (Barber et al.,

1982; Stoeckel et al., 2003; Marichal et al., 2009; Kútna et al., 2013) les NcLCR spinaux sont

GABAergiques. Cependant, il n'existe pas à notre connaissance, de données comparatives et

quantitatives concernant les NcLCR-S bulbo-spinaux. Pour cette raison, nous avons réalisé une

étude immunohistochimique sur coupes de tronc cérébral de souris adultes et avons montré

que environ 80 % des NcLCR-S bulbo-spinaux synthétisent le GABA grâce à l'enzyme de

synthèse GAD67 et qu'ils pourraient le libérer au niveau des cibles. Cependant, environ 20 %

des NcLCR-S PKD2L1+ ne sont pas GABAergiques et nous n'avons pas pu lors de cette étude

déterminer leur phénotype. Bien que nous ne puissions pas exclure que l'absence de marquage

soit due à un faible taux d'expression du GABA et de la GAD67, nous pouvons également

suggérer que ces NcLCR-S correspondent à une population neuronale présentant un autre

phénotype, comme il l'est suggéré par d'autres études (Jaeger et al., 1983; Shimosegawa et al.,

1986; Nagatsu et al., 1988; Chatelin et al., 2001). Chez les vertébrés non mammifères, il a été

montré que les NcLCR expriment la dopamine et la sérotonine (Dale et al., 1987; Barreiro-

Iglesias et al., 2009). Quoi qu’il en soit, nos résultats sont en accord avec des études précédentes

réalisées sur la moelle épinière de souris et de rats où les NcLCR ne sont ni sérotoninergiques ni

dopaminergiques (Shimosegawa et al., 1986; Nagatsu et al., 1988). Une autre possibilité, que

nous n'avons pas testée est que les NcLCR-S PKD2L1+ expriment soit l'enzyme de synthèse des

monoamines : la décarboxylase des L-acides aminés aromatiques (AADC pour L-amino acid

decarcoxylase) (Jaeger et al., 1983; Nagatsu et al., 1988; Chatelin et al., 2001) ou la leucine- et la

205
Discussion

méthionine-enképhaline comme il l'a été reporté chez la souris (Shimosegawa et al., 1986). Ainsi,

sur cette caractéristique phénotypique, il apparait qu’il puisse y avoir deux sous-populations de

NcLCR bulbo-spinaux dont une majoritairement GABAergique.

En plus de permettre la démonstration du phénotype GABAergique des NcLCR-S PKD2L1+,

l'anticorps anti-GAD67 a permis de révéler la présence d'un fort marquage dans le parenchyme

autour du canal central. Ce marquage ponctiforme est en contact étroit avec le corps cellulaire

des NcLCR-S PKD2L1+ et pourrait correspondre à la présence de terminaisons GABAergiques

connues pour accumuler la GAD (Mackie et al., 2003). Ces résultats rejoignent ceux obtenus par

microscopie électronique montrant que les NcLCR spinaux reçoivent des contacts provenant de

terminaisons contenant des petites vésicules synaptiques caractéristique de la transmission

GABAergique (Barber et al., 1982). L’ajout des résultats obtenus lors des enregistrements

électrophysiologiques sur tranches de tronc cérébral de souris adultes aux données

morphologiques, permettent de démontrer la présence d’afférences synaptiques GABAergiques

contactant les NcLCR PKD2L1+. En effet d'une part nous avons montré que les NcLCR-S

expriment le récepteur ionotropique au GABA (R-GABA-A) et d'autre part que ce récepteur est

impliqué dans une transmission synaptique spontanée. Il convient de noter que lors de ces

enregistrements, le potentiel d'inversion des courants GABA (Erev, GABA), n'est pas identique à ECl.

Cette différence entre Erev, GABA et ECl (16 mV) peut être expliquée par la perméabilité des canaux

GABA-A au bicarbonate qui peut entrainer un décalage de Erev, GABA vers des valeurs plus

positives que ECl (Kaila et al., 1989). Puisque les résistances séries ne sont pas compensées (10-20

MΩ), nous ne pouvons exclure une erreur dans la détermination du potentiel membranaire

pouvant également participer à ce décalage. Cependant, cette erreur serait faible dans cette série

d'expériences et nous l'estimons au maximum entre 5 à 10 mV pour des amplitudes maximales

au pic de courant GABA de ± 500 pA.

L'ensemble de ces résultats montrent que les NcLCR-S PKD2L1+ sont modulés par des

terminaisons GABAergiques fonctionnelles pouvant provenir d'interneurones locaux. En plus

de cette modulation GABAergique, les NcLCR reçoivent également une modulation par des

afférences synaptiques glycinergiques. Cependant, cette modulation apparait secondaire du fait

de sa faible fréquence d’apparition par rapport à la transmission GABAergique. Ces résultats

montrent que les NcLCR du tronc cérébral reçoivent essentiellement des entrées synaptiques

GABAergiques et glycinergiques, et représentent la première caractérisation de contacts

synaptiques fonctionnels sur cette population neuronale. De plus, cette modulation pourrait
206
Discussion

avoir un rôle fonctionnel non négligeable sur cette population neuronale atypique puisque la

neurotransmission GABAergique est connue pour jouer un rôle important dans la régulation de

la neurogénèse et la maturation des circuits neuronaux où un changement de l’effet du GABA

(dépolarisant vs. hyperpolarisant) s’observe lors du développement (Rivera et al., 1999; Wang et

al., 2002, 2005). Plus précisément, il a été mis en évidence, que l’effet dépolarisant du GABA soit

impliqué dans le maintien des cellules souches neurales dans un état de quiescence (Song et al.,

2012). Par analogie, les NcLCR sont présents dans un état de maturité intermédiaire (voir partie

discussion C) dont la régulation pourrait impliquer ces afférences GABAergiques.

Enfin, pour connaitre l’implication fonctionnelle de ces modulations synaptiques, il apparait

nécessaire d’identifier la nature des fibres GABAergiques et glycinergiques qui contactent les

NcLCR du tronc cérébral. De nombreux neurones GABAergiques sont retrouvés au niveau du

noyau du tractus solitaire (NTS) (Fong et al., 2005) dont certains, localisés dans la partie latérale

du NTS, co-expriment le GABA et la glycine (Dufour et al., 2010). De ce fait, ces interneurones

locaux pourraient représenter un bon candidat pour l'innervation des NcLCR-S. D’autre part, il

a été mis en évidence que tout comme les NcLCR-S PKD2L1+ bulbo-spinaux de souris, les

NcLCR spinaux de rats sont GABAergiques (Stoeckel et al., 2003) et il a été suggéré qu’ils

pourraient recevoir des collatérales d’axones de NcLCR voisins (Vigh et al., 1977). La présence

de ces collatérales n’a jamais été identifiée au cours de cette étude, ni lors des marquages

immunohistochimiques (PKD2L1 et GFP), ni après diffusion de l’Alexa 594 au cours des

enregistrements électrophysiologiques. Cependant, la difficulté déjà rencontrée pour le

marquage et l’identification de prolongements axonaux peut expliquer en partie l’absence de

visualisation de collatérales. Nous pouvons également supposer qu’une telle modulation entre

NcLCR soit réalisée mais de manière distincte et faisant appel à une libération de GABA dans le

LCR, à partir du bud. Ceci est conforté par le fait que la présence de granules de sécrétion au

niveau du bud a déjà été démontrée dans les NcLCR (Vigh-Teichmann & Vigh, 1983; Vígh et al.,

2004). Il serait donc intéressant de vérifier la présence de matériel d’exocytose dans cette

structure.

Nous avons également observé des fibres positives pour la TH, la 5-HT et la ChAT en contact

étroit avec les NcLCR-S PKD2L1+, ce qui suggère la présence de modulations des NcLCR-S par

des afférences catécholaminergiques, sérotoninergiques et cholinergiques. Ceci est conforté par

la présence de neurones cholinergiques dans le noyau moteur dorsal du nerf vague (DMNX)

qui pourraient projeter vers les NcLCR-S qui, de plus, expriment des récepteurs cholinergiques
207
Discussion

de type nicotinique fonctionnels. Bien que nous n'ayons pas observé de réponse rapide à

l'application de sérotonine, révélant l'absence de récepteurs ionotropiques de type 3

fonctionnels sur les NcLCR-S, une étude immunohistochimique montre que les cellules autour

du canal central sont fortement positives pour le récepteurs métabotropiques à la sérotonine de

type 6 (Ward et al., 1995). Nos conditions expérimentales ne permettant pas d'identifier la

présence de récepteur métabotropique (absence de GTP dans le milieu intra-pipette), il peut être

suggéré que les NcLCR-S PKD2L1+ expriment le récepteur à la sérotonine de type 6 et soient

modulés par des afférences sérotoninergiques. Cependant, l’existence de telles modulations

apparait comme mineure puisqu’elle n’a jamais été identifiée que ce soit lors de l’activité

spontanée, ou après induction par un choc hyper-osmotique.

Afin d'aller plus loin dans l'étude de la modulation des NcLCR-S, nous avons réalisé des

enregistrements électrophysiologiques sur tranches de tronc cérébral de souris adultes.

L'application de divers agonistes endogènes a ainsi permis de mettre en évidence qu'en plus des

récepteurs GABA-A et nicotiniques, les NcLCR-S expriment des récepteurs fonctionnels pour la

glycine et le glutamate. De manière intéressante nous avons observé que ces neurones

présentent une réponse glutamatergique atypique, dont la cinétique lente, la faible amplitude et

la faible sensibilité à l'acide kynurénique ont premièrement fait penser à l'implication de

récepteurs de type métabotropique (R-mGlu). Cependant, le blocage de l'ensemble des R-mGlu

par l'utilisation d'antagonistes sélectifs n'induit aucune modification de cette réponse. Nous

avons démontré que cette réponse était due à l'activation de récepteurs glutamatergiques

ionotropiques (R-iGlu) de type AMPA et Kaïnate. Bien que nous ne puissions pas écarter la

possibilité que cette réponse puisse être due à la stimulation des R-iGlu au niveau d'afférences

contactant les NcLCR-S, la probabilité de ce phénomène est faible puisque ces réponses sont

enregistrées en présence de gabazine et de strychnine qui bloquent la signalisation

GABAergique et glycinergique, correspondant aux afférences majeures des NcLCR-S. Une autre

possibilité pourrait être que la structure de ces canaux soit responsable de la résistance à l'acide

kynurénique comme il l'a préalablement été montré dans les récepteurs Kaïnate constitués de

GluR6/KA2 (Alt et al., 2004). Cette réponse glutamatergique atypique enregistrée dans les

NcLCR-S est caractérisée par des courants lents, qui présentent peu de désensibilisation et qui

sont partiellement inhibés par l'acide kynurénique et montrent donc de grandes similarités avec

des courants AMPA enregistrés dans les motoneurones d'embryon de poulet (Zorumski &

Yang, 1988). Enfin, cette réponse atypique pourrait également être due au stade de maturité des
208
Discussion

neurones puisqu’il est démontré qu’au cours du développement la signalisation

glutamatergique se met en place après la signalisation GABAergique (Tozuka et al., 2005;

Panzanelli et al., 2009; Chancey et al., 2013) et joue un rôle important dans la maturation des

neurones GABAergiques (Chang et al., 2014). La caractérisation de la nature de ces courants

demande donc un intérêt particulier avec l'utilisation d'antagonistes spécifiques sur des

enregistrements effectués sur des tranches de tronc cérébral provenant d’animaux à différents

âges.

Contrairement aux résultats obtenus lors d'études réalisées sur NcLCR spinaux de rat (Stoeckel

et al., 2003; Marichal et al., 2009), nous n'avons pas enregistré de réponse à l'ATP ou au 2-Me-S-

ATP, ce qui indique que les NcLCR du tronc cérébral de souris n'expriment pas de récepteurs

P2X2 fonctionnels. L'absence de réponse suite à l'application du 2-Me-S_ATP confirme que ce

résultat est bien dû à une absence de récepteur fonctionnel et non pas à l'hydrolyse rapide de

l'ATP dans le tissu. L’absence de courant induit pas l’ATP dans les NcLCR-S du tronc cérébral

semble surtout due à une différence inter-espèce (souris vs. Rat) plutôt qu’à une différence

régionale (tronc cérébral vs. moelle épinière) puisque l’ensemble des résultats arguent en faveur

de l’existence d’une seule population neuronale le long du canal central au niveau bulbo-spinal.

L'ensemble de ces expériences montrent que les NcLCR-S sont GABAergiques et sont

intégrés dans un réseau neuronal, puisqu'ils sont modulés par des afférences synaptiques

GABAergiques et glycinergiques. Au cours de cette étude nous n'avons jamais observé d'autres

types d'entrées synaptiques, que ce soit de manière spontanée ou provoquée par un choc hyper-

osmotique. Cependant, l'expression d'une batterie de récepteurs ionotropiques fonctionnels

(récepteurs cholinergiques de type nicotiniques et glutamatergiques) ou métabotropiques (R-5-

HT 6) (voir www.Gensat.org ; BAC : RP23-65B23) ainsi que la présence nombreuses fibres

(sérotoninergiques, cholinergiques et catécholaminergiques) au voisinage de ces neurones

permettent de supposer que dans certaines conditions, ces neurones puissent recevoir d'autres

types de modulations synaptiques.

209
Discussion

2. LES NcLCR INTEGRENT LES VARIATIONS DU MILIEU EXTERIEUR GRACE AU CANAL

PKD2L1

Le développement de souris transgéniques PKD2L1:EGFP a également permis de

visualiser les NcLCR PKD2L1+ dans les tranches de tronc cérébral et ainsi de réaliser la première

caractérisation de l’activité canal dans un système natif.

La caractérisation de l'activité canal observée dans les NcLCR du tronc cérébral a été réalisée

par l'étude des courants unitaires enregistrés en configuration cellule entière à partir du corps

cellulaire de ces cellules. Les résultats ont montré que tous les NcLCR PKD2L1+ bulbo-spinaux

présentent un courant unitaire dont l'amplitude moyenne est ≈ -10 pA et qui est dû à l'ouverture

d'un canal unique de type cationique non sélectif de grande conductance (~141 pS). Ce courant

est une caractéristique principale de ces neurones puisqu’il n’a jamais été enregistré dans les

cellules négatives pour l’EGFP même celles localisées à proximité du canal central.

Si l’on considère la forte immunoréactivité contre PKD2L1 observée dans les NcLCR du tronc

cérébral, il apparait surprenant que les enregistrements en configuration cellule entière ne

révèlent pas de larges courants dus à l’ouverture simultanée de plusieurs canaux (courant

macroscopique). Spontanément, l'activité du canal PKD2L1 est majoritairement due à des

ouvertures de canal unique, la présence d'ouvertures multiples (2 ou 3) est très rare et nous

n'avons jamais observé plus de trois ouvertures simultanées. De même qu’au niveau du bud, les

enregistrements en configuration outside-out ou cellule attachée à partir du corps cellulaire

n'ont jamais permis de détecter l'activité canal, ce qui témoigne que seule une faible proportion

de canaux PKD2L1 fonctionnels est localisée à la membrane plasmique. Cette contradiction

entre les résultats immunohistochimiques et les enregistrements électrophysiologiques peut être

expliquée par plusieurs mécanismes décrits récemment. Premièrement, la localisation et la

stabilisation membranaire ainsi que le niveau d’activité semble être dépendant d’interactions

entre PKD2L1 avec de nombreux partenaires protéiques (Murakami et al., 2005; Li et al., 2007;

Inada et al., 2008; Ishimaru et al., 2010; Yang et al., 2011). Comme nous l’avons vu lors de

l’introduction, PKD1L3, une protéine de la famille des polycystines constituée de 11 segments

transmembranaires interagit avec PKD2L1. Cette interaction semble non seulement permettre

d’augmenter l’activité du canal mais parait également être impliquée dans la réponse de type

off observée suite à l’application de solution acide (Murakami et al., 2005; Li et al., 2007; Inada et

al., 2008; Ishimaru et al., 2010). Dans les NcLCR-PKD2L1+ du tronc cérébral, nous avons

210
Discussion

enregistré cette "réponse off" à l’exposition d’acide dans plus de la moitié des cellules testées

(Figure 37. C). De plus, les résultats préliminaires issus de techniques de biologie moléculaire :

RT-PCR réalisées sur des extraits de tissus autour du canal central du tronc cérébral, montrent

la présence d’ARNm codant pour PKD2L1 et pour PKD1L3. Bien que PKD1L3 ne soit pas la

seule protéine qui puisse interagir avec PKD2L1, sa présence dans le tronc cérébral fait d’elle un

bon partenaire potentiel capable de réguler l’activité canal, comme il l’a été démontré dans

certaines cellules gustatives (LopezJimenez et al., 2006; Huang et al., 2006). D’autre part, RACK

1, une protéine d’ancrage, qui interagit avec PKD2L1 (Yang et al., 2011) pourrait également

intervenir dans l’expression membranaire des canaux PKD2L1. Deuxièmement, PKD2L1, tout

comme PKD2, possède un site de rétention au réticulum endoplasmique (RE), qui pourrait

induire une localisation préférentielle de PKD2L1 dans la membrane du RE (Murakami et al.,

2005; Li et al., 2007; Ishimaru et al., 2010). Dans le RE, PKD2L1 pourrait jouer un rôle dans la

mobilisation du calcium intracellulaire à partir des stocks calciques intracellulaires puisque ce

canal est également perméable au calcium (Chen et al., 1999; Koulen et al., 2002). A ce jour, nous

ne savons pas si un tel phénomène influant sur l’homéostasie calcique intracellulaire des

NcLCR-S existe et s’il implique le canal PKD2L1, cela reste à faire. Finalement, la protéine

PKD2L1 présente différentes localisations subcellulaires (voir B. 3 Introduction) telles que la

membrane plasmique, le RE et le cil et un trafic entre le RE et la membrane plasmique peut

exister (Murakami et al., 2005; Ishimaru et al., 2006; DeCaen et al., 2013). Un tel mécanisme

régulant le transport de PKD2L1 depuis le RE et sa stabilisation à la membrane plasmique peut

également expliquer la faible densité de canaux PKD2L1 fonctionnels présents à la membrane

plasmique. Enfin, il ne peut être écarté que le canal ayant une très faible probabilité d'ouverture,

l’activité enregistrée reste faible malgré une forte expression à la membrane plasmique.

Cependant, cette dernière hypothèse reste peu probable puisque même en augmentant la

probabilité d’ouverture par des protocoles adaptés, aucun courant macroscopique porté par

PKD2L1 n’a été observé. Si ces protocoles influent sur la fréquence d’ouverture, le nombre total

de ces ouvertures reste faible (trois ouvertures maximales) et similaire à celui observé

spontanément.

Initialement, du fait de l’absence de bloqueurs spécifiques des canaux PKD2L1, nous

avons analysé l’effet de variations de composition du milieu extracellulaire connues pour

moduler l’activité de ce canal, sur le courant unitaire enregistré dans les NcLCR-PKD2L1+ afin

de déterminer sa nature. Les premiers résultats issus des souris PKD2L1:EGFP montrent que le
211
Discussion

canal est activé par le pH basique et le choc hypo-osmotique et que son activité est diminuée de

manière non significative par le choc hypertonique. Ces résultats sont en accord avec ceux

obtenus dans les systèmes d'expression où PKD2L1 est exprimé seul (Shimizu et al., 2009, 2011).

De manière similaire aux travaux de Shimizu et collaborateurs, nos résultats mettent en

évidence l’existence d’un délai entre l'application de la solution hypo-osmotique et

l'augmentation de l'activité du canal PKD2L1. De ce fait, il a été suggéré que ce délai

correspondrait au temps nécessaire pour que les modifications de forme de la cellule induisent

des effets sur la probabilité d'ouverture de PKD2L1. Ainsi, le choc hypotonique induirait un

flux d’eau entrant à l’origine du gonflement cellulaire qui activerait le canal PKD2L1. Cet effet

passerait par l'activation de la phospholipase A2 qui forme l'acide arachidonique après clivage

des phospholipides membranaires (Shimizu et al., 2009). Nos résultats montrent également une

augmentation de la probabilité d'ouverture lors de l'application de 10 µm d'acide

arachidonique, mais celle-ci n'est pas significative et l'effet de l’acide arachidonique varie d'une

cellule à l'autre. Cette différence de résultats peut être due au fait que nous réalisons nos

enregistrements sur tranche de tronc cérébral, la concentration arrivant sur le neurone

enregistré est donc étroitement liée à la profondeur du neurone, puisque l'acide arachidonique

peut diffuser à travers la membrane plasmique de l’ensemble des cellules du tissu. Ceci peut

également expliquer la dichotomie d'effets observée entre les cellules enregistrées, puisque la

différence de sensibilité pourrait être due à une différence de concentration d’acide

arachidonique au niveau de la cellule enregistrée. Pour vérifier cette hypothèse, il serait

intéressant de tester l’effet de l'application de plus fortes concentrations d'acide arachidonique

sur l'activité du canal PKD2L1. Quoi qu’il en soit, ces résultats suggèrent qu’en plus de la voie

de la phospholipase A2 d'autres mécanismes semblent également participer à l'activation de

PKD2L1 par le choc hypotonique.

Dans un autre temps, nous nous sommes intéressés à l’effet du pH alcalin. Nous montrons que

l'application d'une solution alcaline à pH 9 induit une augmentation de l'activité canal de ~ 88

%, corrélée à une augmentation de la fréquence de décharge neuronale. Ces résultats suggèrent

d'une part que l’activité canal joue un rôle important sur l'excitabilité des NcLCR-S et d’autre

part que ces neurones pourraient intégrer les variations de pH du milieu extracellulaire et

transmettre l'information aux cibles via l'émission de PA. Cet effet de l’activité canal sur

l’émission de PA par les NcLCR-S PKD2L1+ pourrait être lié à la forte résistance membranaire

212
Discussion

de ces neurones, qui permet d’avoir des variations conséquentes du potentiel de membrane

pour de faibles variations de courant.

Enfin nous avons montré que l'application d'un pH acide (entre 2 et 5,5) induit une

réponse en deux temps. Tout d'abord, le pH acide active les canaux ASICs qui sont impliqués

dans une réponse bi-phasique composée d'un courant entrant de forte amplitude, porté par des

canaux qui se désensibilisent rapidement : ASICs 1a (fortement sensibles à la psalmotoxine 1)

(Baron et al., 2008), suivi par une phase plateau. Cette activation des ASICs explique l'activation

des NcLCR spinaux observée lors de l'application d'une solution acide à pH 6 (Marichal et al.,

2009) et qui est retrouvée dans les NcLCR PKD2L1+ du tronc cérébral (Figure 37). En effet, nos

résultats montrent que les NcLCR-S PKD2L1+ répondent à une acidification extracellulaire par

l’émission d’un PA en début (on), sous-tendue par l’activation des ASICs, et en fin (off)

d’application (Figure 37. B). Ainsi, l’effet activateur du pH acide observé sur les NcLCR spinaux

de rat (Huang et al., 2006; Marichal et al., 2009) a été maladroitement attribué au canal PKD2L1.

Au contraire, lors de l’application de l’acide (c'est-à-dire pendant la phase on de la réponse), le

canal PKD2L1 est inhibé et cette inhibition parait dépendante de la valeur de pH (Figure 37. D).

Cette inhibition est observée lors de la phase de plateau et est en accord avec les résultats

obtenus lors de l'expression hétérologue de la protéine PKD2L1 seule (Chen et al., 1999; Shimizu

et al., 2009). Cependant, ces résultats sont en contradiction avec l'effet activateur observé d'une

part dans les systèmes d'expression co-transfectés pour PKD2L1/PKD1L3 et d'autre part, dans

les cellules gustatives (Ishimaru et al., 2006; Huang et al., 2006). Cette différence de résultats peut

s'expliquer par une différence de partenaires protéiques qui jouent un rôle modulateur

considérable sur le canal PKD2L1 (voir Introduction partie B. 4 b). Ceci est d'autant plus

plausible que la "réponse off" observée lors de la co-expression PKD2L1/PKD1L3 n'est pas

retrouvée dans l'ensemble des NcLCR-S du tronc cérébral. Seule, la moitié des NcLCR

enregistrés présentent une augmentation de la probabilité d’ouverture du canal lors du lavage

de la solution acide à pH 2,8, phénomène également observé dans les cellules HEK293T

(Ishimaru et al., 2006; Inada et al., 2008) et dans les cellules gustatives (Kawaguchi et al., 2010) et

qui correspond à la "réponse off". Puisque les enregistrements ont été réalisés en utilisant une

solution intracellulaire de ClCs, il n'a pas été possible de corréler ce rebond d'activité du canal

unitaire avec l'augmentation d'excitabilité observée en mode courant imposé (Figure 37. B,

traces 4 et 5). De même, nous n'avons pas pu analyser, si cette différence d'activité canal au sein

de ces 16 cellules pouvait être liée aux différentes propriétés de décharge mise en évidence
213
Discussion

précédemment (décharge tonique vs. phasique, Figure 25. A). Quoi qu'il en soit, il serait

intéressant de voir si cette protéine est exprimée dans les NcLCR-S présentant une réponse off

et si celle-ci colocalise avec PKD2L1. La différence d’effets observés en réponse à l’application

de solution acide, entre les cellules gustatives et les NcLCR-S du tronc cérébral pourrait

s’expliquer par le fait que PKD2L1 ne semble pas être le seul responsable de cette détection,

puisque les souris délétées pour ce canal présentent toujours une réponse au stimulus acide et

une détection du goût aigre (Horio et al., 2011). Actuellement, de nombreuses études

démontrent que d’autres canaux que PKD2L1 seraient responsables de l’activation des cellules

gustatives lors de l’application de pH acide (Huang et al., 2008; Chang et al., 2010), ce qui

expliquerait également cette différence de résultats.

De manière intéressante, en courant imposé, les résultats révèlent une augmentation de

l’excitabilité neuronale (Figure 37. B) qui pourrait être liée à l’augmentation de l’activité canal.

Ces résultats suggèrent que l’acidification soit codée par les ASICs (réponse on) et les canaux

PKD2L1 (off). Contrairement à ce qui a été reporté par Shimizu et collaborateurs, nous avons

trouvé que l’alcalinisation est plus efficace pour activer le canal PKD2L1.

Les expériences réalisées sur les souris délétées pour PKD2L1 (KO-PKD2L1) ont permis de

confirmer que l'activité canal est portée par PKD2L1. De ce fait, cette étude représente la

première caractérisation du canal unitaire PKD2L1 dans un système natif. Cette caractérisation

montre que l'ouverture du canal PKD2L1 est constitutive, qu’elle est activée par le pH alcalin et

l’hyper-osmolarité et est inhibée par le pH acide. De plus, la conservation de la réponse bi-

phasique (courant entrant transitoire + phase plateau) observée lors de l’application de la

solution acide dans les KO-PKD2L1, confirme les résultats précédents et montrent que ce

courant n’est pas lié aux canaux PKD2L1 mais est bien dû à l’ouverture des ASICs. Par contre, il

convient de noter que lors de cette étude réalisée sur le modèle de souris KO-PKDL21, la

réponse off n’a jamais été visualisée dans les cellules enregistrées. Ceci peut être dû au plus

faible échantillon considéré (5 cellules vs. 16 cellules pour le modèle PKD2L1:EGFP), ou du fait

de la différence de valeur de pH utilisée. Il semblerait donc que pour l’observation de la

réponse off la valeur de pH ait une importance majeure.

Les enregistrements en mode courant imposé des NcLCR du tronc cérébral de souris délétées

pour PKD2L1, confirment également que ce canal joue un rôle important dans l'excitabilité

neuronale. En effet, l'analyse de la décharge spontanée des NcLCR-S KO-PKD2L1, montre que

la fréquence de décharge est fortement diminuée et que 66,7 % des neurones enregistrés ne
214
Discussion

présentent plus de décharge spontanée. Cette délétion n'ayant pas d'effet sur l'amplitude ni sur

la durée du PA, nous pouvons donc supposer que l'ouverture de PKD2L1, canal unitaire

cationique de grande conductance, induit une dépolarisation non négligeable ayant une forte

implication dans la genèse de PA et dans l'excitabilité des NcLCR-S. Ceci est conforté par le fait

que l’augmentation de la fréquence d’émission de PA lors de l’application de solution à pH

alcalin n’est plus observée dans les NcLCR-S KO-PKD2L1 (Figure 43. B). L’implication de

l’ouverture d’un canal unique dans la genèse de PA a été déjà décrite dans des cellules

fortement résistives (Lynch & Barry, 1989; Johansson & Arhem, 1994). En dépit de la faible

densité de canaux fonctionnels à la membrane plasmique, il semblerait que l’activation de canal

unitaire PKD2L1 soit capable de moduler l’excitabilité des NcLCR-S du tronc cérébral.

Grâce à l'étude électrophysiologique des NcLCR-S de tronc cérébral de souris

PKD2L1:EGFP, nous avons pu mettre en évidence que ces neurones possèdent une batterie de

récepteurs ionotropiques et qu'ils sont intégrés dans un réseau neuronal puisqu'ils reçoivent des

afférences GABAergiques et Glycinergiques. De plus, lors de ces enregistrements nous avons

pu observer la présence de courants unitaires dont les caractéristiques permettent de suggérer

qu'ils sont portés par PKD2L1. L'utilisation de modèles de souris délétées pour le canal PKD2L1

a permis de confirmer cette hypothèse. Le canal PKD2L1 apparait comme une des principales

entrées excitatrices de ces neurones et semble jouer un rôle prépondérant dans l'excitabilité

neuronale. De plus, ce canal dont l'ouverture est modulée par des variations de pH et

d'osmolarité du milieu extracellulaire pourrait conférer des capacités de chémosenseur aux

NcLCR-S. Ces neurones présentent une position clé en relation avec le LCR et le milieu

extracellulaire et sont présents au niveau du tronc cérébral qui est une région indispensable à la

régulation des fonctions végétatives. Les NcLCR-S pourraient donc participer à ces régulations

en détectant la présence de molécules bioactives circulant dans le LCR et/ou des variations de la

composition du LCR ou du MEC. De part la présence de PKD2L1, dont l'ouverture induit un

courant cationique entrant, ces modifications environnementales ont un effet direct sur

l'excitabilité des NcLCR-S. De ce fait, l'information sensorielle ainsi collectée pourrait être

relayée via l'émission de potentiels d'action qui se propageraient le long de l'axone pour agir sur

des cibles à distance.

Cependant, il convient de noter que les variations de pH réalisées dans cette étude ne sont

observées ni en condition physiologique, ni en condition pathologique. Ces valeurs sont

215
Discussion

éloignées des valeurs de pH en conditions physiologiques (~7,4 chez l'homme) ou de variations

pathologiques observées lors d'alcalose (~7,8) ou d'acidose (~7, 2) (Kawai et al., 2006; Lesage &

Barhanin, 2011). L'effet du pH acide (2,8) ne peut être observé, même si l’on considère qu’une

grande gamme de pH peut être atteinte localement. Le choix de l’application de solution acide à

pH 2,8 a été motivé par des protocoles utilisés dans les systèmes d’expression qui ont permis de

caractériser les propriétés du canal PKD2L1. Cependant nous avons montré que l’activité canal

est également réduite de manière significative par l’application de solution acide à pH 5,5.

Enfin, il convient de rappeler que nous réalisons des expériences de chémosensibilité au pH in

vitro et que dans ces conditions la détermination de la sensibilité neuronale individuelle au pH

pose des difficultés puisque celle-ci est diminuée par rapport à la situation in vivo (Ballantyne &

Scheid, 2001).

C. DES NEURONES ENCORE IMMATURES A L'AGE ADULTE ?

Chez l'adulte, la plupart des neurones du SNC ont subi des processus de maturation

spécifiques leur permettant d'assurer une fonction, mais dans certaines régions telles que le

gyrus denté de l'hippocampe et le bulbe olfactif de nouveaux neurones continuent d'être formés

constamment (Ming & Song, 2011; Kim & Sun, 2012). Plus récemment, il a été suggéré que la

région épendymaire qui entoure le canal central de la moelle épinière représente une nouvelle

niche neurogénique. Les cellules souches de cette région sont capables de se diviser in vivo pour

générer des cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes) tandis que in vitro elles peuvent

former des neurosphères (Horner & Gage, 2000; Meletis et al., 2008; Sabourin et al., 2009;

Sabelström et al., 2013). Chez les mammifères, cette région pourrait participer aux processus de

réparation après lésion de la moelle épinière (Horky et al., 2006; Meletis et al., 2008; Sabelström

et al., 2013). Parmi ces cellules trouvées autour du canal central, se trouvent les NcLCR qui

continuent d'exprimer des marqueurs associés à des états d'immaturité neuronale tels que DCX

ou PSA-NCAM chez le jeune (Marichal et al., 2009; Kútna et al., 2013) et chez le rongeur adulte

(Stoeckel et al., 2003; Shechter et al., 2007; Kútna et al., 2013).

Tout d'abord nous avons montré que chez la souris adulte, la plupart des NcLCR-S

continuent d'exprimer DCX (≈ 90 % des cellules) et une plus faible proportion de cellules

216
Discussion

expriment également HuC/D (≈ 60 % des cellules). Puisque ces marqueurs sont exprimés d'une

part dans les neurones néoformés lors de la neurogénèse adulte et d'autre part dans les jeunes

neurones post-mitotiques immatures (Ming & Song, 2011; von Bohlen und Halbach, 2011), ces

résultats suggèrent que les NcLCR-S PKD2L1+ ont conservé des caractéristiques de neurones

immatures ou sont de jeunes neurones. De manière similaire, une nouvelle étude a montré que

des neurones non néoformés localisés dans la couche II du cortex cérébral de souris continuent

d'exprimer DCX et PSA-NCAM ce qui suggère qu'ils restent dans un état immature (Bonfanti &

Nacher, 2012). Chez la souris adulte, contrairement à de nombreuses études (Bonfanti et al.,

1992; Stoeckel et al., 2003; Sabourin et al., 2009; Marichal et al., 2009), nous n'avons pas observé

d'immunoréactivité contre PSA-NCAM dans les NcLCR-S PKD2L1+. Une des explications de

cette divergence pourrait être liée au niveau du SNC que nous avons étudié (moelle épinière

cervicale et tronc cérébral) où peu d'immunoréactivité contre PSA-NCAM a été observé

(Alonso, 1999). Le fait que les NcLCR-S soient dans un état d'immaturité est également supporté

par l'absence d'expression de NF-160 , du NF-M (Russo et al., 2004; Marichal et al., 2009) et du

NF-200 (Kútna et al., 2013) et par l'expression de GAP 43 dans les prolongements supposés des

NcLCR spinaux (Stoeckel et al., 2003).

Lors de la phase embryonnaire, Nkx6.1, une protéine homéodomaine, est fortement

exprimée dans la région ventrale du tube neural. Elle permet non seulement la différenciation

des progéniteurs ventraux en motoneurones somatiques (MNs) et en neurones V2 et V3 (Qiu et

al., 1998; Sander et al., 2000) mais semble aussi impliquée dans les processus de migration

cellulaire, de guidage et de croissance axonal (Müller et al., 2003; Prakash et al., 2009). Il est

montré que le niveau d'expression de Nkx6.1 diminue progressivement durant le

développement du SNC, pour n'être retrouvé que dans les régions autour du canal central de la

moelle épinière au stade embryonnaire E18 (Fu et al., 2003) et dans les NcLCR chez l'adulte

(Sabourin et al., 2009). De plus, chez la souris adulte (P60), certaines cellules Nkx6.1+ incorporent

les BrdU, ce qui témoigne de leur capacité de prolifération (Fu et al., 2003). Dans cette étude,

nous démontrons que chez la souris adulte, la plupart des NcLCR-S expriment fortement

Nkx6.1 et que ce niveau d'expression concerne l'ensemble des NcLCR-S PKD2L1+ de la moelle

épinière cervicale (niveau 1) au tronc cérébral rostral (niveau 4). L'immunoréactivité contre

Nkx6.1 est essentiellement retrouvée dans les neurones de contact et seules quelques cellules

autour du canal central apparaissent faiblement marquées. Ces résultats suggèrent que les

217
Discussion

NcLCR-S PKD2L1+ puissent provenir de progéniteurs communs avec les MNs, les neurones V2-

3. Le destin du lignage neuronal de ces cellules progénitrices Nkx6.1+ est dépendant d'une part

du gradient de concentration de la protéine Sonic hedgehog (Shh), sécrétée lors du

développement par la partie ventrale de la moelle épinière (Briscoe et al., 2000; McMahon, 2000;

Fuccillo et al., 2006) et d'autre part, de l'activité électrique (Belgacem & Borodinsky, 2011;

Borodinsky et al., 2012; Swapna & Borodinsky, 2012). Chez l'adulte, la signalisation Shh reste

active (Pascual et al., 2005; Traiffort et al., 2010; Hugnot & Franzen, 2011), elle semble requise

pour le fonctionnement des niches neurogéniques (Charytoniuk et al., 2002; Lai et al., 2003;

Machold et al., 2003), la migration des neuroblastes (Angot et al., 2008) et le maintien de

l'expression de Nkx6.1 (Fu et al., 2003). La conservation de l'expression de Nkx6.1 renforce l'idée

que les NcLCR-S conservent un phénotype non mature jusqu'au stade adulte. De part cet état

apparent de maturation incomplète de la plupart des NcLCR-S PKD2L1+ chez l'adulte, il peut

être suggéré que ces neurones conservent des capacités de maturation et/ou de migration qui

peuvent être activées dans certaines circonstances et conditions dont la nature reste à être

déterminée. Une des hypothèses est que cette activation aurait lieu suite à une lésion de la

moelle épinière et qu'elle serait impliquée dans les processus de réparation qui en découlent

(Marichal et al., 2009), ce qui est conforté par une étude récente montrant l'implication de

cellules Nkx6.1+ dans les processus de récupération après lésion de la moelle épinière (Amemori

et al., 2013). Bien qu'il soit maintenant établi que dans ces circonstances les processus de

régénération et de réparation tissulaire soient corrélés à l'augmentation de la transcription de

facteurs tels que Pax6 et Olig2 (Yamamoto et al., 2001). Nous pouvons supposer que l'expression

sélective de Nkx6.1 dans les NcLCR-S PKD2L1+, un autre facteur de transcription impliqué dans

la différenciation neuronale, participe dans les processus post-traumatiques tels que la

croissance axonale, la synaptogénèse ou la migration neuronale. Il peut être également émis,

que dans certaines circonstances (dont la lésion), les NcLCR subissent une maturation vers une

des trois lignées identifiées pour les cellules Nkx6.1. Sur des critères morpho-fonctionnels, il

apparait peu plausible que les NcLCR puissent évoluer en MNs ou en interneurones V2a et V3

qui sont majoritairement excitateurs (Lundfald et al., 2007; Zhang et al., 2008 p.3). Les NcLCR

semblent partager plus de points communs avec les neurones V2b dont la plupart sont

GABAergiques ou glycinergiques (Lundfald et al., 2007) ou aux neurones V2c qui ont

récemment été identifiés (Panayi et al., 2010) et qui semblent participer aux processus

locomoteurs (Al-Mosawie et al., 2007). Ainsi, il parait plausible de supposer que les NcLCR
218
Discussion

dérivent du domaine p2 qui génère ces deux populations d'interneurones (Briscoe et al., 2000).

Toutefois, si ce raisonnement pourrait s'appliquer aux NcLCR-S spinaux, il apparait peu

probable que celui-ci concerne les NcLCR-S médullaires, dont on imagine mal une participation

à un processus locomoteur. Cependant, il apparait important de noter que l'expression de

Nkx6.1 peut également avoir des effets différents en fonction de la région considérée. En effet, il

a été montré que la régulation de l'expression des gènes Olig lors du développement neural est

sous la dépendance de Nkx6.1 au niveau spinal mais pas au niveau bulbaire (Liu et al., 2003).

Chez le jeune rat, Marichal et collaborateurs (Marichal et al., 2009) ont montré que les

NcLCR sont NeuN négatifs (Marichal et al., 2009). Ces résultats sont en accords avec le

phénotype DCX+, PSA-NCAM+ et HuC/D+ et confirment que les NcLCR spinaux sont

immatures. Ces auteurs suggèrent également que les cellules présentent dans la couche

épendymaire spinal, vraisemblablement des NcLCR, restent NeuN- chez les animaux de trois

semaines (P21). Notre étude rejoint les travaux récents de Kứtna et collaborateurs (Kútna et al.,

2013) et montre que les NcLCR bulbo-spinaux de souris adultes (~P90) expriment NeuN ainsi

que les marqueurs de neurones immatures. De plus, nos résultats suggèrent qu'il existe un

gradient de maturation le long de l'axe rostro-caudal puisque le pourcentage de NcLCR-S

PKD2L1+/NeuN+ varie le long de l'axe. Ces résultats sont étonnants et inattendus puisque

durant le développement ou la neurogénèse, l'expression de NeuN est supposée augmenter

avec la maturation neuronale tandis que l'expression de DCX devrait diminuer en parallèle

(Ming & Song, 2011). Cependant, dans le bulbe olfactif et le gyrus denté une recouvrement

transitoire dans l'expression de DCX/PSA-NCAM et NeuN est observé dans les neurones

néoformés (Ming & Song, 2011). Une situation similaire a également été reportée dans les

neurones immatures de la couche II du cortex cérébral (Bonfanti & Nacher, 2012). Dans

l'ensemble des niveaux étudiés, l'expression de NeuN apparait plus faible dans les NcLCR-S

PKD2L1+ que dans les autres cellules négatives pour PKD2L1 et localisées dans les mêmes

régions. Ce qui indique une fois de plus, que les NcLCR-S présentent un degré de maturité

neuronal intermédiaire. Cette plus faible expression peut également expliquer la différence de

résultats avec les travaux stipulant une absence d'expression de NeuN dans les NcLCR spinaux

(Marichal et al., 2009).

Au plan électrophysiologique, il est difficile d'évoquer un caractère immature de ces

neurones : les cellules présentent des PA robustes, une activité synaptique et sont incorporées
219
Discussion

dans un réseau. Toutefois, l'analyse du potentiel de réversion physiologique des ions chlore

(ECl), qui a révélé la présence de deux populations de NcLCR dans le tronc cérébral de souris

adultes. Une population où l'application de GABA induit un courant qui s'inverse autour de -

80 mV et est à l'origine d'un effet hyperpolarisant. Dans cette population neuronale, puisque la

valeur de ECl est plus négative que Vm, la force électromotrice (Vm - ECl) est positive et est à la

base de l'effet inhibiteur du GABA. Cependant, il existe également une autre population de

NcLCR, où la valeur physiologique de ECl est moins négative que Vm (~50 mV), la force

électromotrice résultante est donc (Vm - ECl) négative, ce qui explique l'effet dépolarisant du

GABA. Ces résultats rejoignent ceux obtenus sur les NcLCR spinaux de tortue juvénile (Reali et

al., 2011). L'effet dépolarisant du GABA est un phénomène observé lors du développement

(Jean-Xavier et al., 2007; Ben-Ari et al., 2007; Fukuda & Wang, 2013) et lors de la neurogénèse

adulte (Deisseroth & Malenka, 2005; Tozuka et al., 2005; Song et al., 2012) et le passage vers un

effet hyperpolarisant est un processus fondamental pour la maturation du cerveau (Fukuda &

Wang, 2013; Pontes et al., 2013). L'effet excitateur du GABA joue un rôle crucial, dans les

processus trophiques car le GABA agit à tous les niveaux, de la prolifération à la différenciation,

la croissance et la synaptogénèse (Ben-Ari, 2002; Ge et al., 2006). Cette dichotomie d'effets,

s'explique par une variation de l'expression de transporteurs au chlore durant le

développement (Chabwine et al., 2009). Ainsi, l'effet excitateur du GABA s'explique par la forte

concentration intracellulaire en chlore ([Cl]i) sous-tendue par une forte expression du

transporteur NKCC1 et une faible expression de KCC2 (Wang et al., 2002; Ge et al., 2006;

Chabwine et al., 2009). Au cours du développement, l'augmentation de l'expression de KCC2 est

à l'origine de la diminution de la [Cl]i rendant ECl plus négatif et entraine le changement d'effet

du GABA (Rivera et al., 1999). Il semblerait également que ce phénomène joue un rôle important

dans les processus de récupération chez des individus ayant subi une lésion de la moelle

épinière (Boulenguez et al., 2010). Il est également supposé, que le bicarbonate joue un rôle dans

l'effet dépolarisant du GABA, puisque sa concentration intracellulaire est dépendante de

transporteurs membranaires dont l'expression varie au cours du développement (Hübner &

Holthoff, 2013). Nous pouvons donc supposer, que chacune de ces deux populations de NcLCR

présente différents taux d'expression des transporteurs de chlore, ainsi, les NcLCR où le GABA

exerce un effet dépolarisant exprimeraient majoritairement NKCC1, puis avec la maturation

neuronale, l'expression de KCC2 deviendrait majoritaire. Cette hypothèse est confortée par le

fait que ce phénomène est décrit dans les NcLCR spinaux de tortue juvénile (Reali et al., 2011).
220
Discussion

La présence de ces deux actions du GABA est d’autant plus importante de par le fait que nous

avons montré que les NcLCR-S du tronc cérébral reçoivent spontanément exclusivement des

entrées synaptiques GABA/Glycine. Connaissant l’importance de la neurotransmission GABA

durant le développement (Ben-Ari, 2002) et dans la régulation de l’état de quiescence des

cellules souches (Song et al., 2012), ces afférences synaptiques pourraient jouer un rôle majeur

dans la conservation de caractères d’immaturité mis en évidence dans les NcLCR-S bulbo-

spinaux. Toutefois, nous n'avons pas de données concernant les propriétés

électrophysiologiques de ces deux populations. Des étude précédentes réalisées dans les NcLCR

spinaux de rat nouveau-né et de tortue juvénile ont suggéré que lors de la maturation neuronale

des variations de conductances voltage-dépendantes permettraient de passer d'une décharge

phasique à une décharge tonique (Marichal et al., 2009; Reali et al., 2011). Il parait donc plausible

de suspecter que les deux populations neuronales observées en patch perforé correspondent

aux deux types de neurones, ceux à décharge phasique et ceux à décharge tonique. Cependant,

il convient de noter, que d'une part, même s'il existe deux effets du GABA, un hyperpolarisant

et un autre dépolarisant, ils conduisent tous les deux à un même effet sur l'excitabilité, qui est

de type inhibiteur, puisque l'application de GABA entraine un arrêt de la décharge neuronale.

D'autre part, la présence de ces deux patrons de décharge, même si elle sous-tend une

possibilité de maturation dans l'expression des conductances voltage-dépendantes, témoigne

d'une certaine maturité neuronale qui est renforcée par l'absence de visualisation de réponse

lente calcique.

Ainsi, les données électrophysiologiques arguent plus en faveur d'une population

neuronale ayant acquis un certain degré de maturité et posent la question de l'implication des

NcLCR bulbo-spinaux dans les processus de neurogénèse et de plasticité post-lésionnelle. Quoi

qu'il en soit, l'association des résultats obtenus lors de l'approche immunohistochimique avec

les résultats électrophysiologiques sur tranches de tronc cérébral, montrent que les NcLCR-

PKD2L1+ bulbo-spinaux présentent un état de maturité intermédiaire. Il parait plausible que la

conservation de cet état soit régulée par les afférences synaptiques GABAergiques. Cependant,

les données fonctionnelles ne confortent pas l'hypothèse que les NcLCR-S bulbo-spinaux soient

en mode de "stand-by" et qu'ils puissent être impliqués dans les phénomènes de neurogénèse

observés lors de lésions de la moelle épinière. L'impact fonctionnel de la conservation de

marqueurs retrouvés dans les neurones immatures au sein de cette population neuronale reste

221
Discussion

donc ouvert à débat. Cette question nécessite une étude précise et il serait intéressant de

rechercher si les propriétés des NcLCR-S varient dans des modèles de lésion ou d'inflammation

connus pour activer les couches épendymaires (Danilov et al., 2006; Meletis et al., 2008).

222
223
Conclusion

V. CONCLUSION

Cette étude représente la première caractérisation morpho-fonctionnelle des NcLCR-S

PKD2L1+ localisés autour du canal central au niveau bulbo-spinal chez la souris adulte. Nos

résultats montrent que les NcLCR bulbo-spinaux sont présents dès la naissance et que leur

organisation autour du canal central semble être définitive dès P7. Cette population neuronale

possède des caractéristiques morpho-fonctionnelles homogènes, elle est localisée exclusivement

au niveau sous-épendymaire et s’étend du tronc cérébral rostral (à partir du 4V) jusqu’à la

moelle épinière cervicale. Ces neurones majoritairement GABAergiques, possèdent un cil

primaire sur le soma, au contact du MEC et émettent une dendrite vers le canal central qui se

termine par une structure ampoulée (bud) portant une structure ciliée et baignant dans le LCR

(voir schéma bilan Figure 48). La présence de ces deux structures pourrait conférer aux NcLCR-

S des capacités de senseur du MEC et du LCR. De plus, nous avons montré que le canal

PKD2L1 est localisé uniquement sur le compartiment somato-dendritique des NcLCR et qu’il

représente un marqueur spécifique de ces neurones. L’analyse électrophysiologique du canal

PKD2L1 dans les NcLCR-S a révélé que l’activité de ce canal est modulée par des variations de

pH et d’osmolarité du milieu extracellulaire et qu’elle participe à la régulation de l’excitabilité

neuronale (Figure 48). Ainsi, les NcLCR semblent correspondre à des neurones sensoriels, qui

détecteraient des signaux environnementaux, les intègreraient (variation de la fréquence de

décharge) et les transmettraient aux cibles dont la nature reste inconnue. Les NcLCR reçoivent

également des modulations synaptiques de type GABAergiques et Glycinergiques qui

pourraient participer au traitement du message sensoriel (Figure 48). De par la présence de

nombreuses fibres sérotoninergiques, catécholaminergiques et cholinergiques à proximité de

ces neurones qui, de plus, expriment de nombreux récepteurs fonctionnels, il parait

envisageable que d’autres types de neurotransmetteurs modulent leur activité et participent à

l’intégration du signal.

Enfin, nos résultats montrent que les NcLCR-S PKD2L1+ existent dans un état de maturité

intermédiaire. Ces neurones possèdent de nombreuses caractéristiques de neurones matures : ce

sont des cellules polarisées qui émettent un prolongement de type dendritique dans le

parenchyme, elles présentent des décharges toniques, sont intégrées dans un réseau synaptique

et expriment NeuN. Cependant, l’expression de NeuN est plus faible dans les NcLCR que dans

les autres neurones présents dans le tissu, ils n’expriment pas de marqueur axonal retrouvé

224
Conclusion

dans les neurones matures, ils continuent d’exprimer de manière concomitante des marqueurs

de neurones immatures et présentent une double action du GABA.

Cette population neuronale atypique présente les caractéristiques morpho-fonctionnelles

des cellules sensorielles et ont une position déterminante en connexion avec le LCR et le MEC

pour assurer ces fonctions. Ces propriétés associées à la conservation d’un certain état

d’immaturité, pourrait d’une part permettre à ces neurones de détecter des variations du milieu

ambiant corrélées à des phénomènes pathologiques ou lors de lésions et d’autre part de

participer aux processus de réparation.

Variations de composition du MEC / LCR


(pH, osmolarité …) Modulation par les afférences
synaptiques

PKD2L1

iR-Glu NcLCR GABA-A-/Gly-


R
iR-Ach
cc
ASICs

Axone

FIGURE 48. DESSIN BILAN RESUMANT L'ENSEMBLE DES PROPRIETES MORPHO-FONCTIONNELLES DES NCLCR-S PKD2L1+
BULBO-SPINAUX.

225
Perspectives

VI. PERSPECTIVES

Cette étude représente un premier pas qui est important et nécessaire pour la

connaissance et la compréhension des NcLCR bulbo-spinaux. Cependant la question majeure

concernant cette population neuronale reste en suspens : quelle est leur fonction physiologique?

Pour répondre à cette question des études supplémentaires sont proposées et détaillées ci-

dessous.

A. LES NcLCR PKD2L1 DES SENSEURS ENVIRONNEMENTAUX

Les données obtenues lors de cette étude arguent en faveur d'un rôle sensoriel joué par

les NcLCR-S bulbo-spinaux. Afin de vérifier cette hypothèse, certains aspects morpho-

fonctionnels doivent être éclaircis. Tout d'abord, il parait nécessaire d'analyser la nature du bud

par une étude morphologique plus poussée utilisant des outils de microscopie électronique

associés à des marquages immunohistochimiques qui permettraient d'identifier d'une part, la

constitution subcellulaire de cet appendice et d'autre part, la nature de la structure ciliée que

nous avons mise en évidence ici. Du fait de sa localisation au sein du LCR, le bud semble avoir

une position clé dans la réception d'information circulante mais également dans la transmission

d'informations. En effet, il est maintenant établi que le LCR contient des substances

neuroactives dont la plupart affectent des fonctions nerveuses et dont la source est encore

inconnue (Vígh et al., 2004; Veening & Barendregt, 2010; Johanson et al., 2011b; Leak & Moore,

2012).

Cette hypothèse, d'un rôle fonctionnel tenu par les NcLCR-S bulbo-spinaux, est également sous-

tendue par l'expression du canal PKD2L1 dont l'activité est modulée par des variations de la

composition du milieu environnant et qui constitue la base moléculaire des capacités de

détection de ces neurones. Nous avons vu lors de cette étude, qu'il existe très peu de canaux

fonctionnels au niveau de la membrane et du fait de l'importante immunoréactivité du

compartiment somato-dendritique, cela pose la question de la localisation de ce canal. Il a

récemment été mis en évidence que ce canal se situe au niveau du cil primaire (DeCaen et al.,

2013; Delling et al., 2013) localisé sur le soma des NcLCR-S, ce qui opterait pour une détection

préférentielle de variations du MEC plutôt que du LCR. Cependant, cela n'annule pas la

possibilité de détections de variations du LCR puisque certains composés présents dans le LCR

226
Perspectives

peuvent diffuser vers le MEC (Proescholdt et al., 2000). Un autre point qu'il apparait intéressant

d'investiguer est la présence de PKD2L1 sur des organites intracellulaires tel que le RE puisque

PKD2L1 possède une séquence de rétention au RE et est majoritairement retrouvée dans cet

organite. D’autre part, PKD2L1 étant perméable au calcium (Chen et al., 1999) il serait

intéressant d'analyser son rôle dans l'homéostasie calcique. Pour cela, à l'aide d'une sonde

calcique intracellulaire (Oregon grenn 488 BAPTA 1 AM, kd = 170 nM), nous comptons 1/

Observer l'effet de l'ouverture spontanée du canal PKD2L1 sur la concentration de calcium

intracellulaire ([Ca]i), 2/ Tester l'effet d'activateurs du canal (solution alcaline à pH 9, choc

hypotonique) sur la [Ca]i et 3/ Analyser si PKD2L1 qui est activée par le calcium (Chen et al.,

1999) est impliquée dans un phénomène de type calcium induced calcium release de manière

similaire à son homologue PKD2 (Delmas et al., 2004b). Pour cela, nous analyserons l'effet de la

déplétion des stock calcique (caféine) sur la variation de [Ca]i lors de l'activation du canal

PKD2L1 (solution alcaline à pH 9, choc hypotonique). Une comparaison des résultats obtenus

chez les KO-PKD2L1 devrait permettre d'évaluer le rôle de PKD2L1.

Enfin, un point clé dans la détermination de la fonction de ces neurones est d'identifier

le lieu de projection ainsi que la nature des cibles. L'une des approches possible est celle

récemment utilisée par Aoyagi et collaborateurs et qui consiste à "rendre transparent" par

délipidation du tissu par des bains de thio-2,2'-diéthanol (TDE) de concentrations croissantes

(Aoyagi et al., 2013). Nous utiliserons pour cela des animaux PKD2L1:EGFP+ et prélèverons

cerveau et moelle épinière après fixation à la PFA 4 %. Après un tel traitement, il nous sera

possible de visualiser la fluorescence des NcLCR-S autour du canal central ainsi que celle de

leur prolongement sur de longues distances. Nous pourrons ainsi déterminer les territoires

innervés par les NcLCR-S.

227
Perspectives

B. BASES MOLECULAIRES DES DEUX EFFETS DU GABA, EFFETS DE

L’INFLAMMATION OU DE LA LESION SUR LES NcLCR PKD2L1+

Au cours de ces travaux, nous avons mis en évidence que chez la souris adulte, les

NcLCR-S conservent l'expression de marqueurs d'immaturité (DCX, HuC/D et Nkx6.1). Il serait

donc intéressant d'analyser l'expression de ces marqueurs au cours du développement, du

nouveau né (P0-P5), à 1 mois et chez la souris âgée (6 mois et 1 an).

De plus, nous avons montré qu'il existe deux populations de NcLCR différenciées par la valeur

de ECl. Les variations d'ECl sont généralement attribuées à différents niveaux d'expression de

transporteurs au chlore NKCC1 (responsable d'une forte [Cl] i) (Yamada et al., 2004) et NKCC2

(responsable d'une faible [Cl]i) (Stil et al., 2009). Il serait donc intéressant d'observer par

immunohistochimie l'expression de ces transporteurs au sein des NcLCR-S ainsi que leurs

proportions et de vérifier si celle-ci dépend de la position du neurone dans l'axe rostro-caudal,

puisque, nos travaux montrent que l'état de maturité des NcLCR-S varie en fonction de cette

position. Enfin, il serait également intéressant de vérifier s'il existe un parallèle entre ces valeurs

de ECl et les deux patrons de décharge (phasique et tonique) enregistrés dans les NcLCR-S.

Pour mettre en évidence l'éventuelle implication fonctionnelle de la conservation de

l'expression de marqueurs d'immaturité chez l'adulte, il serait nécessaire de tester l'effet de

l'inflammation ou de la lésion sur les propriétés morpho-fonctionnelles des NcLCR-S. De plus,

nous nous sommes procurés des souris transgéniques Gt(ROSA)26SorDTA qui après croisement

avec les souris PKD2L1:CRE induit des souches de souris où les cellules PKD2L1+ sont

génétiquement ablatées. Le promoteur de ces souris permet l’expression de la toxine

diphtérique dans les cellules où CRE est exprimée. Ce modèle permettrait de réaliser des études

in vivo afin de mettre en évidence l'effet de l'ablation des cellules PKD2L1 + sur les capacités de

récupération après lésion spinale. Toutefois, plusieurs cellules expriment PKD2L1, notamment

au niveau des bourgeons du goût, de la rétine, des reins et des testicules et il sera donc difficile

de corréler un phénotype à une délétion des NcLCR-S bulbo-spinaux.

228
Perspectives

C. DONNEES PRELIMINAIRES : QUELQUES PISTES SUR LA FONCTION DES

NcLCR PKD2L1+

Les NcLCR-S sont présents au niveau du CVD, région cérébrale impliquée dans la

régulation de la prise alimentaire (Schwartz, 2006) et de l'homéostasie énergétique (Dallaporta

et al., 2009; Young, 2012). Ces neurones sont en contact avec le LCR et pourraient détecter les

molécules bioactives qui y circulent et notamment des peptides impliqués dans la régulation de

la prise alimentaire tel que la CCK, la leptine ou le neuropeptide Y (voir tableau 2 de

l'introduction A. 1c) Ceci est conforté par la présence du récepteur au neuropeptide Y sur ces

neurones (www.Gensat.org ; BAC : RP23-426J22). Une prochaine étape de l'étude des NcLCR-S

du tronc cérébral consistera à évaluer leur implication dans les fonctions du CVD et plus

précisément dans la régulation de la prise alimentaire et l'homéostasie énergétique.

D'autre part, au cours de cette étude, nous avons mis en évidence la sensibilité des

NcLCR-S PKD2L1+ du tronc cérébral aux variations de pH extracellulaire. En plus d'être

impliquée dans la régulation la prise alimentaire, cette structure est également impliquée dans

la régulation de la respiration (Guyenet, 2006; Guyenet et al., 2010) qui est un phénomène basé

sur la détection de pH extracellulaire (Wang et al., 2013b). De part cette analogie, nous avons

réalisé une étude préliminaire sur le modèle de souris délétées pour PKD2L1 où nous nous

sommes intéressés à évaluer l'implication des NcLCR-S PKD2L1+ dans la régulation de la

respiration. En effet, le niveau de CO2 dans le sang est corrélé aux valeurs de pH du LCR

(Siesjö, 1972) et de nombreuses études montrent que les variations de la pCO2 affectent la pCO2

du LCR, le pH et la respiration (Pappenheimer et al., 1965; Fencl et al., 1966; Loeschcke &

Sugioka, 1969; Andrews et al., 1994; Wang et al., 2013b). Il a également été montré que de très

faibles variations du pH du LCR (0,005 unités) sont détectées par les chémorécepteurs centraux

(Fencl et al., 1969) et sont à l'origine de modifications de la ventilation (Pappenheimer et al.,

1965).

Par exemple, lors de l'augmentation de CO2 plasmatique (hypercapnie), le pH du LCR diminue

ce qui entraine l'activation de chémorécepteurs centraux localisés au niveau bulbaire et une

augmentation de la ventilation (Andrews et al., 1994). L'hyperventilation résultante permet ainsi

d'éliminer l'excès de CO2 plasmatique et de conserver des variations de pH dans les limites

homéostasiques. Afin de tester si les NcLCR-PKD2L1+ participent à cette boucle de régulation,

229
Perspectives

nous avons analysé par pléthysmograhie la réponse respiratoire à l'hypercapnie, chez des souris

mâles adultes (2-3 mois) délétées pour PKD2L1(KO-PKD2L1), par analyse de la fréquence

respiratoire (fR), du volume courant (VT) et du débit ventilatoire (VE). VT correspond au

volume d’air inspiré lors de chaque cycle respiratoire. Il est proportionnel à l’amplitude du

signal et estimé à partir de l’équation de Drorbaugh et Fenn (Drorbaugh & Fenn, 1955) en se

basant sur les mesures réalisées à la fin de l’enregistrement : calibration par injection d’un

volume d’air connu (0,05 ml) dans la chambre expérimentale, relevé de la température et du

poids de l’animal qui permettent de corriger l'équation. Lors du test, les paramètres

respiratoires sont enregistrés en condition normocapnique et normoxique (air ambiant)

pendant 1h, puis pendant 5 min en condition hypercapnique (CO2 à 5 %). Cette fraction

inspiratoire de CO2 est suffisante pour induire une forte réponse ventilatoire chez l’animal

non anesthésié.

Les résultats préliminaires (Figure 49) montrent qu'en condition basale (normocapnie et

normoxie), il n'y a pas de différence significative (p > 0,2) sur les paramètres respiratoires

analysés (fR : 162,9 ± 5,5 cycles/min pour les sauvages vs. 156,3 ± 4,6 cycles/min pour les KO-

PKD2L1 ; VT : 0,75 ± 0,05 ml/100 g pour les sauvages vs. 0,60 ± 0,04 ml/100 g pour les KO-

PKD2L1 ; VE : 121,7 ± 6,5 ml/min/100 g pour les sauvages vs. 94,0 ± 7,1 ml/min/100 g pour les

KO-PKD2L1 ; n = 11 pour les sauvages et n = 9 pour les KO-PKD2L1).

Lors de l'application du test, en condition d'hypercapnie, nous observons, comme attendu, une

augmentation de la réponse ventilatoire chez les animaux sauvages et KO-PKD2L1, cependant,

celle-ci est diminuée chez les animaux KO-PKD2L1. En effet, ces animaux présentent une

diminution du VT (1,56 ± 0,14 ml/100 g pour les sauvages, n = 11 vs. 1,17 ± 0.12 ml/100 g pour les

KO-PKD2L1, n = 9, p = 0,0179, test de comparaison multiple de Holm-Sidak) et du VE (500,3 ±

66,0 ml/min/100 g pour les sauvages, n = 11 vs. 349,2 ± 58,7 ml/min/100 g pour les KO-PKD2L1,

n = 9, p = 0,0179, test de comparaison multiple de Holm-Sidak) sans affection de la fréquence

respiratoire (fR : 308,3 ± 16,7 cycles/min pour les sauvages vs. 283,7 ± 19,6 cycles/min pour les

KO-PKD2L1.

230
Perspectives

Fréquence respiratoire (fR), cycles/min


Poids, g ± Ti, °C ± Tf, °C ±
SEM SEM SEM 400

WT 25,3 ± 0,3 37,6 ± 0,2 36,5 ± 0,3 300

KO 26,0 ± 0,8 37,8 ± 0,1 36,7 ± 0,2


200

100
WT

KO 0
Basale Hypercapnie

Volume courant (VT), ml/100 g Débit ventilatoire (VE), ml/min/100 g


2,0 600 *
*
1,6
400
1,2

0,8
200

0,4

0,0 0
Basale Hypercapnie Basale Hypercapnie

FIGURE 49. REPONSE VENTILATOIRE A L’HYPERCAPNIE DE SOURIS ADULTES DELETEES POUR PKD2L1. Le tableau résume les
valeurs de poids corporel, de température initiale (avant le test) et finale (en sortie de chambre pléthysmographiques) des
animaux sauvages (WT, n = 11) ou délétés pour PKD2L1 (KO), qui sont des constantes physiologiques intervenant dans le
calcul des paramètres ventilatoires. Les histogrammes montrent les mesures moyennes de fréquence respiratoire, du
volume courant et de débit ventilatoire calculés en condition basale (normoxie, normocapnie) et lors du test hypercapnique
(5 % de CO2 pendant 10 min). En présence de 5 % de CO2 les souris délétés pour PKD2L1 ont un volume courant et un débit
ventilatoire plus faible que les animaux sauvages, mais la fréquence respiratoire n’est pas modifiée (n = 11). * : p < 0,05, test
de comparaison multiple de Holm-Sidak.

231
Perspectives

Ces résultats ne permettent pas de faire de conclusion quant un rôle des NcLCR-S PKD2L1+

dans la détection au pH impliquée dans régulation de la respiration. Mais de part ces premiers

résultats in vivo, cette hypothèse mérite d'être investiguée. Pour cela, nous envisageons dans un

premier temps de tester l'effet de variation de CO2 dans le milieu de perfusion sur l'activité

canal enregistrée dans les NcLCR-S sur tranches de tronc cérébral. Puis, dans un deuxième

temps, d’analyser sur préparation in situ, la réponse au pH des NcLCR-S PKDL21+. Ce modèle

d’étude permettra de vérifier l'existence d'un lien entre la réponse comportementale décrite ici

et la modulation par le pH de ces neurones, puisque cette préparation permet d'enregistrer de

manière simultanée l'activité neuronale et la respiration fictive révélée par l'activité des nerfs

phrénique.

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