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Travaux Pratiques de Chimie Organique Nadia BOULEKRAS

Chromatographie de pigments verts


I. INTRODUCTION

Les organismes chlorophylliens sont capables de synthétiser des


molécules organiques simples sous l’action de la lumière visible. Cette
synthèse nécessitant la lumière comme source d'énergie s'appelle la
photosynthèse.

L'utilisation de l'énergie lumineuse est rendue possible grâce à l'existence de


pigments : molécules capables d’absorber certaines longueurs d'onde
lorsqu'ils sont éclairés par de la lumière blanche. Cette propriété leur donne
une couleur déterminée.

La chlorophylle (mot grec composé chlorós : vert et phýllon : feuille) est le


principal pigment constituant des végétaux photosynthétiques.
La chlorophylle est contenue dans les chloroplastes : de minuscules
organismes situés dans les cellules végétales vivantes,
essentiellement dans les feuilles.

La chlorophylle est constituée de plusieurs molécules de structures


chimiques très proches : les chlorophylles a, b, c et d, les xanthophylles
et les caroténoïdes. Les chlorophylles a et b sont les plus abondantes
chez les plantes supérieures et algues vertes, en proportions variables
suivant l’espèce. Les chlorophylles c et d sont présentes chez les algues
brunes et cyanobactéries.

o Chlorophylle a (vert-bleu) :

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o Chlorophylle b (vert-jaune) :

o Phéophytine (vert-olive)

o β-Carotène (jaune-orangé) :

o α-Carotène (orange) :

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o Lutéine (jaune)
OH

HO

o Xanthophylles (jaune) :

• Viola xanthine
OH

HO

• Néo xanthine

HO OH OH

Remarque : toutes ces molécules contiennent des liaisons doubles


conjuguées qui sont essentielles pour l’absorption et le transport de
l’énergie lumineuse.

En automne, la dégradation des chlorophylles a et b provoquent un


changement de couleur des végétaux : les feuilles des arbres perdent leur
teinte verte et prennent des couleurs allant du jaune au rouge sombre. Sous
l’action d’enzymes, la chlorophylle verte se transforme en des molécules
rouges puis incolores. Les autres pigments de la plante, les caroténoïdes
(jaune-orange) ne seront plus cachés par le vert de la chlorophylle et
seront responsables de la couleur rouge (ou jaune) que prendra la feuille.

II. PRINCIPE

Les pigments que l'on rencontre dans les feuilles des plantes vertes sont
facilement séparés par chromatographie. Ils sont extraits par un solvant
organique (l’éthanol : CH3CH2OH ou l’acétone CH3COCH3). Les constituants
de l’extrait sont séparés par chromatographie sur colonne puis analysé
par chromatographie sur couche mince (C.C.M).

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Les chlorophylles : sont très solubles dans les solvants polaires.

 Les xantophylles: ont une solubilité plus ou moins importante dans


les solvants polaires, mais elles sont aussi solubles dans les solvants
apolaires.
 Les carotènes: ne possèdent aucun groupement polaire et sont
solubles dans les solvants apolaires.

III. MODE OPÉRATOIRE : Pour 4 binômes

• Prendre 5 feuilles d’une plante verte, les rincer à l’eau distillée puis les
sécher avec du papier absorbant.
• Choisir la partie vert foncée, enlever les nervures et les tiges, puis les
couper finement.
• Mettre les feuilles coupées dans un mortier puis ajouter une spatule de
sable (qui facilite le broyage) et 10 mL d’acétone (ou d’éthanol).
• Broyer à l'aide du pilon jusqu'à ce que le solvant prenne une couleur vert-
foncé.
• Filtrer la solution sur papier filtre (ou Büchner) : le filtrat obtenu doit avoir
une couleur vert limpide.
• Evaporer le solvant à l’évaporateur rotatif (ou en chauffant modérément
au bain-marie) : on obtient une pâte de couleur vert-foncé.
• Réaliser une chromatographie sur couche mince.

Feuilles après broyage Filtrat après broyage Après évaporation du solvant

IV. CHROMATOGRAPHIE

1) Chromatographie sur colonne :

a) Préparation de la colonne :

Introduire un petit morceau de coton au fond une colonne propre et


sèche, munie d'un robinet à la base. Maintenir la colonne
verticalement à l'aide d'une pince en bois fixée à un support (voir
schéma). La remplir de poudre de silice. Imprégner la colonne
d'éluant jusqu'en haut avant de déposer l'échantillon.

Remarque : Pendant la phase d’élution avec le solvant on veillera à


ne pas assécher la partie supérieure de la phase fixe.
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b) Dépôt de l’échantillon

A l'aide d'une pipette pasteur, prélever un peu de la solution à


séparer et la déposer doucement sur le dessus de la colonne de
silice (le long des parois de la colonne): attention à ne pas déformer
la surface de la phase stationnaire pendant cette opération.

c) Développement de la colonne (élution) :

Lorsque le dépôt a bien imprégné la silice, verser un peu d'éluant


sur la colonne, très doucement, pour ne pas déplacer la silice.
Ajouter régulièrement de l'éluant dans la colonne : le niveau
d'éluant dans la colonne doit rester au dessus de celui de la silice
jusqu'à la fin du développement.

Développer la colonne en recueillant les fractions dans des petits


tubes à essais. Changer de tube (en déplaçant le portoir) dès que le
niveau du liquide dans le tube atteint 2 cm pour le premier tube,
1cm pour les suivants ou dès qu'une couleur différente parvient en
bas de la colonne: en traversant la colonne, l'éluant entraîne les
composants du mélange les uns après les autres.

Lorsque la colonne de silice est pratiquement décolorée, arrêter


l'expérience. Laisser évaporer un peu le solvant sous la hotte pour
concentrer les fractions.

d) Analyse des fractions

Analyser les fractions par chromatographie sur couche mince, en


déposant au même endroit plusieurs gouttes de chaque échantillon
car les solutions sont très diluées. On identifiera chaque échantillon

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par le numéro de la fraction, indiqué légèrement au crayon sous la


ligne de dépôt.

2) Chromatographie sur couche mince :

a) Préparation de la cuve :

L'atmosphère de la cuve doit être saturée en vapeur d'éluant. Ceci


impose d'avoir une cuve bien fermée et préparée à l'avance.

Sous la hotte, verser l’éluant dans un bécher sec de 100 mL, sur
une hauteur de ½ cm. Recouvrir la cuve avec une boîte à pétri :

• Eluant : Ether de pétrole/Acétone/Cyclohexane :


80/15/5% ou 75/20/5%

b) Préparation de la plaque chromatographique :

o Prendre une plaque d’aluminium recouverte de silice. Ne pas


toucher avec les doigts.
o Découper avec un cutter, une plaque de (5 cm x 3 cm).
o Tracer au crayon sans appuyer, une ligne (ligne de dépôt), à 1
cm du bord inférieur de la plaque.
o Marquer légèrement au crayon sur cette ligne, l’emplacement
du dépôt.

c) Dépôt de l’échantillon :

o A l’aide d’une pipette pasteur, d’un tube capillaire ou d’un cure-


dent, prélever une goutte d’extrait vert, la déposer à
l’emplacement marqué.
o Laisser sécher avant d’effectuer un nouveau dépôt.
o Effectuer une dizaine de dépôts au même endroit, en laissant
sécher entre chaque dépôt.

d) Elution :

o Lorsque les dépôts sont secs, introduire la plaque verticalement


dans la cuve (la ligne de dépôt ne doit pas tremper dans l’éluant)
et refermer à l’aide de la boîte à pétri.
o Au cours de l’élution, l’éluant migre sur la plaque en imprégnant
la silice.
o Retirer la plaque de la cuve avec des pinces, lorsque le front du
solvant est à 1 cm du bord supérieur de la plaque.
o Repérer le front du solvant au crayon. Laisser l’éluant s’évaporer
sous la hotte.
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e) Révélation (développement du chromatogramme):

Observer le chromatogramme et entourer au crayon, les différentes


tâches colorées qui apparaissent.

f) Analyse du chromatogramme :

On met en évidence 4 sortes de pigments, du haut vers le bas :

• Carotènes (jaune-orange) : très peu polaires.


• Chlorophylle A (vert-bleu) : peu polaire.
• Chlorophylle B (vert-jaune) : moyennement polaire.
• Xantophylles (jaune) : polaires.

Remarque : lorsque les taches sont incolores, on les fait apparaître


sous une lampe UV ou à l'aide d'un révélateur chimique mais dans le
cas des pigments, ils apparaissent sous forme de taches colorées,
visibles à l’œil nu.

o Les xantophylles (violaxanthine et néoxanthine) : sont des


carotènes oxydés, ils sont polaires puisqu’ils comportent de
nombreux atomes d’oxygènes qui vont pouvoir se lier avec les
groupements hydroxyles (–OH) du support solide.

o Les chlorophylles a et b : sont des composés peu polaires.


La chlorophylle b se différencie de la chlorophylle a par la
présence un groupement aldéhyde (-CHO) au lieu d’un
méthyle (CH3). La chlorophylle b est donc plus polaire et plus
retenue par le support solide que la chlorophylle a.

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o Les carotènes (β-carotène) : sont des composés apolaires,


ne comportant pas d’atome d’oxygène et ne sont donc pas
retenus par le support solide.

g) Rapport frontal :

On appelle rapport frontal Rf d'une espèce chimique, le rapport


entre la distance x parcourue par l'espèce et la distance y parcourue
par l'éluant pendant le même temps.

Rf dépend de la nature du produit, de l'éluant et de la phase fixe.

dis tan ce parcourue par la susbs tan ce x


Rf = =
dis tan ce parcourue par l' éluant y

V. COMPTE RENDU

• Reproduire le chromatogramme obtenu. Identifier chaque pigment, en


utilisant les indications données ci-dessus.
• Calculer les différents rapports frontaux.

• Comparer le chromatogramme obtenu à partir du pigment vert avec


celui du paprika : Y a-t-il une substance commune aux deux extraits?

• Quelle est la technique qui nous permet de révéler le résultat d’une


CCM lorsque les produits ne sont pas colorés ?

• On a broyé des feuilles de persil que l’on répartit dans 2 béchers :

5 mL d'eau 5 mL d'éthanol

Feuilles de persil
broyées

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On agite, on laisse agir, puis on filtre dans 2 tubes à essai. On constate


que :

 dans le 1er tube, la couleur du filtrat est à peine verte (presque


incolore).
 dans le 2ème tube, la couleur du filtrat est vert foncé.

Quel est le meilleur solvant pour la chlorophylle ?

Références

• http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle
• http://fr.wikipedia.org/wiki/Chlorophylle

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