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MÉMOIRE DE STAGE
DE MASTER 2
2
E. Mesure de l'ADN associé au NETs: ................................................................................... 18
F. Isolement des Lymphocytes B CD19+ totaux: ................................................................... 18
G. Culture des cellules PBMC et des lymphocytes B: ........................................................... 19
H. ELISA, mesure des cytokines: ............................................................................................ 19
I. Analyse des molécules de surface des cellules B par cytométrie en flux: ...................... 19
IV. Résultats:............................................................................................................................ 20
A. Le complexe NETs déclenchent l'activation des PBMC d'une manière dose-dépendante:
20
B. Les lymphocytes B naïfs et à mémoire sont activés par les NETs: .................................. 21
C. Profil pro-inflammatoire des NETs: .................................................................................. 22
D. Les lymphocytes B purifiés sont directement activés par les NETs: ............................... 23
V. Discussion et perspectives:.................................................................................................... 25
Bibliographie: ................................................................................................................................ 27
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Abréviations
A
I
AAV. vascularite
ACPA. Anticorps anti-protéine citrullinés IgG. Immunoglobulines de type G
Acs. Anticorps IL. Interleukine
ADN. Acide désoxyribonucléique INF. Interféron
Ag. antigène
ANCA. Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies L
APRIL. A proliferation-inducing ligand
LB. Lymphocyte B
LED. lupus érythémateux disséminé
B LT. Lymphocyte T
BAFF. B-cell activating factor
M
C MPO. Myéloperoxidase
CD. cellule dendritique, clusters de différenciation
CII. Collagène de type 2 N
CPA. Cellule présentatrice d'antigène
NE. élastase neutrophile
NETs. neutrophil extracellular traps
D
DMARD. Disease-modifying antirheumatic drugs P
Dnase. Désoxyribonucléase
PBMC. cellules mononucléaires du sang périphérique
PMA. phorbol acétate de myristate
F PNN. polynucléaires neutrophiles
FcγR. Fc gamma receptor PR. polyarthrite rhumatoïde
FLS. Fibroblastes synoviaux
FMF. Fièvre méditerranéenne familiale R
FR. facteur rhumatoïde
RA33. Ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A2 /
B1
H RANKL. Receptor activator of nuclear factor kappa-B
HC gp-39. Human cartilage glycoprotein-39 ligand
HLA. Antigènes des leucocytes humains
T
TNF. Facteur de nécrose tumorale
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I. Problématique et objectifs du rapport
La polyarthrite rhumatoïde ( PR ) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent de nature
auto-immune. Cette pathologie touche environ 0,5 % de la population mondiale. Les
mécanismes physiopathologiques qui va aboutir à une synovite et à des lésions du cartilage ( et
donc de la fonction articulaire ) et des tendons sont nombreux, comme des mécanismes
enzymatiques non spécifiques par des enzymes protéolytiques (métalloprotéases dont les
collagénases) qui dégradent le cartilage, des mécanismes immunologiques à médiation cellulaire
avec une activité autoréactive des lymphocytes T CD4+ et CD8+, aussi des mécanismes
immunologiques à médiation humorale avec la production des auto-anticorps ( ACPA, FR ), Ces
auto-anticorps peuvent former des complexes immuns qui se déposent dans les articulations,
entraînant une inflammation nocive et des lésions tissulaires. Ces données physiopathologiques
essayent d'expliquer les mécanismes de la maladie pour proposer des thérapeutiques nouvelles
mais ne sont pour l'instant utiles ni au diagnostic ni au suivi de ce malade.
De plus la production des auto-anticorps spécifiques indique que les lymphocytes B ( LB )sont
impliqués dans certains mécanismes pathogènes. Cependant, les mécanismes d’activation des
LB, les stimuli impliqués et les autoantigènes reconnus restent mal caractérisés.
Par ailleurs, les polynucléaires neutrophiles ( PNN ), cellules en général décrites comme
proinflammatoires et pourtant peu étudiées dans la PR, sont activées et recrutées dans les
articulations de patients. Cependant, des données récentes, dont les nôtres (1), rapportent des
capacités d’immunomodulation. Les PNN activés produisent des « neutrophil extracellular traps
» ( NETs ), des fragments de chromatine associés à des protéines cytoplasmiques et expulsés par
les PNN ( NETose ). Nous venons de démontrer que les NETs ( sont reconnus par les anticorps de
patients ) sont pro-inflammatoires, en particulier chez les patients PR, et peut activer les
lymphocytes B d'une manière polyclonale et indépendante de l'antigène ( effet adjuvant des
NETs ).
Pour cela, nous avons préparé des NETs à partir des PMN des donneurs sains ou des patients PR,
puis nous avons d'abord essayé d'examiner l'effet stimulant des NETs sur les cellules
mononucléaires du sang périphérique ( PBMC ), en étudiant la sécrétion de cytokines
proinflamatoires par test ELISA, après conformation que les NETs ont la capacité d'activer les
PBMC, nous sommes approfondis vers notre objectif où nous avons examiné le même effet
particuliarement sur des lymphocytes B dans les PBMC , ensuite sur des lymphocytes B CD19+
purifiés et des LB naives par analyse de l’expression des molécules de costimulation et la
production des cytokines pro-inflamatoires, nous avons également étudiés l'effet de coculture
de cellules autologues comme les monocytes avec des lymphocytes B en présence des NETs, pour
savoir si les cellules autologues peuvent aider à activer ou non les lymphocytes B. Toutes ces
expériences sont destinées à démontrer l'effet adjuvant et proinflammatoires des NETs qui peut
activer les cellules B, favorisant ainsi l'auto-immunité dans la PR, et de déterminer les
conséquences pathogènes de la NETose dans la PR.
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II. Introduction
A. Maladies auto-immunes:
Les maladies auto-immunes sont classées selon les organes et les tissus endommagés par la
réponse immunitaire. Il existe une maladie auto-immune dirigée contre presque tous les organes
du corps, impliquant généralement une réponse immunitaire à un antigène ( Ag ) exprimé dans
ces organes. Les maladies auto-immunes peuvent être définies à l'aide des postulats de Witebsky
(2). Ces postulats nécessitent que : 1) une réaction auto-immune soit identifiée sous la forme
d'un auto-anticorps ou d'une réaction immunitaire à médiation cellulaire, 2) l'Ag correspondant
soit connu, et 3) une réponse similaire provoque une maladie similaire chez les animaux de
laboratoire.
La polyarthrite rhumatoïde ( PR ) est considérée comme une maladie auto-immune, avec des
réponses immunitaires spécifiques , cellulaire et humorale, contre les Ags dans l’articulation. Les
données récentes indiquent que la réponse immunitaire contre les antigènes citrullinés est un
candidat attractif pour la réalisation des trois épreuves de postulats de Witebsky. Ces dernières
années, ils ont trouvés que la majorité de patients atteints de PR ont des anticorps ( Acs ) anti
protéines contenant de la citrulline. Et ces Acs apparaissent tôt dans la PR et sont rarement
trouvés chez les personnes en bonne santé ou les patients atteints d'autres maladies.
De plus, des données récentes montrent que les Ag citrullinés eux-mêmes sont exprimés dans
l'articulation enflammée. Cela laisse le troisième postulat de Witebsky ouvert, bien que des
données récentes suggèrent que l'immunisation avec des peptides ou des protéines citrullinés
pourrait conduire à une reponse cellulaire significative chez des modèles souris (3).
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1. Épidémiologie:
La polyarthrite rhumatoïde est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques.
Sa prévalence est variable suivant les pays, elle a touchée en 2016 0,5 à 1% de la population
mondiale adulte et près de 150 000 personnes en France dont 75 % sont des femmes. L’âge
moyen d’apparition se situe entre 35 et 55 ans, cependant, la maladie peut débuter à tout âge,
y compris chez l'enfant ( arthrites juvéniles idiopathiques ).
2. Traitement:
Le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde doit être aussi précoce que possible car c’est au stade
du début de la maladie que les traitements ont le plus de chance d’être efficaces, parmi ces
traitements on a:
a. Traitements Symptomatiques:
Ils ont pour but de soulager les douleurs mais n'influencent peu ou pas l'évolution. On utilise:
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C. Physiopathologie:
La PR est une affection dont l'origine précise n'est pas connue, elle est classé comme une maladie
auto-immune à cause de la présence de signes biologiques d'autoréactivité, elle est liée à des
anomalies de l’immunité à médiation cellulaire et humorale, avec activation des lymphocytes T
et B, qui provoque la synovite inflammatoire; lésion responsable de la destruction articulaire.
Plusieurs phases caractérisent l’évolution de la synovite rhumatoïde: initiation, recrutement
cellulaire et inflammation, prolifération synoviale, et destruction de l’articulation.
Au début de la maladie, les leucocytes migrent vers l'articulation où des réponses innées et
adaptatives se développent, avec une infiltration précoce des neutrophiles, des cellules T, des
cellules B et les plasmocytes qui synthétisent les auto-anticorps et forment des follicules
lymphoïdes ectopiques dans les synovium. Les complexes immuns formés dans l'articulation
peuvent activer la cascade du complément qui active et recrute davantage les leucocytes. Outre
les neutrophiles, d'autres cellules immunitaires innées, principalement les monocytes /
macrophages et les cellules tueuses naturelles NK sont impliqués dans la pathogenicité PR. En fin
de compte, le milieu inflammatoire local entraîne des changements fondamentaux dans la
biologie des fibroblastes synoviaux résidents ( FLS ), ce qui favorise la formation d'un synoviale
hyperplasique et inflammatoire. (6)
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1. Mécanismes immunologiques:
La PR est caractérisée par une réponse inflammatoire qui implique des réponses immunitaires
innée et adaptative cellulaire et humorale.
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1- Présentation de l'antigène et signal de co-stimulation pour l'activation des
lymphocytes T:
La présentation des autoantigènes aux lymphocytes T dans le tissu synoviale pourrait être très
important dans l'initiation de l'arthrite inflammatoire. Le LB peut fonctionner comme cellule
présentatrice d'antigène CPA en traitant et en présentant des peptides antigéniques aux
lymphocytes T. Les LT prolifèrent alors et exercent activités pro-inflammatoires. Il est bien connu
que les lymphocytes B peuvent lier les antigènes par leur récepteur d'immunoglobuline ou BCR.
Le récepteur d'immunoglobulines se trouve à la surface des cellules B et peut lier un très faible
taux d'antigène dans l'environnement. L'antigène est dégradé par les LB en peptides
antigéniques. Celles-ci sont ensuite présentés par la molécule CMH de classe II pour activer les
cellules T, qui à leur tour subissent divers processus, y compris la prolifération, la production de
cytokines qui contribuent à la pathogène processus dans PR.
Par exemple, les cellules B du facteur rhumatoïde ( FR ) sont les cellules B qui produisent la FR
qui reconnaisse et se lie à la partie Fc des IgG. Ces cellules peuvent reconnaître les complexes
immuns antigène-Ig via leurs récepteurs membranaires Ig, qui ont une spécificité RF et réagissent
ainsi avec la partie Fc des anticorps. Les cellules B traitent et présentent alors les peptides de
l'antigène, et induisent ainsi l'activation des lymphocytes T (8).
2- Sécrétion des cytokines proinflamatoires:
Les lymphocytes B synoviaux peuvent produire plusieurs cytokines, y compris lymphotoxine bêta
LT-β, qui peuvent être nécessaires à la formation de tissu lymphoïde ectopique synovial , le TNF
et IL-6, ce qui implique un rôle pro-inflammatoire direct.
De plus, la population de lymphocytes B était la seule population dans le liquide synovial qui
exprimait à la fois IL-12p35 et IL-12p40, les deux sous-unités qui sont nécessaires pour la
production d'IL-12 fonctionnelle, qui favorise le réponse cellulaire de type Th1. Les cellules B du
liquide synovial expriment également IL-23p19, la sous-unité qui se hétérodimérise avec IL-12p40
pour former IL-23, indiquant que les cellules B du liquide synovial ont la capacité de produire IL-
23 fonctionnel qui est une cytokine pro-inflammatoire et une cytokine clé pour le l'expansion de
Th17. Et également une nouvelle étude a montré que les cellules B synoviales dans la PR peuvent
produire RANKL, la cytokine clé responsable de la destruction osseuse par activation des
ostéoclastes (9), de même, de nombreuses études montrent le rôle important de RANKL en tant
que nouveau régulateur de l'organogenèse des ganglions lymphatiques in vivo en utilisant des
souris déficientes en RANKL qui présentent une modification des populations de cellules B et T
et manquent de ganglions lymphatiques, ce qui indique que RANKL joue un rôle dans le
développement des lymphocytes et l'organogenèse des ganglions lymphatiques.
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3- Production d'autoanticorps:
L'une des caractéristiques de la PR est la présence d'auto-anticorps dans la circulation. Ces auto-
anticorps pourraient contribuer directement à la réponse inflammatoire.
Ainsi, la présence des autoanticorps dans le sérum des patients atteints de PR a fourni des indices
sur le rôle important des lymphocytes B dans la physiopathologie de la maladie.
De nombreux autoanticorps ont été décrits dans la PR , Ces auto-anticorps peuvent être classés
en deux groupes: ceux présents dans d'autres maladies auto-immunes tels que le facteur
rhumatoïde ( RF ), les anticorps anti-RA33, les anticorps anticalpastatine, les anticorps
anticollagènes de type 2 et ceux qui semblent être relativement spécifiques de la PR, comme les
anticorps anti-protéine citrullinée ( ACPA ), Ces auto-anticorps sont fortement associés à la PR,
avec une spécificité publiée de 95 à 100%.
Les lymphocytes B peuvent produire des ACPA qui sont dirigés contre des peptides et
des protéines qui sont citrullinées. Pendant l'inflammation, les résidus d’acides aminés
l’arginine peuvent être convertis par voie enzymatique en résidus de citrulline dans des
protéines telles que la vimentine, par un processus appelé citrullination.
Ces autoanticorps ACPA ont de nombreuses fonctions dans la pathogénicité de la maladie PR:
• Liaison aux récepteurs Fc: En général, les anticorps exercent un effet sur d'autres
cellules via la liaison au récepteur Fc. Par exemple il peut stimuler la sécrétion de TNF
via la stimulation des récepteurs Fcγ sur les macrophages.
• Activation du complément: Une autre fonction effectrice principale des anticorps est
l'activation du complément. Il a été démontré que l'ACPA a la capacité de recruter du
complément via les voies classiques et alternatives, mais pas via la voie des lectines (10).
• Érosion osseuse et activation des ostéoclastes: La PR séropositive est associée à une
augmentation des dommages aux articulations, L'ACPA peut se lier à la surface des
ostéoclastes et améliorant la différenciation des précurseurs des ostéoclastes in vitro et
in vivo. Le transfert adoptif d'ACPA a également conduit à une résorption osseuse
accrue chez les modèles de souris, bien que ce processus semble différer des lésions
articulaires dans la PR (11).
De plus La région Fc de l'ACPA a un niveau de galactosylation et de sialylation inférieur à celui
des autres anticorps. Moins de sialylation des anticorps dans les complexes immuns peut
conduire à l'ostéoclastogenèse in vitro et in vivo grâce à une signalisation FcγR altérée.
Egalement, les patients atteints de PR avec de faibles niveaux de sialylation ACPA-IgG Fc avaient
des volumes osseux et un nombre de trabécules inférieurs. Ainsi, la signature spécifique du
glycane Fc de l'ACPA pourrait influencer leur capacité à contribuer à la physiopathologie de la
maladie.
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c. Rôle des cytokines dans la pathogenèse de la PR:
Les cytokines sont reconnues comme des facteurs importants dans la pathogenèse de la PR. Dans
la polyarthrite rhumatoïde, l'articulation est infiltrée par de multiples populations de cellules
inflammatoires, dont les lymphocytes T, les lymphocytes B, les macrophages et les neutrophiles,
qui contribuent tous au réseau local de cytokines.
Il existe dans l’articulation rhumatoïde un déséquilibre entre les cytokines à action
proinflammatoire, comme le TNF-α, l'IL1 et l’IL6, présentes en excès, et les cytokines à action
anti-inflammatoire, représentées par l’IL10, l’IL4, l’IL13, les récepteurs solubles du TNF-α.
Principalement les monocytes, les macrophages, les fibroblastes FLS et les lymphocytes T libèrent
de nombreuses cytokines lors de la stimulation. La plupart de ces cytokines, y compris le TNF-α
et l'interleukine-1, peuvent être détectées dans le liquide synovial de patients atteints de PR. Les
concentrations sériques et synoviales de ces deux cytokines sont élevées chez les patients
atteints de polyarthrite rhumatoïde active. De plus, le TNF-α et l'interleukine-1 sont de puissants
stimulateurs des cellules mésenchymateuses, telles que les fibroblastes synoviaux, les
ostéoclastes et les chondrocytes, qui libèrent les métalloprotéinases qui detruisent le tissu. Peut-
être qu'en induisant la production d'interleukine-11, le TNF-α stimule le développement des
ostéoclastes, qui sont responsables de la dégradation osseuse. De plus les IL-7, IFNβ, IL-23,
facteur d'activation des cellules B de la famille TNF ( BAFF ) et un ligand induisant la prolifération
APRIL, jouent un rôle dans la différenciation et survie des cellules B et les lymphocytes T (12).
D. Neutrophiles
Les neutrophiles sont l'une des premières lignes de défense contre l'invasion des microbes, ce
sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine, et leur nombre augmente très
fortement et très rapidement lors d’infections. Les neutrophiles peuvent tuer les
microorganismes par une multitude de mécanismes tels que la phagocytose, la libération
d’enzymes qu’ils présentent au niveau de leurs granules cytoplasmiques ( myéloperoxidase MPO,
élastase NE, protéinase-3, cathépsine G, etc. ), ou de dérivés réactifs de l’oxygène, ou la
formation de NET ( neutrophil extracellular traps ). Les neutrophiles en circulation sont dirigés
par des cytokines vers des tissus, où ils rencontrent des microbes envahisseurs. En effet, lors de
la réponse inflammatoire, les neutrophiles apoptotiques sont éliminés par phagocytose par les
macrophages anti-inflammatoires.
Cepandent certains produits libérés lors de l’activation des neutrophiles, et qui sont impliqués
dans les défenses anti-microbiennes, ont également des effets pro-inflammatoires puissants. Les
neutrophiles peuvent ainsi contribuer aux dommages tissulaires dans le contexte d’une réponse
immunitaire et participer à l’inflammation pathologique dans certaines maladies auto-immunes
ou allergiques, par exemple le rôle pathogène des neutrophiles dans la PR implique une
altération de divers processus, y compris une capacité migratoire et une survie cellulaire accrues,
une activité inflammatoire anormale, des processus de stress oxydatif améliorés et une libération
de pièges extracellulaires à neutrophiles ( NETs ) par un processus de Netose.
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1. Netose:
L'un des facteurs de défense les plus uniques que les neutrophiles portent est leur capacité à
former les pièges extracellulaire des neutrophiles ou NETs. Les neutrophiles peuvent libérer leur
chromatine décorée de protéines granulaires. Il forme de grandes structures extracellulaires sous
forme de filets ( NET ). En 2004, Brinkmann et al. ont observé que la libération de chromatine
nucléaire peut être un processus réglementé qui entraîne des événements de ce qu'ils appellent
des NETs, et que la libération de NET peut avoir des conséquences physiologiques, bénéfiques
ou non.
Les neutrophiles stimulé par l'interleukine-8 ( IL-8 ), le phorbol acétate de myristate ( PMA ) ou
lipopolysaccharide ( LPS ) est devenu plat et a formé des trous membranaires, et extrude des
structures extracellulaires ou NETs.
Cepandent, des stimuli spécifiques induisent la formation de NET in vivo comme les bactéries, les
hyphes fongiques, les stimuli biochimiques, certaines cytokines et chimiokines inflammatoires,
les complexes immuns et le contact avec les plaquettes activées.
Les NETs contiennent des protéines de granules azurophiles ( primaires ) , comme élastase
neutrophile ( NE ), cathepsine G, et la myéloperoxydase ( MPO ). Et de protéines de granules
spécifiques secondaires et tertiaires, tels que la lactoferrine et la gélatinas (13). de plus les NETs
sont décorés de peptides antimicrobiens comme le LL-37…
L'ADN est également un composant structurel majeur des NETs, car ils sont fortement colorés
par plusieurs colorants intercalants d'AND, et un bref traitement à la désoxyribonucléase
( Dnase ) entraînent la désintégration des NETs. De plus, ils contiennent des histones protéiques
car ils ont réagi avec des anticorps contre les histones H1, H2A, H2B, H3 et H4.
La NETose est la processus de formation des NETs, et elle peut se faire en deux formes, une qui
entraîne la mort de neutrophiles ( NETose suicidaire ), et la NETose vitale qui n'entraîne pas la
mort des neutrophiles. Dans l'ensemble, de nombreux composants clés du processus sont
similaires pour les deux types de NETose, cependant, il existe des différences clés dans les stimuli,
le calendrier et le résultat final final. la formation des NETs est surtout considérée comme un
processus actif entraîné par des voies intrinsèques cellulaires qui sont activé par des stimuli
externes.
a. Voie d'activation:
la voie de formation des NETs initialement décrite était induite par le PMA ou les bactéries, les
neutrophiles libèrent de l'ADN nucléaire décoré de protéines dans le milieu extracellulaire via
mécanisme dépendant de NADPH oxydase 2 ( NOX2 ), impliquant la mort du neutrophile . Plus
tard, il est devenu clair que la formation des NETs peut se produire via plusieurs voies distinctes.
Outre NOX2, l'exigence de neutrophiles spécifiques de neutrophile élastase ( NE ) et la
myéloperoxydase ( MPO ) ont également été décrites pour les stades ultérieurs de formation de
NET, plus particulièrement pour la décondensation de la chromatine. En particulier, Les ROS
dérivés de NOX2 ont été signalés comme essentiels pour la libération de NE et MPO à partir de
13
granules azurophiles (14). Cependant, il est maintenant clair que certaines formes de formation
NETse produisent indépendamment de NOX2 et MPO.
L'enzyme PAD4, fortement exprimée en neutrophiles, assure la conversion de l'arginine en
citrulline, ce qui entraîne une perte massive de charges positives sur résidus d'arginine dans les
histones. Cette conversion diminue le force entre l'ADN et les histones et contribue ainsi à
décondensation de la chromatine, et l'inhibition de PAD4 peuvent diminuer la formation des
NETs.
le processus de décondensation, entraînant la rupture de l'enveloppe nucléaire. La chromatine
non condensée pénètre dans le cytoplasme où des granules et des protéines cytoplasmiques
supplémentaires sont ajoutés au NET à un stade précoce. Le résultat final du processus dépend
alors de la voie NETose qui est activée.
b. NETose vitale:
Dans la voie non suicidaire de formation de NET, la cellule reste intacte et les fonctions cellulaires
des neutrophiles restent normale, comme la chimiotaxie et la phagocytose. les processus
semblent se produire beaucoup plus rapidement que le voie canonique NET induite par PMA ou
autre formes de libération NET qui entraînent une perturbation du membrane plasmique, elle
est rendue possible par la formation des vésicules remplient d'ADN qui sont exocytées et laisse
la membrane plasmique intacte. Sa formation et sa libération rapides n'entraînent pas la mort
des neutrophiles, cependant, la cellule est sans ADN, ce qui soulève la question de savoir si une
cellule sans ADN peut être considérée comme vivante.
c. NETose suicidaire:
La NETose suicidaire est la libération de NETs entraînait la mort des neutrophiles par une voie
différente de l'apoptose ou de la nécrose. Desai et al. ont constaté que la formation NET qui
prend plus de 2 h apres stimulation avec du PMA ou des cristaux implique le voie de nécrose
dépendante de RIPK3 / MLKL (15).
De plus, plusieurs études récentes ont démontré qu'une fraction considérable des acides
nucléiques contenus dans les NETs est d’origine mitochondriale. Une attention particulière est,
cependant, nécessaire pour distinguer l’ ADN mitochondries dérivées du NET des acides
nucléiques mitochondriaux expulsé pendant mitophagie neutrophile incomplète car l'ADN
mitochondrial oxydé a des propriétés pro-inflammatoireset par example a un rôle important
dans la pathogenèse du lupus érythémateux disséminé (16).
14
2. Implication des neutrophiles et Netose dans les maladies auto-immunes:
Le neutrophile par ses différentes fonctions ( phagocytose, sécrétion de médiateurs,
dégranulation et NETose ), a été considéré comme une cellule effectrice crucial dans de
nombreuses maladies inflammatoires, telles que le lupus érythémateux disséminé ( LED ), la
polyarthrite rhumatoïde ( PR ), la vascularite et la fièvre méditerranéenne familiale ( FMF ).
Les neutrophiles sont le premier type cellulaire recruté sur les sites d'inflammation, de là, ils
peuvent changer de phénotype et générer diverses sous-populations avec différentes fonctions
cellulaires, ils sont le type cellulaire le plus abondant trouvé dans le liquide synovial PR et sont
également détectés dans le tissu synovial, une articulation du genou typique peut avoir 2×109
cellules, dont 90% sont des neutrophiles. Ces cellules sont mobilisées dans le tissu synovial par
des médiateurs chimioattractants, tels que CXCL1, CXCL2 et le leukotriène B4, un processus dans
lequel les macrophages résidents jouent un rôle central (17).
Egalement les neutrophiles dans les articulations synoviales synthétisent diverses molécules avec
des rôles importants dans le maladie auto-immune comme l'arthrite, y compris le facteur de
nécrose tumorale ( TNF ) et le facteur d'activation des cellules B ( BAFF ), un membre de la
superfamille du TNF qui induit la prolifération des cellules B et contribue à la génération
d'autoanticorps. Les neutrophiles peuvent également synthétiser l'activateur du récepteur
nucléaire de ligand du facteur kappa B ( RANKL ), un membre de la superfamille du TNF
responsable de différenciation des ostéoclastes et de l’érosions osseuses dans la PR. Les
neutrophiles sont également une source de chimiokines qui amplifient davantage l'inflammation.
Par ailleurs, La formation de pièges extracellulaires de neutrophiles ( NET ) peut être déclenchée
par une large gamme de stimuli pendant l'inflammation. Les ACPA sont présents dans
l'articulation du patient PR et peuvent induire la dégranulation des neutrophiles par signalisation
à travers les Fc gamma receptor IIIb (FcγRIIIb) (18), et la formation de NET est fortement associée
à la PR20). De plus, in vitro les neutrophiles des patients atteints de PR ont une capacité
spontanée et élevée à former des NETs, par rapport aux neutrophiles des donneurs sains (1).
15
un rôle important dans le développement et la persistance de réponses auto-immunes dans
diverses maladies auto-immunes.
La cellule dendritique ( CD ), une autre cellule présentatrice d’antigène, peut être activée par les
NETs. Dans LED les cellules dendritiques internalisent l'ADN pour le présenter à d'autres cellules
immunitaires, ce processus nécessite la présence de peptides antimicrobiens neutrophiles qui
protègent l'ADN de la dégradation enzymatique. Les protéines LL37 et HMGB1 forment un
complexe avec l'ADN des NETs, ce qui facilite l'internalisation de l'ADN par la CD (22).
Autre que l’activation des cellules presentatrices d’antigenes, récemment, il a également été
démontré que les complexes LL37-ADN dans les NETs , qui ont la capacité unique d'accéder aux
compartiments endosomaux des cellules et d’activer le récepteur TLR9, peuvent activer
directement les cellules B mémoire autoréactive pour produire des anticorps anti-LL37 dans le
LED (23).
Les NETs peuvent également induire indirectement l'activation des lymphocytes T, comme déjà
mentionné, après l'internalisation des NETs par les fibroblastes synoviaux, ces cellules présentent
les antigènes NETs aux lymphocytes autoréactives et induire leur activation (24).
Au total, comme mentionné ci-dessus, les « neutrophils extracellular traps » ( NET ) en tant que
source potentielle d'autoantigènes et d'activateurs de cellules immunitaires jouent un rôle très
important dans les maladies auto-immunes, favorisant la réponse inflammatoire et à travers
diverses et nombreuses interactions avec des cellules comme les FLS, les macrophages et les
lymphocytes B et T qui peuvent moduler la fonction de ces derniers jouant un rôle crucial dans
la pathogénicité de la PR.
16
III. Matériles et Méthodes:
A. Prélevements humains:
Des échantillons de sang de patients atteints de PR du service de rhumatologie de l'hôpital
Avicenne et de donneurs Sains de l'établissement français du sang ( EFS ) de Bobigny ont été
prélevés. Le diagnostic de PR a été déterminé selon les critères de la Ligue Européenne contre les
Rhumatismes de 2010. Ces patients PR n'étaient pas sous biothérapie, ils étaient soit sans
traitement, soit sous méthotrexate, avec ou sans corticostéroïdes oraux.
17
D. Mesure des protéines associées au NETs:
La quantification des protéines a été analysée en mesurant l'absorbance des échantillons
préparés contenant les NETs ou les contrôles à une longueur d'onde 280 nm par
spectrophotométrie microvolume ou nanodrop selon les instructions du fabricant. Pour cela
l’absorbance de solution de PBS 1X sans Ca2+ et Mg2+ est utilisé comme Blanc, puis l’absorbance
à 280 nm de chaque échantillon a été mesuré.
De plus, une autre méthode pour détecter la présence de protéines dans les NETs preparés a été
réalisée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou SDS-PAGE à 100 V pendant 3 heures.
Une fois les protéines séparées, leur visualisation se fait en les colorant directement avec Instant
Bleu. Deux bandes de masse molaire entre 10 et 15 KDa sont obtenues dans les pistes où les
échantillons NETs ont été ajoutés et aucune bande dans celles des contrôles.
18
G. Culture des cellules PBMC et des lymphocytes B:
Les PBMC et les lymphocytes B totaux qui ont d'abord été isolés des PBMC de sang de donneur
sain ou de patient PR par un tri cellulaire à l'aide de billes magnétiques CD19 ont été cultivé en
milieu IMDM avec 10% SVF ( euribio ) dans une plaque de culture de 96 puits, avec des NETs
solubles dilués à 50% , à 25% et à 12,5% ( concentration initiale entre 10-20 µg/ml ), ou avec du
tampon de préparations des NETs avec les mêmes dilutions que celles déjà utilisées pour les
NETs. un contrôle positif a été préparé en stimulant les cellules avec du LPS typhimurium et du
CpG (2395, Invivogen) à des concentrations finales de 100 µg / ml et 1 µg / ml respectivement.
19
IV. Résultats:
A. Le complexe NETs déclenchent l'activation des PBMC d'une
manière dose-dépendante:
Dans un premier temps, on a essayé de savoir si les complexes NETs peuvent induire l'activation
des cellules parmi les PBMC, pour cela nous avons cultivé des des cellules mononuclées du sang
périphérique isolées de donneur sain avec des NETs que on a également préparée à partir de
donneur sain DS. les cellules ont été cultivées avec différentes concentrations des NETs; NETs
dilué à la moitié (NET1/2), au quart (NET1/4 ) et au huitième (NET1/8), avec le tampon de préparation
des NETs (TP) et avec de (LPS + CpG) comme contrôle positif, après 24h, les surnageants ont été
collectés et un analyse des cytokines IL-6, IL-8 et TNF-a a été réalisée par TEST ELISA. Comme le
montre la figure (1, A), le tampon utilisé pour préparer les NETs (contrôle négatif) n'a pas été en
mesure d'activer les cellules PBMC, mais le complexe NET a déclenché l'activation de ces cellules
et stimule la production de cytokines pro-inflammatoires IL-8 et TNF, sans résultat significatif
pour la cytokine IL-6. De plus, cette activation était d'une manière dose-dépendante. cela montre
l’importance des complexes NETs dans l’induction de l’inflamation et l’activation des cellules
immunitaires.
Figure 2 Le complexe NETs induit l'activation des PBMC d'une manière dose-dépendante, en particulier les macrophages CD14+
et les lymphocytes B CD19+. (A, B) PBMC des donneurs sains cultivé avec des NETs de DS avec tampon de préparation de NET (TP)
et de (LPS+CpG), L'activation cellulaire a été estimée en mesurant la sécrétion d'IL-8 , TNF et IL-6 par ELISA (A) et le niveau
d’expression de HLA-DR par cytométrie en flux (B). Chaque experience représente un donneur testé avec une préparation NET ou
son tampon de purification. les données de deux donneurs sains sont représentées. La moyenne et l’écart type de triplicats sont
indiqués. DS : donneur sain, PBMC : cellules mononuclées du sang périphérique. MFI: intensité moyenne de fluorescence.
20
Ensuite, pour détecter quels types cellulaires parmi les PBMC sont activables
par les NETs, on a analysé par cytométrie en flux le niveau d'expression du marqueur d'activation
HLA-DR sur les différentes populations cellulaires dans les PBMC totales, en particulier on a
constaté que les NETs induisent une régulation positive de l'expression de la molécule HLA-DR à
la surface des monocytes CD14+ et des lymphocytes B CD19+, une augmentation significative de
HLA-DR MFI a été trouvée dans la population CD14+ et dans la population CD19+ parmi les PBMC
lorsque les PBMC ont été stimulées par des NETs par rapport au tampon de préparation NETs
(figure 1,B).
100
CD27- (naïve)
80 CD27+ (mémoire)
60
40
20
0
milieu TP NET LPS + CpG
Figure 3 Les NETs déclenchent l'activation des lymphocytes B indépendamment de la spécificité de l'antigène. Des PBMC de DS
ont été cultivés avec des NETs, de tampon de préparation ou avec des agonistes de TLR. L’activation des lymphocytes B naives
CD19+CD27- et mémoires CD19+CD27+ a été analysé par cytometrie en flux en mesurant le pourcentage des cellules positives
pour CD86. Un donneur sain est representé (n=1). La moyenne et l’écart type de triplicats sont indiqués. DS : donneur sain.
21
C. Profil pro-inflammatoire des NETs:
Les résultats ci-dessus ont montré que les lymphocytes B sont les cellules majoritairement activés
par les NETs parmi les PBMC. On a ensuite affiné en triant les B pour etudier de plus l’effet directe
des NETs sur ces cellules. Les lymphocytes B ont été purifiés par tri magnétique par microBilles
anti-CD19, et l'éluat est collecté sous forme de cellules ne contenant pas de LB ( cellules non B ).
Ces cellules B et non B ont été cultivées avec dif Les surnageants de culture cellulaire ont été
récoltés après 24 et 72 heures et la sécrétion de cytokines IL-8 et TNF a été estimée par ELISA.
On a vérifié que le TNF est spécifique des cellules B stimulées par le NET car après 24 h de culture,
le taux de TNF dans les surnageants de culture était significativement élevé dans les cellules
stimulées par les NETs par rapport aux cellules non B qui ne montraient aucune augmentation
d'une manière dose-dépendante de la sécrétion de TNF ( figure 3, A ), cela indique le rôle cruciale
de l'interaction NET et LB dans la réponse immunitaire innée et l'inflammation dans la
polyarthrite rhumatoïde. Egalement la sécrétion de TNF était en fonction de la durée, on a trouvé
que la secretion optimale est apres 24 heures de stimulation par rapport au 72h, par exemple le
taux de TNF dans le culture des LB CD19+ stimulé par les NET1/2 était plus élevé après 24 h que
après 72h avec des valeurs 98.3 et 8.9 pg/ml de respectivement (figure 3, B).
Figure 4 Les lymphocytes B activés par les NETs produisent plus de TNF et d'IL-8 que les autres cellules, (A,C) Lymphocyte B
CD19+ triés, (A,B) des cellules non B qui ne contenant des LB CD19+ cultivées avec des NETs purifiés, tampon de préparation ou
agonistes TLR, les surnageants de culture ont été collectés après 24 et 72 heures et la sécrétion de cytokines a été estimée par
ELISA. (A) représentant le niveau de TNF-a après 24 h de culture (B) le niveau de TNF-a après 72 h de culture et (C) le niveau d'IL-
8 après 24 h de culture. Un donneur sain est representé (n=1). La moyenne et l’écart type de triplicats sont indiqués.
22
De plus, les cultures ont été réalisées sans aucune cellule, uniquement en ajoutant les stimuli
NET dilués au demi ( NET1/2 seule ), et cela nous a permis de vérifier que les cytokines détectés
après l'activation des lymphocytes B CD19+ ou les cellules non B par les NETs ne sont pas
simplement dû à la transfert passif des cytokines présentes dans les préparations NETs mais ils
sont vraiment sécrétées par les cellules cibles, Par exemple, les concentrations de TNF mesurées
dans les cultures stimulés sans cellules cibles ( NET1/2 seule ) ou avec cellules cibles ( NET1/2 ) ont
respectivement de 0 et 98.3 pg/ml dans les cultures avec PBMC. Et on a également détecté une
augmentation de la production de cytokines autres que le TNF-a par les lymphocytes B comme
l'IL-8 après stimulation par les NETs (figure 3, C).
Figure 5 les NETs induisent une régulation positive de HLA-DR, CD86 et de CD40 sur des lymphocytes B CD19+ , (A,B,C,D)
lymphocytes B purifiés par tri magnétique de DS, cultivées avec des NETs purifiés, tampon de préparation ou agonistes TLR, puis
analysé par cytométrie en flux (A,B,C). (D) représente les lymphocytes B CD19+ sous deux conditions de culture (milieu et NET)
visualisés par microscope optique. Un donneur sain est representé (n=1), La moyenne et l’écart type de triplicats sont indiqués.
DS : donneur sain.
23
Alors que le tampon utilisé pour préparer les NET ( contrôle négatif ) n'était pas en mesure
d'activer les lymphocytes B, le complexe NETs ont déclenché l'activation polyclonale des
lymphocytes B CD19+ avec une augmentation marquée de l'expression des HLA-DR, CD40 et CD86
de manière dose-dépendante (figure 4, A, B et C). Par exemple, le pourcentage de cellules qui
expriment CD40 parmi LB CD19+ était le plus élevé quand on stimulait les LB CD19+ avec des NETs
dilués à la moitié (NET1/2) avec une valeur de 75,7%, de 64,2% avec NET1/4 et 55,3% avec NET1/8 .
le pourcentage des cellules exprimant CD40 dans le milieu sans stimuli était 35.7% (figure 4, C).
Nous étudions également les lymphocytes B en culture au microscope optique pour vérifier l'état
d'activation de ces cellules par les NET, nous avons constaté que les cellules stimulées par les NET
forment des clusters d'activation sous forme d'agrégats cellulaires lorsque les cellules sont
stimulées par des NETs par rapport aux cellules dans le milieu de culture sans stimulation du tout
(figure 4, D).
Ces résultats suggèrent que les lymphocytes B activées par les NETs pourraient jouer le rôle de
cellules présentatrices d'antigène en régulant à la hausse le niveau d'expression des molécules
de co-stimulation CD40 et CD86, et la molécule HLA-DR nécessaires à cette fonction.
24
V. Discussion et perspectives:
les neutrophiles sont utilisés récements comme un Biomarqueur qui est en corrélation avec les
phénotypes cliniques de la PR, ce qui fait ces cellules comme des acteurs importants de l'activité
de la maladie. Par exemple, la signature du gène des granules de neutrophiles sanguins a
récemment été associée à une mauvaise réponse au traitement anti-TNF dans la PR. De plus, la
mesure de complexes NETs dans les tissus, serum, et le liquide synovial est en train de devenir
un ajout à cette famille de biomarqueurs et nécessitera une validation supplémentaire. Par
exemple Les NETs sériques sont en corrélation avec les marqueurs de l'activité de la PR dans les
patients atteints de cette maladie.
Néanmoins, les résultats d’une récente essai clinique randomisé ont montré que le système
d'épuisement des lymphocytes B est utile pour la gestion des symptômes et des signes de la PR.
Ce résultat inattendu a déplacé une partie de l'effort de recherche en rhumatologie vers l'étude
de l'implication des lymphocytes B dans la pathogenèse de la PR.
Dans notre étude on a démontré que les NETs en particulier chez les patients PR, sont pro-
inflammatoires et peuvent activer les LB, et on a validé que cet activation provoque une
régulation positive des molécules de co-stimulation CD40 et CD86, et de la molécule
d'histocompatibilité HLA classe II, et une augmentation dans la production des cytokines pro-
inflamatoires ( TNF, IL-6 et IL-8 ), donc les LB autres leur rôle dans la production d'autoanticorps,
ils peuvent également jouer un rôle important dans le pathogène RP et donc jouer le rôle de
cellule présentatrice d'antigène et peut participer dans l’activation des LT favorisant ainsi la
réponse inflammatoire dans la PR.
En outre, on a également proposé que les NET agissent comme un stimulus antigénique
nécessaire aux lymphocytes B pour induire la production d'auto-anticorps chez le patient PR.
Ainsi, les NETs à travers ces deux rôles peuvent être un élément crucial et très important dans la
pathogenèse de la PR.
Notamment, les complexes immuns peuvent induire la formation des NETs. Il est reconnu que
les complexes immuns dérivés des cellules B puissent activer les neutrophiles en se liant au
récepteur gamma Fc IIIb (FcγRIIIb) et induire une formation supplémentaire des NETs,
provoquant une boucle de rétroaction dans les réponses auto-immunes et favorise la
progression de la maladie.
25
Activité pro-inflammatoire et effet adjuvant des « Neutrophil Extracellular Traps »
dans un contexte physiologique et pathologique.
Résumé:
Les polynucléaires neutrophiles ( PNN ) sont des cellules essentielles au cours de la réponse
immunitaire innée; recrutés rapidement au site inflammatoire où ils participent à la phase aigüe
de maladie, Ils peuvent en effet moduler la réponse adaptative par interaction avec les cellules
immunitaires via des médiateurs solubles ou des interactions cellulaires directes. Les Neutrophil
Extracellular Traps ( NETs ) libérés par les PNN activés pourraient jouer un rôle important dans ce
contexte. Les NETs sont des filaments de chromatine décondensée associés à des protéines
issues principalement des granulations et du cytoplasme. Ils sont essentiels dans la réponse anti-
infectieuse mais semblent également impliqués dans la physiopathologie de certaines maladies
auto-immunes et inflammatoires comme le Lupus et le polyarthrite rhumatoïde.
L’objectif de ce travail a été d’évaluer l’effet adjuvant des NETs et qu’ils sont pro-inflammatoires,
en particulier chez les patients PR afin de déterminer les conséquences pathogènes de la NETose
dans la PR. Ces résultats pourraient expliquer en partie le déséquilibre de la réponse immunitaire
observé dans la PR.
Notre étude identifie un lien entre les neutrophiles, les NETs et l’activation des lymphocytes B
autoréactives et que ces structures sont hautement immunogènes et déclenche l'activation des
cellules B d’une maniere polyclonale et indepandent de l’antigene conduisant à une régulation à
la hausse des molécules de costimulation et à une augmentation de la production de cytokines
pro-inflammatoires.
Mots clés :
Neutrophil Extracellular Traps ( NETs ), polynucléaire neutrophile, lymphocyte B, Autoimmunité,
inflammation, polyarthrite rhumatoïde, réponse immune, effet adjuvant.
Laboratoire de rattachement :
INSERM UMR1125 – Lip2 “ Physiopathologie, cibles et thérapies de la polyarthrite rhumatoïde “.
26
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