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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES


DEPARTEMENT DE PHYSIOLOGIE ANIMALE
ET DE PHARMACOLOGIE
Laboratoire de Pharmacognosie Appliquée (IMRA)

MEMOIRE
Pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Approfondies
OPTION : PHARMACOLOGIE

ETUDE PHARMACOLOGIQUE D’UNE


PLANTE ANTIASTHMATIQUE CODEE
LPA05

Présenté par :

YOUSSOUF MOHAMED MBAE

Soutenu Publiquement le : 17-10-2013

Devant les membres de JURY composés de :

Président : Mr.RANDIMBIVOLOLONA Fanantenanirainy Professeur titulaire


Rapporteur : Mr. RAMANITRAHASIMBOLA David Maître de conférences
Examinateur : Mr. RANDRIANTSOA Adolphe Professeur titulaire
Mr. RAKOTOARISON Olivier Maître de conférences
Nom : YOUSSOUF

Prénoms : Mohamed Mbae

Date et lieu de naissance: 12 Mars 1984 à M’dé Bambao

Adresse : Lot II F 67 Andraisoro

ETUDE PHARMACOLOGIQUE D’UNE


PLANTE ANTIASTHMATIQUE CODEE
LPA05

Année universitaire : 2010-2011

Option : PHARMACOLOGIE

Rapporteur : Docteur RAMANITRAHASIMBOLA David

Laboratoires : -Laboratoire de pharmacodynamie du département de physiologie


animale et de pharmacologie.
- Laboratoire de pharmacognosie Appliquée - IMRA
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

REMERCIEMENTS
De prime abord, je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance et mes vifs
remerciements au Docteur RAMANITRAHASIMBOLA David, Directeur de ce mémoire,
Maitre de conférences à la Faculté de Médecine d’Antananarivo et chef du Laboratoire de
Pharmacognosie Appliquée (LPA) à l’IMRA. Vous avez encadré patiemment ce travail, vos
précieuses remarques constructives et votre suivie pour mener à terme ce travail, je vous
remercie très vivement et vous prie de trouver ici le témoignage de mes sentiments
respectueux.

Je ne pourrais remercier jamais assez Monsieur le Professeur RANDIMBIVOLOLONA


Fanantenanirainy, président de jury, Professeur titulaire de la Faculté des Sciences
d’Antananarivo. Avec vos nombreuses responsabilités et vos occupations, vous avez accepté
de juger ce mémoire. Toutes les connaissances et les formations que j’ai obtenues de vous,
que vous trouviez ici le témoignage de ma reconnaissance et de ma respectueuse gratitude.

Je remercie chaleureusement Monsieur le Professeur RANDRIANTSOA Adolphe,


Professeur titulaire de la Faculté des Sciences d’Antananarivo d’avoir accepté d’examiner ce
mémoire malgré vos nombreuses occupations. Pour votre gentillesse, avec votre compétence
en Pharmacologie et votre talent pédagogique, toutes les formations que j’ai obtenues de
vous, que vous trouviez ici le témoignage de ma profonde reconnaissance et de ma
respectueuse gratitude.

Je suis également très honoré que Monsieur RAKOTOARISON Olivier, Maître de


conférences ait accepté de juger et de siéger dans le membre de jury de ce mémoire. Qu’il
trouve ici le témoignage de ma profonde reconnaissance.

Mes vifs remerciements vont aussi à Madame le professeur RAKOTO-


RATSIMAMANGA Suzanne Urverg. Présidente de l’IMRA, de m’avoir accueilli dans son
Institut. Qu’il nous soit permis de vous adresser notre profonde gratitude.

Je remercie également Monsieur le Docteur Charles ANDRIANJARA, Directeur


Exécutif de L’I.M.R.A, qui m’a donné son accord sur ce sujet.

Mes remerciements vont également à toutes les personnes qui ont contribué, de près ou
de loin, à la réalisation de ce travail, notamment :
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

Monsieur le Docteur RAKOTONDRAMANANA A. Dina, de m’avoir aidé à réaliser la


partie chimique de mon travail. Veuillez trouver ici l'expression de ma profonde gratitude.

Aux techniciens et chercheurs au sein du Laboratoire de Pharmacognosie Appliquée de


l’IMRA. Soyez en remerciés.

A tous les enseignants de la Faculté des Sciences et plus particulièrement ceux du


département de Pharmacologie Générale et de Physiologie Animale pour la formation qu’ils
nous ont offerte.

.A ma très chère femme Hasina pour son soutien de tous les instants et sa
compréhension.

A tous mes amis et amies.

Ce travail est à l’occasion pour moi d’exprimer mes profondes reconnaissances à ma


famille particulièrement mes parents, mes sœurs, mes frères, oncle HOUSALAM et tonton
KAMY pour leur soutien moral, affectif et financière dont ils m’ont comblé.

En fin, Au Bon DIEU, la miséricorde, le tout puissant,

Sans qui rien n’aurait existé


DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

TABLE DES MATIERES


TABLEAU DE MATIERE S…………………………………………………..I
LISTE DES TABLEAUX…………………………………………………….III
LISTE DES FIGURES……………………………………………………….IV
INTRODUCTION……………………………………………………………...1
I –Connaissances actuelles…………………………………………………….3
I.1- Définition de l’asthme……………………………………………………………….3
I.2- Les cibles pharmacologiques des antiasthmatiques……………………………….4

II - MATERIELS ET METHODES………………………………………….6
II.1- Matériel végétal…………………………………………………………………….6
II.2- Travaux chimiques…………………………………………………………………6
II.2.1- Extraction chimique…………………………………………………………...6
II.2.2- Fractionnement de l’extrait Brut (EB) par partage liquide-liquide……………6
II.2.3- Fractionnement bio-guidé de la fraction FAE…………………………………7
II.2.4- Criblage phytochimique……………………………………………………..13

II.3- Tests pharmacologiques…………………………………………………………..14


II.3.1- Animaux d’expérience……………………………………………………….14
II.3.2- Tests in vitro…………………………………………………………………15
II.3.2.1- Effet relaxant d’EB, FH, FDCM, FAE et FA sur la trachée isolée de cochon
d’Inde pré-contractée avec l’histamine………………………………………...16
II.3.2.2- Effet relaxant des fractions issues de FAE……………………………………..16
II.3.2.3- Etude du mécanisme d’action broncho-relaxante de F3-3………………………17
II.3.2.4- Effet inhibiteur de l’isoprenaline sur la réponse broncho-contractile de
l’histamine……………………………………………………………………18

II.3.3-Produits utilisés………………………………………………………………19
II.3.4- Etude de toxicité aiguë d’EB………………………………………………..19
II.3.5- Expression des résultats et analyses statistiques…………………………….20

III – RESULTATS……………………………………………………………21

III.1- Résultats chimiques……………………………………………………21


III.1.1- Rendements de l’extraction et du fractionnement…………………………..21
III.1.2- Composition chimique du matériel végétal étudié………………………….22
III.1.3- Chromatogrammes comparatifs des différents produits……………………23

III.2- Résultats pharmacologiques…………………………………………………….24

III.2.1- Effet relaxant de l’extrait brut et des différentes fractions sur la trachée de
cochon d’Inde……………………………………………………………...24
III.2.2- Etude du mécanisme d’action broncho-relaxante de F3-3…………………..26
III.2.2.1- Effet relaxant de F33 sur la trachée de cochon d’Inde pré-contractée à
l’acétylcholine……………………………………………………………....26
III.2.2.2- Effet inhibiteur de la fraction F3-3 sur la réponse contractile de
l’Histamine……………………………………………………………………..27
III.2.2.3-Effet inhibiteur de la fraction F3-3 sur la réponse contractile du KCl……........29

I
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

III.2.2.4-Effet du propranolol sur l’activité broncho-relaxante de F3-3 sur la trachée de


cochon d’Inde pré-contractée à l’histamine…………………………….............30

III.2.3- Effet inhibiteur de l’isoprénaline sur l’effet broncho-contractile de


l’histamine…………………………………………………………………32

III.3-Etude de toxicité aigüe……………………………………………………………34

IV- DISCUSSION…………………………………………………………….35
V – CONCLUSION…………………………………………………………..39
REFERENCES BILIOGRAPHIQUES
ABSTRACT
RESUME

II
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

LISTE DES TABLEAUX


Tableau I : Résumé des différents tests utilisés pour détecter les familles chimiques présentes
dans la plante codée LPA05

Tableau II: Critères utilisés pour l’estimation de l’abondance relative des familles chimiques

Tableau III : Rendements de l’extraction et des différents fractionnements chimiques

Tableau IV : Teneurs relatives des familles chimiques présentes dans la poudre de LPA05

Tableau V : Comparaison des valeurs de CE50 des différents produits préparés avec la plante
LPA0 sur la trachée isolée de cobaye pré-contractée avec l’histamine (X ±e.s.m)

Tableau VI : Comparaison des valeurs de CE50 de F3-3 en fonction de l’agoniste broncho-


contracturant (X ±e.s.m ; n=4)

Tableau VII : Valeurs des CE50 et d’Emax de l’histamine en absence et en présence de la


fraction F3-3 (X ±e.s.m ; n=4)

Tableau VIII : Valeurs de CE50 et d’Emax du KCl en absence et en présence de différentes


concentrations de F3-3 (X ±e.s.m ; n=4)

Tableau IX : Valeurs de CE50 et d’Emax de F3-3 sur la trachée isolée de cochon d’Inde pré-
contractée avec l’histamine en absence et en présence de propranolol (X ±e.s.m;
n=4)

Tableau X : Comparaison des valeurs de CE50 et d’Emax de l’histamine en absence et en


présence de F3-3 ou d’isoprénaline (X ±e.s.m ; n=4)

Tableau XI : Délai d’apparition et durée des signes anormaux observés chez les souris après
une prise orale de l’extrait brut (EB) de la plante LPA05 (n=5)

III
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Les cibles pharmacologiques des antiasthmatiques

Figure 2 : Préparation de l’extrait Brut (EB)

Figure 3 : Préparation des différentes fractions par partage liquide-liquide d’EB entre l’eau et
différents solvants de polarité croissante

Figure 4 : Fractionnement bio-guidé de FAE par chromatographie sur colonne

Figure 5 : Chromatogrammes d’EB (1), FDCM (2), FAE (3), FDCM+FAE (4), F3-3 (5) et FA
(6) sur une plaque CCM couverte de couche de silice activée sur un support en
aluminium en utilisant le mélange DCM-MeOH (95-5: v/v) comme éluant

Figure 6 : Courbe effet-concentration de F33 sur la trachée de cochon d’Inde pré-contractée


avec l’histamine ou avec l’acétylcholine (n=4)

Figure 7 : Courbes montrant l’effet broncho-constricteur de l’histamine en fonction de sa


concentration en absence et en présence de 100 ou 200µg/ml de F3-3 sur la trachée
isolée de cochon d’Inde (n=4)

Figure 8 : Courbes effet-concentration du KCl en absence et en présence de F3-3 sur la trachée


isolée de cochon d’Inde (n=4)

Figure 9 : Courbes montrant l’effet broncho-relaxant de F3-3 sur la trachée de cochon d’Inde
pré-contractée avec l’histamine en absence et en présence de propranolol (n= 4)

Figure 10 : Comparaison de l’effet inhibiteur de F3-3 à celui de l’isoprénaline sur l’effet


spasmodique de l’histamine sur la trachée isolée de cochon d’Inde (n=4)

IV
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

INTRODUCTION
On estime qu’il ya plus de 300 million de personnes souffrant d’asthme dans le monde
[1]. Il constitue la première maladie chronique de l’enfant avec une prévalence estimée à 10%
[2]. Dans trois quarts des cas, il apparaît avant l'âge de 5 ans [3]. Il n’est pas un problème de
santé publique spécifique aux pays à haut revenu; il sévit dans tous les pays, quel que soit leur
niveau de développement [1]. Au niveau mondial, on estime que le coût associé à l’asthme
dépasse ceux de la tuberculose et de l’infection à VIH/sida réunis.
L’asthme est une maladie particulièrement invalidante apparaissant au cours des
premières années de la vie mais également à l’âge adulte. Lorsqu’il est persistant, sévère et à
fortiori non contrôlé, il peut être à l’origine des handicapes majeurs pour le patient. La qualité
de vie de l’asthmatique est souvent altérée : activité physique limitée, restriction des activités
sociales et limitation des activités professionnelles. A l’heure actuelle, il ne bénéficie d’aucun
traitement curatif. Il se soigne mais ne se guérit pas [4]. Les objectifs du traitement consistent
donc à faire disparaitre totalement les symptômes surtout nocturnes, à limiter les recours aux
urgences et à permettre aux asthmatiques de reprendre aux activités physiques, sociales et
professionnelles. Les drogues pharmacologiques de l’asthme constituent un groupe des
médicaments hétérogène formé d’une part par les bronchodilatateurs destinés à inhiber le
spasme bronchial à l’origine de la crise et d’autre part, par les anti-inflammatoires pour le
traitement de fond.
Environ 80% de la population mondiale compte encore aujourd’hui sur la phytothérapie
pour répondre à ses besoins de santé [5]. A Madagascar comme dans les pays en
développement, le coût cher du traitement médicamenteux de l’asthme amène les patients à
tourner vers la médecine traditionnelle pour se soigner par les plantes à vertu antiasthmatique
[6]. Cette médecine traditionnelle s’appuie sur les connaissances empiriques des tradi-
praticiens locaux et sur la richesse de la biodiversité de la flore tropicale malgache. 12% des
plantes médicinales malgaches sont utilisées pour le traitement des maladies qui touchent le
système respiratoire (asthme, bronchite, toux, coqueluche). Parmi ces plantes, on peut citer
entre autres Euphorbia hirta, une plante très rependue dans la région tropicale reconnue par
ses effets expectorant, antiasthmatique et sédatif de l’appareil respiratoire, Hedera helix
utilisée comme expectorant, antiasthmatique et aussi pour les inflammations des voies
respiratoires [7], de Tetracera madagascariensis [8] et Gomphocarpus fruticosa [9] qui sont

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

aussi utilisées traditionnellement comme antiasthmatiques et qui ont montré une activité
broncho-dilatatrice.

La plante codée « LPA05 » est l’une des plantes constitutives d’un phyto-médicament
antiasthmatique fabriqué et commercialisé par la société SOAMADINA qui est la branche
commerciale de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA).

Le présent travail intitulé « ETUDE PHARMACOLOGIQUE DE L’ACTIVITE


ANTIASTHMATIQUE DE LA PLANTE CODEE LPA05» s’inscrit dans la convention de
collaboration entre la Faculté des Sciences d’Antananarivo, à travers le Département de
Physiologie Animale et de Pharmacologie et l’IMRA. Il a comme objectif principal
d’apporter des preuves scientifiques de sa vertu antiasthmatique et de son utilisation comme
étant élément constitutif de ce phyto-médicament. Pour atteindre cet objectif principal, nous
nous sommes fixés comme objectifs spécifiques :

la mise en évidence de la propriété pharmacologique de la plante


la détermination de la fraction active contenant le minimum des taches
chromatographiques
l’étude du mécanisme d’action pharmacologique de la fraction active
la détermination de la composition chimique de l’extrait de la plante et
l’étude de la toxicité de la plante

Notre ouvrage comporte quatre parties :

- Nous rappelons dans la première partie la définition de l’asthme et les cibles


pharmacologiques des antiasthmatiques actuellement sur le marché.
- Les méthodologies et les matériels utilisés pour les travaux chimique et
pharmacologique sont détaillés dans la deuxième partie.
- Les résultats chimiques et pharmacologiques sont présentés dans la troisième partie
- La dernière partie est consacrée à la discussion de nos résultats et à la conclusion.

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

I –Connaissances actuelles
I.1- Définition de l’asthme
L’asthme est un syndrome inflammatoire chronique affectant les voies respiratoires dans
lequel des nombreuses cellules, notamment les mastocytes, les éosinophiles et les
lymphocytes T, jouent un rôle pathologique. Dans l'asthme, l'inflammation est caractérisée
par une hypersensibilité bronchique à différents stimuli, de type allergique des voies
aériennes, qui entraîne des symptômes récurrents comme une respiration sifflante, une
oppression de la poitrine, des essoufflements et des toux [10]. Ces symptômes sont souvent
accompagnés d’une obstruction des voies aériennes, qui rétrocède spontanément suite à l'arrêt
de l'exposition à l'allergène ou à l’aide d’un traitement [11]. Ces symptômes peuvent être
causés, déclenchés ou influencés par des nombreux facteurs. Ceux-ci peuvent être liés au
patient lui-même: caractère héréditaire, facteurs de risques hormonaux, psychologiques ou
digestifs. Ils peuvent aussi être liés à son environnement: allergènes (domestiques, extérieurs
ou d’origine professionnelle), tabagisme (actif ou passif), pollution atmosphérique, exercice
physique, alimentation, virus [12-13].
Cette maladie inflammatoire est accompagnée chez certains sujets asthmatiques d’un
remodelage de la paroi bronchique qui est responsable d’un déclin progressif et irréversible de
la fonction respiratoire et de la constitution d’un trouble ventilatoire obstructif irréversible et
résistant aux thérapies conventionnelles, notamment aux corticoïdes [14]. Le remodelage des
voies aériennes se caractérise, entre autres par des lésions épithéliales, d’une
hyperplasie/métaplasie des fibroblastes et des cellules musculaires lisses bronchiques
entraînant l’épaississement de la membrane basale et l’augmentation de la masse musculaire,
d’infiltration au niveau de la muqueuse des éosinophiles, des fibroblastes sécrétant du
collagène [15]. L’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent ces
altérations tissulaires est l’étape indispensable à l’identification de nouvelles stratégies
thérapeutiques préventives et/ou curatives.
Cliniquement, on peut distinguer 4 stades de l’asthme : l’asthme intermittent, l’asthme
persistant léger, l’asthme persistant moyen et l’asthme persistant sévère.

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

I.2- Les cibles pharmacologiques des antiasthmatiques


Actuellement, la prise en charge médicamenteuse de l’asthme repose sur deux principaux
types de médicaments :

- les médicaments de contrôle appelés également préventifs qui visent à réduire


l’inflammation des voies respiratoires et qui doivent être pris quotidiennement. Ils
sont représentés par les anti-inflammatoires [16, 17-18].
- les médicaments de soulagement ou de dépannage qui sont destinés à aider le patient
en cas de crise ou de difficulté respiratoire. Ce sont les broncho-dilatateurs. Ils
doivent être gardés à porter de la main du patient. Ces médicaments ne contrôlent pas
les symptômes d’asthme à long terme mais ils agissent rapidement en réduisant les
déclencheurs de la crise d’asthme.

Très souvent, en fonction du nombre des crises et de leur importance, les médecins les
prescrivent en association.

Leur cible pharmacologique peut être divisée en deux :

- les cellules musculaires lisses bronchiaux pour les broncho-dilatateurs, soit en


stimulant le récepteur de relaxation (les β2 agonistes) [19-20], soit en bloquant les
récepteurs des agonistes contracturants endogènes (les anti-M3 [21-16], les anti-
CysLT1 [20-21], les anti-H1 [22-23]), soit en inhibant l’enzyme de dégradation
d’AMPc (théophylline et ses dérivés) [24-25]
- les processus inflammatoires pour les glucocorticoïdes [26-27], les anti-IgE tels que
les anti-corps monoclonaux ou les protéines recombinantes [28-29] et les inhibiteurs
de l’enzyme 5-lipooxygenases ou les cellules inflammatoires pour les cromones [21],
les anti-leucotriènes [20] et les anti-cytokines pro-inflammatoires tels que les anti-
FLAP, anti-TNFα et les anti-IL5 [30-31].

La figure 1 résume les cibles pharmacologiques des médicaments disponibles sur le


marché utilisés pour le traitement de l’asthme.

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

Mesures Exposition antigénique


d’hygiène

Les anti-IgE
Production des IgE (Omalizumab)

Les stabilisateurs
membranaires Activation des mastocytes
(Cromones)

Libération des médiateurs :

- Préformés (Histamine, Sérotonine)


- Néoformés (Leucotriènes, Cytokines,…)

Bronchoconstriction Les anti-CysLT1 et anti-H1 Inflammation

Les glucocorticoïdes
Les broncho-dilatateurs
Les β2 stimulants
Les anti-M3
La théophylline et ses dérivés
I.2.1- Les bronchodilatateurs
Figure 1 : Les cibles pharmacologiques des antiasthmatiques

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

II - MATERIELS ET METHODES
II.1- Matériel végétal
Le matériel végétal nous a été fourni par la société SOAMADINA sous forme de
poudre fine colorée en vert et conditionnée en 1 Kg dans un sachet en plastique transparent
fermé.

II.2- Travaux chimiques

II.2.1- Extraction chimique


Cinq cent g de poudre de la plante ont été macérés dans 2l d’éthanol (90°) pendant 24 h
sous agitation permanente. Le macérât a été récupéré dans un erlen et le marc a été de
nouveau macéré avec le même solvant. La macération a été répétée 3 fois pour optimiser le
rendement de l’extraction [32]. Les macérâts obtenus ont été regroupés dans un erlen et filtrés
sur un papier Joseph. Le filtrat a été ensuite dépigmenté par passage sur une couche de
charbon actif. Puis, il a été évaporé sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif de
marque BUCHI (R–114) à la température de 40°C pour avoir l’extrait brut (EB).

Poudre de plante

3 x Macération EtOH (90°) / 24 h


Regroupement

Marc Macérât

Filtration sur charbon actif

Macérât déchlorophyllé

Evaporation sous pression réduite

Extrait brut
(EB)

Figure 2 : Préparation de l’extrait Brut (EB)

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

II.2.2- Fractionnement de l’extrait Brut (EB) par partage liquide-liquide

Dans l’objectif de déterminer la fraction active de l’extrait brut (EB), ce dernier a été
soumis à une série des partages liquide-liquide entre l’eau et une succession des solvants
organiques de polarité croissante : hexane, dichlorométhane et acétate d’éthyle [8].

L’extraction liquide-liquide est une opération fondamentale de transfert de la matière


entre deux phases liquides non miscibles sans transfert de chaleur. Elle consiste à extraire un
ou plusieurs constituants d’une solution au contact d’un solvant dans lequel les corps sont
solubles [33].

EB a été dissout dans de l’eau et la solution obtenue a été mélangée avec l’hexane (v/v).
Le mélange a été introduit dans une ampoule à décanter à l’aide d’un entonnoir. L’ampoule
bien bouchée a été agitée afin d’augmenter la surface d’échange. Pour éviter une surpression,
l’ampoule a été débouchée puis laissée au repos pendant 30min pour permettre une meilleure
décantation du mélange. Deux phases ont été obtenues : une phase organique supérieure qui
constitue la phase hexanique et une phase inferieure aqueuse. La phase hexanique a été
récupérée et la phase aqueuse a été reprise trois fois avec le même volume d’héxane pour
avoir une bonne séparation. Les phases hexaniques ont été regroupées et la phase aqueuse a
été comme précédemment mélangée avec du dichlorométhane (v/v). Après agitation et
décantation, deux phases ont été obtenues : une phase organique inferieure constituant la
phase dichlorométhanique et une phase aqueuse supérieure. L’opération a été répétée 3fois.
Les phases dichlorométhaniques ont été regroupées et la phase aqueuse a été mélangée avec
de l’acétate d’éthyle (v/v). Après agitation et décantation, le mélange a présenté deux phases :
une phase organique supérieure représentant la phase acétate d’éthyle et une phase aqueuse
inférieure. Comme précédemment, l’opération a été répétée trois fois. Les trois phases
d’acétate d’éthyle ont été regroupées.

Les différentes phases ainsi obtenues ont été concentrées séparément à l’aide d’un
évaporateur rotatif et 4 fractions ont été obtenues : la fraction hexanique (FH), la fraction
dichlorométhanique (FDCM), la fraction acétate d’éthyle (FAE) et la fraction aqueuse (FA).
Les différentes étapes du fractionnement d’EB sont récapitulées dans la figure 3.

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

EB

Partage hexane/Eau (v/v)


Décantation

Phase hexanique Phase aqueuse

Evaporation
Partage DCM/Eau (v/v)
Décantation
FH

Phase Phase aqueuse


dichlorométhanique

Partage AcETOH/Eau (v/v)


Evaporation
Décantation

FDCM
Phase Phase aqueuse
acétate éthylique

Evaporation Evaporation

FAE FA

Figure 3 : Préparation des différentes fractions par partage liquide-liquide d’EB entre l’eau et
différents solvants de polarité croissante

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

II.2.3- Fractionnement bio-guidé de la fraction FAE


Le fractionnement chimique a été guidé par la puissance de l’effet pharmacologique
broncho-relaxant sur trachée isolée de cochon d’Inde pré-contractée à l’histamine.
Dans le but de déterminer la molécule active contenue dans FAE, ce dernier a été
fractionné par la méthode de chromatographie sur colonne. Cette technique permet la
séparation des différents constituants d’un mélange en leur subissant deux forces, une force
d’adsorption exercée par la phase stationnaire et une force d’entraînement exercée par la
phase mobile [34].
Une colonne de verre de 3 cm de diamètre et de 50 cm de hauteur a été utilisée. 84 g de
silice (silica gel A°60 avec une granulométrie 0,040-0,063 mm) ont été pesés, puis mis en
suspension dans du dichlorométhane (DCM) et versés dans la colonne. Cette phase
stationnaire a été entassée en milieu humide par rajout dedichlorométhane. 11,84 g de FAE
ont été dissouts dans 20ml de dichlorométhane puis déposé soigneusement sur la silice de
manière à ne pas perturber cette phase stationnaire. Les solvants d’élution utilisés ont été
l’hexane, le dichlorométhane et le méthanol par progression de la polarité afin d’accélérer le
déplacement des composés. L’élution a été commencée avec un mélange hexane / DCM
(10/90 : v/v) suivie du même mélange mais à des proportions différentes (5/95 : v/v). Le
système d’élution a été ensuite remplacé par du DCM 100% puis par un mélange DCM /
MeOH (95/5 : v/v). Puis du méthanol (MeOH) 100% a été utilisé pour laver la phase
stationnaire.
Le débit d’élution a été fixé à 3 ml/mn et la collecte a été réglée à un tube hémolytique
toutes les 2 mn. Cent vingt tubes ont été collectés à la fin de la chromatographie. Quelques
fractions collectées ont été analysées par CCM. Des plaques CCM à support en aluminium
avec une couche de silice activée de 0,2 mm d’épaisseur (silice 60 F254,Merck) ont été
utilisées. Elles ont été découpées à 10 cm de longueur et 25 cm de largeur. Les tubes à
analyser ont été sélectionnés à raison de 6 tubes c’est-à-dire tous les 6 tubes, un échantillon a
été pris et analysé. Ce qui a donné 20 fractions à analyser. Les dépôts ont été faits à 1 cm du
bord inférieur de la plaque. Les premier et dernier dépôts ont été faits à 1 cm des bords
latéraux. Deux dépôts témoins avec EB et FAE ont été réalisés et les différentes fractions
sélectionnées ont été déposées avec 1 cm de distance l’une de l’autre. Les dépôts ont été faits
par 4 couches successives. Le système d’élution a été formé par un mélange de DCM-acétate
d’éthyle (85/15 : v/v). L’éluant a été introduit dans la cuve à CCM (30 x 14 x 7 cm)
hermétiquement couverte pendant 15 mn avant le début de l’élution pour qu’il y ait saturation

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

en vapeur du solvant dans la cuve. L’élution a été arrêtée si le front du solvant atteint une
distance à 1 cm du bord supérieur de la plaque. Les fractions montrant une similarité en
termes de nombre et de déplacement de taches chromatographiques dans ces conditions
d’analyse ont été regroupées. Après regroupement et évaporation, 6 fractions ont été obtenues
(F1 à F6). Elles ont été testées sur la trachée isolée de cobaye pré-contractée à l’histamine.
La fraction F3 a été de nouveau fractionnée comme précédemment par chromatographie
sur colonne de 2,5cm de diamètre et de 80cm de hauteur sur gel de silice de granulométrie
comprise entre 0,040 à 0,063mm. Cette phase stationnaire a été entassée en milieu humide
avec du dichlorométhane. Les solvants d’élution utilisés ont été identiques à la
chromatographie précédente suivant un mode d’élution par gradient de polarité. 6,8 g de F3
ont été dissouts dans 15 ml DCM puis déposés soigneusement sur la phase stationnaire. Le
débit d’élution a été fixé à 1 ml/mn et la collecte a été faite toutes les minutes. A la fin de
cette chromatographie, 90 fractions ont été obtenues. Une analyse comparative par CCM a été
effectuée avec FAE, F3 et quelques fractions issues de cette2e chromatographie sur colonne en
utilisant les mêmes techniques et les mêmes matériels que précédemment. L’éluant a été
formé par un système de solvants formé par un mélange de DCM-acétate d’éthyle (70/30:
v /v). Cette analyse comparative nous a permis de regrouper toutes les fractions en 6 fractions
notées F3-1 à F3-6. Elles ont été testées sur trachée isolée de cobaye pour mesurer de nouveau
leur effet broncho-relaxant. Les différentes étapes du fractionnement bio-guidé de FAE sont
récapitulées dans la figure 4.

Une analyse comparative par CCM a été effectuée sur l’extrait brut EB, la fraction FAE,
la fraction aqueuse (FA) et la fraction biologiquement la plus active F3-3. C’est une méthode
physique de séparation et d’identification des constituants d’un mélange basée sur la
différence d’affinité existante entre substances à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou
fixe, l’autre mobile [35]. Ainsi, 20 ml d’éluant formé par un mélange de Méthanol-DCM
(5/95: v/v) a été introduit dans une cuve de développement de CCM (22 x 14 x 7cm) et
recouvert pour saturer l’atmosphère en vapeur d’éluant. Les échantillons à analyser (EB, FAE,
FA et F3-3) ont été déposés par 4 couches successives sur un trait horizontal à 1cm du bord
inferieur à l’aide d’une micropipette puis laissés sécher. La plaque a été placée verticalement
dans la cuve. L’élution a été arrêtée lorsque le front de déplacement du solvant arrive à 1 cm
de l’extrémité supérieure de la plaque et la plaque a été retirée de la cuve puis séchée à l’aide
d’un séchoir. L’identification des molécules a été faite par observation directe de la plaque

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sous une lampe UV à 254et à 365 nm de longueur d’onde pour les taches fluorescentes puis
après pulvérisation d’un révélateur (vanilline) sur la plaque.

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FAE

Chromatographie
- Phase stationnaire : silice A° 60 (0,040-0,063 mm)
- Eluant : hexane/DCM (10/90, 5/95 puis 0/100 : v/v)
DCM/MeOH (95/5 puis 0/100 : v/v)

Regroupement

F1 F2 F3 F4 F5 F6

Chromatographie
- Phase stationnaire : silice A° 60 (0,040-0,063 mm)
- Eluant : hexane/DCM (10/90, 5/95 puis 0/100 : v/v)
DCM/MeOH (95/5 puis 0/100 : v/v)

Regroupement

F31 F32 F33 F34 F35 F36

Figure 4 : Fractionnement bio-guidé de FAE par chromatographie sur colonne

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II.2.4- Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique est une détermination qualitative et quantitative des familles


chimiques présentes dans une plante.

Pour inventorier les familles chimiques contenues dans LPA05, la méthode décrite par
FONG et ses collaborateurs en 1977 [36] a été utilisée. Elle est basée sur l’utilisation des
réactifs spécifiques qui réagissent avec une famille chimique donnée pour former un
complexe soluble coloré ou un complexe insoluble formant de précipité.

Les principaux tests utilisés pour le criblage phytochimique de la plante sont résumées
dans le tableau I. L’appréciation de l’abondance relative a été faite selon les critères décrits
dans le tableau II.

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Tableau I : Résumé des différents tests utilisés pour détecter les familles chimiques présentes
dans la plante codée LPA05

Familles chimiques Tests Solvants Réactifs Réaction positive


ALCALOIDES Macération HCl 2 N - Wagner Précipitation
chlorhydrique - Mayer
- Draggendorf
FLAVONOIDES Willstater Ethanol Tournure de Mg Coloration :
LEUCOANTHOCYANES + HCl concentré - rouge (Flavones)
- pourpre (Flavonols)
- violacée (Flavanones
ou flavanols)
Bath Smith Ethanol HCl concentré : Coloration :
- à chaud Rouge violacée
(leucoanthocyanes)
- à froid Rouge (anthocyanes)
TANINS Eau distillée - Gélatine 1% Précipité (Polyphénols)
POLYPHENOLS - Gélatine salée Précipité (Tanins)
- FeCl3 10% dans Coloration :
méthanol - Bleue verte
(Tanins condensés)
- Bleue noirâtre
(Tanins hydrolysables)
QUINONES Benzène NH4OH Phase alcaline rouge
violacée
STEROIDES Liebermann Chloroforme Anhydride Coloration :
TERPENOIDES Burchard acétique + H2SO4 - Rouge pourpre
concentré (Triterpenoides)
- Violacée ou bleue
verte (Stéroïdes)
Salkowski Chloroforme H2SO4 concentré Anneau de séparation
rouge (Stérols insaturés)
BadjetKedde Chloroforme Acide picrique Coloration rouge
(Stérols lactoniques)
Keller Killiani Chloroforme FeCl3 10% + Anneau de séparation
acide acétique rouge pourpre (Désoxy-
glacial 2-sucres)
SAPONINES Test de Eau distillée Agitation Mousse persistante
mousse (≥ 2 cm)
POLYSACCHARIDES Méthanol Macération Précipité

Tableau II: Critères utilisés pour l’estimation de l’abondance relative des familles chimiques

Notation Précipité Coloration Indice de mousse (cm)


- Négatif Sans coloration 0à2
+ Faible Faible 2à4
++ Abondante Franche 4à5
+++ Forte, floculation immédiate Intense 5

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II.3- Tests pharmacologiques

II.3.1- Animaux d’expérience


Deux espèces animales ont été utilisées durant notre étude :

des cochons d’Inde tricolores mâles ou femelles, de poids compris entre 250 à 300g
fournis par des éleveurs locaux ont été utilisés pour la détermination de l’activité des
produits testés sur la trachée isolée. Ils ont été conditionnés en élevage au laboratoire
au moins une semaine avant leur utilisation.

des souris femelles de race OF-1 pesant en moyenne 25±2 g et élevées dans
l’animalerie de l’IMRA ont été utilisées pour l’étude de toxicité. Elles ont été nourries
avec de la provende LFL et de l’eau.

II.3.2- Tests in vitro


Dans le but de déterminer l’activité biologique de la plante codée LPA05, des tests sur
trachée isolée de cochon d’Inde ont été effectués. La réponse de l’organe a été captée,
amplifiée et enregistré par un myographe de marque Ugobasile.

- Prélèvement, nettoyage et montage de l’organe

L’animal a été assommé par un coup sec donné au niveau de la nuque puis ex-sanguiné
en coupant les artères carotidiennes et les veines jugulaires. Une ouverture de la peau et du
muscle a été réalisée à partir de la cage thoracique jusqu’à la mâchoire inférieure de l’animal
pour faire dégager la trachée. Un morceau de 2 cm de trachée a été prélevé et plongé tout de
suite dans une boite de pétri contenant de la solution de Krebs-Henseilet dont la composition
en mM dans l’eau distillée est la suivante : NaCl : 120 ; NaHCO3 : 25 ; KCl : 4,72 ; CaCl2 :
2,5 ; MgSO4 : 0,5 ; KH2PO4 : 1,2 et D-glucose : 11.

L’organe a été nettoyé en enlevant les tissus conjonctifs et les mésentères, puis, il a été
découpé en spirale. L’organe ainsi découpé a été suspendu dans la cuve à organe (dont la
capacité est de 20 ml) contenant de la solution de Krebs-Henseilet. L’une de ses extrémités a
été fixée au fond de la cuve et l’autre a été reliée au capteur isotonique de marque Ugobasile.
Une tension de base de 2g a été imposée à l’organe. La cuve a été aérée avec du carbogène
(95% O2 + 5% CO2) pour maintenir le pH de la solution de survie à 7,4. La température dans
la cuve a été maintenue à 37°C par un bain marie thermostaté.

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- Equilibration et sensibilisation

L’organe a été laissé s’équilibrer avec les conditions expérimentales pendant un laps de
temps de 60 mn. Ce temps d’équilibration a été entrecoupé d’un rinçage toutes les 15 mn qui
consistent au renouvellement de la solution de Krebs-Henseleit dans la cuve à organe. Après
équilibration, l’organe a été sensibilisé avec 10-5M d’histamine puis rincé trois fois de suite et
laissé au repos jusqu’à ce que l’organe retrouve sa tension initiale avec rinçage toutes les
15min.

II.3.2.1- Effet relaxant de EB, FH, FDCM, FAE et FA sur la trachée isolée de cochon
d’Inde pré-contractée avec l’histamine
Après équilibration et sensibilisation, l’organe a été pré-contracté avec de l’histamine à
5x10-7 M. Au plateau de contraction, des concentrations croissantes et cumulatives de l’extrait
brut (EB), de FH, de FDCM, de FAE ou de FA ont été testées. Les amplitudes de contraction
et de relaxation de l’organe ont été enregistrées et mesurées. Les effets relaxants de l’extrait
brut ont été exprimés en % de relaxation et la CE50 a été déterminée par régression linéaire.

Les concentrations testées ont été les suivantes :

100 à 800µg/ml pour EB, FDCM et FAE


100 à 1000 µg/ml pour FH et FA

CE50 étant la concentration du produit testé qui provoque une relaxation de 50% de la
contraction de la trachée isolée de cochon d’Inde induite par l’histamine utilisée.

II.3.2.2- Effet relaxant des fractions issues de FAE


Les mêmes techniques et le même protocole que précédemment ont été utilisés pour
déterminer la fraction la plus active issue du fractionnement bio-guidé de FAE. Au plateau de
contraction provoquée avec 5x10-7 M d’histamine, les fractions ont été testées de 50 à 300
µg/ml de façon croissante et cumulative. Les valeurs des CE50 ont été calculées.

- 16 -
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II.3.2.3- Etude du mécanisme d’action broncho-relaxante de F3-3


- Etude de l’effet de F3-3 sur la trachée isolée de cochon d’Inde pré-contractée avec
l’acétylcholine

Après équilibration et sensibilisation, l’organe a été pré-contracté avec 5x10-6 M


d’acétylcholine. Au plateau de contraction, différentes concentrations de F3-3 allant de 50 à
300 µg/ml ont été testées de façon cumulative. Sa CE50 a été calculée comme précédemment
par régression linéaire.

- Etude de l’effet de F3-3 sur l’activité broncho-constrictrice de l’Histamine

Dans le but d’étudier l’effet inhibiteur éventuel de F3-3 sur la réponse contractile des
cellules musculaires lisses trachéales à l’histamine, des tests étudiant l’effet contractile
d’histamine en fonction de sa concentration en absence et en présence de F3-3 ont été réalisés
sur la trachée isolée de cochon d’Inde.

Après équilibration et sensibilisation, des concentrations croissantes et cumulatives


d’histamine allant de 10-8 à 10-4M ont été testées. Les réponses contractiles induites par
l’histamine ont été enregistrées, mesurées et exprimées en pourcentage de contraction en
fonction de la concentration. Puis l’organe a été rincé trois fois de suite et laissé au repos
jusqu’à ce qu’il retrouve sa tension de base et en faisant un rinçage toutes les 15 mn. L’organe
a été ensuite mis en contact avec 100 ou 200 µg/ml de F3-3pendant 10 mn puis le test effet-
concentration de l’histamine a été répété. Les amplitudes de contraction ont été enregistrées et
mesurées. Les pourcentages de contraction induite par l’histamine en fonction de la
concentration ont été calculés par rapport à son effet maximal (Emax) et les valeurs de CE50
ainsi que la réduction d’Emax en absence et en présence de F3-3 ont été calculées.

- Etude de l’effet de F3-3 sur l’activité broncho-spasmodique du KCl

Dans l’objectif d’étudier l’effet inhibiteur de F3-3 sur la réponse contractile des cellules
musculaires lisses trachéales au KCl, des tests effet-concentration de ce dernier ont été
effectués sur la trachée isolée de cochon d’Inde en absence et en présence de F3-3.

Après équilibration et sensibilisation de l’organe avec 10-5M de l’histamine, il a été rincé


trois fois avec une solution de Krebs sans KCl et laissé au repos pour retrouver sa tension
initiale. Des concentrations croissantes et cumulatives du KCl allant de 0,31 à 80mM ont été

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testées. Les amplitudes de contraction ont été enregistrées et la courbe effet-concentration a


été construite. L’organe a été rincé trois fois successives et laissé au repos jusqu’à ce qu’il
retrouve sa tension initiale. 10min après une pré-incubation de la fraction F3-3, le même
protocole expérimental a été répété. Les amplitudes de contraction ont été de nouveau
enregistrées et la courbe effet-concentration a été construite. Les valeurs des CE50 et des
réductions de l’effet maximal (Emax) en absence et en présence de F3-3 ont été calculées.

- Effet du propranolol sur l’activité broncho-relaxante de F3-3

Dans l’objectif d’étudier l’implication du récepteur β2-adrénergique dans l’effet broncho-


relaxant de F3-3, des tests évaluant l’effet de F3-3 en fonction de sa concentration ont été
effectués sur la trachée isolée de cochon d’Inde pré-contractée à l’histamine en absence et en
présence du propranolol, un antagoniste spécifique du récepteur β-adrénergique.

Après équilibration et sensibilisation, l’organe a été pré-contracté avec 5x10-7 M


d’histamine. Au plateau de contraction, F3-3 a été introduit dans la cuve de façon cumulative
pour avoir des concentrations croissantes allant de 50 à 300µg/ml. Les amplitudes de
relaxation ont été enregistrées et mesurées.

Après trois lavages, l’organe a été laissé au repos pour retrouver sa tension initiale. Puis,
10 ou 10-8M de propranolol a été mis en contact avec l’organe pendant 10 mn avant de pré-
-6

contracter l’organe. Au plateau de contraction, le test effet-concentration avec F3-3 a été


répété. Les amplitudes de relaxation dans ces conditions ont été mesurées et les valeurs de
CE50 ont été calculées.

II.3.2.4- Effet inhibiteur de l’isoprenaline sur la réponse broncho-contractile de


l’histamine
Ce test a été effectué dans l’objectif de comparer l’effet de la fraction F3-3 à celui de
l’isoprenaline sur l’activité broncho-spasmodique de l’histamine afin de confirmer le
mécanisme d’action de F3-3.

Après équilibration et sensibilisation, des concentrations croissantes et cumulatives


d’histamine allant de 10-8 à 10-4M ont été testés sur la trachée isolée de cochon d’Inde. Les
réponses contractiles induites par l’histamine ont été enregistrées. Puis l’organe a été rincé et
laissé au repos jusqu’à ce qu’il retrouve sa tension de base. L’organe a été ensuite mis en
contact avec 10-9M d’isoprenaline pendant 10min (pré-incubation) puis le test effet-
concentration de l’histamine a été répété. Les amplitudes de contraction ont été mesurées. Les

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valeurs des CE50 et d’Emax de l’histamine en absence et en présence d’isoprenaline ont été
calculées

II.3.3 – Produits utilisés


Le diméthyle sulfoxide (DMSO) a été utilisé pour dissoudre l’extrait brut(EB) ainsi
que les différentes fractions. Il est de marque Sigma.
Les agonistes de références (Histamine, Acétylcholine, Théophylline) et antagoniste
(Propranolol) utilisés sont de marque sigma.
Les différents sels : NaCl, NaHCO3, KCl, CaCl2, MgSO4, KH2PO4 ainsi que le D-
glucose utilisés pour la préparation de la solution de Krebs-Henseilet légèrement
modifiée sont de marque Prolabo.

II.3.4- Etude de toxicité aiguë d’EB


Ce test a pour but de déterminer les doses létales d’EB après une administration unique
par voie orale.

Le test a été réalisé chez la souris femelle, de race OF-1 et de poids moyen de 25±2 g
[13]. Les animaux ont été mis à jeun 12 h avant l’expérience. Ils ont été répartis en 5 lots de 5
souris chacun.

- Le premier lot a servi de lot témoin et les souris de ce lot n’ont reçu que de l’eau
distillée qui est le véhicule utilisé pour l’administration d’EB.
- EB a été administré par gavage dans un volume de 0,25 ml/souris aux animaux des 2e,
3e, 4e et 5e lots à la dose de 0,5 ; 1 ; 1,5 et 2 g/kg respectivement.

Après le traitement, les souris ont eu accès libre à la nourriture et à l’eau. Les
comportements des animaux ont été observés de façon permanente pendant les 6 premières
heures puis toutes les 12 h pendant 2 jours. L’éventuelle mortalité et les comportements
anormaux par rapport à ceux des animaux témoins ont été notés.

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II.3.5- Expression des résultats et analyses statistiques


Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne des valeurs obtenues ± écart-type
(X±e.s.m) sur n tests ou animaux utilisés.

Le test t de Student a été utilisé pour l’analyse et la comparaison statistiques de deux


moyennes [47]. La différence a été considérée comme statistiquement significative pour une
valeur de p<0,05.

La CE50 exprime la concentration de l’agoniste, de l’extrait ou de la fraction testée


provoquant une relaxation ou contraction de l’organe à 50% de l’effet maximal. Elle a été
calculée par régression linéaire.

L’Emax exprime l’effet maximal correspondant à 100 % de contraction ou de relaxation.

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III - RESULTATS
III.1- Résultats chimiques

III.1.1- Rendements de l’extraction et du fractionnement

Les masses et les rendements de l’extraction et des fractionnements par partage liquide-
liquide et par chromatographie sur colonne sont présentées dans le tableau III.

Tableau III : Rendements de l’extraction et des différents fractionnements chimiques

Extrait Brut et fractions Poids en (g) Rendements en (%)

EB 52,91 10,58
FH 3,7 0,82
FDCM 9,62 2,55
FAE 11,85 3,14
FA 12,93 3,42
F3 6,28 1,66
F3-3 1,18 0,31

Après 3 macérations de 24 h successives dans l’éthanol 90° et dépigmentation par


passage sur charbon actif, le rendement de l’extraction est important (10,58%). La fraction la
plus active F3-3 se trouve dans une proportion relative de 0,31% dans le matériel végétal
étudié.

- 21 -
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III.1.2- Composition chimique du matériel végétal étudié


Les résultats du criblage phytochimique effectué sur la poudre de LPA05 sont présentés
sur le tableau IV. Elle est relativement riche en stérols insaturés et en molécules
terpénoïdiques. Les polysaccharides et les stéroïdes à sucre désoxy-2 sont également en
abondance relative moyenne, tandis que sa teneur relative en tanins de type hydrolysable et en
saponines est faible. Les autres composés chimiques comme les alcaloïdes, leucoanthocyanes,
quinones, flavonoïdes et polyphénols sont soit absents soit en quantité non détectable avec les
méthodes utilisées.

Tableau IV : Teneurs relatives des familles chimiques présentes dans la poudre de LPA05

Familles chimiques Abondance relative


Stérols insaturés +++
Terpénoïdes +++
Polysaccharides ++
Désoxy-2 sucre ++
Saponines +
Tanins hydrolysables +

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II.1.3- Chromatogrammes comparatifs des différents produits


Les chromatogrammes d’EB, FDCM, FAE, mélange de FDCM–FAE, F3-3 et FA sont
comparés sur la figure 5. On note qu’avec le système d’élution utilisé :

- aucun composé ne migre avec FA


- il y a une ressemblance entre FAE et FDCM
- F3-3 présente encore plusieurs taches observables sous UV à 254 nm et après
révélation à la vanilline. Elle présente deux composants majoritaires qui absorbent
fortement à 365 nm et qui présentent une référence frontale respective de 0,55 et 0,31.

Rf = 1

Rf = 0,55

Rf = 0,31

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

A B C

Figure 5 : Chromatogrammes d’EB (1), FDCM (2), FAE (3), FDCM+FAE (4), F3-3(5) et
FA(6) sur une plaque CCM couverte de couche de silice activée sur un support en
aluminium en utilisant le mélange DCM-MeOH (95-5: v/v) comme éluant

A : observation directe sous UV à 365 nm

B : observation directe sous UV à 254 nm

C : observation après révélation à la vanilline sulfurique 1% dans MeOH

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III.2- Résultats pharmacologiques


III.2.1- Effet relaxant de l’extrait brut et des différentes fractions sur la trachée de
cochon d’Inde
Testés sur la trachée isolée de cochon d’Inde pré-contractée avec 5x10-7 M d’histamine,
l’extrait brut de LPA05 et les différentes fractions ont produit une broncho-relaxation
concentration dépendante. Les valeurs de leurs CE50 sont comparées dans le tableau V.

Dans ces conditions expérimentales, EB à 800 µg/ml peut induire une relaxation de 100%
de la trachée pré-contractée avec l’histamine et sa CE50 est de 429,07±33µg/ml.

Après séparation des différents composés contenus dans EB par extractions successives
avec des solvants de polarité croissante, c’est FAE qui présente la CE50 la plus faible
(284,92±19 µg/ml). Elle est 1,5 fois plus active qu’EB. Les fractions héxanique et aqueuse
sont les moins actives avec une CE50 respectivement de 493,25±26µg/ml et 867, 01±4 µg/ml.

Puisque c’est FAE qui est la plus active, le fractionnement bio-guidé a été réalisé sur elle.
Parmi les fractions obtenues par la séparation chromatographique de FAE, c’est la fraction F3
qui est la plus active avec une CE50 égale à 262,28±8 µg/ml. Mais sa CE50 n’est pas
statistiquement différente par rapport à celle de FAE (p>0,05).

Cette fraction F3 a subi à son tour une séparation chromatographique. Parmi les 6
fractions obtenues par cette chromatographie, c’est la fraction F3-3 qui est la plus active avec
une CE50 égale à 125,14±5 µg/ml. Elle est deux fois plus active que F3.

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Tableau V : Comparaison des valeurs de CE50 des différents produits préparés avec la plante
LPA0 sur la trachée isolée de cobaye pré-contractée avec l’histamine (X ±e.s.m)

Préparation Extrait et fractions CE50 (µg/ml) n


Macération dans EtOH 90° EB 429,07±33 5
FH 493,25±26 4

FDCM 376,35±19 4
Partage liquide-liquide d’EB
FAE 284,92±19 5

FA 867,01±4 3

F1 >1000 3

F2 596,79±32 3
Chromatographie sur colonne
sur gel de silice de FAE F3 262,28±8 4

F4 293,69±23 3

F5 331,93±43 3

F6 596,78±21 3

F3-1 374,35±9 3

F3-2 312,19±17 3

Chromatographie sur colonne F3-3 125,14±5 4

sur gel de silice de F3 F3-4 418,10±13 3

F3-5 450,23 ±34 3

F3-6 713,17 ±42 3

n: nombre des tests

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III.2.2- Etude du mécanisme d’action broncho-relaxante de F3-3


III.2.2.1- Effet relaxant de F3-3 sur la trachée de cochon d’Inde pré-contractée à
l’acétylcholine
Sur une trachée pré-contractée avec 5x10-6 M d’acétylcholine, F3-3 provoque un effet
broncho-relaxant concentration-dépendant avec CE50 égale à 144,16±7µg/ml et l’Emax est
obtenu avec 300 µg/ml (Figure 6 et tableau VI). Comparée avec sa CE50 sur une trachée pré-
contractée avec l’histamine, la différence est statistiquement non significative (p>0,10).

Tableau VI : Comparaison des valeurs de CE50 de F3-3 en fonction de l’agoniste broncho-


contracturant (X ±e.s.m ; n=4)

Agent contracturant CE50 (µg/ml) Equation de la courbe r2


de tendance
Histamine 125,14±5 y=0,0042x-0,02 0,940

Acétylcholine 144,16±7 y=0,0035x-0,02 0,996

1
Effet broncho-relaxant

0,8
(E/Emax)

0,6

0,4

0,2

0
0 100 200 300 400
[F3-3] µg/ml
Histamine A.chol

Figure 6 : Courbe effet-concentration de F33 sur la trachée de cochon d’Inde pré-contractée


avec l’histamine ou avec l’acétylcholine (n=4)

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III.2.2.2- Effet inhibiteur de la fraction F3-3 sur la réponse contractile de l’Histamine


Les courbes montrant l’effet broncho-constricteur de l’histamine en fonction de sa
concentration en absence et en présence de 100 ou 200 µg/ml de F3-3 sont présentées sur la
figure 7.

En absence de la fraction F3-3, l’histamine contracte la trachée de cobaye de façon


concentration-dépendante avec une CE50 = 5,54±1 x 10-6 M. L’Emax est obtenu à 5x10-4 M.

En présence de F3-3, la courbe effet-concentration de l’histamine est déplacée vers la


droite et son Emax est significativement réduit :

- En présence de 100 µg/ml de F3-3, la CE50 de l’histamine est devenue 18,36±4x10-6 M


qui est statistiquement différente par rapport à sa CE50 sans F3-3 (p<0,001) et son
Emax est diminué de 27,4±3% (Tableau VII).
- En présence de 200 µg/ml de F3-3, sa CE50 est devenue 17 fois plus grande (96,47±10
x10-6M) et son Emax est réduit de 50,46 ±5% (p<0,001).

- 27 -
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Tableau VII : Valeurs des CE50 et d’Emax de l’histamine en absence et en présence de la


fraction F3-3 (X ±e.s.m ; n=4)

F3-3(µg/ml) CE50 de l’histamine (M) Equation de la courbe de r2 Emax


tendance
0 5,54±1 x 10-6 y=0,19Ln(x)-0,716 0,99 1

100 18,36±4 x 10-6*** y=0,12Ln(x)-0,445 0,98 0,73±0,03***

200 96,47±10 x 10-6*** y=0,15Ln(x)-0,899 0,99 0,49±0,04 ***

*** : p<0,001

1
Effet broncho-constricteur

0,75
(E / Emax)

0,5

0,25

0
1 10 100 1000 10000 100000
log [Histamine 10-8 M]

+ 0 µg/ml F3-3 + 100 µg/ml F3-3 + 200 µg/ml F3-3

Figure 7 : Courbes montrant l’effet broncho-constricteur de l’histamine en fonction de sa


concentration en absence et en présence de 100 ou 200µg/ml de F3-3 sur la trachée
isolée de cochon d’Inde (n=4)

- 28 -
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III.2.2.3-Effet inhibiteur de la fraction F3-3 sur la réponse contractile du KCl


Les courbes montrant l’effet broncho-constricteur du KCl en fonction de sa concentration
en absence et en présence de F3-3 sont présentées sur la figure 8.

Le KCl agit en contractant la trachée isolée de cobaye de façon concentration-dépendante


avec une valeur de CE50 = 12,14±1mM (Tableau VIII).

En présence de F3-3, sa courbe effet-concentration est déplacée vers la droite, les valeurs
de sa CE50 ont augmenté et son Emax est déprimé (Tableau VIII). Les études statistiques de
ces modifications ont conclu à une différence significative.

Tableau VIII : Valeurs de CE50 et d’Emax du KCl en absence et en présence de


différentes concentrations de F3-3 (X ±e.s.m ; n=4)

F3-3(µg/ml) CE50 de KCl (mM) Equation de la courbe de r2 Emax


tendance
0 7,58±1 y=0,910x-0,188 0,98 1

100 14,01±3*** y=0,045x-0,136 0,96 0,79±0,02 ***

200 26,98±4*** y=0,023x-0,134 0,94 0,68±0,04 ***

*** : p<0,001

1
Effet broncho-constricteur

0,75
E / Emax

0,5

0,25

0
10 100 1000 10000
log [KCl x 10-2 mM]
+ 0 µg/ml F3-3 + 100 µg/ml F3-3 + 200 µg/ml F3-3

Figure 8 : Courbes effet-concentration du KCl en absence et en présence de F3-3 sur la trachée


isolée de cochon d’Inde (n=4)

- 29 -
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

III.2.2.4- Effet du propranolol sur l’activité broncho-relaxante de F3-3 sur la trachée


de cochon d’Inde pré-contractée à l’histamine
La figure 9 présente les courbes effet-concentrations de F3-3 en absence et en présence de
différentes concentrations de propranolol qui est un antagoniste spécifique des récepteurs β-
adrénergiques.

- Testée sur la trachée isolée de cobaye pré-contractée avec l’histamine, F3-3 provoque
un effet broncho-relaxant concentration-dépendant avec une CE50 égale à
125,14±5µg/ml (n=4).
- En présence de 10-8M de propranolol, la courbe effet-concentration de F3-3 est
déplacée vers la droite avec une augmentation de sa CE50=150,63±21 µg/ml (n=4).
Mais la différence entre sa CE50 en absence et en présence de 10-8 M de propranolol
n’est pas statistiquement significative (p>0,05). Dans cette condition, son Emax est
toujours atteint avec 300 µg/ml (Tableau IX).
- En présence de 10-6M de propranolol, la courbe effet-concentration de F3-3est aussi
déplacée vers la droite. Sa CE50 est devenue 168,05±14µg/ml (n=4). Elle est
statistiquement différente par rapport à sa CE50 sans propranolol (p<0,001). Son Emax
n’est pas modifié (Tableau IX).

- 30 -
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

Tableau IX : Valeurs de CE50 et d’Emax de F3-3 sur la trachée isolée de cochon d’Inde pré-
contractée avec l’histamine en absence et en présence de propranolol (X ±e.s.m;
n=4)

[Propranolol] CE50 de F3-3 (µg/ml) Equation de la r2 Emax


M droite de tendance
0 125,14±5,47 y=0,004x-0,014 0,93 1
10-8 150,63±20,70 (p>0,05) y=0,005x-0,198 0,98 0,99±0,01
10-6 168,05±14,35 (p<0,001) y=0,004x-0,219 0,97 1

1
Effet broncho-relaxant (E / Emax)

0,75

0,5

0,25

0
0 50 100 150 200 250 300

[F3-3 µg/ml]

+ 0 M propranolol + 10-8 M Propranolol + 10-6 M Propranolol

Figure 9 : Courbes montrant l’effet broncho-relaxant de F3-3 sur la trachée de cochon d’Inde
pré-contractée avec l’histamine en absence et en présence de propranolol (n= 4)

- 31 -
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

II.2.3- Effet inhibiteur de l’isoprénaline sur l’effet broncho-contractile de


l’histamine
La figure 10 montre la comparaison de l’effet inhibiteur de F3-3 et celui de l’isoprénaline
sur la réponse broncho-contractile de l’histamine.

L’histamine seule à des concentrations cumulatives et croissantes contracte la trachée


isolée de cobaye avec une CE50 = 5,54±1 x 10-6 M. Son Effet contractile maximal est atteint
avec 2x10-4 M.

En présence de 100 µg/ml de F3-3, la courbe effet-concentration de l’histamine est


déplacée vers la droite avec une dépression de son Emax (Figures 10).

En présence de 10-9 M d’isoprenaline, la courbe effet-concentration de l’histamine sur la


tachée de cobaye est aussi déplacée vers la droite avec une dépression significative de son
Emax (Figure 10).

En présence de 100 µg/ml de F3-3 ou de 10-9 M d’isoprénaline, les courbes effet-


concentrations de l’histamine se superposent (Figure 9). Les différences observées au niveau
des valeurs de deux paramètres pharmacologiques de l’histamine (CE50 et Emax) en présence
de 100 µg/ml de F33 et en présence de 10-9 M d’isoprénaline ne sont pas statistiquement
significatives (p>0,20) (Tableau X).

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Tableau X : Comparaison des valeurs de CE50 et d’Emax de l’histamine en absence et en


présence de F3-3 ou d’isoprénaline (X ±e.s.m ; n=4)

CE50 de Equation de la courbe r2 Emax


l’Histamine (M) de tendance
Histamine seule 5,54±1 x 10-6 y=0,190Ln(x)-0,70 0,99 1

En présence de F3-3 18,36±4 x 10-6 y=0,130Ln(x)-0,49 0,98 0,73±0,03


100 µg/ml
En présence 15,03±4 x10-6 y=0,125Ln(x)-0,40 0,98 0,77±0,03
d’isoprenaline 10-9M

1
Effet broncho-spasme

0,8
(E/Emax)

0,6

0,4

0,2

0
1 10 100 1 000 10 000 100 000

log [Histamine x10-8 M]


Hist seule Hist + Isopren (10-9M) Hist + F33 (100µg/ml)

Figure 10 : Comparaison de l’effet inhibiteur de F3-3 à celui de l’isoprénaline sur l’effet


spasmodique de l’histamine sur la trachée isolée de cochon d’Inde (n=4)

- 33 -
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III.3-Etude de toxicité aigüe


Aucune mortalité n’a été observée chez les souris après administration par gavage de
l’extrait brut (EB) jusqu’à la dose de 2g/kg. Cependant, par rapport aux animaux non traités,
les animaux traités ont présenté un signe de somnolence notable. Cet effet sédatif est
réversible. L’apparition et la durée de ce signe de somnolence varient en fonction de la dose.

Tableau XI : Délai d’apparition et durée des signes anormaux observés chez les souris après
une prise orale de l’extrait brut (EB) de la plante LPA05 (n=5)

Dose d’EB Délai Durée % des souris


(g/kg) Signe de toxicité observé d’apparition (h) affectées

0,5 aucun 0 0 0

1 1h 1h 40

1,5 Somnolence 30min 2h 80

2 10min 4h 100

- 34 -
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IV- DISCUSSION
L’objectif de cette étude consiste à apporter des preuves scientifiques justifiant
l’utilisation traditionnelle de la plante LPA05 dans le traitement de l’asthme par la mise en
évidence de ses propriétés pharmacologiques contribuant à sa vertu thérapeutique en utilisant
des modèles d’étude expérimentale in vitro, sur la trachée isolée de cochon d’Inde et par
l’étude de la toxicité de sa prise par la voie orale chez la souris.

L’asthme est une maladie respiratoire caractérisé par un gène respiratoire [37-38]. Il
demeure l’une des principales maladies chroniques des enfants [11]. Comme le traitement de
l’asthme est très souvent de longue durée, le coût est forcément très cher et difficilement
supportable par le budget ménager de la plupart de la population des pays pauvres d’où
l’intérêt des études scientifiques plus poussées sur les plantes médicinales à vertu
antiasthmatique.

Testé sur la trachée isolée de cobaye pré-contractée à l’histamine, l’extrait brut de


LPA05 (EB) provoque un effet broncho-relaxant concentration-dépendant. Les broncho-
dilatateurs constituent les médicaments de soulagement en cas de crise en améliorant le
calibre de la voie respiratoire facilitant ainsi la respiration. Mais certains d’entre eux, comme
la théophylline ou les agonistes β-adrénergiques de longue durée d’action (ou long acting β-
adrenergic, LABA) sont aussi utilisés dans le traitement de fond de l’asthme.

EB, obtenu par macération dans éthanol, contient toutes les molécules de la plante aussi
bien les apolaires comme les terpénoïdes et les stérols insaturés que les molécules très
polaires comme les polysaccharides. Les partages liquide-liquide effectués sur EB utilisant
des solvants de polarité croissante ont permis de les séparer grossièrement. Les composés
apolaires sont extraits par l’hexane et le dichlorométhane et trouvés dans FH et FDCM. Leur
taux relatif est de 3,4%. Les composés très polaires, constituant également 3,4%, se trouvent
dans la fraction aqueuse FA. Les composés moyennement polaires sont extraits par l’acétate
d’éthyle. C’est la fraction FAE qui présente l’activité broncho-relaxante la plus intense. C’est
la raison par laquelle, la suite du fractionnement chimique a été réalisée sur elle. Les
fractionnements ont été guidés par l’importance de l’effet broncho-relaxant de chaque produit
sur la trachée isolée de cochon d’Inde pré-contractée à l’histamine. Après séparation des
constituants chimiques de FAE par chromatographie sur gel de silice, c’est la fraction
intermédiaire F3 qui a montré l’effet broncho-relaxant le plus marqué. Elle a été ensuite
séparée à son tour toujours par chromatographie sur gel de silice pour donner six fractions.

- 35 -
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

C’est la fraction intermédiaire F3-3 qui est la plus puissante pour relaxer la trachée de cobaye
pré-contractée à l’histamine. Analysée par chromatographie sur couche mince, elle montre
encore plusieurs taches dont deux majoritaires observables directement sous UV à 365 nm, la
première de couleur bleue claire se trouvant à une référence frontale 0,55 et la seconde de
couleur jaune claire est à 0,31. Plusieurs autres analyses devraient être faites pour caractériser
chimiquement ces deux taches majoritaires [39]. Il est donc très probable que ce soit l’un de
ces deux composés majoritaires qui serait à l’origine de l’effet broncho-relaxant de la plante.
Plusieurs molécules d’origine végétale ont montré des effets broncho-dilatateurs, entre autres
les coumariniques [40]. Nous avons donc fait une analyse du mécanisme pharmacodynamique
de l’activité broncho-relaxante de F3-3.

Elle est capable de provoquer un effet broncho-relaxant concentration-dépendant sur la


trachée pré-contractée aussi bien à l’histamine qu’à l’acétylcholine avec sensiblement la
même intensité. Son effet n’est donc pas spécifique pour l’agoniste broncho-contracturant.
Ces deux agonistes sont des médiateurs très impliqués dans le spasme bronchique lors des
crises d’asthme aussi bien allergique que nerveux. L’histamine agit par stimulation des
récepteurs histaminiques de type 1 (H1) pour provoquer la contraction des muscles lisses
bronchique [41]. L’acétylcholine par contre, provoque son effet bronchospasme par
stimulation des récepteurs muscariniques de type M3 [42-43]. Ces deux types de récepteur
membranaire sont de récepteurs couplés à la protéine G. Leur activation entraîne
l’augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2+ à l’origine de la contraction du
muscle lisse [44-45]. La fraction F3-3 est donc capable de diminuer la concentration
cytosolique en Ca2+ vers son niveau physiologique (10-7 M) et d’inhiber ainsi la
bronchoconstriction induite par l’acétylcholine ou l’histamine. Plusieurs mécanismes sont
possibles pour cet effet.

Puisque l’histamine est le médiateur le plus largué par les cellules inflammatoires
activés notamment les mastocytes, les éosinophiles et les basophiles et au cours de la
manifestation allergique, nous avons étudié d’abord l’effet de F3-3 sur l’effet broncho-
spasmodique de cette dernière. F3-3 réduit significativement la CE50 de l’histamine et son
Emax. Ce qui indique que F3-3 antagonise l’effet de l’histamine mais de façon non compétitive
c’est-à-dire qu’elle ne peut pas entrer en compétition avec l’histamine sur le récepteur H1. F3-3
ne se fixe pas sur le site de fixation de l’histamine mais elle modifie l’affinité de cette dernière
sur son récepteur d’où la baisse de son effet broncho-spasmodique.

- 36 -
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

En cas de dépolarisation des cellules musculaires lisses, les canaux calciques voltage-
dépendants vont s’ouvrir et laissent entrer l’ion Ca++. Ce qui va contribuer à l’augmentation
de sa concentration cytosolique d’où la contraction musculaire [46]. La dépolarisation est
l’inversion de la polarité provoquée par l’augmentation du taux des cations intracellulaires
notamment le Na+. Dans notre expérience, elle a été provoquée par le KCl [47]. C’est l’ion K+
qui est à l’origine de la dépolarisation membranaire et l’activation des canaux calciques VOC
d’où l’entrée de Ca++ [48]. Le but du test était de vérifier si F3-3 est capable de bloquer l’influx
calcique et d’inhiber ainsi le bronchospasme provoqué au KCl. Effectivement, elle réduit
significativement à la fois la CE50 et l’Emax de KCl. Cet effet serait la conséquence de la
baisse de l’influx calcique à travers les canaux calciques VOC. F3-3 pourrait empêcher
directement la dépolarisation des cellules musculaires bronchiales induite par KCl ou bloquer
les canaux calciques VOC.

Au niveau des glandes à mucus et des cellules épithéliales bronchiales se localisent une
haute densité des récepteurs β2. Les β2 mimétiques sont les bronchodilatateurs de première
intention dans le traitement des crises d’asthme. L’effet principal des β2 stimulants dans le
traitement de l'asthme reste la relaxation du muscle lisse bronchique Ils peuvent également
exercer leur action bronchodilatatrice de manière indirecte, en diminuant d’abord le tonus
parasympathique ou des terminaisons nerveuses parasympathiques, ensuite, en inhibant les
mécanismes biochimiques de la réponse contractile du muscle lisse à des agonistes comme
l'acétylcholine, l'histamine, la bradykinine et les leucotriènes, exerçant ainsi un effet broncho-
protecteur.

Pour étudier l’implication des récepteurs β2-adrénergiques dans l’effet la


bronchodilatateur de F33, nous avons effectué des tests de relaxation sur trachée isolée de
cochon d’Inde en absence et en présence du propranolol. Ce dernier est un antagoniste
spécifique de ces récepteurs β2-adrénergiques [49].

En présence de propranolol dans le bain, l’effet broncho-dilatateur de F3-3 sur la trachée


isolée de cochon d’Inde pré-contractée à l’histamine est inhibé. L’inhibition est caractérisée
par augmentation significative de sa CE50 sans aucune dépression de la valeur de son Emax.
Ce type d’inhibition est caractéristique d’un antagonisme compétitif. C’est-à-dire F3-3 et le
propranolol se fixeraient sur le même type de récepteur qui est le récepteur β2-adrénergique.
F3-3 est capable de déplacer le propranolol sur son récepteur et de reproduire son Emax. La
stimulation des récepteurs ß2-adrénergiques au niveau des cellules musculaires lisses conduit

- 37 -
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à la relaxation musculaire. C’est un récepteur couplé à la sous unité Gs de la protéine G. Sa


stimulation conduit à la relaxation des cellules musculaires lisses bronchiales [50].

L’isoprénaline est une catécholamine. Elle est un agoniste spécifique des récepteurs β-
adrénergiques. Au niveau bronchial, elle est capable de stimuler les récepteurs β2-
adrénergiques pour dilater les bronches. Quand elle a été mise dans la cuve avant de stimuler
la trachée avec l’histamine, la CE50 de cette dernière est significativement augmentée et son
Emax est réduit. On observe aussi le même effet avec F3-3. L’effet inhibiteur de 10-9M
d’isoprénaline et celui de F3-3 à 100 µg/ml sont d’ailleurs tout à fait comparables. Par analogie
d’effet, nous postulons que F3-3 est aussi capable de stimuler le récepteur β2-adrénergique
pour provoquer son effet broncho-dilatateur. Ce qui confirme notre hypothèse précédente.

L’étude de toxicité aigüe de l’extrait brut de la plante codée LPA05 a montré que sa
prise par la voie orale ne provoque aucune létalité jusqu’à dose de 2 g/Kg chez la souris.
Pourtant une somnolence réversible a été observée chez les animaux ayant reçus l’extrait à
partir de la dose orale de 1 g/Kg. Cet effet de somnolence est bénéfique pour les asthmatiques
en cas de crises nocturnes ou de petit matin. Par contre, une précaution doit être prise en cas
de travail nécessitant une vigilance particulière comme la conduite de voiture. Ce qui indique
que l’utilisation de cette plante en tant que plante médicinale pour traiter l’asthme est
sécurisante et ne présente pas de risque majeur pour la santé.

- 38 -
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V - CONCLUSION
L’ensemble des résultats obtenus sur l’EB et la fraction F3-3 indique que la plante codée
LPA05 possède une activité broncho-relaxante concentration-dépendante contribuant
certainement à sa vertu antiasthmatique. Les résultats pharmacologiques et l’absence de
toxicité confirment son utilisation comme remède traditionnel antiasthmatique.

L’analyse du mécanisme d’action broncho-relaxante de la fraction F3-3 a permis de


conclure que son effet broncho-relaxant n’est pas spécifique à l’agoniste broncho-
spasmodique utilisé. Son effet est inhibé de façon compétitive par le propranolol qui est un
antagoniste spécifique des récepteurs β-adrénergiques. Son effet broncho-relaxant serait alors
dû à la stimulation du récepteur β2-adrénergique. F3-3 inhibe également de façon non
compétitive l’effet broncho-spasmodique de l’histamine et du KCl. Son effet inhibiteur sur
l’activité broncho-contractile de l’histamine est identique à celui de l’isoprénaline, un
agoniste β-adrénergique spécifique.

Perspectives

La suite de notre travail consistera à l’isolement du principe actif responsable de l’activité


broncho-relaxante de la fraction F3-3, à la détermination de sa structure chimique ainsi que
l’élucidation complète de son mécanisme d’action.

La toxicité chronique de la plante LPA05 sera aussi étudiée de façon approfondie


ultérieurement.

- 39 -
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

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DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

Title: Pharmacologic study of antiasthmatic plant coded LPA05

ABSTRACT
The objective of this study was to highlight the pharmacological properties of the coded plant
LPA05 which is a principal constituent of the plant mixture of an antiasthmatic
phytomedicine manufactured and commercialized by SOAMADINA.
Tested on the histamine pre-contracted isolated guinea pig trachea, the crude extract of
LPA05 (EB) is able to induce 100% of relaxation at 800µg/ml with EC50 to 429.07±33 µg/ml.
The successive extractions of EB by the technique of liquid-liquid partition using water and
different organic solvents with increasing polarity produced various fractions. It is the ethyl
acetate fraction (FAE) which is the most active. The fractionation of FAE by the column
chromatography led to F3-3 which is the most active (EC50 = 125.14±5 µg/ml). Its
chromatogram presents several spots. The two majority spots were shown at FR in 0.55 and
0.31 respectively. F3-3 provokes a concentration-dependent relaxing effect on the either
histamine or acetylcholine pre-contracted guinea-pig trachea. It inhibited in a non-competitive
manner the broncho-spasmodic effect of KCl. Its broncho-dilating effect was competitively
antagonized by the propranolol. Compared with isoprenaline, F3-3 and this specific β-agonist
inhibited in the same way the broncho-contracting effect of the histamine. These results
allowed us to postulate the β2-adrenergic stimulation by F3-3 as a pharmacological mechanism
of its broncho-relaxing effect.
The administration of EB by oral route until the dose of 2 g/Kg does not cause any lethality in
the mouse.
The whole of these results confirmed the anti-asthmatic therapeutic virtue of this plant LPA05
and its traditional use.
Key words: medicinal plant, asthma, β2-adrenergic, isolated trachea

Encadreur : Impétrant:

Dr RAMANITRAHASIMBOLA David YOUSSOUF Mohamed Mbae


LPA, IMRA, AvarabohitraItaosy Lot II F 67 Andraisoro, Antananarivo (101)
033 12 201 39 034 25 715 18
dramanitrahasimbola@yahoo.fr youssoufmohamedmbae@yahoo.fr
DEA de YOUSSOUF Mohamed Mbae

RESUME
L’objectif de ce travail a été de mettre en évidence les propriétés pharmacologiques de
la plante codée LPA05 qui entre dans la composition d’un phyto-médicament antiasthmatique
fabriqué et commercialisé par la société SOAMADINA.

Testé sur la trachée isolée de cochon d’Inde pré-contractée à l’histamine, l’extrait brut
de LPA05(EB) est capable de provoquer 100% de relaxation à 800 µg/ml avec une CE50 égale
à 429,07±33µg/ml. Les extractions successives des composés chimiques d’EB par la
technique de partage liquide-liquide utilisant l’eau et différents solvants organiques de
polarité croissante ont permis d’avoir différentes fractions. C’est la fraction d’acétate d’éthyle
(FAE) qui est la plus active. Son fractionnement parla technique de chromatographie sur
colonne a conduit à F3-3 qui est la plus active (CE50=125,14±5 µg/ml). Son chromatogramme
présente encore plusieurs tâches dont deux spots majoritaires avec une Rf 0,55 et 0,31
respectivement. F3-3 produit une relaxation concentration-dépendante de la trachée pré-
contractée à l’histamine ou à l’acétylcholine. Elle inhibe de façon non compétitive l’effet
broncho-spasmodique du KCl. Son effet broncho-dilatateur est antagonisé compétitivement
par le propranolol. Comparée à l’isoprénaline, F3-3 et celle-ci inhibent de la même façon
l’effet broncho-contracturant de l’histamine. Ces résultats nous ont permis de postuler un
mécanisme de broncho-relaxation due à la stimulation du récepteur β2-adrénergique par F33.

L’administration par voie orale d’EB jusqu’à la dose de 2 g/Kg ne provoque aucune
létalité chez la souris.

L’ensemble de ces résultats confirment la vertu thérapeutique antiasthmatique de cette


plante LPA05 et son utilisation traditionnelle.

Mots clés : plante médicinale, asthme, β2-adrénergique, trachée isolée

Encadreur : Impétrant:

Dr RAMANITRAHASIMBOLA David YOUSSOUF Mohamed Mbae


LPA, IMRA, AvarabohitraItaosy Lot II F 67 Andraisoro, Antananarivo (101)
033 12 201 39 034 25 715 18
dramanitrahasimbola@yahoo.fr youssoufmohamedmbae@yahoo.fr