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Matériels et Méthodes

1. Matériel

1.1. Matériel végétal 


La plante Alkanna tinctoria a été récoltée à la fin du mois de juin 2018, dans la région de
Ouad Boussalam, Sétif. Elle a été identifiée par Pr. Oudjhih Bachir, université Elhadj
Lakhdar, Batna. La partie aérienne (PA) de cette plante a été lavée et coupée, puis séchée à
l’ombre et à température ambiante puis broyé et stocké à l’abri de la lumière jusqu'à
utilisation.

1.2. Réactifs et appareillage

Les réactifs chimiques utilisés dans cette étude sont : acide gallique, carbonate de sodium
(Na2CO3), réactif de Folin-Ciocalteu, quercétine, le trichlorure d’aluminium (AlCl3) , 2,6 di-
tert-butyl-4-methyl phénol (BHT) , 2,2’-diphényle-1-picryl hydrazyl (DPPH), chlorure de fer
(FeCl3) , β-carotène, Tween-40, Acide linoléique, proviennent de Sigma-Aldrich, Fluka et
Prolabo. Le méthanol et le chloroforme ont été obtenus de Prolabo, ether de petrol, ethyl
acétate,acide asitique, acide sulfirique, NaOH 10%.

Parmi l’appareillage utilisé : Spectrophotomètre Visible (Pharmacia) et un rota vapeur.

2. Méthodes
Exraction

La préparation des extraits a été réalisée par macération de la poudre de la plante dans des
solvants de polarité croissante avec un rapport de 1 / 10.

La préparation de la décoction a été préparée par addition de la poudre de la plante dans de


l’eau distillée bouillonnante avec un rapport de 1 / 10. (Ferreira et al., 2006).

2.3. Dosage des composés phénoliques


2.3.1. Polyphénols totaux
La teneur totale en phénols des extraits a été déterminée selon la méthode de Folin-
Ciocalteu (Bentahar et al., 2016). Le réactif du folin-Ciocalteu est constitué d’un mélange
d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique. L’oxydation en milieu alcalin du
réactif Folin-Ciocalteu par les groupements oxydables des composés phénoliques conduit à la
formation d’un mélange d’oxyde bleu. L’intensité de la coloration produite, qui a une
absorbance maximale à 765 nm, est proportionnelle à la quantité des polyphénols présents
dans l’extrait analysé (Georgé et al., 2005).
100 µl de chaque extrait ont été mélangé avec 500 µl de réactif de Folin Ciocalteu (dilué
10 fois) et incubé à température ambiante pendant 4 minutes. Ensuite, 400 µl de solution de
carbonate de sodium à 7.5 % ont été ajouté et incubé de nouveau pendant 90 minutes à
température ambiante. L'absorbance de tous les échantillons a été mesurée à 760 nm. Les
concentrations des composés phénoliques sont déterminées à partir de la courbe d’étalonnage
(Figure 8). Les résultats sont exprimées en milligramme équivalent d’acide gallique par
gramme d’extrait (mg EAG/ g).

1.4

f(x) = 0.01 x − 0.01


1.2 R² = 0.99

0.8

0.6

0.4

0.2

0
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

2.3.2. Dosage des flavonoïdes


La méthode du trichlorure d’aluminium (AlCl3) citée par (Djeridane et al., 2006) est
utilisée pour quantifier les flavonoïdes dans ces extraits.
La formation d’une liaison covalente entre le trichlorure d’aluminium et les groupements
hydroxyles OH des flavonoïdes produit un complexe de couleur jaune ayant une absorbance
maximale à 430 nm. A 500 µl de chaque extrait (préparé avec des dilutions convenables) est
ajouté 500 µl d’AlCl3 (2 % dans le méthanol). Après 10 minutes d'incubation, la lecture de
l'absorbance est effectuée à 430 nm. Le calcule de la concentration des flavonoïdes est fait à
l'aide d’une gamme d'étalonnage établie avec la quercétine (2,5 - 40 μg/ml) (Figure 9). La
concentration est exprimée en milligramme d'équivalent de quercitrine par gramme d'extrait
(mg EQ/g).
1.6
1.4
1.2 f(x) = 0.18 x − 0.35
R² = 0.99
1
0.8
Axis Title
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Axis Title

Screening
1. Teste des tanins
500 μl de l’extrait dilue par 1 ml de chloroforme a été ajouté a 1ml d’acide ascitique et 1
ml d’acide sulfurique. L’apparition d’une couleur bleu noir indique la présence des tanins.
.( Rufai et al,.2016)

2. Teste des catechique et gallique


1 ml de l’extrait a été ajoute à 1 ml de FeCl3 , la formation d’un précipité brun signifie la
présence des tanin catechique et l’apparition d’un couleur bleu noir a signifié la présence
des tanins gallique. ( Koffi et al ,.2009)
3. Teste alcaloïdes
1 ml de l’extrait a été ajouté à 1 ml de réactif WAGNER et bien agité, la formation d’un
précipité marron/rougeâtre indique la présence des alcaloïdes (Rufai et al,2016).
4. Teste des coumarines
1 ml de l’extrait a été ajouté à 2 ml de NaOH 10%, après une agitation pendant 5 min
l’apparition de la couler jaune signifie la présence des coumarines. (Rufai et al ,.2016)
5. Teste des terpenoides
1 ml de l’extrait a été ajoute à 1 ml de l’acide ascitique et 2 ml de l’acide sulfurique, la
formation d’un anneau marron/rougeâtre signifie la présence des terpenoides.
( Aiyegoro et Okoh ,.2009)
6. Teste des saponines
1 ml de l’extrait a été ajouté à 2 ml d’eau distillée, après une agitation pendant 1 min la
formation d’un mousse en haut signifie la présence des saponines. ( Rufai et al,.2016
)

2.4. Evaluation du pouvoir antioxydant :


2.4.1. Test du DPPH :
L'activité de piégeage des radicaux DPPH a été déterminée selon la méthode décrite par
Bentahar et al. (2016). Ce test est basé sur le principe selon lequel le DPPH acceptant un
atome d'hydrogène (H) de la molécule piégeuse, c'est-à-dire antioxydant, entraînant la
réduction de DPPH, de couleur violette devient jaune avec une diminution concomitante de
l'absorbance à 517 nm. Le changement de couleur est surveillé par spectrophotométrie et
utilisé pour la détermination des paramètres pour les propriétés antioxydantes (Mishra et al,
2012).
50 μl des différentes dilutions des extraits ont été ajoutés à 1250 μl d'une solution de
DPPH. Le mélange a été maintenu à température ambiante pendant 30 minutes avant de
mesurer son absorbance à 517 nm. BHT a été utilisé comme étalon de référence. L'activité de
piégeage radical a été calculée en pourcentage (I%) comme suit:

I% = 100 (Abs contrôle - Abs échantillon) / Abs Contrôle

Où Abs contrôle est l'absorbance de la solution du DPPH, et Abs échantillon est l'absorbance en
présence de l’extrait. La concentration de l'extrait fournissant 50 % d'inhibition (IC50) a été
calculée à partir du pourcentage de la courbe d'inhibition par rapport à la concentration de
l'extrait.

.4.3. Test de blanchissement du β- carotène


La capacité antioxydante a également été déterminée en mesurant l'inhibition de la
formation des hydroperoxydes diene conjugués résultant de l'oxydation de l'acide linoléique
(Amamra et al., 2015). Une émulsion (2.5 ml) contenant du ß-carotène, de l'acide linoléique
et du Tween-40 a été ajoutée à 0.35 ml de l'échantillon, puis incubée pendant 48 h à
température ambiante. La même procédure a été répétée avec l'antioxydant synthétique BHT
comme contrôle positif, et H2O comme contrôle négatif. L'absorbance du mélange a été
mesurée à 490 nm après 0, 1, 2, 4, 6, 24 et 48 h. L'activité antioxydante (AA) des extraits a été
évaluée en pourcentage de blanchiment du ß-carotène: I% = Abs échantillon / Abs échantillon
(t0) x 100.

2.4. Analyse statistique


Les valeurs ont été en général exprimées en moyenne  SD. Les résultats des différents
tests sont analysés par le test d’ANOVA uni variée suivie du test de Tukey pour les
comparaisons multiples et la détermination des taux de signification. La comparaison des
moyennes et des écarts types est déterminée grâce au logiciel « Graphpad Prism » version 5.0.

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