TD CHROMATOGRAPHIES : PARTIE THÉORIQUE

BST1 SVT

Daniela LENER
IBMC

Texte conseillé pour consultation : Biochimie, Voet & Voet, ed. De Boeck.
 Purification des protéines

L’études des propriétés physicochimiques, les études structurales (séquence,dichroïsme circulaire,

cristallographie…) des protéines et les études fonctionnelles (Vmax, KM, Kcat…) des enzymes
nécessitent une certaine quantité de protéine:

PURE, HOMOGENE
RENDEMENT MAXIMALE
FONCTIONNELLE (max activité catalytique)

séparation de la protéine d’intérêt d’un mélange complexe

Purification (acides nucléiques, lipides, carbohydrats et autres protéines).
Ex. protéine <0,1% du poids sec du tissu 98% de pureté.
 Purification des protéines

Tout le long de la procédure de purification il faut déterminer des paramètres précis pour vérifier si
notre procédure est adéquate:

1) Volume de la solution
2) Concentration protéique
3) Activité enzymatique

Ces trois paramètres nous permettrons de calculer:

4) Activité spécifique
5) Activité totale
6) L’enrichissement
7) Le rendement
 Purification des protéines

La purification d’une protéine consiste de trois phase principales:

1) Le choix de la source

2) La méthode d’extraction

3) La méthode de séparation
 Choix d’une source de protéines

Le choix de la source dépend de la protéine à étudier:

•Protéine spécifique d’un tissu d’un organisme bien précis tissu de cet organisme
•Protéine du métabolisme fondamentale de tout organisme source plus avantageuse

Le techniques de clonage moléculaire permettent d’isoler le gène codant pour la protéine d’intérêt
pour l’exprimer (surexpression) dans un organisme approprié mis en culture. Ex. protéine de
mammifère (souris, homme).
Bactérie Levure Insecte Mammifère in vitro
Facilité du procédé +/- complexe, lent +/- compl, lent compl, lent compl, lent simple, rapide
Expression rapide rapide assez lente assez lente très rapide
Production élevée élevée moyenne moyenne faible
milieu pas cher pas cher coûteux coûteux coûteux
protéine sécrétée? souvent, avec aussi souvent parfois rarement ne s'applique pas
corps d'inclusion
purification simple simple assez simple assez simple simple
co-expression difficile difficile assez facile difficile facile
Interférence avec l'hôte rarement rarement rarement rarement non
Repliement correct pas toujours pas toujours oui oui pas toujours
N-glycosylation non oui, riche en mannose simple, pas d'acide complexe non
sialique
O-glycosylation non oui oui oui non
phosphorylation sur Tyr; très rare sur oui oui oui non
Ser et Thr
acétylation non oui oui oui non
acylation du N-term non oui oui oui non
gamma- carboxylation non non non oui non
 Techniques de solubilisation

Pour purifier une protéine il faut l’extraire de son milieu naturel (cellule) dans une solution tampon
pour garder le pH du lysat entre 7-8, pH proche du pH physiologique.
Plusieurs choix sont possibles selon la nature de la source:

tissu mixeur et/ou collagénase

C d’insecte Choc osmotique (tp hypotonique)

ou de mammifère tp physiologique + détergents (NP-40, triton X-100)
Lyse mécanique: homogénéisateur Dounce ou Potter
 Techniques de solubilisation

Bactéries tp physiologique + Lysozyme (dégrade la parois bactérienne);

sonication (ultrasons); presse de French (passage à haute pression par un
petit orifice)

Levures tp physiologique + zymolyase ou lyticase (dégradent la parois des

levure); billes de verre; presse de French.
 Stabilisation des protéines

La chaleur dénature les protéines ainsi que le contact avec l’air (oxygène---> oxydation) il faut donc
toujours travailler entre 0-4°C en évitant de faire mousser le lysat. Il faut aussi ajouter au lysat:

• agents réducteurs des ponts disulfures:
-mercaptoethanol (CH2OH-CH2SH), dithiotreitol

Cys---S---S---Cys + 2 CH2OH-CH2SH <----> 2 Cys---SH + CH2OH-CH2S---SCH2-CH2OH

• agents chélateurs de cations: EDTA (éthylène diamine tetra-acetate; Mg2+, Mn2+, Zn2+), ,
EGTA (éthylène glycol tetra-acetate; Ca2+). Inhibition des metalloprotéases.

• inhibiteurs de protéases: PMSF (serines protéases dont acétylcholine estérase!),

Pepstatine A (protéases aspartiques), aprotinin, leupeptin et chymostatin (serine protéases à
spectre +/- ample).

• agents stabilisateurs: glycérol (stabilise les interaction protéine-protéine).

 Clarification du lysat

Pour éliminer les débris cellulaires le lysat peut être centrifugé, laissant dans le surnageant la
protéine recherché.

Centrifugation différentielle:
 Méthodes de séparation et de purification

Elle exploitent les propriétés qui différentient les molécules. Méthodes douces non dénaturantes qui
préservent l’intégrité des molécules.

Méthodes conventionnelles: exploitent les propriétés physicochimiques générales des molécules

• taille et encombrement : chromatographie par filtration sur gel ou tamisage moléculaire

électrophorèse sur gel de polyacrylamide

• charge : chromatographie par échange d’ions (groupes chargés en surface)

électrophorèse sur gel de polyacrylamide,
isofocalisation (séparation en fonction de leur pHi)

• hydrophylicité et hydrophobicité: relarguage par les sels

chromatographie sur support hydrophobe

• masse et densité : centrifugation

Méthodes spécifiques: exploitent les propriété particulières des macromolécules biologiques

• chromatographie d’affinité: rétention spécifique de la protéine par son ligand immobilisé sur un
support.
 Effet des sels sur la solubilité des protéines

La solubilité d’une protéine en solution aqueuse est fonction de la concentration en sels dissous.
La concentration en sels est exprimé par la force ionique I:
I=1/2
ci Z2i ci = concentration molaire des espèces ioniques
Zi = charge ionique

La solubilité d’une protéine à faible force ionique NaCl - +

augmente avec la concentration en sels: Salting in
+ - +- +
- -
- +- + - + +
Protéines agrégées par les interactions ioniques;
Agrégats peu solubles Solubilisation
(meilleur solvatation)
Contre-ions entourent les charge des protéines,
augmentant leur solubilité.

Pour des forces ioniques élevées, la solubilité des >>(NH4)2SO4

protéines diminue: Salting out
Déstabilisation de
l’eau organisé
Protéines s’agrégent par interactions hydrophobes.
Agrégats
L’eau est insuffisante pour hydrater aussi les protéines,
qui sortent donc de solution et précipitent.
 Effet des sels sur la solubilité des protéines

Courbe de solubilité en fonction de la force ionique

Solubilité
Optimale

Salting in Salting out

(NH4)2SO4

1 Force ionique 2

La série de Hofmeister ci-dessous décrit les effets relatifs de différents ions sur la précipitation des
protéines ou la promotion de leurs interactions hydrophobiques.

précipitation PO43- > SO42- > COO- > Cl- > Br- > NO3- > ClO4- chaotropique

(salting out) NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ (salting in)
 Séparation des protéines par salting out (relarguage)

1 La solubilité d’une protéine en solution aqueuse est fonction

Domaine 2 3
hydrophobe
de la concentration en sels dissous.
Solubilité

La solubilité de différentes protéines à même force ionique

dépend de l’hydrophobicité de chaque protéine.

Accroissement de la force ionique détermine un ordre de

précipitation

1 2 3 4 5 6 Force ionique
Le salting out est à la base de la précipitation fractionné des
Solubilité

protéines. Etape grossière de purification qui peut éliminer

NaCl
jusqu’à 50-70% des contaminants. Le sulfate d’ammonium,
(NH4)2SO4, est le sels le plus utilisé.

Première étape
Purifier et concentrer l’échantillon
(NH4)2SO4 Pas dénaturante

Force ionique En effet, les ions qui diminuent la solubilité des protéines
stabilisent leur structures natives.
 Dialyse
La dialyse permet de séparer les molécules selon leur taille, en utilisant des membranes semi-perméables
dont les pores ont une taille bien définie, inférieure aux poids moléculaire des macromolécules que on veut
garder. Ce poids est le poids moléculaire d’exclusion (molecular weight cut off - MWCO).

Cette technique est utilisée pour:

dessaler un échantillon,
changer le tampon de l'échantillon
ou pour concentrer une solution macromoléculaire (polyethylène glycol)

Dialyse

O.N. 4°C
 Filtration sur membrane

La filtration sur membrane ou ultrafiltration, comme la dialyse, permet de séparer les molécules selon leur
taille, en utilisant des membranes semi-perméables d’un certain poids moléculaire d’exclusion.

Cette technique, rapide, est de choix pour concentrer un échantillon, mais aussi pour changer son tampon.
 Chromatographie sur colonne

La séparation des protéines par chromatographie sur colonne se base sur l’équilibre de répartition
des molécules entre une phase mobile (le solvant contenant les protéines) et une phase stationnaire
(matrice solide).

La phase stationnaire ou matrice est constitué de billes de différent diamètre:

billes de silice O 4-40 μm 10-400 bar (HPLC)
Condition dénaturantes
billes de silice O 40-100 μm 1-10 bar (FPLC)

agarose, cellulose, acrylamide pression atmosphérique

billes O 100-1000 μm condition non dénaturantes

La matrice peut avoir des groupes fonctionnels différents: groupes chargés,

molécules hydrophobiques (C4-C18), ligands spécifiques.

La phase mobile dépend de la technique de séparation.

 Chromatographie sur colonne

La séparation des protéines par chromatographie sur colonne suit deux grand principes:

1. Adsorption des molécules sur la phase stationnaire. La protéine passe de la phase

mobile à la phase stationnaire (la protéine est adsorbé) et elle séparée sur la base de son
interaction avec le support. Chromatographie par échange d’ions, chromatographie sur
support hydrophobe, chromatographie d’affinité.

2. La phase stationnaire fonctionne comme un tamis et les protéines sont séparées en

fonction de leur taille et de leur forme. La protéine reste toujours en solution.
Chromatographie par filtration sur gel (ou par exclusion ou tamisage moléculaire).

Le pouvoir de résolution de la chromatographie vient de ce que le processus de

séparation se déroule de manière continue tout au long de la colonne.
Schéma de l’appareillage de chromatographie
Chromatographie par adsorption
 Chromatographie par échange d’ions
Cette méthode de séparation utilise les interactions électrostatiques que se établissent
entre les protéines et le support chromatographique.

Le support ---> de synthèse (polystyrène)

densité de charge élevé ---> rétention élevé
grandes variation de pH
dénaturantes
interactions aspécifiques
aa, peptides, oligonucléotides, désionisation de l’eau

Naturelles (Cellulose, dextrane, agarose)

faible densité de charge ---> faible rétention
ne supportent pas grandes variation de pH
non dénaturantes
pas d’interactions aspécifiques
protéines

Les groupes chargés ---> positivement échangent des anions

négativement échangent des cations

 Résines échangeurs de

Anions Cations
Echangeur faible ---> base faible, à pH basique Echangeur faible ---> acide faible, à pH<4,5 perd
perd la charge. 2 <pH < 10 la charge (acquière H+).

Echangeur fort ---> base forte, la charge est Echangeur fort ---> acide fort, à pH<2 perd la
maintenue pour des pH entre 2 et 14. charge (acquière H+).
 Chromatographie par échange d’ions

Dans le processus d’échange d’ions, les ions liés

électrostatiquement à la matrice chargé (positivement ou
négativement) sont remplacés de manière réversible par des ions
en solutions (protéines chargées). Cette phase est l’adsorption.
adsorption.

Les matrices échangeurs d’

d’anions fixent les protéines
chargées négativement.

Les matrices échangeurs de cations fixent les protéines

chargées positivement.

Pendant la phase d’adsorption les diverses protéines se lieront à la

matrice avec affinité électrostatique différente qui dépend de leur
charge.

L’élution ou désorption sélective se fait en variant la force ionique ou

le pH du tampon d’élution (pour changer la charge de la protéine).
 Chromatographie par échange d’ions
•Enchaînement d’aa liés par des liaisons peptidiques.

Le pKa des groupes ionisables des protéines varie de 4 à 12 (ex. pKa Asp= 4, pKa Lys=10,5)

Caractère amphotère

•La charge nette d’une protéine dépend du pH:

pH isoélectrique = pH auquel la charge nette est zéro

+
pH>pHi charge nette négative, liaison ech. anionique

Charge
pHi
pH<pHi charge nette positive, liaison ech. cationique
4 5 6 7 8 9 10 11 12

•Les pH extrêmes dénaturent les protéines donc il faut

tenir compte de la stabilité de la protéine pour choisir
- --
le pH de travail et donc le type d'échangeur à utiliser. ++
-+ + -- + -+-
•Distribution de charge (existence de domaines chargés).

•Nombre de charge : peu chargées---> faiblement retenues---> élution à faible concentration de sels

très chargées---> fortement retenues---> élution à forte concentration de sels

 Echangeur d’anions
CH2-CH3
DEAE (diéthylaminoéthyl) cellulose -O-CH2-CH2-+NH Cl-
CH2-CH3
_
+
+ _ _+ Cl-
_ + _ +
+
Cl- Cl-
+
_ Na+ Cl- +_ _ Cl- +
+ _ + _ + +
_ -
+_ _+ +
+
>>Na+ Cl- Cl- + Cl -
_ + Cl
_
+ +_ _+ +
+ _ _ +_ _+
+ _
+ _ +
_ Na
+ +

Na+ Na+ Na+ Na_+

Na_+ Na+ _ _ 1M _ _
_ _ _ _
Na+ _
Na+ Na+ Na+ +
_ _ Na
DO280nm

Na+ Na+
NaCl
+ _
_ Na Na+

Fractions (ml)
Séparation des protéines des acides nucléiques sur échangeur anionique

DO260nm
DO
2M
DO280nm

NaCl
1M

Fractions (ml)
Protéines basiques Protéines privées d’acides nucléiques
non retenues A 280nm
= 1,8
A 260nm
 Echangeur de cations
CM (carboxyméthyl) cellulose -CH2-COO- Na+
P (phospho) cellulose -PO3++
-+
- + +- + Elution avec un gradient linéaire de concentration croissante de NaCl
-
-+
-+ -
DO260nm

DO280nm Cl-
DO

1M
+
+ Cl- Cl-
Cl- +
Cl- + +

NaCl
+
Cl-

Fractions (ml)
Acides nucléiques et protéines
acides non retenus
 Chromatographie par interaction hydrophobe
L’hydrophobicité est la capacité des zones non polaires d’une ou de plusieurs molécules à s’associer
entre elles pour minimiser l’exposition de la zone hydrophobe au solvant polaire.

Les résines portant des groupements hydrophobiques (cycliques ou aliphatiques) permettent de

séparer les protéines en fonction de leur hydrophobicité.

Une colonne de chromatographie par interaction hydrophobe est chargée à haute force ionique et
éluée avec un gradient décroissant de sels.

Domaine
hydrophobe

chaîne C

DO280nm
Elution gradient
decroissant NaCl
Augmentation de
l’hydrophilicité des ml
protéines ---> élution
 Chromatographie en phase inverse
Cette technique comme la chromatographie par interaction hydrophobe sépare les molécules en
fonction de leur hydrophobicité.

Une colonne de chromatographie en phase inverse est chargée à haute force ionique et éluée avec
un gradient de solvant apolaire (hydrophobicité croissante---> dénaturant).

Méthode employé pour purifier les peptides et les petites molécules biologiques.

Domaine
hydrophobe

chaîne C 50%

DO280nm
Elution gradient
0-50% acetonitrile
0%
ml
 Chromatographie d’affinité

La chromatographie d
affinité se base sur le principe de l
adsorption spécifique: interaction entre une
protéine bien déterminée à purifier et son ligand spécifique fixé sur une matrice chromatographique.

Adsorbants à spectre large: spécifiques d
une

classe de protéines.

Adsorbants spécifiques: matrice sur laquelle on fixe

de manière covalente le ligand spécifique de la
protéine à purifier

substrat spécifique (élution avec

excès de substrat ou analogue
structural)

anticorps spécifiques (dénaturation

pH 3 ou pH 12)

protéine de fusion
 Chromatographie d’affinité

Résine Affinité pour...

Calmoduline sepharose 4B ATPases

5' AMP sepharose 4B
DNA-agarose
Colonnes d'héparine
Poly(U) sepharose
Arginine sepharose 4B
Lysine sepharose 4B
Cibacron blue F3G-A
ConA Sepharose 4B
Wheat germ Lectin Sepharose
kinases dépendantes de l'ATP
ADN polymérases, protéines liant l'ADN
Lipases, protéines liant l'ADN
Transcriptase réverse, ARNm
Sérine protéases
ARNr
enzymes nécéssitant des nucléotides
glycoprotéines /
-D-mannose,
-D-glucose et des sucres
similaires
glycoprotéines contenant du N-acetyl--D-glucosmine

Résine Groupe à coupler

CNBr-activated Sepharose 4B -NH2

EAH Sepharose 4B -COOH
Activated thiol sepharose 4B -SH
rProtein A sepharose Partie Fab des anticorps
 Chromatographie d’affinité pour le métal (IMAC)
Immobilisation, sur une résine, d'un atome métallique comme le nickel ou le cobalt.

Résine IMAC (immobilized metal affinity chromatographie) populaire (nickel- nitriloacetic acid ou
nickel-NTA) utilise un ion de nickel comme site actif.

L'EDTA et l'EGTA chélatent le nickel ---> diminution de la capacité de liaison de la résine.

Les agents réducteurs ---> réduction des histidines--->diminution de la capacité de liaison de la
protéine.

Elution : baisse de pH < 6

Gradient d
imidazole (compétiteur de l'histidine pour le nickel)

Etiquette multi-histidines est très petite.

Peut être cloné facilement.
Reconnue par des anticorps spécifiques disponibles commercialement.
Modification mineure facilitant la purification d'une protéine recombinante.
Imidazole
Chromatographie par filtration sur gel
 Chromatographie par filtration sur gel
La chromatographie par exclusion ou tamisage moléculaire est une technique qui permet de séparer
les molécules en fonction de leur taille et de leur forme (encombrement).

Matrice = granules de gel poreux; le diamètre des pores est contrôlé et fluctue autour d’une valeur
moyenne qui est caractéristique de chaque type de gel.

Dépôt d’un mélange de molécules:

1. molécules de taille > O des pores se

déplacent dans la phase extra-granulaire
(exclues = 1éres éluées)

2. molécules de taille < O des pores rentrent

dans la phase intrgranulaire (incluses =
dernières éluées)

3. molécules de taille comprise dans les limites

du O des pores sont partiellement incluses
(éluées dans l’ordre de taille décroissante)
 Chromatographie par filtration sur gel
Nom de la résine Capacité de fractionnement (en Da)

type dextran
Sephadex G-10 700
Sephadex G-25 1 000- 5 000
Sephadex G-75 3 000- 70 00
Sephadex G-200 5 000- 800 000

type polyacrylamide
Bio-gel P2 200- 2 000
Bio-gel P6 1 000- 6 000
Bio-gel P-150 15 000- 150 000
Bio-gel P-300 60 000- 400 000

type agarose
Sepharose 2B 2 000 000- 25 000 000
Sepharose 4B 300 000- 3 000 000
Bio-gel A-0,5M 30 000- 500 000
Bio-gel A-15M 30 000- 15 000 00
Bio-gel A-150M 5 000 000- 150 000 000

Pour une bonne séparation il faut une haute concentration et un faible volume de matériel de départ.

La forme d'une colonne de filtration devrait être étroite et longue pour une meilleure séparation.

La filtration sur gel se fait avec un tampon dont la nature ne change pas pendant la séparation. Ceci permet de
garder les complexes macromoléculaires.
 Chromatographie par filtration sur gel
Pour chaque colonne de gel filtration on peut définir les volumes suivants:

VT= volumes totale

V0= volume vide (volume de solvant entre les billes, déterminé avec le bleu dextrane)
Vx= VT-V0= volume de la matrice (gel+ solvant)
Ve= volume d’élution protéine
Vi= VT-V0-Vgel= volume du solvant dans les pores de la matrice disponible
à la diffusion des petites molécules

Coefficient di distribution (Kd

(Kd)) entre la phase mobile et la phase
stationnaire est spécifique de chaque molécule et de chaque
colonne. Kd représente la fraction de la phase stationnaire
disponible à la diffusion d’une déterminé molécule.

Kd = (Ve –V0) / (VT-V0-Vgel)

Cependant, pratiquement on définis un coefficient d’

d’avancement VT V0 VT-V0
Kav qui peut être déterminé facilement.

Kav = (Ve –V0) / (VT – V0)

 Chromatographie par filtration sur gel
Ve= f(encombrement de la molécules)
Molécules de même forme (masse/encombrement = K) ---> Ve= f(masse)
Log PM

DO
In M A
fra terv I N E

DO280nm
cti alle D
on E
né de F
es tail R A
le C T
da I O
ns N
leq N E
ue M E
l le N T
ss ml
ub V0 Vi
sta
nc Ve
es
so
nt

Ve minimale des Ve optimale des

molécules exclues molécules incluses Ve
(V0) (Vi)
Limite supérieure > KDa > Limite inférieure
 Chromatographie par filtration sur gel
Il existe une relation linéaire entre le volume d’élution (et le Kav) et le logarithme de la masse
moléculaire.
Log PM

DO
In M A Log PM = f(Kav)
fra terv I N E
cti alle D
on
né de
E
F Kav = (Ve –V0) / (VT – V0)
es tail R A
le C T
da I O
ns N
leq N E
ue M E
l le N T
ss
ub
sta
nc
es
so
nt

Kav = 0 Kav = 0,95 Kav

Molécules totalement Molécules totalement
exclues incluses
 Chromatographie par filtration sur gel
La chromatographie par filtration sur gel peut être utilisée pour déterminer la structure
oligomérique d’une protéine (composition en sous-unités):

masse de la protéine native ---> dénaturation---> masse des sous-unités

Log PM = f(Kav)

La dénaturation permet de dissocier les chaînes polypeptidiques---> abolition des interactions

stabilisant les structures 2re, 3re et 4re.

- disruption des liaison non covalentes (interactions ioniques, ponts hydrogène,

interactions hydrophobes)

- disruption des liaison covalentes (ponts disulfures)

Urée (8M) rompt les liaisons H et hydrophobes Guanidine (6-12M) liaison H et ioniques

NH2----- NH2-----
----O=C -----+H2N=C
NH2----- NH2-----

Le dodécylsulfate de sodium (SDS) rompt les interaction hydrophobes et ioniques.

Le
-mercaptoéthanol et le ditiothréitol (DTT) réduisent les ponts disulfures.