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Bruno Dassy (bruno.dassy@upmc.fr)


Section 64 Biochimie
UFR 927 Sciences de la Vie

MICROBIOLOGIE GÉNÉRALE
PLAN
Présentation et principales caractéristiques des microorganismes
• Objet de la microbiologie et historique
• La microbiologie dans l'étude de l'évolution et des origines de la vie
• Remaniements de la classification et domaines Bacteria/Eucarya/Archaea
• Présentation des Archaea : phylogénie, conditions extrêmes et métabolismes particuliers

Culture et croissance des microorganismes


• Besoins nutritionnels et métabolisme primaire des microorganismes : aliments essentiels
ou nutriments, facteurs de croissance, types trophiques
• Types de milieux de culture : liquides/solides, synthétiques/empiriques, sélectifs
• Facteurs physico-chimiques et conditions optimales de croissance
• Méthodes de mesure de la croissance : DO, numération directe ou indirecte, poids sec
• Croissance : courbe, phases, paramètres (taux de croissance, temps de génération)
• Diauxie
• Influences de la concentration en substrat sur la croissance : facteur limitant, relation de
Monod
• Cellules viables mais non cultivables (VBNC)
• Croissance endogène ou cryptique
• Principales régulations chez les bactéries
• Pratique de la culture de microorganismes : stérilité, sécurité (voir TP), conservation

Le métabolisme énergétique des microorganismes


• Sources et conservation de l'énergie dans le monde vivant
• Chimiotrophie et oxydo-réduction : rappels de bioénergétique
- Fermentations : définitions et exemples
- Types respiratoires et relation avec l'oxygène moléculaire
- Respirations aérobies et anaérobies : exemples de la bactérie Escherichia coli et de
l'Archaea Pyrococcus furiosus
- Chimio-lithotrophie : exemple de l'Archaea Acidianus ambivalens
• Phototrophie : photosynthèse, pompe ionique (bactériorhodopsine)

Diversité et classification des microorganismes


• Taxonomie (ou taxinomie) : classification, nomenclature et identification
• Utilisation de la région ARNr 16-18S (ssu rRNA) pour la classification
• Taxonomie numérique et construction d'un dendrogramme
• Coloration de Gram et structure de la paroi bactérienne
• Autres structures de surface distinctes de la paroi
• Principaux caractères utilisés pour l'identification et la classification des
microorganismes : morphologiques, biochimiques, génétiques

Les microorganismes dans leur environnement


L’ADN mobile chez les microrganismes
• Les phages et les bactéries lysogènes
• Les plasmides et leur capacité de conjugaison voir résistance aux antibiotiques, les
transposons outils de mutagénèse
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Ecologie microbienne
• Les microorganismes dans les cycles géochimiques (exemple le cycle de l’azote).
• La fixation de l’azote et le fonctionnement de la nitrogénase
• Interactions avec d’autres organismes symbiose, mutualisme
Symbiose pour la fixation de l’azote: rhizobium et la formation d’un nodule chez les
légumineuses Dialogue moléculaire,
Syntrophie: Eubactéries et archaebactéries dans la dégradation de la cellulose dans le rumen
Microorganismes agents de maladies chez l’homme
• Différents types de maladies infectieuses et les infections nocosomiales
• Exemple de Bio films, la carie dentaire
• Facteurs de virulence des microrganismes : invasion, colonisation échapper aux
défenses de l’hôte
exemple (le cholera) notions d’ilots de pathogénicité, rôle des phages, mode d’action de la toxine
cholérique.
Chimiothérapie anti-bactérienne
• Les familles/ les cibles
• La résistance aux antibiotiques
• Production d’antibiotiques

Microorganismes eucaryotes
Présentation, quelques définitions
Exemple de parasite Plasmodium
Le cycle du paludisme
Comment Plasmodium échappe au système immunitaire
Quelles stratégies de lutte anti-malaria (médicaments, vaccins..)
Les levures taxonomie, cycle, diversité, exemple Candida albicans (protéases, dimorphisme)
Phytophthora infestans et le mildiou de la pomme de terre
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PRÉSENTATION ET PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES


DES MICROORGANISMES

INTRODUCTION

Définition et objet de la microbiologie


• C'est l'étude des organismes trop petits pour être vus à l'œil nu, c'est-à-dire des
microorganismes ou microbes, du grec mikros "petit". Cette étude implique des techniques
spécifiques comme par exemple la microscopie et la mise en culture.
• Place centrale de la microbiologie en biologie : Biochimie Génétique
↕ ↕
Ecologie ↔ M i c robiologie ↔
Immunologie

Evolution et origines de la vie

Repères historiques et découvertes marquantes


• Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), naturaliste hollandais, en fabricant ses propres
microscopes grossissant 100 à 300 fois a pu observer pour la première fois des
protozoaires, des levures, et même des bactéries en 1670. Ces minuscules êtres vivants
nouvellement découverts ont été nommés "animalcules". Il a aussi observé des hématies et des
spermatozoïdes.
• Robert Hooke (1635-1703), astronome, mathématicien et naturaliste anglais, après
avoir perfectionné la conception et l'utilisation du microscope, observe pour la première
fois en 1663 une moisissure du genre Mucor , et confirme en 1678 les observations de
bactéries faites par van Leeuwenhoek, avec qui il entretenait une correspondance régulière.
• Lazzaro Spallanzani (1729-1799), grâce à l'emploi de flacons chauffés et scellés, porte
en 1785 un rude coup à la théorie de la génération spontannée.
• Edward Jenner (1749-1823), médecin et naturaliste anglais, tente son premier essai de
"vaccination" contre la variole en 1796.
• Theodor Schwann (1810-1882), naturaliste allemand, élabore en 1839 sa théorie
cellulaire.
• John Snow (1813-1858), médecin anglais, démontre par une enquête épidémiologique
exemplaire à la suite de l'épidémie de choléra à Londres en 1854 que la transmission de l a
maladie se fait par l'eau contaminée de certaines fontaines.
• Ignác Semmelweis (1818-1865), médecin hongrois, est un des premiers à mettre en
évidence le caractère infectieux de la fièvre puerpérale qui frappait durement les
parturientes à l'époque, et à préconiser non sans mal les premières règles d'asepsie.
• Louis Pasteur (1822-1895) est avec Robert Koch un des fondateurs de la microbiologie
moderne par l'exploration de domaines variés :
- 1857 : étude de la fermentation du sucre en alcool par la levure, et mise en évidence de
l'effet métabolique qui porte son nom.
- 1861 : confirmation magistrale des conclusions de Spallanzani sur l'inexistence de l a
génération spontannée, grâce à l'emploi de flacons à "col de cygne" qui laissent passer l ' a i r
mais pas les microrganismes.
- 1865 : mise en évidence du rôle des bactéries acétogènes dans l'obtention du vinaigre.
- 1866 : étude des maladies du vin et observation des microorganismes qui leurs sont
associés.
- 1876 : étude de l'élaboration de la bière auprès de brasseurs alsaciens, et invention d'un
procédé de conservation : la pasteurisation.
- 1877 : observation de l'action bactériostatique de certains microorganismes sur d'autres.
- 1878 : confirmation des observations de Semmelweis et préconisation de l'asepsie en
médecine.
- 1881 : vaccins contre le charbon et le "choléra" des poules.
- 1885 : vaccin contre la rage. En l'honneur de Jenner, Pasteur propose d'étendre le terme
"vaccination" à toutes les démarches d'immunisation en vue de protéger contre une maladie.
- 1888 : création de l'Institut Pasteur à Paris.
• Robert Koch (1841-1910) est le rival allemand de Pasteur :
- 1877 : le charbon est dû à Bacillus anthracis.
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- 1880 : invention du milieu de culture solide par utilisation de la gélatine.
- 1882 : découverte et culture du bacille de la tuberculose.
- 1883 : confirmation de l'identification du bacille responsable du choléra, bacille
initialement décrit par le naturaliste italien Filippo Pacini en 1854.
- 1884 : énonciation des postulats.
- 1905 : obtention du prix Nobel de médecine.
• Alphonse Laveran (1845-1922), médecin militaire français, découvre en 1880 le
protozoaire parasite responsable du paludisme ou malaria, et obtient le prix Nobel de
médecine en 1907 pour avoir posé les bases de la parasitologie.
• Walter Hesse (1846-1911), un des assistants de Koch, remplace en 1881 la gélatine par
la gélose. Par la suite il applique la méthode de pasteurisation au lait.
• Hans Gram (1851-1928), microbiologiste danois, met au point en 1884 la célèbre
coloration qui porte son nom.
• Richard Petri (1852-1921), un autre assistant de Koch, invente en 1887 la célèbre
boîte ronde de culture qui porte son nom.
• Joseph Lister (1827-1912), chirurgien anglais, met en place des règles d'aseptie pour
l'ensemble de la chirurgie en se basant sur les travaux de Pasteur, de Koch, et de
Semmelweis enfin reconnu.
• Martinus Beijerinck (1851-1931), microbiologiste hollandais, découvre en 1898 le
premier virus, celui de la mosaïque du tabac.
• Félix d'Hérelle (1875-1949), microbiologiste canadien, après avoir observé des plages
de lyse sur une culture bactérienne, découvre et propose le mot bactériophage en 1917.
• Albert Calmette (1863-1933) et Camille Guérin (1872-1961), microbiologistes
français, développent en 1921 un vaccin contre la tuberculose, qui existe toujours sous le
nom de BCG (Bacille de Calmette et Guérin).
• Frederick Griffith (1879-1941), microbiologiste anglais, découvre la transformation
génétique et la compétence bactérienne chez le pneumocoque en 1928.
• Alexander Fleming (1881-1955, sir ), médecin écossais, découvre le lysozyme en 1921,
la pénicilline en 1929, et obtient le prix Nobel de médecine en 1945.
• Jacques Monod (1910-1976) est un des grands microbiologistes français du XXe siècle :
- 1940 : étude la croissance bactérienne de E. coli et découverte de la diauxie.
- 1961 : découverte de l'opéron lactose et postulat de l'existence de l'ARNm, avec François
Jacob et André Lwoff.
- 1965 : proposition d'un modèle d'enzyme allostérique, avec Jeffries Wyman et Jean-
Pierre Changeux.
- 1965 : obtention du prix Nobel de médecine.
- 1970 : parution du livre le hasard et la nécessité.
- 1971-1976 : direction de l'Institut Pasteur de Paris.
• Chronologie des premiers génomes (de "gène" et "chromosome") entièrement séquencés :
- Bactériophage : ΦX174 (5386 pb, 11 gènes) en 1977.
- Virus eucaryote : Epstein-Barr (172 kpb, 80 gènes) en 1984.
- Bactérie : Haemophilus influenzae (1,83 Mpb, 1900 gènes) en 1995.
- Eucaryote : levure Saccharomyces cerevisiae (17,4 Mpb, 6600 gènes) en 1996.
- Et pour comparaison : Homo sapiens (3,2 Gpb, 22000 gènes) en 2006.

La microbiologie et l'étude de l'évolution et des origines de la vie


• Les plus anciens organismes vivants étant unicellulaires, leur étude est du ressort de l a
microbiologie. Des hypothèses sur leurs aspects et leurs propriétés peuvent être émises à
partir de données phylogénétiques comparées tirées de l'ensemble des microroganismes
actuels, ainsi que de l'observation de microorganismes vivants dans des niches écologiques
particulières dont les caractéristiques se rapprochent de celles que l'on suppose pour les
différentes époques passées de la Terre.
• Tentative de définition de la vie : système complexe compartimenté et hautement organisé
(à faible niveau d'entropie), qui échange de la matière avec son environnement, assure sa
maintenance par renouvellement de ses composants, utilise l'énergie de son environnement
en état de déséquilibre thermodynamique, et persiste par auto-réplication et transfert
d'information.
• Autres définitions utiles :
- Exobiologie : recherche et étude de la vie en dehors de la Terre.
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- Astrobiologie : étude de l'origine, de la répartition et de l'évolution de la vie dans l'univers,
y compris la Terre. L'astrobiologie inclut donc l'exobiologie.
• Stanley Miller (1930-2007), chimiste américain, montre avec Harold Urey en 1953
qu'un mélange gazeux d'ammoniac, de méthane, d'hydrogène et de vapeur d'eau soumis à des
décharges électriques peut générer des acides aminés.
• Conditions nécessaires (mais peut-être pas suffisantes) à la vie :
- Facteurs physiques dont la grandeur doit se situer dans une certaine plage : température,
pression, rayonnement, gravité, …
- Présence d'une source d'énergie : chimique (oxydo-réduction), lumineuse, ou autre
(gradient thermique ?).
- Présence d'eau liquide : remplacée par d'autres solvants liquides voire même gazeux ?
- Présence de carbone : remplacé par le silicium ?
- Présence de phosphore : remplacé par l'arsenic ?
- Autres conditions ? (Non, surtout pas le "dessein intelligent" qui n'est pas une théorie
scientifique !!!)
• Trois autres planètes de notre système solaire sont actuellement candidates pour abriter
éventuellement la vie : Mars, Vénus et Titan (le plus gros des satellites de Saturne). Malgré
les résultats surprenants mais négatifs obtenus par les deux sondes Viking sur Mars en
1976, le débat reste ouvert et les projets d'exploration sont toujours d'actualité.

DISTINCTION DES TROIS DOMAINES : BACTERIA, EUCARYA, ARCHAEA

Remaniements importants de la classification des êtres vivants


• A la fin des années 70, Carl Woese a proposé une nouvelle classification des être vivants
basée sur la comparaison des séquences de l'ensemble de la région codant pour les ARNr 1 6 -
18S (voir plus loin), qui a conduit à éclater l'ancien règne des bactéries pour établir un
troisième domaine, celui des Archaea, distinct à la fois des domaines Bacteria et Eucarya.
Cette classification a été depuis confirmée par d'autres critères, et il est maintenant admis
qu'aucun des domaines ne descend d'un des deux autres. Pour cette raison, il vaut mieux
abandonner l'emploi des termes "eubactérie" et "archébactérie" qui peuvent laisser croire à
tort que les archées sont les ancêtres des bactéries.
• Les Bacteria et les Archaea sont des procaryotes ou cellules sans noyau ni organites, ce qui
correspond à l'ancien règne des bactéries. Le terme "procaryote" ne correspond plus à une
hiérarchie de classification (taxon) et doit maintenant être utilisé avec précaution, car d'une
part il repose sur une définition négative et d'autre part il laisse entendre par sa racine que
les procaryotes auraient précédé les eucaryotes, ce qui est actuellement discuté. Les Eucarya
regroupent les 4 anciens règnes des animaux, plantes, champignons et protistes.
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Tableau comparatif des trois domaines

Domaine Bacteria Archaea Eucarya


Caractéristique (bactéries) (archées) (eucaryotes)

Taille moyenne 0,2 à 15 µm 0,2 à 15 µm 10 à 100 µm


Présence d'organites Non Non Oui
Noyau entouré d'une membrane Non Non Oui
Lipides membranaires :
- Chaîne carbonée liée au glycérol Acide gras Alcool isoprénoïde Acide gras linéaire,
et type de liaison linéaire, ester ramifié, éther ester
- Présence de stérol Oui Non Oui
Paroi : - Présence Oui Oui Oui
- Composant principal Peptidoglycane Très variable, sans Pectocellulose (plantes)
(muréine) peptidoglycane ou chitine (champignons)
Croissance à température > 90°C Non Oui Non
Formation de spore Oui Non Oui
Photosynthèse Oui Non Oui
Chimio-lithotrophie Oui Oui Non
Méthanogénie Non Oui Non
Fixation de l'azote atmosphérique Oui Oui Non
ATP synthétases/ATPases F1F0 A 1A 0 F1F0, V1V0
Pouvoir pathogène Oui Rare et indirect Oui
Organismes pluricellulaires Non Non Oui
Présence de virus (10 à 400 nm) Bactériophages Oui Oui
Présence de plasmides Oui Oui Rare
Présence de transposons Oui Oui Oui
Présence d'opérons Oui Oui Non
Chromosomes : - Ploïdie Haploïde Haploïde Le plus souvent diploïde
- Nombre 1 (2) 1 (2) Plusieurs
- Forme Circulaire Circulaire Linéaire
- Télomères Non Non Oui
- Histones Non Oui Oui
- Origine(s) de réplication Unique Multiples Multiples
ARN polymérase ADN dépendante
: 1 2 3
- Nombre d'enzymes 5 (α2ββ'σ) Jusqu'à 13 Au moins 33
- Sous-unités Sensible Résistante Résistante
- Rifampicine
ARNm : - Epissage Non Parfois Très souvent
- Polycistronique Oui Oui Non
- Complexe exosome Non Oui Oui
Initiation de la traduction N-formyl-Met Met Met
Ribosome : - Taille 70 S 70 S 80 S
- Chloramphénicol Sensible Résistant Résistant
- Toxine diphtérique Résistant Sensible Sensible

PRÉSENTATION DES ARCHAEA

Phylogénie des Archaea


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• D'après l'arbre phylogénétique basé sur les séquences de la région codant pour les ARNr
16-18S, les Archaea se seraient séparées des Eucarya après une première séparation d'avec
les Bacteria à partir de LUCA ( last universal common ancestor) qui est dit progénote c'est-
à-dire ni procaryote ni eucaryote, mais la position de la racine reste discutée et une autre
hypothèse propose que les Eucarya soient apparus après l'ensemble des procaryotes à partir
d'une ou plusieurs syntrophies ou endosymbioses Bacteria/Archaea (cyanobactérie ➝
chloroplaste ; α-Proteobacteria sulfure-dépendante ➝ mitochondrie ; Archaea ➝ noyau). Les
Archaea se répartissent actuellement dans 4 (?) phyla (ou règnes ?) distincts, selon l'arbre
phylogénique simplifié et provisoire suivant (* indique la présence d'hyperthermophiles) :

Crenarchaeota Archaea
Sulfolobales*
Desulfurococcales* Euryarchaeota
Caldisphaerales*
Thermoplasmatales
Eucarya Archaeoglobales* Halobacteriales
Thermoproteales* Methanosarcinales
Thermococcales*
Bacteria Methanocellales
Methanomicrobiales
Korarchaeota Methanococcales*

Methanobacteriales*
LACA* ? Methanopyrales*
?
Nanoarchaeota

LUCA ?

- Le phylum des Crenarcheota comprend 4 ordres : Caldisphaerales, Desulfurococcales,


Sulfolobales et Thermoproteales. La plupart des Archaea cultivables de ce phylum ont un
métabolisme énergétique lié au soufre.
- Le phylum des Euryarchaeota comprend les méthanogènes (voir plus loin), les halophiles
extrêmes (Halobacteriales), les réducteurs de sulfate (Archaeoglobales) et des thermophiles
(Thermococcales et Thermoplasmatales).
- Le phylum des Korarchaeota est surtout connu par métagénomique, car ce n'est que tout
récemment qu'un de ses membres a pu être enfin cultivé.
- Le phylum des Nanoarchaeota est le dernier découvert. On n'en connaît pour l'instant que
très peu de représentants, qui pourraient être apparentés aux Euryarchaeota.
• Si certaines Archaea, dont les premières découvertes, sont extrêmophiles, les nombreux
échantillonnages effectués depuis et étudiés par métagénomique (techniques ne faisant pas
appel à la mise en culture, voir plus loin) indiquent que les Archaea sont en fait présentes
partout sur la planète au même titre que les bactéries. Cependant, LACA ( last archaeal
common ancestor) est supposé hyperthermophile du fait de l'enracinement profond de toutes
les Archaea hyperthermophiles, et l'émergence de mésophiles aurait alors été plus tardive.
• Les Archaea cultivables ont été initialement divisées en 5 catégories physiologiques et
métaboliques : thermophiles, halophiles, acidophiles, méthanogènes et nitrifiantes. Mais ce
classement est sommaire et incomplet, car certaines de ces catégories se recoupent et
d'autres types métaboliques ont été découverts depuis.

Archaea extrêmophiles et adaptation au stress énergétique


Une cellule peut être confrontée au stress énergétique dans 2 types de situation :
- Du fait des conditions environnementales défavorables, notamment lorsqu'elles sont
extrêmes. Ces conditions éliminent la plupart des microorganismes, mais les archées
thermophiles, acidophiles et halophiles y sont particulièrement bien adaptées ce qui leur
confère un avantage sélectif sur les bactéries. Ces archées extrêmophiles sont en effet
capables de contrebalancer l'augmentation du niveau d'énergie de maintenance (voir plus
loin) induite par des conditions physico-chimiques extrêmes. Par exemple :
8

110

Température optimale de croissance (°C)


100
ARCHAEA

90

80

70
ARCHAEA + BACTERIA
60

0 1 2 3 4 5 6 7
pH minimal de croissance

- Du fait que l'énergie disponible peut être faible en conditions environnementales plus
modérées, ce qui est aussi une situation génératrice de stress. Les archées peuvent alors
occuper des niches écologiques particulières, grâce à des voies métaboliques qui leurs sont
propres comme par exemple la méthanogénie ou certaines syntrophies (voir plus loin).
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CULTURE ET CROISSANCE DES MICROORGANISMES

BESOINS NUTRITIONNELS ET MÉTABOLISME PRIMAIRE DES MICROORGANISMES

Aliments essentiels ou nutriments


Toute cellule vivante requiert les substrats indispensables lui permettant de synthétiser
l'ensemble des molécules qui composent sa biomasse à partir de son métabolisme primaire
(voir cours de biochimie). Ce sont les aliments essentiels ou nutriments, qui doivent
obligatoirement être présents dans le milieu de culture :

Elément chimique Exemples de substrats utilisés comme sources de l'élément


(% du poids sec) Minéraux Organiques
C (≅50) CO2, (CO) Glucides, lipides, acides aminés, ...
O (≅20) H2O, CO2, (O2) La plupart
N (≅15) NH , NO , NO , N2, ...
4
+
3

2

Acides aminés, bases azotées, amines,
...
H (≅10) H2O, H , (H2)
+
La plupart
P (≅3) Phosphates Nucléotides, composés phosphorylés, ...
S (≅1) SO , SO , H2S, ...
4
2–
3
2–
Cys, Met, thiols, sulfonates, sulfides, ...
Sels (≤1) Na , K , Mg , Ca , Cl , ...
+ + 2+ 2+ –

Métaux ou oligo- Fe , Zn
2+ 2+
Mn , Cu , Co ,
2+ 2+ 2+
Hème pour le fer, ...
éléments (<0,1) Ni2+, ...

- C, O, N, H et P sont des macro-nutriments, car ils constituent la plus grande partie de l a


biomasse.
- L'apport d'oxygène et d'hydrogène en tant qu'éléments de la biomasse ne nécessite pas de
substrats spécifiques : soit ils sont associés aux sources de C et de N, soit ils proviennent
d'échanges métaboliques d'eau (qui est aussi le solvant) ou de protons avec le milieu.
- S et les principaux sels sont des micro-nutriments car ils sont nécessaires en moins
grandes quantités (de 0,1 à 1%).
- La présence de sels est aussi nécessaire pour maintenir la pression osmotique du milieu.
- Les oligo-élements ne sont nécessaires qu'à l'état de traces, et comme ils sont souvent
présents en tant que contaminants d'autres composants, il n'est pas toujours utile d'en
ajouter.

Facteurs de croissance
• Un facteur de croissance est un constituant indispensable de la biomasse que la cellule est
incapable de synthétiser par elle-même, et qu'elle doit donc se procurer directement comme
substrat : acide aminé, vitamine ou coenzyme, base azotée, lipide, ... Un facteur de
croissance, pour lequel la cellule est dite auxotrophe (voir le tableau des types trophiques),
ne doit surtout pas être confondu avec un aliment essentiel !
• Cette situation peut être soit naturelle et c'est alors une des caractéristiques du
microorganisme éventuellement utilisée en taxonomie, soit provoquée par exemple par une
mutation touchant la voie de biosynthèse du constituant pour lequel le microorganisme
devient alors auxotrophe.
• Il existe aussi des auxotrophies conditionnelles, c'est-à-dire dépendantes des conditions de
culture. Par exemple chez la levure, l'oxygène est nécessaire en tant que co-substrat pour l a
synthèse des stérols et de l'acide nicotinique (vitamine PP, précurseur du coenzyme NAD+)
du fait de la présence d'oxygénases dans les voies correspondantes, ce qui implique que ces
composés doivent être ajoutés au milieu seulement pour une culture anaérobie.

Types trophiques ou nutritionnels


• Pour synthétiser sa propre matière, une cellule vivante nécessite des aliments essentiels
et d'éventuels facteurs de croissance, du pouvoir réducteur (donneur d'électrons), et de
l'énergie (voir plus loin). L'ensemble de ces besoins permet de définir des type trophiques
(du grec trophê "nourrir") généraux :
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Besoin Type trophique
Source d'énergie primaire lumineuse Phototrophe
chimique Chimiotrophe
Substrat énergétique oxydé minéral Lithotrophe
(donneur d'électrons) organique Organotrophe
Source de carbone minérale : CO2 Autotrophe
organique Hétérotrophe
Facteur de croissance indispensable Auxotrophe
inutile Prototrophe
Croissance en présence de forte Copiotrophe
concentration en substrat faible Oligotrophe

• Il existe de plus des types trophiques correspondant à des besoins particuliers :


hydrogénotrophe, méthanotrophe, diazotrophe (voir plus loin), méthylotrophe, ...

Types de milieux de culture selon leur composition


• Un milieu complexe ou empirique est un milieu préparé à partir d'extraits de matières
organiques et dont la composition exacte n'est par conséquent pas connue. Par exemple :
hydrolysat de protéine, extraits de levure, de viande, de soja, de lait, d'œuf, de sang, etc. Ce
type de milieu est parfois dit "riche" car il contient suffisamment de composés pour
permettre la croissance de la plupart des microorganismes courants. Il a l'avantage d'être
facile à préparer.
• Un milieu synthétique ou chimiquement défini est un milieu dont la composition
exacte est entièrement connue. Ce milieu est dit "minimum" lorsqu'il ne contient que les
éléments strictement indispensables à la cellule, c'est-à-dire les nutriments et les facteurs
de croissance éventuels. Ce type de milieu est utile pour étudier précisément les besoins
nutritionnels du microorganisme, son métabolisme et sa physiologie.
• Un milieu liquide est rendu solide par addition d'agar, composé appartenant à une famille de
polysaccharides gélifiants extraits de certaines algues rouges (agarose, guar, etc.) et aussi
utilisés comme additifs alimentaires (E406). Les milieux solides sont très utiles pour
effectuer des isolements, ce qui permet de trier un mélange de microorganismes différents
(voir TP).
• Un milieu peut être rendu "sélectif" par addition d'un ou plusieurs inhibiteurs auxquels le
microorganisme que l'on souhaite isoler est insensible ou résistant.

Paramètres physico-chimiques et conditions optimales de croissance


• Les conditions optimales de croissance dépendent de 4 principaux facteurs physico-
chimiques :

Conditions optimales de croissance Catégorie


Température < 20°C Psychrophile ou cryophile
entre 20 et 40°C Mésophile
entre 40 et 80°C Thermophile
> 80°C Hyperthermophile
pH < 6 Acidophile
entre 6 et 8 Neutrophile ou neutralophile
>8 Alcalophile ou basophile
Salinité > 2,8 M Halophile
Dessiccation Xérophile
Pression > 400 bars Barophile ou piézophile

• Parmi les hyperthermophiles capables de vivre au dessus de 90°C, on ne rencontre pour


l'instant que des archées. Les records actuels sont détenus par des archées cultivées en
laboratoire : 113°C pour Pyrolobus fumarii , et plus récemment 121°C pour une archée en
forme de coque pas encore identifiée. La température la plus élévée pouvant être supportée
par des microorganismes est estimée à 140-150°C, mais cela reste à vérifier.
• La méthode courante pour éviter les trop grandes variations de pH du milieu pendant l a
culture est de le tamponner, le plus souvent avec des sels de phosphate pour les
microorganismes neutrophiles.
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• Rappels : l'isotonicité est à 0,15 M en sels soit 9 g/L de NaCl. L'eau de mer est à une
concentration moyenne en sels de 35 g/L soit environ 0,6 M, et de nombreux organismes dits
halotolérants et appartenant aux 3 domaines y vivent.
• Une archée piézophile (et hyperthermophile) du genre Pyrococcus vivant dans une source
hydrothermale du rift médio-Atlantique à 4100 m de profondeur et capable de supporter
120 MPa (1200 bars) a été récemment décrite.
• Deinococcus radiodurans est une bactérie extrêmophile proche du genre Thermus (la Taq
polymérase provient de Thermus aquaticus ). C'est un coque à Gram-positif avec 2
chromosomes, chimio-organotrophe, hétérotrophe, aérobie strict, et possédant une couche S
(voir plus loin). Mais elle présente aussi des caractéristiques atypiques : sa paroi est
dépourvue d'acide teichoïque, elle utilise une ATP synthétase de type V1V0, ses lipides
membranaires comportent des alkylamines, et surtout chaque cellule possède 2 à 4 copies
complètes de son génome sous forme d'anneaux condensés visibles au microscope optique. Sa
caractéristique la plus spectaculaire est qu'elle est capable de résister sans perte de viabilité
à des doses de radiations ionisantes de 5000 Gy (unité officielle du système international, le
Gray est la quantité de radiation absorbée par une masse de matière donnée, exprimée en
J/kg avec 1Gy = 100 rad), alors que quelques centaines de Gy suffisent à tuer E. coli ! Outre
les copies multiples de son génome, cette bactérie est pourvue de systèmes de réparation de
l'ADN et de protection des protéines beaucoup plus performants que la plupart des autres
organismes.

CROISSANCE MICROBIENNE

Principales méthodes de mesure de la croissance


• Absorbance ou densité optique (DO) : c'est une mesure turbidimétrique où la diminution de
l'intensité lumineuse est due à la diffraction de la lumière par les particules, ici les cellules,
en suspension. La DO est proportionnelle à la concentration de cellules, à condition de
respecter la loi de Beer-Lambert (DO = ε.C.l) et de faire le zéro du spectrophotomètre avec
le milieu de culture. Elle doit être corrélée au nombre de cellules par un étalonnage avec une
méthode de numération. Une démarche courante consiste à multiplier la DO mesurée par le
facteur de dilution pour les valeurs fortes qui ne respectent plus la loi de Beer-Lambert, ce
qui donne une DO corrigée qui reste ainsi toujours proportionnelle aux nombre de cellules.
• Le poids sec, ou biomasse, est déterminé après dessiccation au four, pour éliminer l'eau
extra et intracellulaire, d'un culot ou d'un filtrat cellulaire correspondant à un volume de
culture connu. Cette mesure est proportionnelle à la totalité des cellules et nécessite donc
également un étalonnage.
• Pour la numération directe, on utilise une cellule de comptage (hématimètre de Thoma ou
de Malassez par exemple), constituée d'une lame sur laquelle est gravé un quadrillage de
dimensions connues, surmontée d'une lamelle placée à une distance elle aussi connue,
l'ensemble délimitant donc un volume connu. L'échantillon de la suspension de cellules à
compter est introduit entre lame et lamelle et observé au microscope.
• Pour le comptage de colonies (CFU ou colony forming unit ), une série de dilutions de l a
suspension cellulaire de l'échantillon est préparée, et un volume connu de chaque dilution est
entièrement étalé sur milieu gélosé en boîte de Petri. Après incubation, les colonies sont
comptées sur les boîtes en comportant entre 10 et 200 pour la précision de la mesure, et le
résultat est multiplié par la dilution correspondante pour obtenir la concentration cellulaire
de la suspension initiale. Il s'agit d'une numération indirecte, une colonie étant considérée
comme équivalente à une seule cellule vivante déposée sur le milieu solide au moment de
l'ensemencement.
• Parmi les méthodes de quantification des cellules, seul le comptage des colonies n u m è r e
des cellules vivantes. La numération directe au microscope ne permet pas toujours de
savoir si les cellules sont viables. Les autres méthodes (mesures de la densité optique, du
poids sec, des protéines cellulaires totales, etc.) permettent de quantifier les cellules mais
pas de les numérer, et nécessitent un étalonnage pour être corrélées à leur nombre.

Exemple de courbe de croissance microbienne (voir figure)


12
La représentation du nombre de cellules sur une échelle arithmétique (en haut) ne donne que
peu d'informations, car la distinction entre les différentes phases de croissance est difficile à
établir. Par contre, grâce à la représentation en log décimaux (au milieu), on distingue
clairement dans l'exemple ci-dessous une phase de latence (➀ : 0 à 25 min), une phase
d'accélération (➁  : 25 à 75 min), une phase exponentielle ( ➂ : 75 à 325 min) avec un
temps de génération de 35 min, une phase de ralentissement (➃  : 325 à 375 min), et une
phase stationnaire (➄ : à partir de 375 min) :

➀ ➁ ➂ ➃ ➄
10
9
8
N (108 cellules/mL)

7
6
5
4
3
2
1
0

8,5
log(N)

7,5

6,5

6
Taux de croissance
µ = Ln2/G (h-1)

0,5

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Temps (min)

Description des phases de croissance


13
• Phase de latence (facultative) : temps d'adaptation des cellules à de nouvelles conditions
d'environnement, au cours duquel aucune croissance n'est observée. On peut arriver à
supprimer cette phase en réensemençant plusieurs fois de suite une culture dans les mêmes
conditions.
• Phase d'accélération : certaines cellules commencent à se diviser. Cette phase peut être très
courte et n'est pas toujours apparente.
• Phase exponentielle : toutes les cellules se divisent régulièrement et leur nombre double à
intervalles de temps constants c'est-à-dire augmente selon une exponentielle de base 2, ce
qui permet de définir un taux de croissance ou nombre de génération par unité de temps, et
un temps de génération ou de doublement (voir ci-dessous). La vitesse de croissance dépend à
la fois des capacités propres du microorganisme et des conditions de culture.
• Phase de ralentissement : certaines cellules cessent de se diviser car les conditions de
culture deviennent défavorables. Soit un des constituants du milieu indispensable aux
cellules est épuisé (cas le plus courant), soit un produit du métabolisme cellulaire s'est
accumulé en entraînant des effets négatifs, comme par exemple une variation de pH trop
importante ou bien la production d'éthanol pour certaines levures.
• Phase stationnaire : il n'y a plus aucune division, mais une partie du métabolisme est
encore actif ce qui permet certaines synthèses. Les cellules s'adaptent à des conditions de
stress (carence nutritionnelle, …). Contrairement à une fausse idée trop répandue, cette
phase n'est absolument pas un équilibre entre des cellules qui meurent et d'autres qui se
divisent !
• Phase de décroissance ou de déclin (facultative) : les cellules meurent et lysent.

Analyse mathématique de la phase exponentielle


Le nombre de cellules augmente selon une exponentielle de base 2, que l'on convertit le plus
souvent en base 10 ou en base népérienne pour en tirer µ et G :
N : nombre de cellules ou biomasse au temps t
N0 : nombre de cellules ou biomasse à t = 0
n : nombre de générations au temps t
k : taux de croissance vrai (base 2), rarement utilisé
µ : taux de croissance népérien, couramment utilisé
G : temps de génération ou de doublement

N = N0.2n = N0.2k.t = N0.2t/G = N0.eµ.t = N0.10(k.log2)t = N0.10(µ.loge)t


LnN = LnN0 + n.Ln2 = LnN0 + µ.t = LnN0 + (k.Ln2)t
logN = logN0 + n.log2 = logN0 + (k.log2)t = logN0 + (µ.loge)t
k = n/t = 1/G = LnN2- L n N1/(t2- t1).Ln2 = logN2-logN1/(t2- t1).log2
µ = n.Ln2/t = Ln2/G = k.Ln2 = LnN2- L n N1/(t2- t1) = logN2-logN1/(t2- t1).loge
G = 1/k = t/n = Ln2/µ

Diauxie
• On parle de diauxie (du grec auxein "augmenter") lorsqu'il y a deux croissances à la suite
l'une de l'autre, traduisant le plus souvent les utilisations successives de deux substrats
différents. Ce phénomène a été découvert par Jacques Monod en 1940.
• L'exemple classique est celui de la bactérie Escherichia coli cultivée en présence de glucose
+ lactose comme sources de carbone et d'énergie. On observe une première croissance
pendant laquelle seul le glucose est consommé, qui s'arrête lorsqu'il est épuisé. Après une
phase de latence correspondant à l'induction de l'opéron lactose qui était réprimé par le
glucose, une seconde croissance lui succède pendant laquelle le lactose est à son tour
consommé. Remarque : il n'y a pas de diauxie avec la même bactérie cultivée dans les mêmes
conditions en présence de glucose + fructose, qui sont alors utilisés simultanément (et il n'y
a pas d'opéron fructose).

Influences de la concentration en substrat sur la croissance


• Un substrat est dit limitant si la croissance s'arrête lorsqu'il est épuisé. La croissance
totale, c'est-à-dire la croissance maximale atteinte à la phase stationnaire moins
14
l'inoculum, est alors directement proportionnelle à la concentration initiale du substrat
limitant.
• La concentration d'un substrat a aussi une influence sur la vitesse de croissance en cours de
phase exponentielle, comme le décrit la relation de Monod : µ = µmax [S]/(Ks+[S])
Le taux de croissance µ varie de manière hyperbolique en fonction de la concentration en
substrat S, pour atteindre une valeur maximale µmax lorsque le substrat est en excès c'est-à-
dire lorsque son utilisation par le microorganisme (transport + métabolisme) est optimale.

Cellules viables mais non cultivables (VBNC)


Bien que le comptage des colonies soit la technique utilisée de façon courante pour numérer
les cellules viables, le fait de ne pas obtenir de colonies visibles ne garantit pas que les
cellules aient irréversiblement perdu la capacité de se diviser. Sous certaines conditions
environnementales, des microorganismes peuvent entrer dans ce que l’on appelle un état
"viable mais non cultivable" (VBNC en anglais). Cet état dans lequel les cellules perdent peu
à peu leur capacité à se diviser mais conservent une faible activité métabolique est considéré
comme une stratégie de survie dans un environnement défavorable. Pour mesurer le nombre
de ces cellules viables mais non cultivables, on se base sur des essais prenant en compte
certaines propriétés physiologiques comme la capacité respiratoire, l’intégrité de l a
membrane, d’autres techniques d’évaluation de l'activité métabolique, ou des marquages
immunologiques.

Croissance endogène ou cryptique


• Il y a toujours dans une population de microorganismes une proportion variable mais en
général faible de cellules qui meurent et lysent, libérant leur contenu qui peut fournir des
substrats aux cellules voisines leur permettant de se diviser. Ce phénomène, appelé
croissance "endogène" ou "cryptique", a lieu tout au long de la culture mais est plus facile à
observer en phase stationnaire, tout en n'étant pas la cause ni de l'apparition ni du maintien
de cette phase.
• Du point de vue évolutif, la croissance endogène est importante car elle génère l'apparition
régulière de nouveaux mutants et variants, ce qui entretient un minimum de diversité au
sein de la population et facilite son adaptation à de nouvelles conditions.

Principales régulations chez les bactéries


Elles sont nombreuses et variées. Outre l'ensemble des régulations métaboliques faisant
appel principalement aux enzymes allostériques (voir cours de biochimie), on peut citer
(voir cours de génétique) :
- Opérons, répression catabolique, atténuation.
- Réponse "stringente", ppGpp et entrée en phase stationnaire.
- Facteurs de transcription σ alternatifs.
- Petits ARN régulateurs non codants (sRNA ou ncRNA) : anti-sens, crispr
- Systèmes capteur/effecteur (sensor/effector) avec phosphorylation intermédiaire.
- Quorum sensing et peptide phéromone.
- Exemple des 2 derniers types de régulation, qui sont souvent associés :

Production et excrétion d'un peptide phéromone servant de signal, par l'ensemble des
cellules de la culture

Accumulation de ce peptide signal dans le milieu au fur et à mesure de la croissance

Fixation de ce peptide signal sur le récepteur du domaine extracellulaire d'une protéine
transmembranaire servant de "capteur" (sensor)

Déclenchement du signal au delà d'un certain seuil de concentration du peptide, correspondant
à une densité cellulaire particulière (quorum sensing)

La protéine "capteur" est activée et son domaine intracellulaire possède une activité kinase
qui phosphoryle une protéine cytoplasmique régulatrice (effector)

15
La protéine régulatrice activée par cette phosphorylation peut alors se fixer spécifiquement
sur certains promoteurs cibles pour activer ou inhiber la transcription des gènes
correspondants

PRATIQUE DE LA CULTURE DE MICROORGANISMES

Stérilité (voir TP)


• Les cultures de microorganismes doivent être manipulées stérilement pour deux raisons :
- La plus évidente, protéger la culture en cours d'une contamination extérieure.
- A l'inverse, protéger l'expérimentateur et l'environnement de la culture lorsque cette
dernière est potentiellement néfaste parce que le microorganisme cultivé est soit pathogène
soit génétiquement modifié (OGM).
• A la paillasse, une source de chaleur (bec Bunsen ou bec électrique) permet de maintenir
une zone de manipulation dans laquelle l'air est stérile.
• Les milieux de culture sont le plus souvent stérilisés par autoclavage : chauffage dans une
enceinte humide et fermée permettant par augmentation de la pression de monter l a
température jusqu'à 120°C, 100°C étant insuffisant pour détruire les spores qu'elles soient
bactériennes ou fongiques. Mais dans certains cas la chaleur risque de détériorer le milieu,
du fait de la présence de substances thermolabiles ou de la réaction de Maillard. Au cours de
cette réaction, qui se traduit par un brunissement, la fonction hémiacétal (aldéhyde ou cétone
cyclysée) d'un ose réagit avec une fonction amine d'un acide aminé ou d'une protéine, formant
une osamine N-substituée et de l'eau. Les liquides peuvent alors être stérilisés par
filtration, en utilisant des filtres spéciaux avec des pores calibrés de 0,2 à 0,4 µm (compte
tenu de la taille de l'ensemble des microorganismes).

Sécurité (voir TP)


• Ne pas consommer d'aliment ou de boisson dans le laboratoire.
• A la paillasse : - Ne jamais rien pipetter à la bouche.
- Toujours manipuler avec une blouse fermée ne laissant dépasser aucune pièce de vêtement.
- Selon le mode de stérilisation choisi, se garder de la chaleur ou de la flamme.
- Porter si nécessaire des gants, masques et lunettes de protection.
• Tout objet ou récipient qui a été en contact avec un microorganisme doit être décontaminé
avant de sortir du laboratoire. Il existe différentes procédures à respecter en fonction du
type de matériaux (verre, plastique, métal, ...) et de leur réutilisation éventuelle.
• Les microorganismes sont maintenant officiellement classés en plusieurs catégories selon
le danger réel ou potentiel qu'ils présentent. Ce classement conditionne leur utilisation et
leur manipulation, en fonction du type de laboratoire (catégories P1 à P4) et de son
équipement (rampes UV, hottes, sas d'accès, pressurisation, vêtements de protection, ...).

Conservation
• Les souches de microorganismes peuvent être conservées sur le long terme, c'est-à-dire
plusieurs années voire même décennies, pour constituer des "collections" :
- Par congélation à -80°C ou mieux à -196°C en azote liquide (mais surtout pas à - 2 0 ° C ) ,
en présence de composés cryoprotecteurs comme le glycérol ou le DMSO. Ce procédé est
efficace pour la plupart des procaryotes et certaines cellules eucaryotes.
- Par lyophilisation, qui consiste en une déshydratation sous vide et à froid. Ce procédé,
couramment employé dans la préparation d'aliments industriels, est efficace pour la plupart
des procaryotes mais plus limité pour les eucaryotes.
• Il existe plusieurs organismes et institutions mettant à la disposition de la communauté
scientifique internationale d'importantes collections de microorganismes variés, comme par
exemple :
- En France, la Collection de l'Institut Pasteur (CIP) à Paris.
- En Belgique, la Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) à Bruxelles.
- En Allemagne, la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) à
Braunschweig.
- Aux Etats-Unis, l'American Type Culture Collection (ATCC) à Manassas en Virginie.
- Au Japon, la Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) à Osaka.
16

LE MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE DES MICROORGANISMES

SOURCES ET CONSERVATION DE L'ÉNERGIE DANS LE MONDE VIVANT

Les différentes formes d'énergie utilisées


Les cellules vivantes ne peuvent tirer leur énergie primaire que de 2 sources, soit l a
lumière solaire, soit les réactions d'oxydo-réduction, ce qui permet de définir 2 grands
types trophiques, respectivement phototrophie et chimiotrophie :

E oʼ plus négatif : carbone organique ou autre réducteur Lumière NAD(P)+

Oxydo-réduction Conservation de lʼénergie :


Chlorophylle Chlorophylle
- Gradient ionique
- ATP Rhodopsine
- NADPH
E oʼ plus positif : O2 ou autre oxydant H2O, H 2S, H2, ...

A partir de cette énergie primaire, les cellules vivantes possèdent des systèmes de
conversion entre les différentes formes d'énergie primaires et secondaires :
- Lumineuse : photosynthèse, pompe ionique (voir plus loin).
- Chimique : oxydo-réduction (voir plus loin), synthèses d'ATP et de molécules biologiques
complexes (anabolisme).
- Chimio-osmotique : établissement d'un gradient ionique transmembranaire.
- Transport membranaire : échanges entre la cellule et son environnement.
- Mécanique : mouvements intracellulaires, locomotion et déplacements de l'organisme.

Besoins énergétiques cellulaires des procaryotes


On distingue 3 états physiologiques principaux chez les procaryotes :

Etat Niveau relatif


Fonctions consommatrices d'énergie
physiologique d'énergie

Survie Réparation des macromolécules 1


Maintenance - Réparation et remplacement des macromolécules
- Mobilité 103
- Excrétion
- Cycles futiles et dissipation d'énergie sous forme de
chaleur
Division - Toutes les fonctions précédentes 106
- Réplication de l'ensemble du matériel cellulaire

Conservation de l'énergie
• Dans l'ensemble du monde vivant, l'énergie chimique est principalement conservée par
création d'un grandient ionique transmembranaire ou potentiel chimio-osmotique (découvert
par le biochimiste britannique Peter D. Mitchell, prix Nobel de chimie en 1978), à partir
de réactions d'oxydo-réduction avec un donneur X et un accepteur Y d'électrons. Ce gradient
est le plus souvent à base de protons (force proto-motrice), mais il peut dans certains cas
reposer sur les ion sodium. Il y a 3 mécanismes possibles reposant sur la mise en place de
systèmes membranaires de transfert d'électrons (ou chaînes respiratoires), les mécanismes
B et C, dits vectoriels, étant les plus complexes :
- A : forme la plus simple de tranfert de proton, sans translocation. Il y a oxydation d'un
donneur d'électrons à l'extérieur, transport des électrons à travers la membrane (en général
via une protéine de type Fe-S), et réduction d'un accepteur d'électrons à l'intérieur. Ces 3
étapes couplées génèrent un gradient de protons si la première en libère alors que l a
dernière en consomme. La principale contrainte de ce mécanisme est que l'oxydant ait accès à
la face interne de la membrane. Les cas les plus intéressants concernent CO2 et O2 qui
17
diffusent très facilement. Sinon un transport actif transmembranaire est nécessaire, ce qui
complique le système et alourdit la dépense énergétique.
- B : translocation de protons par une quinone. Cette famille de protéines membranaires
mobiles est quasiment ubiquitaire parmi l'ensemble des être vivants des 3 domaines, des
chaînes respiratoires à la photosynthèse.
- C : translocation par une pompe à protons, comme par exemple les complexes I et IV de l a
chaîne respiratoire mitochondriale des cellules animales.

X + 2 H+
XH2 H+
2 H+
A B C
Extérieur

2 e- 2 e- e- e-
2 e- Q Y Y
X X

Intérieur
2 H+
Y + 2 H+ H+
YH2

• La synthèse d'ATP peut se faire :


- soit par des ATP synth(ét)ases membranaires utilisant le gradient ionique
transmembranaire généré par les chaînes membranaires de transport d'électrons ;
- soit directement à partir du catabolisme du substrat carboné quand celui-ci est organique
(organotrophie).
• Quantum d'énergie biologique : énergie catabolique minimale nécessaire pour sa
conservation. Si ce niveau énergétique n'est pas atteint, il y a découplage total entre le
catabolisme et la conservation d'énergie, et la survie même de la cellule est compromise. Ce
niveau peut toutefois être très faible, avec seulement une fraction d'ATP synthétisé par
molécule de substrat utilisé, situation courante dans une syntrophie (voir plus loin).

Ajustement de l'énergie catabolique avec l'énergie consommée


• Quand un microorganisme est limité pour sa source d'énergie, il met en place un couplage
étroit entre catabolisme (partie oxydative et énergétique du métabolisme responsable des
dégradations) et anabolisme (partie réductive et consommatrice d'énergie du métabolisme
responsable des synthèses) et répartit de l'énergie consommée entre maintenance et division
cellulaire. Par contre quand il est limité par autre chose que l'énergie, il en "gâche" une
partie en la dissipant (energy spilling) sans l'utiliser pour la maintenance. Cette possibilité
de découplage lui confère certains avantages :
- C'est une des manières d'ajuster le catabolisme à l'anabolisme en fonction des besoins
cellulaires.
- En cas de compétition avec un autre microorganisme, l'énergie excédentaire dissipée n'est
pas disponible pour le concurrent.
- Dès que la limitation cesse, le redémarrage de la croissance est plus rapide car l'énergie et
certains précurseurs métaboliques sont déjà présents et immédiatement disponibles.
- La membrane cellulaire ou mitochondriale est mieux préservée des dégâts causés par un
potentiel transmembranaire trop important, dont l'excès peut être dissipé par des cycles
ioniques futiles (avec intervention éventuelle d'agents "découplants" naturels).
- La dissipation d'énergie se fait en général sous forme de chaleur, ce qui peut
éventuellement être utile pour un microorganisme psychrophile.
• Les microorganismes peuvent procéder à cette dissipation d'énergie par différents
mécanismes : cycles futiles métaboliques et ioniques, modification du nombre de pompes à
protons au sein des chaînes de transport d'électrons membranaires (voir plus loin),
découplages, ajustement du rapport stœchiométrique H+/ATP des ATP synth(ét)ases.
CHIMIOTROPHIE : ÉNERGIE CHIMIQUE TIRÉE DE L'OXYDO-RÉDUCTION
18
Rappels de bioénergétique (voir cours de biochimie)
• Potentiels d'oxydo-réduction standards apparents (la zone grisée regroupe l'ensemble des
substrats carbonés organiques) :

–1

Chlorophylles*

Succinate+CO2/α-Cétoglutarate

3-PGlycérate/3P-Glycéraldéhyde CO2/CO
–0,5
CO2/Formate
Glucose (moyenne) Ferrédoxine 2 H +/H2

NAD(P)+/NAD(P)H
S o/H2S
E0' (V) à pH 7 et 25°C

CO2/CH4
Pyruvate/Lactate
SO42-/H2S

0 Fumarate/Succinate FAD/FADH2 S 4O62-/S2O32-


Ubiquinone
3-
DMSO/DMS AsO4 /As(OH)3

Fe 3+/Fe2+ NO2-/NH4+
NO3-/NO2-
+0,5

MnO 2/Mn 2+
Chlorophylles

1/2O 2/H2O

NO/N2O
+1
ClO3/Cl-

Couple Oxydant/Réducteur

Sur ce graphique, les électrons vont spontanément du haut vers le bas, c'est-à-dire du
réducteur dont E0' est le plus négatif vers l'oxydant dont E0' est le plus positif.
• Calcul de l'énergie libre standard apparente, qui est négative dans le cas d'une réaction
spontanée : ∆G0' = – n.F.∆E0' = – n.F.(E0'ox – E0'réd)
avec F = 96500 Coulombs et n le nombre d'électrons échangés.
- Pour le glucose oxydé par l'oxygène : ∆E0' = 0,82 – (–0,42) = +1,24 V
n = 12 d'où : ∆G0' = –2870 kJ/mol
- Pour l'ammonium oxydé par l'oxygène : ∆E0' = 0,82 – 0,35 = +0,47 V
n = 6 d'où : ∆G0' = –272 kJ/mol

Types trophiques
• Les chimiotrophes se répartissent en 2 types selon la nature du substrat réducteur source
primaire d'électrons, qui est soit organique soit minéral :
19

Donneur d’électrons Accepteur final d'électrons ou


Type trophique
(E0' le plus négatif) oxydant
(E0' le plus positif)
Chimio-organotrophe Organique - Organique (interne) : fermentation
- O2 (externe) : respiration aérobie
- Autre que O2, le plus souvent
minéral (externe) : respiration
anaérobie
Chimio-lithotrophe Minéral Minéral (externe) : O2 ou autre

• On rencontre souvent les associations hétérotrophie/organotrophie et


autotrophie/lithotrophie, tout simplement parce que quand un organisme utilise un composé
organique comme source de carbone, le plus efficace pour lui est de l'utiliser aussi comme
source d'électrons plutôt que de se procurer un autre substrat pour cela. Par contre le CO2,
forme la plus oxydée du carbone, ne peut être utilisé que comme source de carbone. Toutefois
ces associations ne sont pas systématiques : les plantes sont autotrophes (grâce à la
photosynthèse) et organotrophes (le glucose synthétisé sert entre autres de donneur
d'électrons comme chez tous les eucaryotes). Il est donc important pour tous les substrats de
distinguer les usages dissimilateurs (utilisation comme source d'énergie dans une réaction
d'oxydo-réduction) des usages assimilateurs (utilisation comme nutriment pour l a
biomasse), certains substrats pouvant assurer les deux usages à la fois.
• Outre l'obtention d'énergie, le donneur primaire d'électrons est aussi nécessaire pour
fournir du pouvoir réducteur à l'anabolisme. Chez les organismes autotrophes, les chaînes
membranaires de transport d'électrons permettent aussi de produire le NADPH nécessaire
pour l'anabolisme, alors que chez les hétérotrophes/organotrophes le NADPH est obtenu par
le catabolisme du substrat carboné organique.

Voies de fermentation microbiennes (au sens biochimique)


• Il faut être prudent dans l'emploi du terme "fermentation" (du latin fermentatio
"bouillonnement") qui a en fait plusieurs significations :
- D'une manière générale, la fermentation désigne simplement la transformation de
substances organiques sous l'action de microorganismes.
- Louis Pasteur, qui a étudié l'activité des levures auprès des brasseurs alsaciens, la définit
comme "la vie sans l'air". La biochimie classique reprend cette définition dans son sens
restrictif : "processus de création d'ATP dans lequel des composés organiques agissent à l a
fois comme donneurs et comme accepteurs d'électrons. La fermentation peut se produire en
l'absence d'oxygène" [Lubert Stryer, in La Biochimie].
- La microbiologie classique a gardé la définition générale : "tout procédé impliquant l a
culture en masse de microorganismes aérobies ou anaérobies" [Prescott, in Microbiologie].
• Le rôle métabolique principal des voies de fermentation (au sens biochimique) est de
recycler les coenzymes d'oxydo-réduction réduits produits par le catabolisme, ce qui
implique que l'accepteur final d'électrons soit un composé organique endogène (par exemple
le pyruvate).
• Contrairement aux eucaryotes chez lesquels existent pricipalement les fermentations
lactique et alcoolique, les procaryotes présentent une variété beaucoup plus grande de voies
de fermentation, dont certaines peuvent coexister dans une même cellule. On parle alors
d'hétérofermentation ou de mode multi-fermentaire. Par exemple, certaines Entérobactéries
(dont E. coli) sont capables d'effectuer la fermentation dite "acides mixtes" conduisant à l a
production simultanée de lactate, acétate, formate, succinate, éthanol, H2 et CO2.
• La présence d'acétoïne et de butanediol est mise en évidence par la réaction colorimétrique
de Voges-Proskauer (VP), utilisée en taxonomie bactérienne (voir TP).
• Voies de fermentation microbiennes les plus courantes :
20

NADH +
Acétaldéhyde Ethanol
CO2 CO2
Pyruvate

α-Acétolactate Pyruvate Oxaloacétate


NADH +
CoASH
CO2
NADH +
Formate CO2 Malate
Lactate
Acétoïne
Acétyl-CoA
Pi Acétyl-CoA
NADH + H2
H2O
CoASH CoASH Fumarate
2,3-Butanediol
Acétyl-P Acétoacétyl-CoA NADH +
ADP NADH +
CO2 Succinate
ATP Pi
Acétaldéhyde Acétone
Acétate CO2
NADH + NADH +
Propionate
Ethanol Isopropanol

Types respiratoires en relation avec l'oxygène moléculaire


• Les microorganismes ont été intialement répartis en 4 types respiratoires principaux
selon leur relation avec l'oxygène moléculaire. Bien que les respirations anaérobies et l a
lithotrophie aient été découvertes depuis, cette répartition est toujours utilisée pour l a
classification et l'identification (voir plus loin) :

Type respiratoire Relation avec l'oxygène O2 Métabolisme énergétique


Aérobie strict Indispensable Respiration aérobie
Aéro-anaérobie Utilisation facultative, - Respiration aérobie
ou anaérobie facultatif mais meilleure croissance avec - Respiration anaérobie
O2 - Fermentation
Microaérophile Nécessaire en faible Cas particulier des 2
concentration précédents
Anaérobie aérotolérant Inutile mais toléré Fermentation
ou indifférent à
l'oxygène
Anaérobie strict Toxique - Fermentation
- Respiration anaérobie

• La méthode la plus simple pour déterminer le type respiratoire consiste à faire une
culture en milieu gélosé contenu dans un tube de faible diamètre par rapport à sa hauteur
(gélose Viande-Foie ou VF). Cette disposition particulière permet d'établir un gradient
d'aération décroissant du haut vers le bas du tube, et d'empêcher le déplacement des
microorganismes mobiles :
- un trouble apparaît seulement en haut du tube : aérobie strict ;
- un trouble apparaît sur toute la hauteur du tube : soit aéro-anaérobie, soit anaérobie
indifférent à l'oxygène ;
- un trouble apparaît seulement au fond du tube : anaérobie strict.
• Une façon indirecte et simple d'agir sur l'oxygénation d'un milieu liquide consiste à faire
varier le remplissage d'un erlenmeyer agité : l'oxygénation dépend du rapport entre l a
surface de contact avec l'air et le volume de liquide. Plus ce volume est petit et plus
l'oxygénation est importante, les conditions optimales étant généralement obtenues avec un
volume de remplissage inférieur ou égal au cinquième du volume total de l'erlenmeyer.
21
• Effet "Pasteur" : chez certains microorganismes aéro-anaérobies, le passage de
l'anaérobiose à l'aérobiose entraîne une diminution de la consommation de glucose et une
diminution de la fermentation. Cet effet est d'autant plus prononcé que la cellule a un
métabolisme aérobie plus important (voir cours de biochimie pour les régulations
métaboliques mises en jeu).

Plasticité de la chaîne respiratoire et respirations aérobie ou anaérobie :


exemple d' Escherichia coli
• Schéma simplifié (Q : ubiquinone ou coenzyme Q ; ➛ : trajet des électrons) : les éléments
en grisé constituent l'équivalent de la chaîne respiratoire mitochondriale animale ( v o i r
cours de biochimie) :

CO2 + 2 H+
HCOOH H2O2 + 2 H+
2 H 2O

Lactate
DH Cyt c
Formate
2 H+ péroxydase CH3-SO-CH 3 + 2 H+
DH
H2 DMSO
réductase
CH3-S-CH3 + H 2O
Hydrogénase
1/2 O2 + 2 H+
Cyt o
Q Cyt b
NADH oxydase
H2O
DH

1/2 O2 + 2 H+
Cyt d
Nitrate oxydase
Succinate réductase H2O
DH Glycérol-3-P
DH NO3- + 2 H+

NO2- + H 2O

• Les donneurs d'électrons sont principalement organiques (organotrophie) avec


éventuellement comme intermédiaire un coenzyme d'oxydo-réduction (NAD+/NADH,
FAD/FADH2, ferrédoxine), sauf dans le cas de l'hydrogène (lithotrophie).
• En condition anaérobie, des oxydants autres que l'oxygène O2 peuvent être utilisés comme
accepteurs finaux d'électrons : nitrate, péroxyde d'hydrogène, diméthylsulfoxyde.
• La cytochrome d oxydase, qui a une affinité pour O2 plus élevée que la cytochrome o
oxydase, n'est utilisée par E. coli qu'en condition microaérophile.
• Les cytochromes c et o oxydases sont des pompes à protons, ce qui n'est pas le cas de l a
cytochrome d oxydase. Cette dernière permet de découpler la chaîne de transfert d'électrons
du gradient transmembranaire de protons, c'est-à-dire le pouvoir réducteur de l a
production d'énergie. Cette substitution possible entre cytochrome oxydases permet aussi de
résister à certains inhibiteurs. Par exemple, le cyanure inhibe les cytochrome c et o
oxydases, mais pas la cytochrome d oxydase.
• Le caractère "oxydase" utilisé pour l'identification bactérienne (voir TP) correspond à l a
cytochrome c oxydase, présente par exemple dans les chaînes respiratoires des genres
Neisseria, Pseudomonas et Vibrio mais absente chez les Entérobactéries.
• La nitrate-réductase peut être mise en évidence par la révélation colorimétrique du nitrite
formé dans le milieu après culture anaérobie en présence de nitrate. C'est la réaction de
Griess, qui utilise la combinaison de 2 réactifs (acide sulfanilique + α-naphtylamine)
donnant une coloration rouge en présence de nitrite (voir TP).

Respirations anaérobies
• On parle de respiration anaérobie lorsque l'accepteur final d'électrons est un autre oxydant
que l'oxygène moléculaire O2. Par exemple :
22
Accepteur Produits
Respiration E0' (V) Exemples de procaryotes
d'électrons réduits
Aérobie O2 H2O – 0,82 Tous les procaryotes aérobies
Anaérobie NO3– NO2– + 0,42 Entérobactéries, Pseudomonas, Bacillus
NO2– NO, N2O, N2 + 0,35 Pseudomonas, Bacillus
SO4– H2S – 0,12 Desulfovibrio, Archeoglobus
CO2 CH4 – 0,25 Archaea méthanogènes hydrogénotrophes
S0 H2S – 0,28 Desulforomonas, Thermoproteus, Pyrococcus
H+ H2 – 0,41 Pyrococcus
Fe3+ Fe2+ + 0,33 Pseudomonas, Bacillus, Geobacter
MnO2 Mn2+, H2O + 0,61 Pseudomonas, Bacillus, Geobacter
ClO4– , ClO3– C l– + 1,29 Dechloromonas, Dechlorospirillum
AsO43– As(OH)3 + 0,13 Chrysiogenes , Bacillus, Pyrobaculum
DMSO DMS + 0,16 Entérobactéries
Fumarate Succinate + 0,03 Wolinella succinogenes

• Des études environ-


nementales géochimiques et
microbiologiques de certains
sols et sédiments marins ont
permis d'établir l'existence
de différents étages de
métabolisme respiratoire en
relation avec les différents
composés oxydants présents,
répartis selon le modèle
schématique ci-contre.
Plusieurs contraintes r é g i s -
sent cette répartition, sur
quelques mètres voire
dizaines de mètres de
profondeur :
- Ces écosystèmes sont riches
en composés organiques, ce
qui implique que la plupart
des microorganismes
présents sont hétérotrophes
et organotrophes.
- L'apport ou le renouvel-
lement des composés
oxydants, le plus souvent par
des phénomènes physico-
chimiques ou géologiques,
n'est pas toujours homogène.
- La comparaison des "∆G0'/électron transféré" indique que le rendement énergétique des
réactions d'oxydo-réduction impliquées va décroissant avec la profondeur.
- Les localisations des différents types de respiration peuvent se chevaucher, même s i
certaines sont incompatibles : les réductions du manganèse et du fer ferrique ainsi que l a
méthanogénie ne s'effectuent pas en présence d'oxygène.

Exemple de chaîne respiratoire simple : P y r o c o c c u s f u r i o s u s sur le fil d u


rasoir
Cette archées de l'ordre des Thermococcales (Euryarchaeota) est hyperthermophile ( 9 0 -
100°C), mobile, anaérobie stricte, et organotrophe. On a longtemps estimé qu'elle n'avait
qu'un métabolisme uniquement fermentatif (au sens biochimique), jusqu'à la découverte de
deux complexes membranaires particuliers capables d'effectuer des réactions d'oxydo-
réduction couplées à la génération d'un gradient transmembranaire de protons, constituant
chacun une chaîne respiratoire simplifiée :
23

Extérieur Intérieur Sucres Intérieur Extérieur


Acides aminés
Fd ox Fd ox

FeS Fd réd Fd réd


FeS
Complexe Complexe
H+ Hydrogénase Oxydoréducase H+
Acides organiques NAD+
NiFe 2 H+ + CO 2 + 2 H+

So
Sulfure NADH
H2 + 2 H+
réductase
H2S

- Un de ces complexes est une hydrogénase membranaire à noyau métallique [Ni-Fe] (partie
gauche du schéma). Les électrons fournis par les substrats organiques (sucres, acides
aminés) sont transférés à la ferrédoxine (E0' = –0,42 V) au lieu du NAD+ (E0' = –0,32 V)
par une voie modifiée d'Embden-Meyerhof. Cela permet ensuite à la ferrédoxine de les céder
à l'hydrogène (E0' = –0,41 V), accepteur d'électrons le plus simple qui soit, via le complexe
hydrogénase membranaire qui est une pompe à protons. L'ensemble de cette réaction, qui a
donc un ∆G0' quasiment nul, est tiré par l'élimination de H2 sous forme gazeuse.
- En présence de soufre S0, il y a production de H2S au lieu de H2. La ferrédoxine réduite cède
alors ses électrons au NAD+ par l'intermédaire d'un autre complexe membranaire lui aussi
générateur d'un gradient de protons, et le NADH ainsi obtenu peut réduire le soufre en H2S
( E0' = –0,28 V) grâce à une sulfure réductase cytoplasmique (partie droite du schéma). I c i
encore, le ∆G0' résultant est faible et la volatilité de H2S tire l'ensemble de la réaction.

Chimio-lithotrophes représentatifs et leurs sources d'énergie


• On parle de lithotrophie lorsque le substrat réducteur source primaire d'électrons est
minéral. L'accepteur final d'électrons pouvant lui aussi être variable, les procaryotes
lithotrophes présentent des combinaisons très diversifiées. Par exemple :

Donneur Accepteur
Procaryotes Produits
d'électrons d'électrons
Alcaligenes, Pseudomonas H2 O2 H2O
Nitrobacter NO2– O2 NO3– , H2O
Nitrosomonas, Nitrosopumilus NH4+ O2 NO2– , H2O
Brocadia, Kuenenia NH4+ NO2– N2, H2O
Desulfovibrio H2 SO42 H2S, H2O
Acidianus ambivalens S 2O32– O2 S 4O62–, H2O
H2 S0 H2S
Thiobacillus denitrificans S 0, H2S NO3– SO42–, N2
Thiobacillus ferrooxidans Fe2+, S0, H2S O2 Fe3+, H2O, H2SO4
S0 Fe3+ Fe2+, SO42–

• Exemples de variation d'énergie libre standard apparente :

Type trophique Réaction d'oxydo-réduction ∆G0' (kJ/mol)


Chimio-organotrophe Glucose + 6 O2 ➝ 6 CO2 + 6 H2O – 2870
Chimio-lithotrophe H2 + 1/2 O2 ➝ H2O – 237
4 H2 + SO42–+ 2 H+ ➝ H2S + 4 H2O – 152
NO2– + 1/2 O2 ➝ NO3– – 73
NH4+ + 3/2 O2 ➝ NO2– + H2O + 2 H+ – 272
NH4+ + NO2– ➝ N2 + 2 H2O – 355
S 0 + 3/2 O2 + H2O ➝ H2SO4 – 496
S 2O32– + 2 O2 + H2O ➝ 2 SO42– + 2 H+ – 936
2 Fe2+ + 2 H+ + 1/2 O2 ➝ 2 Fe3+ + H2O – 47
S 0 + 6 Fe3+ + 4 H2O ➝ SO42- + 6 Fe2+ + 8 H+ – 314
24
La comparaison de ces valeurs permet de mieux comprendre pourquoi les eucaryotes, qui à
masse égale consomment plus d'énergie que les procaryotes, sont chimio-organotrophes avec
respiration aérobie.

Chimio-lithotrophie : exemple de l'Archaea Acidianus ambivalens


Cette archée, de l'ordre des Sulfolobales (Crenarcheota), est chimio-lithotrophe,
thermophile et acidophile, avec une croissance optimale à 80°C et pH 2,5.

Aérobiose Anaérobiose
Extérieur Intérieur Intérieur Extérieur
2 S2O32- H2
Thiosulfate-quinone (thiosulfate) Hydrogénase
oxydoréductase
2 H+
S 4O62-
2 e- 2 e-
(tétrathionate)

H+ CoQ SQ H+

2 e- 2 e-
1/2 O2 + 2 H+ S o + 2 H+
Cytochrome Sulfure
H+ oxydase aa3 réductase
H2O H2S

• En condition aérobie, elle utilise le thiosulfate ( S2O32–) comme donneur d'électrons et


l'oxygène comme accepteur final. Bilan : 2 S2O32– + 2 H+ + 1/2 O2 ➝ S4O62– + H2O
• En condition anaérobie, elle utilise l'hydrogène comme donneur d'électrons et le soufre S0
comme accepteur final, avec comme intermédiaire la sulfolobus quinone (SQ, quinone propre
aux archées avec un potentiel d'oxydo-réduction différent du CoQ). Bilan : H2 + S0 ➝ H2S
• Dans les 2 cas, une chaîne de transporteurs d'électrons permettant de créer un gradient
transmembranaire de protons a pu être mise en évidence.

PHOTOTROPHIE : ÉNERGIE LUMINEUSE OU SOLAIRE

Définition
La phototrophie est l'utilisation par un organisme de l'énergie lumineuse qui est convertie en
énergie chimique. Il existe 2 mécanismes de conversion : photosynthèse ou pompe ionique.

Photosynthèse
• La photosynthèse n'existe que chez les eucaryotes et les bactéries. Elle est absente chez les
archées, qui ne possèdent pas non plus le cycle de Calvin-Benson-Bassham.
• Principe :
Donneur d'électrons externe (H2O, H2S, S0, H2, Fe2+, N02–, ...)

Photosystème : "centre réactionnel photochimique" comportant de la chlorophylle et utilisant
l'énergie lumineuse pour passer à l'état activé (chlorophylle*)

Transfert des électrons à un réducteur fort (E0' très négatif)

Chaîne membranaire de transport d'électrons : conservation de l'énergie par création d'un
gradient transmembranaire de protons

Production de coenzymes réduits (NADH, NADPH) et d'ATP

Retour d'une partie des électrons à un photosystème (le même ou un second)

Synthèse de carbone organique à partir de CO2, de coenzymes réduits et d'ATP par le cycle
réducteur des acides tricarboxyliques (Arnon-Buchanan), le cycle réducteur des pentoses-
phosphate (Calvin-Benson-Bassham), ou le cycle du 3-hydroxypropionate
• Schéma général (les flèches pleines indiquent le trajet des électrons) :
25

• Diversité des bactéries photosynthétiques : on distingue actuellement 5 catégories ( v o i r


tableau). Seules sont indiquées les bactéries cultivables, sachant que la métagénomique laisse
supposer une diversité encore plus grande.
• La photosynthèse anoxique est la plus simple car il n'y a qu'un seul photosystème. Elle
utilise des donneurs d'électrons autres que l'eau ce qui ne libère pas d'O2 :
H2S ➝ S0 , S2O32- , SO42-
S0 ➝ SO42-
H2 ➝ H2O
Fe2+ ➝ Fe3+
N02– ➝ N03–
As(III) ➝ As(V)
• La photosynthèse oxygénique est présente chez les cyanobactéries, bactéries très répandues
dans le plancton océanique, qui apportent une contribution majeure à l'échelle planétaire à l a
fois pour la production d'oxygène, la fixation du CO2 et la fixation de l'azote (voir plus loin).
Elles utilisent un système très proche de celui des eucaryotes, laissant supposer sur le plan
évolutif qu'elles sont probablement à l'origine des chloroplastes par endosymbiose (voir plus
loin) : chlorophylles a et b, 2 photosystèmes dont l'un génère le gradient de protons et l'autre
le NADPH, l'eau comme donneur d'électrons entraînant la production d'O2, et fixation du CO2
par le le cycle de Calvin-Benson-Bassham.