Biochimie TP

Rapport de biochimie 2010-2011
Le dosage du calcium et du magnésium par complexométrie dans

l’eau
Introduction
Les titrages complexométriques sont des méthodes titrimétriques basées sur la formation de complexes. Ces
complexes sont constitués d'un ion central et de particules (chargées ou neutres) appelées ligands ou
coordinats. Les Ligands, couramment utilisés pour effectuer le dosage des cations, doivent posséder au
moins un pair d’électrons non liants disponible pour former la liaison avec l’ion central. Le nombre de
liaisons qu’un cation peut former avec des donneurs d’électrons est son nombre de coordination. La stabilité
des complexes dépend de plusieurs facteurs, notamment : la nature du métal central et du ligand et de la
composition du milieu (pH, solvant, ions étrangers, etc.).
Ayoub HATEB 2eme Année

Les acides amino-carboxyliques sont des excellents agents complexant; le plus utilisé d'entre eux est l'acide
éthylène diamine et l'EDTA.
Cette méthode est basée essentiellement sur les propriétés de l’acide éthylène-diamine-tétra acétique, sel
disodique et de ces complexes métalliques. On le note H2Y.

A. Introduction aux dosages complexometriques

2+ 2+
I. Action du complexon iii sur les ions C a et M g
1. Le complexon III (acide éthylène diamine tétra acétique sel disodique)
Il cristallise avec 2molécules d’eau ; il est très soluble dans l’eau
N a,+ CO−2 CH 2 N +a , CO2

−
CH 2
N CH 2 CH 2 N
HO2 C CH 2
CO2 H CH 2
On le symbolise par : EDTA N a2 , 2H 2 O OU N a2 H 2 Y , 2H 2 O
Dans l’eau N a2 H 2 Y 2 N +a + [H 2 Y ]2−
2. Réaction avec les cations (complexation)

L’atome d’azote possède un doublet libre capable de réaliser une liaison donneur-accepteur avec un cation.
D’autre part les H des fonctions acide carboxylique(- CO2 H ) peuvent partir et il peut se former deux liaisons avec le
cation
EQUATION-BILAN : [H 2 Y ]²¯ + C 2+
a [C a Y ] ²¯ + 2H −
Remarque :
- Le donneur de doublé dans un complexe est appelé « ligand ».

Dans le cas présent, le ligand donne plusieurs doublés ; le calcium semble saisi entre les pinces de l’ion complexant
(ligand). Le complexe obtenu est un chélate.
II. DETERMINATION DES DIFFERENTES DURETES D'UN EAU PAR

COMPLEXOMETRIE
1. Définitions de quelques concepts

● Dureté totale: C’est la concentration en ions calcium et en ion magnésium d’une eau.
● Dureté calcique : C’est la concentration en ion Ca2+ d’une eau.
● Dureté magnésienne: c'est la concentration en ion Mg2+ d'une eau.
● Dureté permanente : C’est la concentration en ion Ca2+ et en ion Mg2+ d’une eau après ébullition
prolongée et filtration.
● Dureté temporaire : C’est la concentration en ions magnésium et calcium enlevé par filtration.
III. Détermination expérimentale des différentes duretés d'une eau par

complexométrie
1. But
La détermination de la dureté d’une eau par complexométrie est une technique permettant d’avoir une idée
sur la potabilité d’une eau .Cette manipulation permet de connaître la teneur en ion calcium Ca2+ et
magnésium Mg2+ d’une eau ; en effet elle permet de voir si l’eau mousse bien pour des utilisations
industrielles ou ménagères.

2. PRINCIPE
en présence du réactif de
Il s’agit d’un dosage direct de la solution de sel disodique de l’EDTA par Ca 2+
PATTON et REEDER selon la réaction suivante :
H2Y2-+Ca2+ CaY2-+2H+
H2Y2--+Ca.Ind CaY2-+2H++Ind2- (en fin de dosage)
Rouge (H2Ind bleu)
3. Mode opératoire
❖ Matériels
✔ Becher de 600 ml ou ballon à fond plat (500ml ou 1l)
✔ Burette
✔ Eprouvette de 10 ml
✔ Fiole jaugée (de 250 ml, 1l); fiole jaugée de 1 l.
✔ Pipette de 50 ml de classe A;
✔ Pipette jaugée de 10 ml
✔ Entonnoir et papier filtre
✔ Erlenmeyer de 250 ml
✔ Spatule
✔ Trépied+toile+bec Bunsen

❖ Produits :
✔ Solutions à environ 0.01 du sel disodique de l’EDTA
✔ Une solution calcique étalon à environ 0,01 molaire préparée à partir de CaCO3
chimiquement pur
✔ Eau à analyser et eau distillée
✔ Solution de la soude à environ 2 mol/l
✔ Réactif de Patton et Reeder, si possible en dilution solide dans NaCl à 1% en masse
✔ Tampon ammoniacal à pH=10
✔ Noir ériochrome T en pastilles ou en solution dans l’alcool à 95° GL (0,8g dans
200ml)
✔ Solution du complexe magnésien de l’EDTA à environ 10g/l
✔ Carbonate de calcium pur pour analyse.
IV. Manipulation
1. Étalonnage d'une solution d'EDTA
❖ Réactifs
● Une solution d'environ 0,01 molaire du sel disodique de l'EDTA.
● Une solution calcique étalon 0,01 molaire préparée à partir de CaCO3 chimiquement
pur.
● De la soude à environ 2 mol.l-1.
● De l'acide chloridrique dilué au demi.

● L'indicateur de Patton et Reeder en dilution solide, à raison de 1 g de réactif intimement mélangé à

100 g de chlorure de sodium, chimiquement pur et finement pulvérisé.
2. Détermination de la dureté de l’eau
1. Principe
Il s’agit d’un dosage direct de la solution de sel disodique de l’EDTA par Ca2+ en présence du réactif de PUTTON et de
REEDER selon la réaction : H 2 Y 2− + C a2+ C a Y 2− + 2H +
H 2 Y 2− + C a ind C a Y 2− + 2H + + ind2−
2. Mode opératoire
a. Préparation de la solution calcique étalon

On prépare 1000ml de solution à 0,0100mol/L ; on part de C a CO3 chimiquement pur et sec qui est le sel de calcium
auquel on peut accorder le plus de confiance.
Déterminer la masse de C a CO3 à peser (masse molaire=100,09g. mol−1 ) ?
Faire passer cette masse avec le minimum d’eau dans une fiole jaugée de 1000ml. Ajouter HC l au ½ goutte à goute
jusqu’à fin d’effervescence et dissolution totale du carbonate de calcium (utiliser un minimum d’acide
chlorhydrique).
Ajuster au trait de jauge à l’eau distillée.
DOSAGE :

C EDT A =?
H 2 Y 2− V 1=8,8 ml
C C a CO = 0, 01mol.L−1
3
C a CO3 V C a = 10ml
+ N a OH à 2M, 10ml et 1 pincée de Patton de Reeder
3. Résultats :
A l’équilibre on a : nEDT A = nC a CO3
C EDT A × V 1 = C CaCO3 × V CaCO3 Avec V 1 = 8, 8ml
AN :

3. Determination de la durete totale d’une eau
a. Définition :
C’est un concept ancien utilisé pour décrire la teneur en ions C 2+ 2+
a et M g des eaux.
b. Dosage
❖ Préparation de la solution
Dans un erlenmeyer de 250ml on met :
● 50 ml d’eau à analyser
● 2,5ml de tampon pH=10
● une pincée de l’indicateur coloré NET
● 1 ml de complexons magnésien
Dans une burette on met de l’H2Y2-, le volume versé est V2.
C EDT A = 0.011mol/l
H 2 Y 2− V 2 = 15ml
C C a M g = Dureté totale
V eau = 50ml

● On dose immédiatement en agitant constamment.

● On vers rapidement au début du dosage puis lentement vers la fin
● On ajoute la solution de sel disodique de l'EDTA goutte à goutte dés que la couleur de la solution
commence à virer du rouge au bleu.
● La couleur ne doit plus changer par addition d'une goutte supplémentaire de solution titrante,
A l’équilibre on a la couleur bleue et V 2 = 15ml
On a nEDT A = nC a M g C EDT A • V 2 = C C a M g • V eau

4. Détermination de la dureté calcique
Dans une fiole jaugée de 50 ml on met :
● 50 ml d’eau à analyser
● 10ml de NaOH à 2M
● Une pincée de Patton et Reeder
● 1 ml de complexons magnésien
C EDT A = 0, 011 mol/l
V 3 = 14
C C a = Dureté calcique
V eau = 50ml
A l’équilibre on a une coloration bleue et V 3 = 14ml

On a: nEDT A = nC a C EDT A • V 3 = C C a • V eau
5. Détermination de la dureté magnésienne
6. Détermination de la dureté permanente

a. Préparation de l’eau
Dans un bécher de 600ml, on met 250 ml d’eau à analyser
Mettre à bouillir cette eau 20 à 30 min de façon à réduire le volume initial d'environ 1/3
Refroidir à la température ordinaire
Filtrer sur l matériel sec
Laisser égoutter le bécher sur le filtre sans le rincer ni rincer le filtre
Transvaser quantitativement le filtrat dans une fiole jaugée de 250 ml
Ajuster au trait de jaugé à l'eau distillée
Bouillir l’eau jusqu’au point de repérage Filtrer l’eau bouillie

b. Dosage
On prépare sur une prise d'essai de 100 ml du filtrat ainsi obtenu

Y ajouter 5 ml de tampon pH=10,02g (ou 2 ml) d'indicateur Net ou 1 ml de Mg Y2- à 10 g/l
Précision du dosage:2,8 %
C EDT A =0,011 mol/l
V 4 = 8, 3ml
C permanante =?
V eau = 100ml
A l’équilibre on a V 4 = 8, 3ml
nEDT A = npermanant C EDT A • V 4 = C permanante • V eau

7. Détermination de la dureté temporaire
B. Dosage des chlorures par argentimétrie

I. Methode de charpentier volhar
1. But :
Déterminer la concentration en Cl.
2. Principe
Il s’agit d’un dosage en retour c'est-à-dire que les ions chlorures contenus dans la solution à titrée sont mis en présence
d’un excès d’AgNO3 et seront titré par une solution de thiosulfate de potassium ou d’ammonium de concentration
connue en présence d’un indicateur coloré : l’alun de fer et d’ammonium.
3. Mode opératoire

3.1 Minéralisation E=10 ml de lait
XClˉ=?
10 ml de AgNO3 (TAg= 0,1 M , E1=10ml)
10 ml de HNO3 concentré
5 ml de KMnO4 solution saturé
Dans un Erlenmayer on ajoute dans la solution 20ml d’eau robinet on aura donc une solution claire.
On l’a bouille pendant 15mn à feux doux ensuite on ajoute 3ml d’indicateur coloré + 30ml d’eau distillée.

3.2 Dosage de l’excès d’Ag
● On laisse refroidir la solution précédente.
● on ajoute 50ml d’eau distillée à l'aide d'une éprouvette et 3 ml d'indicateur coloré.
KSCN ( CSCNˉ,V1 =7,5 )
+50 ml d'eau distillée
+3 ml d'alun de fer
3.3 Etalonnage de la solution de thiocyanate
Dans un erlenmeyer de 250ml,
● on introduit TA=0,1 mol/l de solution de nitrate d’argent.

● 50ml d’eau distillée.

● 10ml d’acide nitrique concentré
● 2 ml de solution( alun de fer et d'ammonium).
Ensuite on titre rapidement par SCN puis on note le volume V2 correspondant au volume versé avant
d’atteindre l’équivalence.
KSCN ( CSCNˉ,V2 =18

)
+ 50 ml d'eau distillée
+AgNO3( TAg=0,1 M, E

2=10 ml )
+ 10 ml de HNO3
+3 ml d'alun de fer
4. Resultats
A l’équivalence exprimer XCl en fonction de V1 ; V2 ; E1, E2 ,TAg, E.
A l’équivalence on a :
nAg =nSCN + nCl
Tag*E1 =CSCN*V1+XCl*E

T Ag *E2
XCl*E=TAg*E1- V2 *V1
V 2*T Ag *E1−T Ag *E2*V 1
X Cl = V 2*E

C. Dosage des protéines d’un blanc d’œuf par clorimétrie par la méthode du
Biuret
Introduction
Au cours des différentes manipulations faites durant notre séance de travaux pratiques le dosage des
protéines par colorimétrie par la méthode du Duret été l'un des objectifs de cette séance, le présent rapport
nous donne une idée générale sur les différentes démarches ainsi que les résultats obtenus.
I- But
Le but de ce dosage est la détermination de la concentration en protéines totale dans un blanc d'œuf.
II- Principe
Tout composé possédant au minimum deux liaisons peptidiques va développer en milieu alcalin et en
présence d'ion Ca2+ une coloration bleu violet caractéristique dont la teinte est fonction du nombre de liaison
peptidique. En milieu alcalin, les composés contenants au moins deux groupements

-CONH- ou -CONH2 voisins forment avec les ions Cu2+ un complexe bleu violet (coloration du biuret
H2N-CO-NH-CO-NH2). Cette coloration est ainsi caractéristique des peptides et des protides qui possèdent
la liaison peptidique –CONH-.
La vitesse de développement de la coloration, sa teinte, et son intensité dépendent de :
l’alcanité et du [Cu2+]. On utilise le réactif de Gornall (sulfate de cuivre II + tartrate double de

sodium et de potassium + soude) pour solubiliser les protéines, même dénaturé.
la température
la nature de la protéine.
Le maximum d’absorption se situe vers 530-540nm et varie avec le nombre de
Liaisons peptidiques. L’intensité de coloration est proportionnelle à ce nombre.
On utilise un sérum contenant un mélange de protéine, comme étalon un sérum de commerce connu.
III- Mode opératoire

1. Etalonnage du spectrophotomètre

1.1. Dilutions
A partir d’un sérum étalon à 50g / l, on procède à une préparation de 5ml des dilutions suivantes, à l’aide
d’eau physiologique (NaCl 0,9%) : 1/10 ; 1/20 ; 1/40 ; 1/80
1ml
Eau 9ml
5ml 5ml 5ml 5ml à
Rejeter
5ml sérum étalon
1/10 1/20 1/40 1/80
1ml 1ml 1ml 1ml

1ml eau
Distillée
Tubes N°0 N°1 N°2 N°3 N°4
4ml de RG 4ml de RG 4ml de RG 4ml de RG 4ml de RG
RG= Réactif de Gornall
Vt= volume total
On ajoute dans les différents tubes 4ml de réactif de Gornall ; on mélange puis on attend 20mn, à
température ambiante, à l’obscurité. La coloration est stable plusieurs heures après.
La gamme d’étalonnage sera présentée dans un tableau récapitulatif des différentes données.
La coloration est stable plusieurs heures après.
La gamme d’étalonnage sera présentée selon un tableau en précisant la quantité de protéines en mg par
tube.

1.2. Lecture au spectrophotomètre

On lit la densité optique de chaque tube contre le blanc à λ=540 nm
2. Dosage des protéines totales
2.1. Dilution du blanc d'œuf au 1/20
1/20
E1
E2
1ml
1ml
0.5ml de blanc d’œuf
Plus 9.5ml d’eau

VE1 = VE2 = 5ml
On prend un tube à eau, on met 0,5 ml du blanc d'œuf et 9,5 ml d'eau physiologique, on homogénéise, on
prend ensuite un autre tube et on met 1 ml du premier tube, après on ajoute 4 ml de Gornall et on incube
pendant 20 min et on lit au spectrophotomètre.
1. Questions
Donner le tableau de composition des tubes.
Tracer la courbe d’étalonnage A=f (g proteines.dm-3)
Déterminer la protéinémie du sérum analysé exprimée en g/l
3. Résultat
3.1. Courbe d'étalonnage
Calculons les quantités en mg de protéine par tube
m = C x V x dilution

Ainsi pour les différents tubes nous avons :
Tube 1: m1 = 50 x 1 x1/10 = 5 mg
Tube 2: m2 = 50 x 1 x 1/20= 2,5mg
Tube 3: m3 = 50 x 1 x1/40 = 1,25mg
Tube 4: m4 = 50 x 1 x 1/80 = 0,625mg
Gamme d'étalonnage : tableau récapitulatif
Nº TUBE 0 1 2 3 4 PT
Eau distillée 1
SE au 1/10 1
SE au 1/20 1
SE au 1/40 1
SE au 1/80 1
Blanc d'œuf 1
Réactif de Gornall 4 4 4 4 4 4
Masse des 0 5 2,5 1,25 0,625 3,2
protéines par tube
en mg
Absorbance 0 0,382 0,262 0,181 0,017 0,248
Tableau récapitulative des données absorbance et masses de protéines
Tube 0 1 2 3 4 PT

Masse de 0 5 2,5 1,25 0,625 3,2

protéines/tub
e
Absorbance 0 0,382 0,262 0,181 0,017 0,248
on trace la courbe des absorbances en fonction des masses de protéines par tube.
mx est
trouvé par projection de Ax sur l'axe des abscisses.
3,2 mg/ml
mx =
Cp= mx*20
Cp= (3.2*20) g/l
AN: Cp= 64 g/l

Courbe d'étalonnage

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Le​ ​dosage du calcium et du magnésium par complexométrie dans

Ayoub HATEB 2eme Année

Ayoub HATEB 2eme Année

A. Introduction aux dosages complexometriques

1. Le complexon III (acide éthylène diamine tétra acétique sel disodique)

Il cristallise avec 2molécules d’eau ; il est très soluble dans l’eau

N a,+ CO−2 CH 2 N +a , CO2

On le symbolise par : EDTA N a2 , 2H 2 O OU N a2 H 2 Y , 2H 2 O

Dans l’eau ​N a2 H 2 Y 2 N +a + [H 2 Y ]2−

2. Réaction avec les cations (complexation)

- Le donneur de doublé dans un complexe est appelé « ligand ».

Ayoub HATEB 2eme Année

II. DETERMINATION DES DIFFERENTES DURETES D'UN EAU PAR

1. Définitions de quelques concepts

III. Détermination expérimentale des différentes duretés d'une eau par

Ayoub HATEB 2eme Année

H​2​Y​2--​+Ca.Ind CaY​2-​+2H​+​+Ind​2- ​ (en fin de dosage)

Rouge (H​2​Ind bleu)

Ayoub HATEB 2eme Année

1. Étalonnage d'une solution d'EDTA

Ayoub HATEB 2eme Année

● L'indicateur de Patton et Reeder en dilution solide, à raison de 1 g de réactif intimement mélangé à

2. Détermination de la dureté de l’eau

a. Préparation de la solution calcique étalon

Déterminer la masse de C a CO3 à peser (masse molaire=100,09g. mol−1 ) ?

Ajuster au trait de jauge à l’eau distillée.

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+ N a OH à 2M, 10ml ​et 1 pincée de Patton de Reeder

A l’équilibre on a : nEDT A = nC a CO3

C EDT A × V 1 = C CaCO3 × V CaCO3 Avec V 1 = 8, 8ml

Ayoub HATEB 2eme Année

3. Determination de la durete totale d’une eau

Ayoub HATEB 2eme Année

● On dose immédiatement en agitant constamment.

A l’équilibre on a la couleur bleue et V 2 = 15ml

On a nEDT A = nC a M g ​ C EDT A • V 2 = C C a M g • V eau

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4. Détermination de la dureté calcique

C EDT A = 0, 011 mol/l

A l’équilibre on a une coloration bleue et V 3 = 14ml

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On a: nEDT A = nC a C EDT A • V 3 = C C a • V eau

5. Détermination de la dureté magnésienne

6. Détermination de la dureté permanente

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Bouillir l’eau jusqu’au point de repérage​ ​Filtrer l’eau bouillie

Ayoub HATEB 2eme Année

On prépare sur une prise d'essai de 100 ml du filtrat ainsi obtenu

C EDT A =0,011 mol/l

nEDT A = npermanant C EDT A • V 4 = C permanante • V eau

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7. Détermination de la dureté temporaire

B. Dosage des chlorures par argentimétrie

Ayoub HATEB 2eme Année

3.1 Minéralisation ​E=10 ml de lait

10 ml de AgNO​3 ​(T​Ag​= 0,1 M , E​1​=10ml)

5 ml de KMnO​4 ​solution saturé

Ayoub HATEB 2eme Année

3.2 ​Dosage de l’excès d’Ag

​KSCN​ ​( C​SCN​ˉ,V​1 ​=7,5 )

+50 ml d'eau distillée

3.3 ​Etalonnage de la solution de thiocyanate

● on introduit T​A​=0,1 mol/l de solution de nitrate d’argent.

Ayoub HATEB 2eme Année

Le dosage du calcium et du magnésium par complexométrie dans

Dans l’eau N a2 H 2 Y 2 N +a + [H 2 Y ]2−

H2Y2--+Ca.Ind CaY2-+2H++Ind2- (en fin de dosage)

Rouge (H2Ind bleu)

+ N a OH à 2M, 10ml et 1 pincée de Patton de Reeder

On a nEDT A = nC a M g C EDT A • V 2 = C C a M g • V eau

Bouillir l’eau jusqu’au point de repérage Filtrer l’eau bouillie

3.1 Minéralisation E=10 ml de lait

10 ml de AgNO3 (TAg= 0,1 M , E1=10ml)

5 ml de KMnO4 solution saturé

3.2 Dosage de l’excès d’Ag

KSCN ( CSCNˉ,V1 =7,5 )

3.3 Etalonnage de la solution de thiocyanate

● on introduit TA=0,1 mol/l de solution de nitrate d’argent.

KSCN ( CSCNˉ,V2 =18

+AgNO3( TAg=0,1 M, E

nAg =nSCN + nCl

Le maximum d’absorption se situe vers 530-540nm et varie avec le nombre de

2.1. Dilution du blanc d'œuf au 1/20

Tube 1: m1 = 50 x 1 x1/10 = 5 mg

Tube 2: m2 = 50 x 1 x 1/20= 2,5mg

Tube 3: m3 = 50 x 1 x1/40 = 1,25mg

Tube 4: m4 = 50 x 1 x 1/80 = 0,625mg

Cp= (3.2*20) g/l

AN: Cp= 64 g/l