Manual Biología Celular 2004

Introducción
El microscopio es una herramienta de uso ineludible en el campo de diversas

áreas científicas, tal es el caso de la Histología, Embriología, Microbiología, Biología
Celular, Diagnóstico Clínico, Micología, Protozoología, Parasitología, etc.
Es considerado como una herramienta que ha jugado un papel muy importante

en los avances científicos; se puede decir que señala el inicio de la Biología moderna, a
partir de las observaciones de los estudiosos del siglo XVII; Hooke; Leeuwenhoek y
otros.
El microscopio es un instrumento óptico mecánico que modula energía y

aumenta el ángulo de visión humana para producir imágenes amplificadas de un objeto
cualquiera.
Actualmente existen varios tipos de microscopios, los cuales se han clasificado

de acuerdo a diferentes criterios como son:
1. Número de pasos de imagen producidos en el microscopio.

2. Tipo de energía empleada o modulada por el microscopio en la producción de
la imagen.
Según el número de pasos de imagen los microscopios se clasifican en simples o

compuestos.
Tomando en cuenta el tipo de energía que utilizan para la formación de la

imagen se pueden clasificar en: fotónicos, electrónicos y de rayos X.
MICROSCOPIO COMPUESTO. El microscopio compuesto se compone de una

parte mecánica y una óptica:
Manual de Laboratorio de Biología Celular

1
Parte Mecánica. La base del microscopio, suficientemente pesada para ser estable,
soporta la platina fija, sobre la que se coloca la preparación a observar.
Fig. 1 Partes de las que están formados los microscopios compuestos
La preparación se mantiene por un carro, con desplazamientos rectangulares,

con un vernier.
En algunos aparatos la platina puede tener desplazamientos verticales. Gracias a

una cremallera (tornillos macros y micrométricos) que regulan la puesta a punto. En
otros casos la platina solo se desplaza horizontalmente.
El brazo, parte rígida, soporta el dispositivo porta ocular y el revolver o

portaobjetivos.
2
En el monocular los dos dispositivos están separados por un tubo, de manera
que la distancia entre el ocular y el objetivo sea de 170 mm.
Fig. 2 Apertura Numérica
En los binoculares, un sistema de prismas reemplaza al tubo.
El dispositivo porta ocular es un tubo simple en el monocular o en el Binocular,

es donde se encuentran los prismas. Los dos oculares se pueden desplazar de acuerdo
a la distancia entre ambas pupilas del observador, y además uno de los oculares es
móvil sobre su eje para corregir las diferencias de convergencia entre los dos ojos.
El portaobjetos o revolver, permite su desplazamiento por rotación y permite

sustituirlos. Bajo la platina se halla el porta condensador móvil, conteniendo el
diafragma. Debajo de él, un espejo permite regular la fuente luminosa.
Parte Óptica. La fuente luminosa, es de filamento de tungsteno. El espejo, que

tiene una cara plana y la otra cóncava, debe, a partir de una fuente luminosa, enviar un
haz de rayos paralelos al eje óptico del microscopio.
El condensador, es una lente que enfoca la luz en el preparado, permitiendo la

formación de un cono con el vértice en el preparado y la base en el lente frontal del
3
objetivo. La entrada de luz se regula con el diafragma iris. El diámetro de abertura del
diafragma depende del campo y debe coincidir con él. La abertura de luz debe ser
menor a la abertura del objeto usado. Se regula por medio de diafragmas anulares.
Las características de los objetivos son las siguientes:
Abertura numérica (AN); que es el seno del semi-ángulo máximo formado por los
rayos que pueden penetrar en el lente frontal del objetivo (Fig. 2)
Aumento; agrandamiento de la imagen introducida por el objetivo, el objetivo

produce una imagen real del preparado dentro del microscopio. El aumento se mide en
diámetros (X) Hay objetivos de los, 25X, 4OX y lOOX (inmersión)
Corrección de aberraciones; para formar una imagen clara, el lente debe enfocar
cada rayo de luz desde un punto del preparado dando un punto de la imagen. Cuando
esto falla, se llama aberración.
Objetivo
El propósito de ésta práctica es el de conocer y manejar el microscopio
compuesto, además de conocer el funcionamiento de otros tipos de microscopios..
Material
• Papel seda. • Portaobjetos y cubreobjetos
• Preparaciones fijas • Azul de metileno
• Abatelenguas. • Goteros.
• Palillos de dientes. • Agua de estanque.
• Microscopios compuestos
Método
1. Familiarízate con cada una de las partes del microscopio y sus nombres.
2. Con el papel seda realizar limpieza de los lentes de los objetivos.
3. El objetivo de inmersión límpialo con papel seda, no uses solventes orgánicos, ya
que puedes disolver el material que mantiene sujeta la lente.
4. Familiarízate con el funcionamiento de cada parte que componen el microscopio.

4
5. Observa a través de los oculares utilizando ambos ojos y ajusta la entrada de luz
abriendo o cerrando el diafragma.
6. Observa las preparaciones fijas que serán proporcionadas por tu profesor. Empieza
observando con el objetivo de menor aumento y aumenta gradualmente la
resolución. Esquematiza tus observaciones de cada caso indicando el aumento
utilizado.
7. Observa una gota del agua de estanque. Utiliza el método anterior. Esquematiza tus
observaciones de cada caso indicando el aumento utilizado.
8. Realiza un raspado de la cavidad oral de tu compañero. Utiliza células del carrillo.
9. Coloca una pequeña gota en un portaobjetos y homogeneiza en ella lo obtenido del
raspado.
10. Coloca una gota de azul de metileno, un cubreobjetos y observa la preparación.
Empieza con el objetivo de menor aumento.
11. Esquematiza tus resultados indicando el aumento utilizado
Resultados
Esquematiza tus resultados.
Discusión y Conclusiones
Discute en equipo tus resultados y saquen sus conclusiones, anotándolas en sus
bitácoras.
Cuestionario
1. ¿Cómo se calcula el aumento de observación en el microscopio compuesto?
2. Define que es el poder de resolución y cómo se calcula.
3. ¿Qué es la apertura numérica y como se relaciona con el poder de resolución?
4. Explica el funcionamiento de los siguientes microscopios. Señala las diferencias que
existen entre ellos:
I. Microscopio electrónico.
II. Microscopio electrónico de barrido.
III. Microscopio de contraste de fases.
IV. Microscopio de fluorescencia.
5. No olvides incluir tu bibliografía.

5
Introducción
Refiriéndose a células vegetales concretamente, estudiaremos los bulbos
de la cebolla, los cuales están formados por células vivas pluripotenciales o
meristemáticas de las cuales pueden crecer hojas y raíces cuando la cebolla se
planta o cuando se almacena en un lugar húmedo. Otras células del bulbo son
menos activas y forman una capa que recubre las hojas de la cebolla. Una de las
características notorias en las células vegetales, es la presencia de la pared
celular, esta no se presenta en las células animales y es de composición química
diferente a la que presentan las bacterias.
En cuanto a las células animales, estudiaremos células de la cavidad oral

y observaremos las diferencias que existen con las vegetales algunas diferencias
pueden observarse con el microscopio óptico otras, necesitan de técnicas mas
complejas y microscopios con mayor poder de resolución tal es el caso de los
cloroplastos.
Objetivo
Observar células vegetales y animales para comparar su estructura
tamaño.
Material
• Microscopio óptico

6
• Bulbos de cebolla
• Solución de lugol o azul de metileno
• Un gotero de agua destilada
• Un portaobjetos y cubreobjetos
• Una navaja de rasurar
• Células de la cavidad oral
• Palillos de dientes
Procedimiento
Parte 1
1. desprender la capa mas delgada y transparente de la cebolla que corresponde a

la epidermis
2. preparar un pedazo de la epidermis de aproximadamente 1cm2
3. colócalo sobre un portaobjetos con una gota de agua de manera que la
superficie de contacto con el bulbo quede hacia arriba
4. tiñe la preparación por capilaridad con una gota de colorante
5. realiza los dibujos correspondientes identificando las estructuras observadas.
Indique cada caso los aumentos de cada observación
6. observa con el objetivo de menor aumento y contesta lo siguiente:
7. cuan es la forma general de las células?
8. Tienen paredes celulares? Menciona su función y composición química
9. Cual es el color y forma del núcleo
10. Que posición guarda el núcleo con relación ala célula completa
11. Describe las características del citoplasma de las células.
Parte 2
1. Coloca una pequeña gota de agua en un portaobjetos limpio.

2. Con el extremo mas ancho del palillo de dientes frota ligeramente la cara
interna de la mejilla. Mezcla la muestra con movimiento rotatorios con el agua
colocado en el portaobjetos
3. Agrega la gota del colorante y cubre la preparación
4. Localiza las células a bajo aumento. Busca las células completas y aplanadas
(no dobladas o rotas). Céntralas en el campo y obsérvalas a mayor aumento.
5. Identifica el núcleo y el citoplasma.
6. Realiza los dibujos correspondientes indicando los aumentos a los que se
realizó la observación.
7. Cual es la relación entre el diámetro de la célula y la del núcleo?
8. Compara morfología y estructura entre las células vegetales y animales.

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Resultados
Esquematiza tus resultados.
bitácoras.
Cuestionario
1. De acuerdo a tus observaciones que diferencias estructurales y
morfológicas encontraste entre células vegetales y animales.
2. Menciona brevemente las diferencias entre tamaño, morfología, y
estructura existentes entre bacterias, protozoarios, hongos, plantas y
animales.
3. Que conclusiones se obtienen de acuerdo al objetivo planteado.
4. Bibliografía consultada.

8
Introducción
Las Investigaciones realizadas en el campo de la Biología Celular con frecuencia
se llega a la necesidad de conocer con exactitud la cantidad de células utilizadas en los
experimentos.
Para hacer un recuento directo de

una población celular se necesita un
microscopio de campo claro y una
cámara de Neubauer.
La cámara de Neubauer, también

es conocida como hemocitómetro o
cámara cuenta glóbulos, consta de un
cubreobjetos de un grosor mucho mayor
que los portaobjetos de uso común (Fig.
Fig. 3 Hemocitómetro o Cámara de 3)
Neubauer
En la cara superior del portaobjetos, se encuentran cuatro canales longitudinales

y un canal transversal central, a cuyos lados superior e inferior existen grabados dos
cuadrados de 9 mm2 de superficie, subdivididos a su vez en una en una cuadrícula mas
fina (Fig. 4)

9
Usando el objetivo de 10X podemos enfocar uno solo de los cuadrados de 1 mm 2
de superficie, siendo el cuadrado central de la zona cuadriculada el que se usa para
contar con el número de células de una población problema.
La superficie del cuadro

central es de 1 mm2
subdividida en 25 cuadros que
miden 0.2 mm por lado y por
lo tanto con una superficie
cada uno de ellos de 0.04 mm2
(Fig. 4)
Al colocar el
cubreobjetos encima de la
superficie donde se encuentra
grabada la cuadrícula, existe
entre ellos (cuadrícula y
portaobjetos) una distancia fija
(profundidad) de 0.1 mm., Por
tanto el volumen de la muestra
problema es uno de los
cuadros grandes (de 1 mm2 de
superficie) será igual a 1.0 mm
× 0.1 mm = 0.1 mm3.
Fig. 4 Cuadrícula de
conteo celular de la Cámara
de Neubauer
Las técnicas de conteo consideran el número de individuos presentes en una

muestra de volumen determinado y comúnmente se expresan como número de
individuos por cada milímetro, ya que 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3 y como 1000 mm3 =
10,000 × 0.1 mm3, entonces 1 ml = 10,000 veces el volumen de la muestra, que como
ya se vio, es siempre de 0.1 mm3.
Vamos a suponer que se hizo un conteo de células en el cuadro central de la

cuadrícula, obteniéndose la cifra de 320 células. Para expresar el número de células
por mililitro, se multiplica 320 × 10,000 mm3. El resultado es de 3,200,000 células / ml
10
PROBLEMAS DE CONTEO
En la práctica de la cuantificación, del número de individuos existentes en una
muestra problema, pueden surgir diferentes situaciones que pueden ser resueltas de la
siguiente manera:
1. Se puede dar el caso de que existan entre 200 y 300 células en los cuadros de
1mm2 de superficie, en tal situación solamente hay que multiplicar por 10,000 el
número de células contadas. El resultado será igual al número de células/ ml
2. Puede ser que en el cuadro central (1 mm2 de superficie) el número de células
sea inferior a 200, en cuyo caso será necesario usar mas cuadros para llegar a
contar las 200 o 300 células requeridas
3. En el cuadro central puede haber un número muy superior a 200 células, por lo
que sería sumamente laborioso hacer el conteo de todas ellas. En este caso se
toman en cuenta los cuadros mas pequeños (de 0.04 mm2 de superficie) y se hace
el conteo de 200 a 300 solamente.
4. Para obtener el resultado se divide el número total de células contadas entre el
número de cuadros de 0.04 mm2 de superficie que forman el cuadro grande central
de 1mm2 de superficie, el resultado será el número de células por ml, solamente hay
que multiplicar el dato anterior por 10,000.
5. Puede haber un número tan elevado de células que sea imposible discriminar
unas de otras impidiendo un conteo correcto; en este caso habrá que diluir la
suspensión multiplicando el número final de células por el factor de dilución
empleado.
Objetivo
Determinación del número de células de levadura en una suspensión.
Material
o Matraz de 250 ml o Vasos de precipitado de 500 ml
o Pipeta de 1 ml o Probetas de 10 ml
o Papel seda o Agua destilada
o Sobre de levadura seca o Microscopio compuesto

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o Cámara de Neubauer
Método
o PARTE A
1. Limpiar con papel seda la cámara de Neubauer.

2. Colocar el cubreobjetos en el lugar correspondiente.
3. Mezclar un gramo levadura en 100 ml de agua destilada agitando hasta que
la suspensión sea homogénea.
4. Pipetear 0.1 ml de suspensión, colocar la punta de la pipeta en la cámara de
tal manera que muestra vaya entrando por capilaridad (Fig. 4), sin caer en los
canales. Si se llegaran a formar burbujas, repita todo el procedimiento, lavando la
cámara previamente con agua destilada.
5. Colocar la cámara de Neubauer en la platina del microscopio y enfocar a
menor aumento (10X)
6. Localizar el cuadro central y enfocar las células de levadura que se
encuentran.
7. La cuadrícula que se usa como guía para el conteo es de 0.2 × 0.2 mm. Al
contar el número de células en la cuadrícula se deben de tomar dos
precauciones:
a) No contar la misma célula en mas de una ocasión.

b) Omitir contar células.
8. Para obtener resultados lo más exactos posibles, hay que contar entre 200 y
300 células en cada muestra.
o PARTE B
1. Con una micropipeta se obtienen células de la parte interna

de la mejilla
2. Se resuspenden en 250 microlitros de PBS
3. De la suspensión anterior se toman 50 µl y se mezclan con
200 µl de azul tripán al 4% en PBS.
4. Se carga la cámara de Neubauer para su conteo al
microscopio.

12
Resultados
1. Esquematice y explique los resultados
2. Calcule el número de células por ml
3. Calcule el porcentaje de viabilidad
bitácoras.
Cuestionario
1. En la Fig. 5 se muestra el aspecto de la cámara de cuenta central del
hemocitómetro con una muestra de un cultivo diluido 1:10 con diversas especias de
protozoarios del suelo. Se hizo la cuenta y se dio un resultado de 2.5 × 106
protozoarios / ml de cultivo ¿es correcto el dato?
2. Suponga que el cuadrado grande del centro de la celdilla contiene 53 células de
levadura. Se hace la cuenta de los cuatro cuadros de los vértices y se encuentra
que contiene 51, 54, 55 y 60 células respectivamente. ¿Cuál es la mejor estimación
del número total de células de levadura en cada ml del cultivo original?
3. Se tiene una suspensión de células de levadura de la que se sospecha que
contiene aproximadamente 3 × 108 células en cada ml ¿Cuantas células habrá en
cada diezmilésimo de ml? ¿Cuánto habrá que diluir una muestra de este cultivo
antes de hacer la cuenta en el hemocitómetro para obtener aproximadamente 300
células en uno de los cuadros grandes?

13
Introducción
La célula se comunica con su medio a través de la membrana, estructura lipídica
por medio de la cual intercambia nutrientes. La bicapa lipídica es altamente
impermeable a muchas moléculas polares. Con el fin de transportar dichas moléculas,
las membranas poseen proteínas específicas para el transporte. Algunas proteínas
transportadoras funcionan como enzimas, ya que tienen sitios específicos para la
molécula que va a ser transportada. Otras proteínas sólo catalizan la difusión facilitada
y otro tipo de proteínas transportadoras funcionan con cambios conformacionales
producidos por la hidrólisis del ATP.
Fig. 8 Esquema de una membrana mostrando algunas de las partes que la

componen

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En general, el transporte puede ocurrir por medio de tres mecanismos:
a) Difusión simple. Ocurre a favor de un gradiente de concentración. No
necesita energía.
b) Difusión facilitada. Ocurre a favor de un gradiente de concentración.
Dependencia parcial de la energía celular. Necesita de transportadores proteicos.
c) Transporte activo. Ocurre en contra de un gradiente de concentración,
razón por la cual se requiere de energía metabólica en la forma de ATP.
Fig. 9 Paso de moléculas a través de una membrana a favor de un

gradiente de concentración.
Objetivo
El propósito de ésta práctica es determinar el efecto de lisis en células de
levadura en presencia de soluciones de diferente concentración y cuantificar dicho
efecto.

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Material
o Imanes o Portaobjetos y cubreobjetos.
o Hemocitómetro o 6 Tubos de ensaye 13 x 100.
o 1 Matraz erlenmeyer de 100 o 6 Pipetas serológicas de 10 ml
o Microscopio compuesto. o Agitador magnético.
o Centrífuga clínica. o Levadura seca activa
Fleischmann.
o Solución salina al 1.5 %. o Solución glucosada al 6 %.
Método
1. Cada equipo deberá pesar 50 mg de levadura y disolverla vigorosamente en el
matraz con 50 ml de SSF al 0.75%. Ayudarse con el agitador magnético y los
imanes.
2. A cada tubo agregar 7 ml de esta suspensión y centrifugarla por 2 min a 2,500 rpm.
3. Tirar el sobrenadante y resuspender el botón en 7 ml de las soluciones con una de
las siguientes concentraciones ara cada tubo.
Tubo No. NaCl ml Tubo No. Glucosa ml

%
1 0.4 7 4 1.5 7
2 0.75 7 5 3.0 7
3 1.5 7 6 6.0 7
4. Dejar reposar los tubos por 2, 5 y 10 mm.

5. Terminada la incubación, determinar el número de células por mililitro en un
hemocitómetro. Observa cuidadosamente la morfología celular y cuenta sólo las
células intactas.
6. Determina cuáles de las soluciones se comportan como hipertónicas, isotónicas
e hipotónicas.

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Resultados
1. Esquematiza tus resultados observados en cada caso.
2. Determina el número de células por mililitro en cada uno de los tubos
experimentales.
3. Determina la velocidad de lisis celular en cada caso.
bitácoras.
Cuestionario
1. Explica que es el gradiente electroquímico.
2. Explica los siguientes términos y menciona ejemplos de moléculas transportadas en
cada caso:
a. Transporte uniporte
b. Transporte simporte
c. Transporte antiporte.
3. Explica el funcionamiento de la bomba Na/K
4. Explica los mecanismos que se conocen para el transporte de glucosa.
5. ¿Cómo interactúan las terminaciones nerviosas con el músculo para desencadenar
la contracción muscular?
6. No olvides incluir tu bibliografía.

17
Introducción
En la adaptación de muchos organismos, tanto unicelulares como pluricelulares
están involucrados los cilios. El movimiento ciliar tiene diversas funciones: desplazar al
individuo, eliminar partículas de desecho o tóxicas, formar corrientes para el
intercambio gaseoso y alimenticio, actividad sensorial, etc.
Fig. 10 Partes del Cilio en corte transversal
Los cilios y flagelos están constituidos por microtúbulos, formados por tubulina,
en un arreglo ultra estructural característico, 9+2 y 9+0 en el cuerpo basal. Además de
la tubulina, se encuentran otras proteínas involucradas, las cuales funcionan
coordinadamente para producir el movimiento.

18
El movimiento ciliar es diferente en varías especies de organismos. En las
células ciliadas de algunos órganos, como las branquias de moluscos bivalvos o en la
tráquea de varios vertebrados, el movimiento ciliar no es simultáneo, formándose ondas
de desplazamiento denominadas ondas metacrónicas.
Para el movimiento ciliar, es necesario un gasto de energía proporcionada por

ATP, la cual es degradado, mediante ATPasas Conocidas como brazos de dineína
localizadas en los microtúbulos periféricos que conforman el cilio.
Objetivo
El propósito de ésta práctica es observar el movimiento ciliar metacrónico en las
branquias del ostión (Cassostrea sp.) en condiciones normales y experimentales.
Material
oPortaobjetos y cubreobjetos oMatraces de 150 ml
oErlenmeyer oCajas de Petri
oTijeras, bisturí oAceite de inmersión
oTubo de vidrio de 5 mm. de oTapón de hule del No. 2
Diámetro bihoradado.
oHielo. oTermómetro.
o Tres ostiones por equipo o grupo oMicroscopio compuesto.
de trabajo.
o Microscopio Compuesto oPinzas de disección.
• SOLUCIONES
Solución No. 1 KCN 0.05 M. Filtrar el liquido obtenido de siete ostiones y preparar con
éste una solución de KNC 50 mM, suficiente para todo el grupo.
Solución No. 2. Humo de tabaco. Filtrar el líquido de siete ostiones y preparar con éste
una solución saturada de CO2 burbujeada con humo de cigarro como lo
marca la Fig. 12.

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Método
1. Abrir las valvas del ostión.
2. Cortar el músculo aductor que une al ostión con su valva derecha (Fig. 11)
3. Colocar en la caja de petri el organismo sobre su valva izquierda, tratando de no
derramar el líquido que contiene.
4. Depositar el líquido de tres ostiones en un matraz. Preparar con ese líquido la
solución de trabajo correspondiente: KCN 0.05 M, humo de tabaco o solución fría
(40C)
5. Descubrir el cuerpo del molusco cortando el manto que lo cubre. (Fig. 11)
6. Tomar cuatro trozos de la región de las branquias, de aproximadamente 5 mm.
por lado cada uno y colocarlos en cuatro portaobjetos excavados etiquetados
como: A, B, C y D.
7. Al portaobjetos A agregarle 2 gotas de líquido frío y mantenerlo sobre hielo.
• Al portaobjetos B agregarle 2 gotas de solución de KCN.
• Al portaobjetos C agregarle 2 gotas del preparado de humo de tabaco. (Fig. 12)
Fig. 11 Representación Esquemática de Cassostrea sp
• Al portaobjetos D agregarle 2 gotas de liquido natural a temperatura ambiente.

• Dejarlos en las soluciones respectivas entre 5 y 10 minutos, como máximo.

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8. Pasarlos a portaobjetos planos y colocarles el cubreobjetos. Presionar ligeramente.
Fig. 12 Preparación de la Solución Saturada de CO2
Resultados
1. Anotar lo observado en cada preparación.
2. Comparar el movimiento ciliar en cada caso y analizar los resultados, en la discusión
y conclusiones.

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Discute en equipo tus resultados y saquen sus conclusiones, y anótenlas en sus
bitácoras.
Cuestionario
1. ¿Cuáles son las estructuras de movimiento en procariotas y eucariotas? Compara la
ultraestructura de ambas.
2. Esquematiza y explica como se lleva a cabo el movimiento ciliar en eucariotas.
3. Menciona en que especies se observan los cilios de ultraestructura 9+2. ¿Existen
organismos superiores que presentan estas estructuras? Menciona ejemplos de
células con cilios.
4. Explica cuál es la importancia del citoesqueleto en movimiento y desplazamiento.
5. Incluye tu bibliografía.

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Introducción
En los vegetales superiores los cloroplastos se presentan generalmente como
cuerpos ovales de 5 a 10 mm de largo por 2 a 3.5 mm de grosor. Es en los cloroplastos
donde se llevan a cabo las reacciones fotosintéticas de las células eucariotas.
La clorofila es uno de los constituyentes químicos más importantes de las

membranas tilacoides de los cloroplastos. El papel que desempeñan en los eventos
fotosintéticos ha sido motivo de intensas investigaciones. Actualmente se sabe que en
la membrana tilacoidea se encuentran varios pigmentos, los cuales difieren en sus
aspectos de absorción y por lo tanto en la longitud de la onda con la cuál son
excitados.
La absorción de la luz por los pigmentos fotosintéticos es el primer evento de la

fotosíntesis, siendo la clorofila el principal elemento fotosintético de las algas y plantas
superiores. Se conocen 2 tipos de clorofilas (a y b) las cuales forman los fotosistemas
conocidos como P700 y P680 respectivamente. Además, los vegetales presentan
pigmentos varios como a y b carotenos. Xantofilas, luteína, etc.; las cuales optimizan el
proceso fotosintético.
En el laboratorio es posible identificar y separa los pigmentos involucrados en

fotosíntesis mediante técnicas que van de lo rudimentario a lo sofisticado. Debido a la
naturaleza pigmentada de tales compuestos es sencillo cuantificarlos y determinar en
espectro de absorción de cada uno de ellos mediante el uso del espectrofotómetro.
El proceso fotosintético en plantas superiores, lo podemos separar en dos

eventos: el primero de ellos llamado fotoquímico o reacción de Hill, requiere de energía
luminosa y sus productos principales son el ATP, NADPH y O2.

23
Fig. 13 Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos.
El segundo evento, también llamado la fase oscura de la fotosíntesis o ciclo de

Calvin, requiere del ATP y las coenzimas reducidas (NADPH) para transformar, por
medios bioquímicas, el CO2
En carbohidratos y otros productos.

En 1937, Robert Hill observó que un homogenado de hojas conteniendo
cloroplastos intactos, tenían la capacidad de reducir el oxalato de potasio férrico (un
aceptor artificial de electrones) en presencia de la luz con desprendimiento de O2.
La absorción de la luz por pigmentos fotosintéticos es el primer evento de la

fotosíntesis, siendo la clorofila el principal pigmento en las algas y plantas superiores.
Debemos recordar que la fotosíntesis se optimizan en los vegetales gracias a la

presencia de pigmentos, cada uno de ellos con espectros de absorción característicos,
de tal forma que se cuenta principalmente con dos fotosistemas importantes P700 y
P680.

24
Actualmente se sabe que las reacciones fotoquímicas de la fotosíntesis se llevan
a cabo en el sistema de membranas tilacoides, que se encuentran en el interior de los
cloroplastos, mientras que las reacciones de la fase obscura se realizan en el estoma.
Fig. 14 Esquematización de cloroplastos y sus partes internas
Objetivo
Esta práctica tiene como propósito los siguientes puntos:
1. Determinar la concentración de clorofila presente por cada gramo de tejido de hojas

de espinaca.
2. Identificar los pigmentos fotosintéticos en hojas de espinaca.
3. Determinar el espectro de absorción.
4. El objetivo de esta práctica es determinar colorimétricamente la actividad
fotosintética de los cloroplastos aislados, cuantificando la concentración de clorofila
presente en la suspensión de cloroplastos.

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Material
o Mortero o licuadora o Tubos de centrifuga
o Matraz Erlenmeyer o 12 tubos de ensaye
o 6 tubos para espectrofotómetro o Probetas graduadas de 100 ml
o Pipetas de 10 ml o Agitadores de vidrio
o Hielo picado o Papel seda
o 2 pipetas graduadas de 10, 5 y 1 o 50 ml de NaCl 0.35 M en Buffer
ml de fosfatos 0.01 M pH 7.2
o 1 vaso de precipitado de 50 ml o 6 tubos de centrifuga de 15 ml
o 1 probeta de 100 y 50 ml o Pipetas de 5 ml
o Cubreobjetos y portaobjetos o Pipetas Pasteur
o Bulbos para pipetas o Charola grande
o Papel 7444aluminio o Papel filtro
o Agua destilada o Papel filtro Whatman No. 1
o Pipetas graduadas de 0.1 ml o Gasa
o 1 lámpara de luz incandescente o 1 cronómetro (reloj)
de 150 watts
o Toallas de papel o Papel parafilm
o Balanza granataria o Microscopio óptico
o Embudo o Centrifuga clínica
o Espectrofotómetro o Hojas frescas de espinaca.
o NaCl 0.35 M o Buffer Tris Base 0.2 M pH 8.0
o Buffer de fosfatos 0.01 M pH 7.2 o Lugol
o Matraz de 250 ml o Acetona al 80%
o 4 ml de DCPIP 0.3 mM o Hexano
o Etanol o Acetona
o Dietil Éter

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Precaución: El material biológico, las soluciones, y la cristalería usadas
en este experimento, deben estar a una temperatura entre 0 y 5 °C antes y
durante la practica. Utilice una hielera con hielo picado para colocar sus
soluciones.
Método
o DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN Y EL ESPECTRO DE
ABSORCIÓN DE LA CLOROFILA.
1. Seleccionar algunas hojas frescas de espinaca, lavarlas con agua de la

llave, y secarlas con toallas de papel.
2. Con una navaja de afeitar cortar el tallo y la nervadura principal de cada
hoja. Desecharlos.
3. Pesar 500 gr. De superficies foliares y molerlas con 100 ml de NaCl 0.35
M mas 10 ml de buffer tris 0.2 M pH 8.0.
4. Filtrar en varias capas de gasa humedecidas en buffer.
5. Colocar 30 ml del filtrado en tubos de centrifuga y centrifugar a 1,700
rpm durante 5 min. Decantar el sobrenadante en tubo limpio y volver a
centrifugar a 2,500 rpm por 10 min. para sedimentar los cloroplastos
intactos. Desechar el sobrenadante.
6. Resuspender el sedimento en 2 o 3 ml de NaCl 0.35 M revolviendo
suavemente.
7. Lavar tres veces el sedimento con NaCl 0.35 M, centrifugando a 3,000
rpm por 8 min. cada tiempo.
8. Desechar el sobrenadante y resuspender los cloroplastos en 10 ml de
NaCl 0.35 M. Rotular como Suspensión de Cloroplastos.
9. Colocar 0.1 ml de la suspensión de cloroplastos en un tubo de ensaye y
agregarle 20 ml de acetona AL 90%.
10. Agitar el tubo suavemente.
11. Filtrar a través de papel filtro (Whatman No.1)
12. Recoger el filtrado en un tubo de espectrofotómetro y leer a 652 nm de
longitud de onda. Observe al microscopio tiñendo con lugol.
13. Usar la solución de acetona 90% como blanco de reactivos.
14. Multiplicar el valor de la absorbancia por 5.8 para obtener los miligramos
de clorofila por mililitro de suspensión de cloroplastos.
15. Determinar el espectro de absorción leyendo los tubos a 420, 480, 520,
620 y 680 NM.
o ACTIVIDAD FOTOSINTÉTICA Y CONCENTRACIÓN DE LA

CLOROFILA

27
1. Seleccionar algunas hojas frescas de espinaca lavarlas con agua de
la llave y secarlas con toallas de papel.
2. Con una navaja de afeitar cortar el tallo y la nervadura principal de
cada hoja. Desecharlos.
3. Pesar 10 gr de superficies foliares y colocarlas en un mortero y
agregar 20 ml de NaCl 0.35 M en buffer de fosfatos 0.01 M pH 7.2
4. Moler durante 4 o 5 minutos en el mortero, licuar durante 30
segundos.
5. Filtrar la suspensión usando 8 capas de gasa, recoger el filtrado en
un matraz.
6. Repartir equitativamente el filtrado en dos tubos de centrífuga.
7. Decantar el sobrenadante en otros dos tubos de centrífuga y
centrifugarlos a 2500 rpm durante 5 min.
8. Decantar el sobrenadante y desecharlo.
9. El sedimento se resuspende con 2 ml de NaCl en buffer de fosfatos.
Marcar este tubo como “Suspensión de cloroplastos “
10. Tomar con una pipeta pasteur, una gota de la suspensión
cloroplastos y observarla al microscopio.
11. Para determinar la concentración de clorofila, colocar en un tubo de
centrífuga 0.2 ml de la suspensión de cloroplastos y agregarle 5 ml de
acetona al 80%.
12. Cubrir con parafilm, agitar por un minuto e incubar el tubo en la
oscuridad por 5 min. decantar el sobrenadante en un tubo de
espectrofotómetro y leer su absorbancia a 649 y 665 nm. , calibrando el
cero de absorbancia con acetona al 80%
13. Para determinar la reducción del DCPIP preparar 5 tubos como lo
indica la tabla siguiente, tener cuidado de adicionar en último término el
DCPIP.
Tubo NaCl 0.35 M Suspensión Suspensión DCPIP (ml)

en buffer de de
PO4 0.01M cloroplastos cloroplastos
(ml) (ml) hervidos (ml)
1 6.0 0.2 ---- 1.0
2 6.0 0.2 ---- 1.0
3 6.0 0.2 ---- 1.0
4 6.0 ------ 0.2 1.0
14. Tapar los tubos con papel parafilm y mezclar su contenido

invirtiéndolo suavemente Evitar la formación de burbujas.
28
15. Medir inmediatamente la absorbancia de cada uno de los tubos a
540 nm de longitud de onda. Anotar los resultados (tiempo cero)
16. Cubrir el tubo 3 con papel de aluminio, el tubo 2 mecerlo en un vaso
de precipitado que contenga hielo.
17. Colocar todos los tubos frente a una lámpara de 150 watts a 60 cm
en un vaso de distancia.
18. Durante 5 min. y a intervalos de 1 min. tomar nuevamente lectura de
todos los tubos en el espectrofotómetro.
Resultados
1. Gráfica tus resultados obtenidos del espectro de absorción
2. Que resultado obtuviste en el punto A.
3. Con los Resultados obtenidos en el punto B 17 realizar una gráfica,
interpretarla y discutirla.
5. Calcular la concentración de clorofila en mg/ ml con la siguiente fórmula.
(6.45) × (Abs 649nm)

____________________
(17.72) × (Abs 649 nm)
Discute en equipo tus resultados y saquen sus conclusiones, anótenlas
en sus bitácoras.
Cuestionario
1. ¿Que concentración de Clorofila obtuviste?. Explica como determinaste la
concentración
2. ¿Cuales fueron tus resultados con los diferentes solventes?
3. Si estos son diferentes explica porque
4. Explica la relación entre estructura y función de los cloroplastos
5. Discute el papel del DCPIP en el modelo que utilizaste
6. Explica como se lleva acabo el gradiente electroquímico y cuál es su
importancia en la fotosíntesis
29
7. Incluye tu bibliografía.

30
Introducción
Cuando se tiñen células con colorantes básicos, sus núcleos presentan
zonas densamente teñidas como las observadas alrededor del nucleolo,
correspondientes a la heterocromatina y zonas con coloración ligera, la
eucromatina.
Barr y Bertram al estudiar la

fisiología neural en gatos observaron la
presencia de un pequeño cuerpo
basófilo redondeado en el núcleo de
gatos hembras. Después de varios
estudios, se concluyó que se trataba de
cromatina sexual.
Posteriormente se comprobó que este

cuerpo era solo uno de los dos
cromosomas X, el cual se conservaba
condensado y el segundo, extendido y
por tanto imposible de detectar.
Este cuerpo puede ser identificado

Fig. 22 Micrografía electrónica durante la interfase con el microscopio
mostrando los diferentes tipos de de luz.
cromatina
Como las mujeres y los animales
hembras poseen cromosomas X
provenientes de ambos progenitores, el
azar determina cuál de ellos quedará
condensado.
De hecho se ha observado que en un solo organismo, las células

somáticas presentan un mosaico de cromosomas sexuales condensados. Esto
es dentro de un mismo organismo las células hepáticas pueden presentar
31
condensado el cromosoma X p y las células epiteliales el cromosoma X m. Se
ha descubierto que el número de corpúsculos de Barr es igual al número de
cromosomas X menos uno.
Objetivo
El propósito de esta práctica es observar el corpúsculo de Barr en
células de epitelio bucal de mujeres y comparar con el mismo tipo celular de
hombres.
Entender el significado de la presencia de estos cuerpos en las células
somáticas.
Material
o Portaobjetos o Abatelenguas
o Cubreobjetos o Barniz o parafina
o Células de epitelio bucal de o Microscopio compuesto
mujeres y hombres.
SOLUCIONES
1. Alcohol ácido: etanol-acético (3:1)

2. HCl 1N
3. Acetorceína 2%
4. Ácido acético
Método
1. Lavar perfectamente los portaobjetos y cubreobjetos con una mezcla de
alcohol etílico-ácido acético 45% (3:1)
2. Con el abatelenguas raspar la parte interna de la mejilla para tomar la
muestra de epitelio
3. Depositar el material en el portaobjetos y hacer un frotis
4. Etiquetar el portaobjetos según el origen de la muestra
5. agregar una gota de HCl 1N y dejarla por un minuto
6. absorber el ácido con una toalla de papel
7. Agregar una gota de acetorceína y dejar 15 minutos
8. Lavar con el ácido acético dejándolo gotear sobre el portaobjetos
inclinado
9. Colocar el cubreobjetos y sellar sus bordes con barniz o con parafina
caliente

32
10. Observar al microscopio, con los objetivos de bajo aumento después de
la inmersión.
APÉNDICE
Para obtener mejores resultados es necesario filtrar la solución de

acetorceína
Momentos antes a la realización de esta práctica, para que el precipitado no

interfiera con la observación
Resultados
Esquematiza y explica tus resultados
Discute en equipo tus resultados y saquen sus conclusiones, anótenlas en sus
bitácoras.
Cuestionario
1. Explica el proceso por medio del cuál se establece el mosaico de células
femeninas
2. Explica cuál es la importancia de esta técnica en genética médica
3. Cuales son las limitantes de esta técnica ¿
4. Explica cuales son las diferencias funcionales entre la cromatina
condensada y la cromatina extendida

33
Introducción
La mitosis es esencialmente la misma en células vegetales y

animales, y solo existen diferencias en los detalles las estructuras
celulares son difíciles de observar debido a que carecen de color y son
casi transparentes en la célula viva.
Una célula generalmente no da evidencias de su notable

capacidad para reproducirse sino hasta que empieza el proceso.
Diversos estudios confirman que la mitosis presenta dos etapas
principales: en la primera los cromosomas se dividen y aparecen como
estructuras pareadas conocidas como cromátidas, cada una de estas
llega a ser un cromosoma en las nuevas células, la segunda fase implica
la división del citoplasma. Sin embargo es muy difícil observar en las
preparaciones la secuencia de cada una de las fases que conforman la
mitosis.
Objetivo
Observar la mitosis en células vivas y tratar de identificar las
fases tanto en las preparaciones como esquemáticamente
Material
1. Semillas en germinación (fríjol , haba u otra)
2. Navaja
3. Pinzas y alfileres
4. Hidrolizante
5. HCl 10N
6. Acetorceína
34
7. Portaobjetos
8. Cubreobjetos
Procedimiento
1. Con la navaja corta la zona del meristemo o pical de la raíz germinada
(punta de la raíz), coloca los fragmentos en el portaobjetos y agrega el
hidrolizante.
Aplica el colorante acetorceína. Comprime (squash) sobre la
preparación agregando una gota de ácido acético. Realiza las
observaciones correspondientes y los esquemas de lo observado
2. Observa el esquema anexo que corresponde a células de una raíz de
cebolla. Cuantas fases de la división puedes reconocer, numéralas y
márcalas indicando la fase en la que se encuentra.
Resultados
1.- Describe las etapas de la división celular
2.- Cuales cambios en la célula indican que la división esta próxima a
efectuarse
3.- Menciona por separado las diferencias y semejanzas entre las mitosis de
células vegetales y células animales
4.- Que conclusiones se obtuvieron de acuerdo al objetivo planteado
5.- Menciona la bibliografía consultada.

35

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