Laboratory: Originators of Aerobic Photosynthesis ‐ the Cyanobacteria 

Objectives 
1. Be able to explain the evolutionary and ecological importance of cyanobacteria. 
2. Be able to recognize and know the function of the basic components of a cyanobacterial cell. 
3. Be able to recognize the diversity of cyanobacterial forms and know the function of any specialized cell types 
that they use. 
4. Understand the importance of cyanobacteria that occur in symbiotic relationships. 
5. Be able to sight ID to genus the list of cyanobacteria included in this section. 
6. Be able to explain and/or identify the terms in the Vocabulary list at the end of this laboratory. 
 
Background 
The  cyanobacteria,  which  are  also  called  cyanophytes  or  blue‐green  algae,  are  a  group  of  oxygen 
producing  photosynthetic  Bacteria.  Referring  to  them  as  blue‐green  algae  is  fine  so  long  as  you  remember  that 
most  algae  are  eukaryotes,  whereas  blue‐green  algae  are  not.  The  cyanobacteria  are  arguably  one  of  the  most 
important groups of organisms to ever evolve. They have radically altered the path of evolutionary events over the 
last 3.5 billion years, and they continue to be pivotal organisms in today’s ecosystems. 
Cyanobacteria were the first organisms to evolve the capacity to use water as an electron donor during the light 
reactions of photosynthesis, rather than electron donors such as hydrogen sulfide that other bacterial 
photosynthetic predecessors used. The switch to water meant that oxygen was now the waste product of 
photosynthesis. As oxygen levels accumulated in the atmosphere, the older groups of bacteria were relegated to 
refugia where oxygen could not penetrate; such as in sediments – and these refugia are where you find these older 
forms today. Another reason that cyanobacteria are considered so important to the evolution of other life forms is 
that the buildup of oxygen meant that it was possible for ozone to form, and that meant that less destructive 
ultraviolet radiation was reaching the earth’s surface. 
Cyanobacteria are also very important ecologically because they are one of the few prokaryotic groups capable of 
nitrogen fixation, or the conversion of atmospheric nitrogen (N2) to ammonia (NH3) by nitrogenase. The ammonia 
can then be used by the cyanobacteria, other prokaryotes and by eukaryotes. No eukaryotes are capable of 
nitrogen fixation! 
 
The cyanobacteria are also important because they can produce blooms in ponds and lakes some of which are 
lethal or very damaging to many organisms including vertebrates. Other cyanobacteria, like Spirulina, are sold in 
health food stores, and this genus is also used by farmers to increase the protein content in their cattle feed. 
 
Modern concepts of cyanobacteria include the prochlorophytes. These are oxygen producing photosynthetic 
bacteria that have chlorophyll’s a and b, no phycobilisomes, and stacked thylakoids. In contrast, most 
cyanobacteria have only chlorophyll a, phycobilisomes, and therefore unstacked thylakoids. Despite these 
phenotypic differences between prochlorophytes and classic cyanobacteria, the prochlorophytes are now 
considered cyanobacteria because gene data show that ‘prochlorophytes’ have evolved from blue‐green 
cyanobacteria at least three times (See dark boxes on the right). 

  1
 There  are  no  synapomorphies  for  all  cyanobacteria  but  a 
blue‐green  cyanobacterium  can  be  easily  identified  by 
using a combination of homologous characters. 
 

 Prokaryotic cellular organization (thus no double 
membrane bound organelles, mitosis, cytokinesis, 
sex, or microtubules) 
 O2 evolving photosynthesis 
 No flagella; do have coccoid cells, colonies, and 
filaments (sheath + trichome); filaments can be 
uni‐, bi‐ or multiseriate. 
 Unstacked thylakoids 
 Phycobilisomes w/ chlorophyll a and accessory 
phycobiliprotein pigments (phycocyanin, 
allophycocyanin, phycoerythrin) 
 Often blue/green (cyan) in color 
 Cyanophycean starch 
 Nitrogen fixation w/ nitrogenase 
 Heterocyst present in derived clades 
 Asexual reproduction by endospores, exospores, hormogonia, or akinetes 
 
The Basic Cyanobacterial Cell 
Use the electron microscope images on the bench in order to be able to recognize and know the function of the 
following cellular features: 
Mucilagenous sheath: Keeps cells together for colonial taxa; UV absorption; captures micronutrients; may detain 
herbivores 
Cell wall (outer membrane, peptidoglycan layer, plasmalemma): Cyanobacteria are gram‐negative bacteria 
because, along with other gram‐negative bacteria that are not cyanobacteria, they have an outer membrane 
(OM) that prevents the gram stain from reacting with the peptidoglycan in the underlying wall. The 
peptidoglycan layer in cyanobacteria is particularly thick. There is another membrane to the inside of the 
peptidoglycan, called the plasmalemma or inner membrane (IM). 
Binary fission: The type of cell division done by prokaryotic cells; the new cell wall (septum, cross wall) forms from 
the outside towards the inside of the cell. The parent cell divides into two daughter cells of equal size. 
Unstacked thylakoid membranes: These membranes, in and upon which the light reactions of photosynthesis 
occur, are unstacked because the surface phycobilisomes prevent stacking. The thylakoids are parallel to each 
other and are free in the cytoplasm – i.e. they are not surrounded by a membrane system. 
Phycobilisomes: Form a half sphere of accessory pigments on the surface of the thylakoids; they are made of 3 
pigments: phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin; they absorb blue‐green to orange wavelengths and 
pass that energy to chlorophyll a. 
Carboxysome (Polyhedral body): Made of Ribulose bis‐phosphate Carboxylase/Oxygenase (rubisco) and is the site 
of carbon fixation in the cyanobacterial cell. 

  2
 Nucleoid: The cluster of prokaryotic DNA (i.e. circular chromosomes) in a prokaryotic cell. The DNA is not directly 
visible in the micrographs; the nucleoid is evident as a clear or open space surrounded by other cytoplasmic 
constituents, like 70s ribosomes. 
70s ribosomes: The site of protein synthesis (i.e. translation); prokaryotic ribosomes are slightly smaller than 
eukaryotic (80s) ribosomes. 
Gas vesicles: Are found in some planktonic species and, when present, confer positive buoyancy to the cell; they are 
made of protein and not membranes (and so should not be called vacuoles); they are formed during low light 
in order to get cells higher in the water column where there is more light; greater photosynthesis produces 
more cyanophycean starch which in turn results in more osmotic pressure within the cells and so the cylindrical 
vesicles collapse and the cells sink again. 
 
Setting up Kohler Illumination on the Compound Microscope 
 
1. Get a prepared slide and get it in focus with the 10x objective. 
2. Rotate the black ring at the bottom of the microscope until the resulting black polygon is as small as it can be in 
your field of view. 
3. Use the knob for the substage condenser to raise or lower the condenser to the point where the edges of the 
black polygon form a sharp black edge with a slight blue tinge. The light is now focused on the same plane as the 
specimen on your slide. 
4. Use the black ring at the bottom again to open the polygon so that it is close to the outer edge of the field of 
view. 
5. Now center the polygon in your field of view by gently turning the two silver knurled knobs under the stage. The 
light is now centered in your field of view. This completes Kohler illumination. 
6. Don’t forget to make further light adjustments as necessary. Light quantity is controlled by the dial on the 
microscope arm whereas the amount of contrast is determined by the iris diaphragm, which is a single lever 
located just underneath the stage. 
 
Diversity 
Traditionally, cyanobacteria have been classified on the basis on cell shape, how they reproduce, whether 
they are unicellular or colonial, the presence or absence of a sheath and the presence of specialized cells. Gene 
based analyses of phylogenetic relationships among cyanobacteria have shown that some of traditional groups 
actually are monophyletic, whereas other are polyphyletic. Not surprisingly, taxa with simple forms (e.g. unicells) 
appear to have evolved multiple times, whereas taxa with specialized cells (e.g. heterocysts, akinetes) form natural, 
monophyletic groups. However, taxonomic keys must rely on phenotypic characters for pragmatic reasons and     
so what follows is an array of cyanobacteria organized by the forms they take. 
 
Unicellular and colonial forms lacking specialized cells or reproduction 
Be able to recognize the plate‐like colony of coccoid cells that is typical for Merismopedia; be able to recognize 
this taxon as an example of a colonial rather than a multicellular taxon; be able to find examples of binary fission. 
Walls from different cells are not physically connected, which is why this taxon is not considered multicellular. 
However, Merismopedia is considered colonial because a common mucilaginous sheath holds the coccoid cells 
together. 
 
FOLLOW  STEPS  1  –  9  BELOW  IN  ORDER  TO  MAKE  YOUR  PREPARATION  AND  DOCUMENT  YOUR  WORK  WITH 
Merismopedia. 
 
1. Get a compound microscope from the cabinet in back of the room. 
 
2. Use freshwater to make a wet mount from the Merismopedia culture. Be sure not to add too much liquid. 
Your coverslip should not be sliding around on the surface of the slide. 
  3
 
3. View the cells in the microscope in order to familiarize yourself with how the microscope works and to 
ensure that you have some colonies present. Don’t do any drawing or photography yet. 
 
4. Take your Merismopedia slide off of the stage and put a very small drop of India ink on one edge of the 
cover slip. Use a small piece of paper towel to pull the ink underneath the coverslip. 
 
After making a slide, you may find that a stain or some kind of background color is necessary to improve 
viewing of the organism. In this case, the India ink is not staining anything. It can only occur in the space 
not occupied by the cyanobacterium and its mucilaginous sheath. India ink is frequently used to detect a 
sheath that might otherwise be difficult to detect by only adjusting the iris diaphragm. 
 
5. Now view your colonies at 400X magnification. Draw some of the colonies and cells in your lab notebook, 
which  you  may  want  to  splice  into  your  lab  manual.  Use at  least  a  half  page  for your drawing.  Colored 
pencils can help a lot. The quality of your drawing should be good enough for you to identify features and 
to help you remember information during your future studying. 
 
Your drawing should contain a date and labels. 
 
6. Add  a  scale  bar  to  your drawing.  There  should  be  a  micrometer  in  one of  your  eyepieces.  Calculate  the 
diameter  of  a  typical  cell  in  your  colony  by  using  the  below  table.  You  need  to  know  your  total 
magnification (eyepiece * objective lens) as well as the number of micrometer units it takes to span the 
diameter of your representative cell. Then you can use the conversion factor in the below table to add a 
scale bar to your drawing that describes the cell diameter in mm or um; the latter are more often used. 
 
magnification  mm/unit  µm/unit 
40X 0.028 28
100X 0.011 11
400X 0.0028 2.8
1000X 0.0011 1.1
 
7. View Merismopedia using the oil immersion lens. Before doing this, make sure that your coverslip is not 
sliding around on too much liquid. After focusing on some cells with the high/dry  objective, place these 
cells in the center of your field and then swing out the objective. Place a SMALL DROP of immersion oil on 
the cover slip spot that you were viewing. Carefully slide the immersion objective into place and find the 
cells again. You will find that when you move the stage, if you have put too much water underneath the 
coverslip then you will just be pushing the coverslip around the slide and you will have little control over 
what you are seeing. If your slide has been on the stage a long time, the light may start to dry off the slide 
and damage the alga. 
 
If you had not been told that Merismopedia was a cyanobacterium, how could you tell from looking at it 
that it is a prokaryote? 
 
8. CLEAN  THE  OIL  OBJECTIVE  LENS  WITH  LENS  TISSUE  WHEN  YOU  ARE  DONE.  ADD  FRESH  WATER  TO  THE 
LENS  TISSUE  AND  GENTLY  WIPE  THE  OBJECTIVES,  FOLLOWED  BY  THE  STAGE  AREA.  ONCE    OIL    GETS 
BEHIND THE LENS OF ANY OBJECTIVE THAT OBJECTIVE HAS TO BE THOWN OUT – VERY EXPENSIVE!! 
 
Make a wet mount of Microcystis with India ink as you did for Merismopedia. Note that the organization of cells 
in  this  colony  is  much  more  amorphous  than  Merismopedia.  This  is  probably  the  taxon  that  has  bloomed  on 
occasion  in  our local  lagoons  and  rivers and  resulted in  the death  of dogs. Draw and photographically  document 
Microcystis as you did for Merismopedia. The toxin produced is called microcystin and is a dangerous hepatotoxin 
for animals including humans. 
 
  4
 Filamentous cyanobacteria lacking spores, heterocysts, or akinetes 
 Make  a  wet  mount  of  Oscillatoria  and  note  the  oscillating  motion  of  the  filaments  (sheath  +  trichome  = 
f i l a m e n t ).  Add  India  ink  to  your  wet  mount  and  note  the  lack  of  a  mucilaginous  sheath  around  the  trichome. 
The  ink  technique will be  a  useful  technique  when, during  the  process  of  keying,  you  need  to  decide  how much 
of a  mucilage layer is present. 
 
 Examine  a  prepared  slide  of  Lyngbya.  Locate  the  mucilaginous  sheath  around  the  trichome  and  the 
hormogonia. A hormogonium is a segment of a larger filament that becomes detached (by programmed cell death) 
and then glides (i.e. oscillates) out of the parent sheath to form a sheath of its own. It is a simple ‘asexual’ way of 
reproducing for filamentous species. 
 
Heterocyst and akinete producing cyanobacteria 
Use the electron micrograph and light microscope images on the bench of heterocysts and akinetes in order to 
learn  how  to  recognize  them  and  explain  how  they  function.  In  comparison  to  other  cyanobacterial  cell  types, 
these are very specialized cells. 
Heterocyst: This cell type is specialized for nitrogen fixation by the enzyme nitrogenase. This enzyme is inhibited by 
oxygen,  which  explains  the  evolution  of  the  heterocyst  as  a  derived  character  within  cyanobacteria.  The 
heterocyst  has  an  extra  thick  wall  to  prevent  the  entry  of  oxygen,  and  it  has  fewer  photosystem  II  light 
harvesting complexes (also note the lower density of thylakoids in the micrograph) and so less oxygen will be 
produced by photosynthesis inside the heterocyst. In the light microscope image, the reduction in the density 
of light harvesting complexes is evident by the lighter pigmentation of the heterocyst. It is important to know 
that nitrogenase occurs in species that do not have heterocysts, but in these cases the nitrogenase can only 
function when the cells happen to be in a microanaerobic environment. 
Akinete:  This  is  a  resting  cell  that  is  able  to  persist  through  adverse  conditions.  The  akinete  is  filled  with  stored 
nitrogen (as cyanophycin granules) and carbon (cyanophycean starch) and it has an extra thick cell wall. When 
conditions improve the cytoplasm inside the akinete divides and pushes through the akinete wall. 

Make a wet mount of Anabaena and locate the intercalary heterocysts. In addition to its thick walls and paler 
yellow‐green color, polar nodules in the heterocyst may help to distinguish it from other vegetative cells. Akinetes 
can  occur  in  Anabaena  but  are  often  not  present  because  the  cultures  have  been  growing  in  non‐stressful 
conditions. 

Examine the prepared slides of Cylindrospermum and locate akinetes. Akinetes are often 2‐3 times as wide as 
normal vegetative cells and often 3‐4 times longer. In some taxa they have a spiny appearance. 

Be able to find akinetes in the fresh material of Cylindrospermum. 
Study the light microscope image of Scytonema on the bench in order to understand what is meant by “false 
branching.” 

Make a wet mount of Scytonema and note the heterocysts and false branching. 
True‐branching cyanobacteria 
Make a wet mount of Fischerella (similar to Stigonema) and note the true branching, heterocysts, and akinetes 
if present. Fischerella is uniseriate whereas Stigonema is multiseriate. 
 
Some mutualistic symbioses involving cyanobacteria 
Examine the fresh material of the lichen Peltigera. Make a thin cross‐section through the thallus and be able to 
  5
 locate the layer of nitrogen fixing Nostoc. 

Examine the fresh material of the water fern Azolla and locate the pockets of Nostoc. Do this by sectioning and 
then gently squashing the mesophyll of the fern leaf. 
 
Cyanobacterial Sight ID List 
Anabaena 
Calothrix 
Cylindrospermum 
Gloeocapsa 
Lyngbya 
Merismopedia 
Microcystis 
Nostoc 
Oscillatoria 
Scytonema 
Spirulina 
Stigonema 
Tolypothrix 
 
Vocabulary for cyanobacteria 
70s ribosomes 
Akinete 
Allophycocyanin 
Binary fission 
Carboxysome 
Chlorophyll a 
Coccoid  
Colonial 
Cyanophycean starch 
Cyanophycin granules 
False branching 
Filament 
Gas vesicles 
Heterocyst 
Hormogonium (pl. hormogonia) 
Inner membrane (plasmalemma) 
Mucilage sheath 
Nitrogenase 
Nucleoid 
Outer membrane 
Peptidoglycan 
Phycobilisome 
Phycocyanin 
Phycoerythrin 
RubisC/O 
Thylakoid 
Trichome 
True branching 

  6