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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO
ASIGNATURA SEROLOGÍA

INFORME DE LA PRÁCTICA Nº 3: Serología y reacciones serológicas

TÍTULO

Reacciones serológicas: Prueba de fijación de complemento, inmunocromatografía


y enzimoinmunoensayo (Elisa).
Autor(es):

Jessica Paola Llulema Chafla

Katerine Mishel Erazo Paredes

Bethy Marisol Lema Yanchaliquin

Marco Antonio Lema Balla

Profesora: Liliana M. Araujo Baptista Ph.D

Riobamba - Ecuador

Junio, 2020
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ÍNDICE

RESUMEN...................................................................................................................................

Palabras clave:..........................................................................................................................
INTRODUCCIÓN....................................................................................................................1

OBJETIVOS..............................................................................................................................2

Objetivo general......................................................................................................................2
Objetivos específicos...............................................................................................................2
MARCO TEÓRICO.................................................................................................................3

Inmunocromatografia..............................................................................................................3
Fijación de complemento........................................................................................................4
ELISA......................................................................................................................................5
Elisa no competitivos.....................................................................................................................6
ELISA Sandwich............................................................................................................................7
ELISA competitivo.........................................................................................................................7
MATERIAL Y MÉTODOS (PROCEDIMIENTOS)............................................................8

BIBLIOGRAFÍA.........................................................................................................................

ANEXOS......................................................................................................................................

Insertos de los reactivos............................................................................................................


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RESUMEN

Las reacciones serológicas se definen como reacciones antígeno anticuerpo que puede ser
observada en diferentes pruebas serológicas como como la fijación de complemento,
inmunocromatografía y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Elisa) cada una de estas
pruebas tiene como objetivo el estudio serológico de enfermedades infecciosas, para la
práctica se realizó un análisis serológico basado en inmunocromatografía para la detección de
HCG (gonadotropina coriónica humana) en suero o plasma para lo cual se siguió las
indicaciones descritas en el inserto obteniendo resultado positivos o negativo según lo indique
la prueba , que tiene como fundamento la migración de la muestra a través de una membrana
de nitrocelulosa en la cual la muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está
formado por un reactivo de detección unido a un anticuerpo específico contra uno de los
epítopos del antígeno que se desea detectar en la muestra del paciente. Si la muestra contiene
el antígeno en este caso la HCG, este se unirá al conjugado formando un complejo inmune y
migrará a través de la membrana de nitrocelulosa obteniendo un resultado positivo mientras
que si el antígeno problema ( HCG) no está presente en la muestra, migrarán el conjugado y
la muestra sin unirse es decir un resultado negativo

PALABRAS CLAVE: Fijación de complemento, inmunocromatografía, ELISA

INTRODUCCIÓN

Las reacciones serológicas, son reacciones antígeno-anticuerpo mediante la cual se puede


observar una reacción de aglutinación, fijación de complemento, reacciones de
inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa. Entre las reacciones antígeno anticuerpo se tiene
las reacciones de aglutinación en la cual los antígenos son particulados y se aglutinan cuando
se los pone en contacto con el anticuerpo específico. Se pueden realizar en tubo o en placa.
[CITATION HES97 \l 3082 ]

Las Reacciones de precipitación se caracterizan debido a que en estas reacciones el antígeno


es soluble y cuando con un anticuerpo específico da lugar a la formación de un precipitado
visible, otra prueba de precipitación es la prueba del anillo (en medio líquido) en la cual se
produce una precipitación cuando se pone en contacto la solución del antígeno con
el anticuerpo correspondiente (en tubo), también puede realizarse la inmunodifusión en
placas (medios sólidos).[ CITATION 2LE \l 3082 ]

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En las reacciones de fijación de complemento se define al complemento como un


complejo proteico, inestable, y termolábil presente en la sangre caliente; durante las
reacciones de antígeno anticuerpo se fija y se consume, por lo tanto, dicha reacción se detecta
midiendo la fijación del complemento, como no es una reacción visible, se agregan eritrocitos
sensibilizados con hemolisina específica. Si el complemento ha sido fijado por el complejo
antígeno anticuerpo no habrá complemento para la lisis de los glóbulos sensibilizados. Si el
antígeno y el anticuerpo no son específicos, el complemento permanece libre, se fija a los
eritrocitos y estos se lisan. En una prueba de fijación del complemento positivo no se
observa hemólisis, es una negativa ocurre lo contrario.[ CITATION HES97 \l 3082 ]

Las reacciones de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa son técnicas histoquímicas


empleadas para detectar y localizar antígenos y anticuerpos. El anticuerpo específico contra el
material en estudio se marca con sustancias fluorescentes o enzimas.[ CITATION 2LE \l 3082 ]

Las reacciones de ELISA van a ser técnicas inmunológicas que utilizan marcadores, los
anticuerpos y antígenos marcado con sustancias de actividad propia amplifican el poder de la
prueba, incrementando su sensibilidad. Se basa en la propiedad de algunos anticuerpos y
antígenos de ser absorbidos a un medio sólido que les permite construir una secuencia
ordenada de material biológico (anticuerpo, antígeno, anticuerpo conjugado con enzima) y
que puede ser visualizada por la reacción de color que se produce al agregar el sustrato
específico para la enzima que se encuentra conjugada al anticuerpo, permitiendo así una
adecuada cuantificación del antígeno.[ CITATION 2LE \l 3082 ]

OBJETIVOS

Objetivo general
Analizar los fundamentos de las técnicas inmunocromatografía, fijación de complemento y
enzimoinmunoensayo (Elisa) y ejecutar una prueba serológica basada en
inmunocromatografía siguiendo las recomendaciones del fabricante e interpretando
correctamente los resultados para contribuir al diagnóstico clínico

Objetivos específicos

1. Explicar el fundamento de las técnicas inmunocromatografía, fijación de complemento


y Elisa utilizadas en el estudio serológico de enfermedades infecciosas.

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2. Ejecutar el análisis serológico basado en inmunocromatografía cumpliendo con las


indicaciones descritas en el inserto para contribuir con el diagnóstico clínico.
3. Interpretar los resultados de la prueba serológica aplicada.

MARCO TEÓRICO

Inmunocromatografia

Figura 1 Tira de nitrocelulosa. Inmunocromatografìa

Es una técnica muy sencilla para la detección de todo tipo de proteínas con carácter
antigénico. Su rapidez y su fiabilidad hacen que su uso se extienda cada vez más, tanto para el
diagnóstico de parámetros bioquímicos como microbiológicos. Sobre todo se emplea como
método de screening, de modo que las pruebas con resultado positivo se confirman con otra
técnica analítica que valide el diagnóstico.

Tiene además, la ventaja de que pueden usarse todo tipo de muestras: sangre completa, suero,
heces, etc., en función del antígeno buscado. La preparación de la muestra suele ser muy
sencilla: solo necesita diluirse con un tampón de extracción que aumenta la fluidez de la
muestra y facilita su recorrido a través de la membrana.

La prueba utiliza como soporte una tira de nitrocelulosa, que puede ir dentro de una cascada o
en forma libre.[ CITATION Rom16 \l 2058 ]

En la tira de nitrocelulosa podemos distinguir tres zonas:

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 En la parte más cercana al lugar en el que se deposita la muestra, encontramos


anticuerpos de conejo dirigidos contra el antígeno buscado, en forma libre. Estos
anticuerpos están marcados generalmente con una partícula de oro coloidal, aunque
también puede ser látex (Ac).
 Hay una segunda zona, en la parte media de la tira, a la que están fijados a la
membrana anticuerpo de conejo frente al mismo antígeno buscado (Ac)
 Avanzamos en el recorrido de la tira y encontramos una tercera zona, donde se
encuentran fijados a la membrana unos anticuerpos anti-IgG de conejo (suelen ser de
cabra).

Si la muestra problema contiene los antígenos buscados, estos reaccionarán con los
anticuerpos libres marcados, dando lugar a complejo Ag-Ac. Al estar en un entorno fluido,
estos complejos migran por capilaridad a través de la membrana y se encuentran con la banda
de anticuerpos fijados no marcados. Se forma así el complejo Ag-Ac. Este complejo es visible
en forma de banda coloreada.

Los anticuerpos marcados libres siguen migrando por la membrana, ya que están en exceso y
se encuentran con los anticuerpos anti- Ig de conejo, dando lugar a otro complejo visible en
forma de banda coloreada. Esta última banda sirve de control para asegurar el correcto
desarrollo de la prueba y debe ser siempre positiva.

En el caso que la muestra no contenga el antígeno buscado, el resultado será negativo para la
banda de los anticuerpos fijados no marcados y será positiva para la banda control. [ CITATION
Rom16 \l 2058 ]

Fijación de complemento

Una propiedad importante del sistema del complemento es que sus componentes son
enzimáticamente alterados durante la reacción, de modo que no reaccionarán en una nueva
secuencia de reacciones, es decir si el complemento es consumido durante las reacciones
antígeno-anticuerpo esto es llamado fijacion de complemento y ocurre cuando un anticuerpo
de tipo IgG o IgM reacciona con el antígeno en presencia de complemento, aun cuando éste
no sea requerido en la reacción.[ CITATION Tor07 \l 2058 ]

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La prueba de fijación de complemento se lleva a cabo en dos fases. En la fase primera se


mezclan el suero del paciente (previamente calentado a 56°C) y el antígeno en presencia de
una cantidad determinada de complemento; esta mezcla es generalmente incubada durante 30
minutos a 37°C. Si se forman los complejos antígeno-anticuerpo, el complemento es fijado.

En la segunda fase se añade el sistema indicador que consiste en glóbulos rojos de carnero y
anticuerpos contra glóbulos rojos de carnero. La ocurrencia de hemólisis indica que el
complemento no fue utilizado por lo tanto, en la fase 1 no se ha producido una reacción Ag-
Ac específica.

En cambio, la ausencia de hemólisis, indica que el complemento ha sido fijado y por lo tanto
que en la fase 1 se ha producido una reacción Ag-Ac, en este caso se considera una reacción
de fijación del complemento positiva, mientras que en el primer caso se considera negativa la
reacción de fijación de complemento.
Utilizando un antígeno conocido, esta técnica puede ser empleada para detectar y medir
anticuerpos presentes en sueros. Al ocurrir la reacción del antígeno con los anticuerpos del
suero, ésta reacción Ag-Ac se puede poner de manifiesto mediante una prueba de fijación de
complemento[ CITATION Tor07 \l 2058 ]

Figura 2 Fijacion del complemento en una prueba positiva y negativa

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ELISA

Figura 3 Tipos de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se utiliza con frecuencia para medir la
presencia y/o concentración de un antígeno, anticuerpo, péptido, proteína, hormona u otra
biomolécula en una muestra biológica.

Es extremadamente sensible, capaz de detectar bajas concentraciones de antígenos. La


sensibilidad de ELISA se atribuye a su capacidad para detectar las interacciones entre un
único complejo antígeno-anticuerpo [CITATION Sul \l 2058 ]

Además, la inclusión de un anticuerpo específico de antígeno conjugado en enzimas permite


la conversión de un sustrato incoloro en un producto cromogénico o fluorescente que puede
ser detectado y fácilmente cuantificado por un lector de placas. En comparación con los
valores generados por cantidades valoradas de un antígeno de interés conocido, se puede
determinar la concentración del mismo antígeno en las muestras experimentales.

Se han adaptado diferentes protocolos ELISA para medir las concentraciones de antígenos en
una variedad de muestras experimentales, pero todos tienen el mismo concepto básico.

La elección del tipo de ELISA para realizar, indirecta, sándwich o competitiva, depende de
una serie de factores, incluyendo la complejidad de las muestras a probar y los anticuerpos
específicos de antígeno disponibles para su uso. El ELISA indirecto se utiliza con frecuencia
para determinar el resultado de una respuesta inmunológica, como la medición de la
concentración de un anticuerpo en una muestra. El sándwich ELISA es el más adecuado para
analizar muestras complejas, como sobrenadantes de cultivo de tejido, donde el analito, o
antígeno de interés, es parte de una muestra mixta.
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Por último, el ELISA competitivo se utiliza con mayor frecuencia cuando sólo hay un
anticuerpo disponible para detectar el antígeno de interés. Los ELISA competitivos también
son útiles para detectar un pequeño antígeno con un solo epítopo de anticuerpos que no puede
acomodar dos anticuerpos diferentes debido a la obstrucción estática..[ CITATION Sul \l 2058 ]

Elisa no competitivos

Pueden subdividirse de acuerdo al inmunorreactante inmovilizado, serán, por tanto, ensayos


de captura de anticuerpos o de antígenos. Entre los primeros se destaca el principio de ensayo
indirecto, en el cual los antígenos capturan a los anticuerpos y la reacción se evidencia por el
conjugado antiinmunoglobulina-enzima, o proteína A-enzima. La cantidad de enzima
enlazada indica la cantidad de anticuerpos en el suero y puede ser medida por la degradación
de su substrato. No obstante, debe tenerse en cuenta que su correlación con los ensayos in
vivo se afecta cuando la concentración de anticuerpos es baja, ya que el ELISA indirecto
tiende a sobrestimar los sueros de bajos títulos, probablemente esto se deba a la presencia de
inmunoglobulinas inespecíficas o anticuerpos de baja afinidad. Este método es el de elección
para detectar anticuerpos de clase IgG o IgA.

La IgM puede estudiarse previa absorción de los anticuerpos IgG, aunque este isotipo debe
evaluarse preferentemente con ensayos de captura IgM. Los ensayos indirectos presentan una
alta detectabilidad que depende de la densidad de epítopos de relevancia diagnóstica presentes
en la fase sólida.[ CITATION Fel12 \l 2058 ]

ELISA Sandwich

En esta versión DE ELISA, la muestra experimental se "se intercala" entre un anticuerpo de


captura no conjugado y un anticuerpo de detección conjugado, ambos específicos de la misma
proteína pero en diferentes epítopos

 El ELISA tipo sándwich doble anticuerpo es el ejemplo clásico de métodos para la


detección de antígenos, el primer anticuerpo captura el antígeno de la muestra que es
detectado a través del conjugado anticuerpo-enzima o amplificado con un conjugado

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dirigido contra el segundo anticuerpo (sándwich doble anticuerpo modificado) u otros


procedimientos.

 Los ensayos sándwich doble antígeno, son usados para la detección de anticuerpos y
son muy útiles para la evaluación de la respuesta inmune inducida por vacunas; en
estos ensayos, al igual que en los indirectos, los antígenos capturan los anticuerpos,
pero en esta ocasión en lugar de un conjugado anti-inmunoglobulina-enzima, usamos
antígeno-enzima, de esta forma se alcanza la máxima sensibilidad y detectabilidad al
no ser necesario diluir las muestras; sin embargo, detectamos todas las clases de
inmunoglobulinas, lo que en ocasiones no es conveniente.[ CITATION Fel12 \l 2058 ]

 ELISA competitivo

Los pasos de un ELISA competitivo son diferentes de los utilizados en ELISA indirecto y
sándwich, siendo la principal diferencia el paso de unión competitivo entre el antígeno de
muestra y el antígeno "add-in". El antígeno de la muestra se incuba con el anticuerpo primario
sin etiquetar. Estos complejos de anticuerpos y antígenos se añaden a la placa ELISA, que ha
sido pre-revestida con el mismo antígeno. Después de un período de incubación, cualquier
anticuerpo no unido se lava. Existe una correlación inversa entre la cantidad de anticuerpos
libres disponibles para unir el antígeno en el pozo y la cantidad de antígeno en la muestra
original.[ CITATION Gan13 \l 2058 ]

MATERIAL Y MÉTODOS (PROCEDIMIENTOS)

Equipos Materiales Reactivos

 Kit toma de venopunción


 Prueba inmunocromatográfica
 Micropipetas (pipeta
 Centrifuga en suero o plasma HCG
automática 50 µL)
 Microscopio (gonadotropina coriónica
 Puntas amarillas
humana).
 Reloj de cuatro tiempos

Fundamentos del método


La ad-bio hCG Combo Rapid Test es un inmunoensayo cromatográfico de flujo lateral. El
casete de prueba contiene:

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1) una almohadilla de conjugado de color vino tinto el cual contiene conjugado de


anticuerpo monoclonal anti-hCG con oro coloidal (conjugados hCG Ab)
2) una tira de membrana de nitrocelulosa que contiene una línea de prueba (línea T) y
una línea de control (línea C). La línea T se encuentra pre cubierta con otro anticuerpo
anti hCG, y la línea C se encuentra pre cubierta con anticuerpo de control.

Cuando un volumen adecuado de muestra de ensayo se dispensa sobre la almohadilla de la


tira de prueba, la muestra migra por acción capilar a través de la tira. Si hay presencia de hCG
en la muestra en un nivel igual o superior a 12.5 mUI/mL en muestras de suero o plasma o
igual o superior a 25 mUI/mL en muestras de orina, la muestra se une a los conjugados hCG
Ab. El immunocomplejo es capturado en la membrana por el anti hCG Ab pre cubierto,
formando una línea T de color vino tinto, indicando un resultado positivo de la prueba para
hCG. La ausencia de la línea T sugiere un resultado negativo.

La prueba contiene un control interno (línea C) que debe presentar una línea de color vino
tinto del inmunocomplejo de anticuerpo de control independientemente del desarrollo de color
en la línea T. De otro modo el resultado de la prueba no es válido y la muestra debe ser analizada
de nuevo con otro dispositivo.[ CITATION AdB17 \l 3082 ]

Procedimiento:

Toma de muestra punción venosa:

1. Se le pedirá al paciente que se siente y que descubra sus brazos para elegir el sitio de
punción y una vez elegido el sitio de punción se debe colocar el Torniquete, 4 dedos
por encima de la flexión del codo.
2. Desinfectar la zona de punción con alcohol, desde el centro de la zona hacia afuera.
3. Introducir la aguja en la vena, con un ángulo de 15º y con el bisel hacia arriba.
4. Con una mano se debe fijar la capsula, mientras que con la otra mano empujar el tubo
de tapa lila hacia el interior del soporte y cuando él tuvo este lleno se debe retirar del
soporte y homogenizar inmediatamente.
5. Se debe retirar el torniquete
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6. Sacar la aguja con movimiento rápido y depositar en el contenedor de desechos


infecciosos.
7. Colocar una torunda de algodón en el sitio de punción
Plasma

1. Colecte la muestra de sangre en un tubo de recolección superior de lavanda, azul o


verde (que contenga EDTA, citrato o heparina, respectivamente, en Vacutainer)
mediante punción venosa.
2. Separa el plasma por centrifugación tan pronto como sea posible para evitar hemólisis.
Utilizar sólo especímenes claros, no hemolizados.
3. Retire con cuidado el plasma en un nuevo tubo previamente marcado.

Suero

1. Recolecta la muestra de sangre en un tubo con tapa roja (el cual no contiene
anticoagulantes, en Vacutainer) mediante punción venosa.
2. Separa el suero por centrifugación tan pronto como sea posible para evitar hemólisis.
Utilizar sólo especímenes claros, no hemolizados.
3. Extraiga con cuidado el suero en un tubo nuevo etiquetado previamente.

Analice las muestras de suero y plasma tan pronto como sea posible luego de su recolección.
No dejes los especímenes a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo.
Almacene las muestras a 2-8°C, si no se prueba inmediatamente por hasta 48 horas. Los
especímenes deben congelarse a -20°C para un almacenamiento más largo.

GRAFICO PROCEDIMIENTO

1. Lleve los componentes de muestras y ensayos


a temperatura ambiente en caso de estar
refrigerados o congelados. Una vez
descongelada, mezcle bien la muestra antes de
realizar el análisis

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2. Cuando esté listo, abra el empaque de


aluminio por la muesca y retire el dispositivo.
Ubique el dispositivo de prueba sobre una
superficie limpia y plana.

3. Asegúrese de marcar el dispositivo con el


número de muestra.

4. Llene el gotero plástico con la muestra.


Mantenga el gotero verticalmente, vierta de 2-
3 gotas (cerca de 60 a 105 uL) de la muestra
en la cavidad para muestras asegurándose de
que no se produzcan burbujas de aire.

5. Programe el cronometro

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6. Lea los resultados a los 5 minutos. Los


resultados positivos pueden ser visibles a
partir de 1 minuto. Los resultados negativos
deben ser confirmados al final de los 10
minutos. Sin embargo, cualquier
interpretación de los resultados fuera de los 5-
10 minutos debe ser considerados inválidos y
la prueba debe repetirse. Después de
interpretar los resultados, deseche el
dispositivo según las normas locales.

INTERPRETACION DE RESULTADOS

RESULTADO NEGATIVO: Si sólo aparece la


línea C, la prueba indica que no hay hCG
detectable presente en la muestra. En este caso el
resultado es negativo o no reactivo.

RESULTADO POSITIVO: Si además de


presentarse la línea C, también se genera la línea
T, la prueba indica la presencia de hCG en la
muestra. En este caso el resultado es positivo o
reactivo.

RESULTADO INVALIDO: Si no se genera una


línea C, el ensayo es inválido sin importar que se
haya creado una línea de color en la línea T como
se muestra a continuación. El análisis se debe
repetir con un nuevo dispositivo[ CITATION AdB17 \l
3082 ]

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BIBLIOGRAFÍA

1. 1. HESKETH LM, ROWI_ATT JA, GAY NJ et al Child hood in England and Wales.
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2007.

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7. Patel GSDa. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal


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8. Ad-Bio. ad-bio hCG Combo Rapid Test (Suero / Plasma / Orina). [Online].; 2017.
Available from:
http://www.annardx.com/productos/images/productos/diagnostica/pruebas-
rapidas/ad1001chcgsuero,plasmayorinareve798258034.pdf.
x
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ANEXOS

Insertos de los reactivos


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