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SEPARATION DE MOLECULES PAR CHROMATOGRAPHIE

D'EXCLUSION SUR COLONNE


I – PRINCIPE
La chromatographie d’exclusion moléculaire (aussi appelée tamis moléculaire ou
filtration sur gel) permet de séparer les protéines suivant leur rayon de Stockes. En effet, le
volume d’élution (Ve) d’une protéine donnée dépend non seulement de sa masse moléculaire
mais également de sa forme, de son hydratation préférentielle, de sa densité, voire de son
affinité pour le support. Le rayon de Stockes tient compte de tous ces paramètres.
Nous vous proposons de séparer une protéine et un sel:
- Caséine protéine incolore
- Sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4) sel incolore.
Après séparation, les molécules seront détectées et seul la caséine sera dosée.

Pour réaliser la chromatographie d'exclusion moléculaire sur colonne, nous utiliserons


un gel appelé Sephadex G25 (le terme Sephadex est un nom générique donné par la firme qui
le produit et le chiffre G25 reflète le pouvoir d'exclusion).
Un gel de Sephadex est constitué de billes de polysaccharides hydratés. Mises en
suspension dans l'eau ou dans un tampon, ces billes gonflent fortement en prenant l'aspect
d'un gel. Le gel est un réseau poreux dans lequel les molécules de soluté s'engagent d'autant
plus que leur taille est faible.
Le Sephadex G25 utilisé ici permet la séparation des molécules avec une limite d’exclusion
de et 5 000 daltons.
Le gel est placé dans une colonne. Le volume occupé par le gel et le tampon est appelé
volume total (Vt). Le volume d’exclusion ou volume mort (Vo) est le volume d’éluant qui
circule en dehors des billes.
Le volume interne (Vi) est le volume qui circule dans la totalité des pores des billes et Vg est
le volume correspondant au gel.
Comme le volume de gel est négligeable devant Vo et Vi, on peut écrire Vt= Vo + Vi.
De très petites molécules pourront donc être éluées dans le Vt.
Généralement, on définit également le Ve comme étant le volume d’élution d’une protéine
donnée.

II - FRACTIONNEMENT DU MELANGE
Matériel
On dispose d'un tube Eppendorf contenant 0,20 mL de tampon d'élution [Tris, HCl 0,01
mol.L-1, pH 7,5 ; NaCl 0,3 mol.L-1; thimerozal 0,005% (antibactérien)] dans lequel se trouvent
en solution les constituants à séparer : caséine (12,5 mg.mL-1) et sulfate d’ammonium (2,5
mg.mL-1).
La colonne a été rincée au préalable avec le tampon d'élution et est prête à l'emploi.
On dispose également d'un tube contenant 8 mL de solution mère de caséine à 0,5 mg.mL-
1pour la gamme étalon de dosage en colorimétrie.
Méthode
a) Préparation des tubes de collecte :
Numéroter et placer dans le grand portoir les tubes destinés à recueillir les fractions en sortie
de colonne :
- on recueillera 1 mL jusqu'au 15e tube.
- Noter le temps necessaire pour remplir un tube.
La collecte se fera dans ces tubes placés au fur et à mesure dans le petit portoir ; les tubes
remplis seront à nouveaux transférés dans le grand portoir.

b) Dépôt du mélange sur la colonne et élution


Attention !!! la résolution de la séparation dépend en partie de la qualité du dépôt, veiller à
bien observer les conseils donnés dans la figure suivante (0,5 ml à déposer sur la colonne)

Bien surveiller l'élution pour obtenir 15 fractions de 1ml chacune.


c) Rinçage des colonnes
Pendant la rédaction de votre compte rendu, mettre la colonne en rinçage en ouvrant le
robinet, bien vérifier que l'alimentation en tampon soit assurée.

Plan d'analyse du fractionnement du mélange initial en deux étapes


B - Détection de toutes les constituants sépares:
1- Diviser le volume de chaque fraction en deux pour avoir 2 séries des fractions numérotes
de 1-15 et 1’-15’
2- Ajouter 0.5 ml de réactif de Biuret dans la premiers série des fractions (1-15) et BaCl2 dans
la seconde série (1’-15’)
4- lecture de l'absorbance (540 nm Biuret) et noter la turbidité des tubes contenant les sels.
5- tracé du profil d'élution complet: absorbance et turbidité en fonction du volume cumulé.

C - Réponses aux questions.


Résultats : analyse du fractionnement du mélange initial :
Reporter dans le tableau 1 les volumes cumulés correspondant à chaque fraction recueillie.

1 - Détection de la caséine par la méthode de Biuret


Principe:
Biuret`s test: In alkaline medium, there is formation of blue-violet tetrahedral
complexes through coordinate bonds between Cu2+ (present in Biuret`s reagent) and
peptides or proteins containing at least 4 peptide bonds.

Cu2+
+

Blue-violet cplx
The intensity of the colour (540 nm) is directly proportion to the concentration of the
sample.

C - Rédaction du compte rendu et réponses aux questions


Le compte-rendu devra inclure :
- Une introduction (5 lignes maximum).
- Les résultats expérimentaux:
1 tableau (feuille fournie comportant le tableau 1), et une feuille de papier gradué
contenant les 2 graphes sur le même axe:
a) profil d'élution de la colonne (DO en fonction des volumes cumulés pour La caseine)
c) superposé au profil d'élution obtenu par la coloration selon Biuret, le profil indiquant le
volume d'élution du (NH4)2SO4.
Bien noter sur le graphique les unités pour les deux types d'ordonnées utilisées (abscisse
identique).
- Les réponses aux questions suivantes (qui devront tenir sur une seule page).
- Une conclusion (10 lignes maximum).

Questions :
1) déterminer le débit de la colonne
2) Déterminer en justifiant votre choix la valeur des volumes caractéristiques de l'élution :
- le volume d'exclusion (Vo)
- le volume total (vt)
- le volume d'élution de la caséine (Ve).
3) Calculer le temps de retention (Tr) de chaque constituant.
Quelle fraction devez-vous mélanger si votre objectif était d’avoir la pureté maximale de
protéines?
4) Observer et critiquer le profil d'élution (3 ou 4 lignes).

NB: CHAQUE GROUP DOIT APPORTER 2 BOUTEILLES D’EAU.