TRAVAUX PRATIQUES NO 1 DE BIOS 304

Application de la Chromatographie Planaire (CCM et Papier) a la séparation

d’un Mélange d’aminoacides
La chromatographie sur couche mince est une technique de séparation des constituants d’un
mélange basée sur le partage des solutés entre l’adsorbant fixe constitué de la phase solide et
la phase liquide mobile. Chacun des constituants du mélange est soumis à une force de
rétention par adsorption de la phase solide et une force d’entraînement par la phase mobile.
L’équilibre résultant entre ces deux forces permet une migration différentielle des solutés, ce
qui favorise leur séparation.

1. Mode opératoire
1.1. Extraire les protéines solubles totales des graines de soja
 Peser 2 g de poudre dans 10 ml de tampon phosphate de concentration et de pH connus
 Agiter pendant 2 min
 Centrifuger à 2000 tr/min pendant 10 min et recueillir le surnageant. Noter le volume du
surnageant (extrait brut de protéines)
 Hydrolyse acide de l’extrait brute (2 ml de protéines + 2 ml de HCL concentré, 30 min à
chaud, chaleur humide)
 Neutralisation du HCL (hydrolysat acide + 6 ml de NaOH 0,25 M)

1.3. Préparation des dispositifs

1.3.1. Solvants
Préparer un volume final de 10 ml d’éluant composé de n-butanol (6V) et l’eau (4V)
1.3.2. Cuves
Préparer une cuve de chromatographie contenant du solvant sur une hauteur de 5 à 10 mm ; refermer la
cuve et la laisser se saturer en vapeurs de solvant.
1.3.3. Chromatoplaques
Tracer à l'aide d'un crayon graphite une ligne de dépôts à environ 15 mm du bas d’une plaque de gel de
silice de 5 cm x 10 cm.
 Ne jamais toucher avec les doigts une partie « opérationnelle » des plaques.
 Utiliser des gants et/ou des feuilles de papier pour saisir les plaques par leur partie supérieure ou par les côtés.
 Bien repérer et identifier les différentes plaques.
Marquer l'emplacement des dépôts (étalons et produit à analyser), correctement espacés et ordonnés, avec
un crayon.
Reporter le plan de dépôt et le marquage sur le cahier de manipulation.

1.3.4. Échantillons
Solutions d’aminoacides témoins à 5 g/L (Alanine, glutamine, tryptophane et glycine)

 glycine (Gly ; G)  tryptophane (Trp ; W)

 acide aspartique (Glu ; E)  arginine (Arg ; R)
Un produit à analyser (poudre de Soja).
À l'aide d’une micropipette, réaliser les dépôts d’échantillons de 2 µL (le diamètre final ne doit pas
excéder 3 mm) en deux touches et en séchant à l'aide d'un sèche-cheveux entre chaque touche.

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 1.2. Élution et révélation
Introduire rapidement les plaques dans les cuves et laisser migrer le solvant jusqu'à environ deux
centimètres du bord supérieur. Retirer alors les plaques et marquer le front du solvant.
Sécher les plaques sous hotte aspirante.
Révéler les aminoacides à la ninhydrine : tremper la plaque dans un bain de ninhydrine puis la sécher 5
minutes à l'étuve à 80°C.

1.4. Compte-rendu
Questions préliminaires :
a. indiquer les mécanismes mis en jeu : adsorption et/ou partage.
b. D’après vos connaissances de cours, classer les AA testés selon la nature de leur chaîne latérale:
apolaire, ionisable, polaire non chargé.
c. Le profil d’hydropathie (hydrophilie ou hydrophobicité plus ou moins marquée) peut être établi, pour
une chaîne protéique donnée, au fur et à mesure de sa séquence. L’établissement d’un profil
d’hydropathie est fondé sur l’utilisation d’une échelle d’hydropathie des différentes chaînes des AA
(voir Annexe 1).
A partir des profils d’hydropathie présentés en Annexe 2, interpréter les données et proposer une
localisation cellulaire pour les protéines A et B.

Exploitation des résultats :

d. Indiquer les conditions expérimentales permettant d’obtenir la meilleure séparation.
e. Pour chaque condition testée, marquer les différents spots d'aminoacides et calculer les Rf quand c’est
possible.
f. Donner la composition du Mélange.
g. D’après les migrations obtenues proposer une classification des AA en fonction de leur polarité.
Comparer les résultats expérimentaux avec les données présentées en annexe 1.

Chaque group d’étudiants doit se présenter avec une paire de gangs.

Annexe 1

J. Kyte et R. Doolittle ; A simple method for displaying the hydropathic character of a protein ; Journal
of molecular biology, mai 1982, 157 n°1, 105-132.

Dans ce document, les auteurs ont établi une échelle d’hydropathie (hydrophilie ou hydrophobicité plus
ou moins marquée) des chaînes latérales R des aminoacides.
L’index d’hydropathie (hydropathy index) est calculé par détermination de l’énergie de transfert (G°)
lorsqu’un AA est transféré d’un solvant non polaire vers l’eau :
 une valeur positive marque l’hydrophobicité (besoin d’énergie pour mettre l’aminoacide dans l’eau)
 une valeur négative marque l’hydrophilie (libération d’énergie quand l’aminoacide est mis dans
l’eau).

Le tableau ci-dessous présente cette échelle :

G°transfer
Hydropathy index
Side-chain
Isoleucine 4.5 4.4

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Valine 4.2 4.2
Leucine 3.8 4.5
Phenylalanine 2.8 2.5
Cysteine/Cystine 2.5 1.9
Methionine 1.9 1.9
Alanine 1.8 3.9
Glycine -0.4 -
Threonine -0.7 -0.6
Serine -0.8 -0.8
Tryptophan -0.9 -0.9
Tyrosine -1.3 -1.1
Proline -1.6 -
Histidine -3.2 -4.2
Glutamic acid -3.5 -3.9
Glutamine -3.5 -3.5
Aspartic acid -3.5 -4.5
Asparagine -3.5 -3.8
Lysine -3.9 -3.2
Arginine -4.5 -

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