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MASTER – CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

CORRIGE

Exercice N° 1 :
Le chromatogramme 1 a été obtenu dans les conditions suivantes :
Colonne : longueur : L = 15 cm - diamètre interne: d = 0,5 cm
Vitesse de défilement du papier : v = 2 cm/min
Phase stationnaire : Silice greffée C18
Phase mobile : Eau/Méthanol (50/50)
Débit : D = 0,6 mL/min
Le composé A est un composé non retenu sur la colonne utilisée.
A partir de ce chromatogramme déterminer :
1) L'efficacité pour les deux composés B et C
2) L'efficacité moyenne de la colonne
3) Le volume mort Vm de la colonne
4) Le volume de la phase stationnaire VS
5) Les facteurs de rétention kB et kC des deux composés B et C.
6) Les constantes d'équilibre de partition KB et KC des deux composés B et C.
7) La sélectivité α de la séparation.
8) La résolution R de la séparation.
9) La résolution de Purnel RP de la séparation.

Un aggrandissement de la zone des pics B et C est fourni pour faciliter les mesures.
NB = (3,90/0,04043)2 = 9305
NC = (4,38/0,04753)2 = 8492
Nmoyen = 8899
VM = D * tM = 0,6 * 0,95 = 0,57 mL
Vint = L * π * d2 / 4 = 15 * π * 0,52 / 4 = 2,945 mL
VS = Vint – VM = 2,375 mL
kB = ( tB – tM ) / tM = ( 3,90 – 0,95 ) / 0,95 = 3,105
kC = ( tC – tM ) / tM = ( 4,38 – 0,95 ) / 0,95 = 3,611
KB = kB VM / VS = 3,105 * 0,57 / 2,375 = 0,745
KC = kC VM / VS = 3,611 * 0,57 / 2,375 = 0,866
α = KC / KB = kC / kB = 1,16
R = ½ * ( tC – tB) / (σB + σC) = ½ * ( 4,38 – 3,90 ) / ( 0,04043 + 0,04753 ) = 2,73
R = ½ N1/2 ( tC – tB) / ( tC + tB) = ½ * 88991/2 * ( 4,38 – 3,90 ) / ( 4,38 + 3,90 ) = 2,73
R = 2,73
RP = ¼ * N1/2 * [ (1 - α) / α ] * [ kC / (1 + kC ) ] = ¼ * 88991/2 * [ 0,16 / 1,16 ] * [ 3,611 / 4,611 ]
RP = 2,55
Exercice 2 :

Influence du débit sur l'efficacité d'une colonne – Courbe de Van Deemter/Knox

Rappel : L'équation de Van Deemter/Knox est de la forme h(u) = A0 + B0/u + C0*u


u est la vitesse moyenne d'écoulement de l'éluant.
On peut écrire une équation de la même forme en utilisant le débit au lieu de la vitesse.
h(D) = A + B/D + C*D

Myers et Weigand (Alltech) ont étudié la séparation de deux composés sur deux colonnes
différentes ainsi que l'influence du débit. Leurs résultats expérimentaux sont fournis.

Le tableau suivant donne les valeurs de l'efficacité N en fonction du débit pour le


Kaempférol sur deux colonnes différentes.

Longueur (cm) Diamètre (cm) Diamètre des particules de phase stationnaire (µm)

Colonne 1 15 0,46 5
Colonne 2 10 0,46 3

Débit (mL/min) 0,2 0,5 0,7 1 1,4 1,7 2


N colonne 1 10282 13355 13147 12269 11229 10202 9565
N colonne 2 12481 20278 21489 22662 21197 20190 19524

1) Etablir la relation entre débit et vitesse moyenne d'écoulement.

D = VM / tM
u = L / tM
u = L * D / VM

2) Etablir les expressions des paramètres de Knox pour le débit A, B et C en fonction


des paramètres de Knox pour la vitesse A0, B0 et C0 et de caractéristiques
physiques de la colonne dont on précisera la nature.

h(u) = A0 + B0 / u + C0 * u
h(u) = A0 + B0 / ( L * D / VM ) + C0 * L * D / VM
h(u) = A0 + B0 VM / ( L * D ) + C0 * L * D / VM
h(D) = A + B/D + C*D
A = A0
B = B0 VM / L
C = C0 * L / VM
3) Déduire des résultats expérimentaux le débit optimal d'utilisation des deux
colonnes.

4) Déterminer les valeurs de A, B et C pour les deux colonnes.


a) par la méthode vue en cours
b) Tracer sur un même graphique les courbes h = f(D) expérimentale et théorique en
utilisant les valeurs de A, B et C trouvées. Conclusion ?
c) Pour améliorer la détermination expérimentale de A, B et C il est ici préférable de
résoudre le système d'équations pour trois points expérimentaux. On prendra les deux
débit extrèmes et le débit optimal. On écrira les trois équation à résoudre pour déterminer
A, B et C. Le système sera ensuite résolu par utilisation d'une calculatrice fournie.
L'enseignant vous indiquera la procédure à suivre.

Colonne 1

D h1 = 15 / N1 h1 reg h1 theo h1 calc


0,2 0,00145886 0,0015 0,0014578
0,5 0,00112317 0,001266 0,001123
0,7 0,00114094 0,00126429 0,001124086
1 0,00122259 0,001308 0,001193
1,4 0,00133583 0,00139714 0,001329743
1,7 0,0014703 0,0014703 0,00147353 0,001446153
2 0,00156822 0,00156822 0,001554 0,0015685

D1 opt 0,6
A1 0,0009 A1 calc 5,82E-04
C1 0,0003 C1 calc 4,54E-04
B1 = C1 * D1opt^2 0,000108 B2 calc 1,57E-04

Colonne 2

D h2 = 10/N2 h2 reg h2 theo h2 calc


0,2 0,00077876 7,12E-04 8,04E-04
0,5 0,00049315 5,50E-04 4,94E-04
0,7 0,00046535 5,28E-04 4,53E-04
1 0,00044127 5,20E-04 4,42E-04
1,4 0,00047176 5,27E-04 4,60E-04
1,7 0,00049529 0,00049529 5,37E-04 4,84E-04
2 0,00051219 0,00051219 5,50E-04 5,12E-04

D2 opt 1
A2 0,0004 A2 calc 1,98E-04
C2 6,00E-05 C2 calc 1,28E-04
B2 = C2 * D2opt^2 0,00006 B2 calc 1,16E-04
La détermination de A, B et C se fait en supposant que pour les haut débits le terme B/D
devient négligeable devant A + B * D et qu'on a donc alors h = A + C * D.
La détermination de A et C est alors directe : A = ordonnée à l'origine et C=pente de la
droite.
La détermination de B se fait en utilisant le débit optimal d'utilisation estimé
graphiquement, il correspond au mimimum de la courbe h = d(D).
Ce minimum est observé quand la dérivée s'annule soit :
0 = C – B / D2
D = (B / C )1/2.
Pour que cette méthode donne de bons résultats il faut que les points utilisés
correspondent réellement à des débits élevés, ici cette méthode est assez peu
satisfaisante et l'accord entre courbe expérimentale et courbe théorique n'est pas
excellent. Cela vient du fait que les expériences faites n'incluent pas des débits
suffisament élevés pour que l'approximayion soit valable. La forme de la courbe est
toutefois très correcte. Pour améliorer il faut résoudre le système de trois équations à trois
inconnues.

h1 = A + B / D 1 + C * D 1
h2 = A + B / D 2 + C * D 2
h3 = A + B / D 3 + C * D 3

La résolution conduit à des valeurs da Acalc, Bcalc et Ccalc bien meilleures et l'accord
entre valeurs calculées et expérimentales est alors très correct. (Voir les courbes
obtenues).

Remarque : Les calculs ont été effectués en utilisant le débit en cm 3/min et la hauteur
équivalente h en cm, dans ces conditions les unités da A, B et C sont :
A en cm , B en cm4.min-1 et C en min.cm-2

En supposant que les colonnes utilisées suivent bien la loi empirique reliant la vitesse
optimale uopt au diamètre dp des particules de phase stationnaire : uopt = 0,5/dp

5) Déterminer les volumes morts des deux colonnes.


La valeur du débit optimal est connue,.on peut soit l'estimer graphiquement soit la calculer
par Dopt = (B/C)1/2 en utilisant les valeurs de Bcalc et Ccalc déterminées précedemment.
La valeur de la vitesse optimale est déterminée par la formule empirique :uopt = 0,5/dp
avec pour les unités utilisées : u en cm/s ; L en cm et dp en µm.

La relation u = L * D / VM permet ensuite de déterminer VM.


VM = L * D / u
Il faudra exprimer le débit en cm3/s (ou u en cm/min) pour avoir des unités cohérentes.

Dopt graphique Dopt calculé Dopt uopt VM Vint ε


Colonne 1 0,6 mL/min 0,59 mL/min 0,01 mL/s 0,1 cm/s 1,5 mL 2,49 mL 0,602
Colonne 2 1 mL/min 0,95 mL/min 0,0167 mL/s 0,167 cm/s 1 mL 1,66 mL 0,602

Remarque : Puisque l'écart entre la détermination graphique et la valeur calculée pour


Dopt est très faible nous retiendrons la valeur déterminée graphiquement pour le calcul de
VM. Le fait de trouver une porosité identique pour les deux colonnes semble montrer que
l'hypothèse est correcte.
6) Déterminer les facteurs de rétention k1 et k2 des deux composés.

7) Déterminer la sélectivité α et la résolution R de la séparation pour les deux colonnes.

Le débit étant de 1 mL/min, le temps mort (en minutes) et le volume mort (en mL)
s'expriment par le même nombre.
Les temps de rétentions sont mesurables sur les chromatogrammes.
La résolution R peut s'exprimer par R = ½ * ( t1 – t2 ) / ( σ1+ σ2 )
Toutefois la détermination de σ1 et σ2 est très hasardeuse sur les chromatogrammes
fournis, l'échelle étant très petite.
Il est plus aisé d'utiliser l'efficacité pour le composé 2 qui a été déterminée précedemment
pour le débit considéré.
On supposera que les efficacités sont identiques pour les deux composés.
On peut alors utiliser la relation R = ½ N1/2 (t2 - t1) / ( t1+ t2 )
On peut également calculer R par la relation de Purnel.

Colonne 1 : 10 min = 5,65 cm


t1 = 4,45 cm = 7,89 min
k1 = ( 7,89 – 1,5 ) / 1,5 = 4,26
t2 = 4,80 cm = 8,49 min
k2 = ( 8,49 – 1,5 ) / 1,5 = 4,66
α = k2 / k1 = 4,66 / 4,29 = 1,1
R = ½ * 122691/2 * ( 8,49 – 7,89 ) / ( 8,49 + 7,89 ) = 2,03
RP = ¼ * N1/2 * ( α – 1 ) / α * k2 / ( 1+ k2 )
RP = ¼ * 122691/2 * 0,1 / 1,1 * 4,59 / 5,59 = 2,07

Colonne 2 : 10 min = 5,8 cm


t1 = 2,85 cm = 4,91 min
k1 = ( 4,91 – 1 ) / 1 = 3,91
t2 = 3,25 cm = 5,60 min
k2 = ( 5,60 – 1 ) / 1 = 4,60
α = k2 / k1 = 4,60 / 4,91 = 1,18
R = ½ * 226621/2 * ( 5,60 – 4,91 ) / ( 5,60 + 4,91 ) = 4,93
RP = ¼ * N1/2 * ( α – 1 ) / α * k2 / ( 1+ k2 )
RP = ¼ * 226621/2 * 0,18 / 1,18 * 4,6 / 5,6 = 4,72

8) Conclure sur l'intérêt comparé des deux colonnes, d'un point de vue pratique et
économique.

On voit qu'il est très interressant d'utiliser une colonne plus courte avec un diamètre des
particules plus petit (colonne 2).
La résolution est nettement supérieure avec des temps d'analyse et donc une
consommation d'éluant bien moindre.
L'efficacité de la colonne augmente sensiblement quand la taille des particules diminue,
cela permet de diminuer sa longueur sans perte d'efficacité.
Le modèle simple vu en cours permet de bien le comprendre.
hopt est sensiblement proportionnelle à dp : hopt = k dp
h est inversement proportionnelle à N : h = L / N
Donc N = h / L = k dp / L
Si on divise dp par deux on peut également diviser L par deux tout en gardant la même
efficacité en se plaçant au débit optimal d'utilisation de la colonne.
Le débit optimal d'utilisation est lui même inversement proportionnel à dp : uopt = 0,5 / dp
La colonne 1 contenant des particules plus grosses a un débit optimal d'utilisation plus
faible (0,6 mL/min), et la colonne 2 un débit optimal plus élevé (1 mL/min).
En se placant à un débit de 1 mL/min on est donc au maximum d'efficacité de la colonne
2, alors que la colonne 1 est alors nettement moins efficace bien que de longueur plus
élevée. Normalement les facteurs de rétention k1 et k2 et donc α devraient rester
sensiblement constants entre les deux colonnes puisque on garde la même nature pour
les phases stationnaires et mobiles et également la même température.
C'est approximativement ce qui est observé, les valeurs de k1 et k2 ne diffèrent que de
1% entre les deux colonnes.
La résolution dépend alors seulement de N (k et α identiques) et elle est beaucoup plus
élevée pour la colonne 2. Le rapport des résolutions 4,09/2,06 = 1,98 est bien
sensiblement égal au rapport des efficacités 22662/12269 = 1,85.

9) On constate que les pics sont plus hauts pour la colonne 2. Pour quelle raison ? Cela a-
t-il un intérêt pratique ?

La hauteur des pics est inversement proportionnelle à leur écart type.


Plus l'efficacité sera grande et plus la hauteur des pics sera élevée.
Cela permetra de détecter plus facilement des composés présents en toute petite quantité,
la sensibilité sera plus élevée si l'efficacité est plus importante.
Il est donc interressant d'utiliser la colonne 2 pour améliorer la sensibilité de l'analyse.
Enfin la finesse des particules augmente la pression à utiliser mais cela est compensé par
la longueur moindre de la colonne.
Il n'y a donc finalement que des avantages à utiliser la colonne 2.
Exercice 3 : Application analytique

Exploiter les chromatogrammes suivants pour déterminer les concentrations des


composés A et B dans l'échantillon.
ETALON

t Cetalon Setalon Si/Set k


A 3,26 0,25 37500 0,536 2,143
B (étalon interne) 4,52 0,35 70000 1,000 2,857
C 5,23 0,45 67500 0,964 2,143

ECHANTILLON

t Sechantillon Si/Set k Céchantillon


A 3,28 22500 0,402 2,143 0,188
B (étalon interne) 4,54 56000 1,000 2,857 0,350
C 5,25 35100 0,627 2,143 0,293

Soit pour les concentrations cherchées :


A : 0,188 g.L-1
B : 0,293 g.L-1

Remarque : La méthode de l'étalon interne était indispensable car les surfaces des pics
de B sopnt sensiblement différentes dans les deux chromatogrammes ce qui montre qu'il y
a eu une erreur d'injection non négligeable.

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