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05/12/2015

TD de Microbiologie (SV5) :
Méthodes microbiologiques en analyses
alimentaires (2)
Exercices

Pr. Rachida MIMOUNI


2015-2016

Exercice 1 : L’analyse bactériologique d’une suspension bactérienne


par deux binômes a donné le résultat suivant

Dilutions 10-2 10-4 10-6 10-7


Binôme 1 > 300 > 300 256 34
Colonies /mL

Binôme 2 > 300 > 300 > 300 > 300


Colonies /mL

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Questions :

1. Ce résultat vous parait-il logique ? Justifier votre réponse.

2. Faire un schéma de la technique utilisée pour cette analyse


sachant qu’il a été proposé de dénombrer cette suspension par la
méthode d’étalement de 0,1 mL par boite de milieu de culture et les
binômes avaient à leur disposition des tubes contenant 9,9 mL
d’eau physiologique stérile par tube.

3. Donner le nombre d’unité formant colonie par mL de la


suspension mère

Question 1 :
Dilutions 10-2 10-4 10-6 10-7
1. Ce résultat vous parait-il logique ? Binôme 1: ufc/mL > 300 > 300 256 34
Justifier votre réponse. Binôme 2: ufc/mL > 300 > 300 > 300 > 300

Réponse 1 :
* Ce résultat n’est pas logique. Les deux binômes n’ont pas trouvé le même résultat.
* Pour le premier binôme, il parait que le résultat est normal, car on trouve une
diminution du nombre de colonies d’une dilution à l’autre en allant de 10-2 à 10-7. et
plus particulièrement un facteur de 10 entre le nombre de colonies de la dilution 10-6
= (256) et le nombre de colonies de la dilution 10-7 = (34) ce qui est logique.
* Pour le binôme 2:
• soit il n’a pas respecté le facteur de dilution recommandé dans le protocole
expérimental (premières dilutions au centième et la dernière au dixième),
• soit il n’a pas respecté les règles d’aseptie et dans ce cas il a comptabilisé les
colonies d’origine et les colonies de contamination et ceci est vrais dans le cas où les
deux binômes ont utilisé le même lot de diluant. S’ils ont utilisé des lots différents, il
se peut que le diluant utilisé par le deuxième binôme est contaminé.
• Dans les deux cas, il faut vérifier qu’il y a bien des colonies de contamination dans
le cas où la suspension mère est pure. Si la suspension mère est mixte, il est difficile
de confirmer qu’il s’agit de contamination sans analyser le diluant et bien distinguer
les différents types de colonies présentes dans les boites du binôme 2.

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Questions 2 :
Faire un schéma de la technique utilisée pour cette analyse sachant qu’il a été proposé de dénombrer
cette suspension par la méthode d’étalement de 0,1 mL par boite de milieu de culture et les binômes
avaient à leur disposition des tubes contenant 9,9 mL d’eau physiologique stérile par tube.

Réponse 2 :
- 0,9 mL
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 1 mL

Eau
physiologique

9,9 mL 9,9 mL 9,9 mL 9 mL

Suspension
mère
10-2 10-4 10-6 10-7

Pipette
graduée

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

Figure 1. Protocole expérimental de la préparation et de l’ensemencement des dilutions

Question 3 :
Donner le nombre d’unité formant colonie par mL de la suspension
mère

Réponse 3 :

* Pour la dilution 10-6 = 256 colonies par mL donc 256 x 106 ufc / 0,1 mL

* Pour la dilution 10-7 = 34 colonies par mL donc 34 x 107 ufc / 0,1 mL

* Pour la suspension mère (256 x 106) + (34 x 107) = N ufc / 0,1 mL


2

* N = 256 x 106 + 340 x 106 x 10 = 298 106 x 10 = 29,8 108 ufc / mL


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Exercice 2

Exercice 2
Déterminez (moyenne), à partir du nombre de colonies dénombrées
dans les 3 boîtes (milieux gélosés) et du schéma de dilution ci-
dessous, le nombre de cellules bactériennes (UFC) présentes dans
500 mL de l’échantillon (détaillez vos calculs).

0.7 mL
0.1 mL 250 ufc
0,3 mL
10 mL 10 mL 1 mL 1 mL 1 mL

0.5 mL 0.1 mL 173 ufc


0,5 mL
Echantillon 90 mL 90 mL 9 mL 9 mL 9 mL
à analyser
0.1 mL 88 ufc
0.3 mL

0,7 mL

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Calcul du facteur 0.7 mL 0.1 mL 250 ufc


10 mL 10 mL 1 mL 1 mL 1 mL 0,3 mL
de dilution
0.5 mL 0.1 mL 173 ufc
0,5 mL
Echantillon 90 mL 90 mL 9 mL 9 mL 9 mL
à analyser 0.1 mL 88 ufc
0.3 mL
0,7 mL

* Pour V= 0,7 mL Ci x Vi = Cf x Vf 10-5 x 0,7 = Cf x 1

Cf = 10-5 x 0,7 = 10-5 x 0,07 = 10-5 x 7. 10-1 = 7. 10-6


1
* Pour V= 0,5 mL Ci x Vi = Cf x Vf 10-5 x 0,5 = Cf x 1

Cf = 10-5 x 0,5 = 10-5 x 0,05 = 10-5 x 5. 10-1 = 5. 10-6


1
* Pour V= 0,3 mL Ci x Vi = Cf x Vf 10-5 x 0,3 = Cf x 1

Cf = 10-5 x 0,3 = 10-5 x 0,03 = 10-5 x 3. 10-1 = 3. 10-6


1

0.7 mL
Réponse de 10 mL 10 mL 1 mL 1 mL 1 mL 0,3 mL
0.1 mL 250 ufc

l’exercice 2 0.5 mL 0.1 mL 173 ufc


0,5 mL
Echantillon 90 mL 90 mL 9 mL 9 mL 9 mL
à analyser
0.1 mL 88 ufc
0.3 mL

• Nombre en UFC = Nombre de colonies x (1 / Fd) 0,7 mL

• Fd1 = 7 x 10-6 Fd2 = 5 x 10-6 Fd 3 = 3 x 10-6

• Dans le cas de 250 UFC on a: 250 x (1/Fd1) x 10 x 500 c.à.d 1,78 x 1011 UFC /
500 mL

• Dans le cas de 173 UFC on a: 173 x (1/Fd2) x 10 x 500 c.à.d 1,73 x 1011 UFC /
500 mL

• Dans le cas de 88 UFC on a: 88 x (1/Fd3) x 10 x 500 c.à.d 1,46 x 1011 UFC /


500 mL

• Alors le nombre de cellules bactériennes en UFC présentes dans 500 ml de


l’échantillon est: Moyenne : 1,66 x 10 11 UFC / 500mL

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Exercice 3

Exercice 3. Comment allez-vous faire pour obtenir les dilutions (A-E) à partir
des suspensions proposées.

Dilution Réponses Suspensions proposées

(A) 10-4 [2] [1] 1 ml de la suspension 10-2


[2] 0,1 ml de la suspension 10-2
(B) 10-7 [7] [3] 1 ml de la suspension mère
[4] 0,1 ml de la suspension 100
(C) 10-3 [1] [5] 1 ml de la suspension 10-4
[6] 0,1 ml de la suspension 10-4
(D) 10-6 [6] [7] 1 ml de la suspension 10-6
[8] 0,1 ml de la suspension 10-6
(E) 10-1 [3] [9] 1 ml de la suspension 10-8
[10] 0,1 ml de la suspension 10-8

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Exercice 4

Exercice 4:
Deux laits crus provenant d’une ferme ont été analysé par les méthodes suivantes :
- Réduction du bleu de méthylène (BM)
- Méthode de Breed (carré de 2 cm2, volume de 10 µl)
Les résultats suivants ont été obtenus

Temps de Nombre moyen par champs UFCmoyen/Dilutions 10-3


Décoloration du optique (50 champs)
BM
Lait 1 : 10 heures 0.3 45
Lait 2 4 minutes 600 Inc
Questions

- Donner les principaux groupes de microorganismes recherchés dans le lait.


- Rappeler les méthodes d’analyse utilisées
- Analyser ces résultats en donnant votre conclusion concernant la qualité de ces
deux laits, sachant que pour le lait cru 5.105 germes /mL est le seuil limite
d’acceptabilité

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Question 1
Donner les principaux groupes de microorganismes recherchés dans le lait

Réponse 1
Dans un lait cru, on peut trouver des:
- Bactéries lactiques
- Bactéries de contamination (flore saprophyte et flore à intérêt sanitaire
(coliformes)
- Levures (Geotrichum candidum,…)
- Moisissures ( Penicillium roquefortii,…)
-Virus (entérovirus ) et divers protozoaires (Toxoplasma gondii, agent de la
toxoplasmose ) peuvent également être présents.

Question 2
* Rappeler les méthodes d’analyse utilisées

Réponse 2

* Réduction du bleu de méthylène (BM) : Tests au bleu de méthylène


- On place dans un tube à essai stérile (18 x 180 mm), 10 mL de lait.
- On ajout stérilement dans le tube 1 mL d’une solution de bleu de méthylène à
0,05 %.
- On incube le tube dans un bain-marie à 37°C en l’agitant de temps en temps.

Interprétation:
Tableau 1. Qualité du lait en fonction du temps de sa décoloration du bleu de
méthylène.
Temps de décoloration Qualité du lait
Inférieur à 15 min Très fortement contaminé
Supérieur à 1 heure Fortement contaminé
Inférieur à 3 heures Légèrement contaminé
Supérieur à 3 heures Satisfaisant

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Question 2
* Rappeler les méthodes d’analyse utilisées

Réponse 2
•Méthode de Breed (carré de 2 cm2, volume de 10 µl)

Méthode de Breed
1/ Déposer 0,01 mL du liquide à examiner dans un carré de 1 cm² délimité sur une lame
de verre
2/ Fixation + coloration au bleu de méthylène ou Gram
3/ Compter les cellules dans 30 à 50 champs microscopiques (n)

N=
N= (n x S) ÷ (s(n
x v)x S) ÷ (s x v)
N = nombre de micro-organismes aérobies mésophiles par mL.
S = surface de comptage (cm²).
s = surface d’un champ microscopique (cm²).
v = volume de l’échantillon en mL

Ose de 4mm
de diamètre
= 0,01 mL

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Calcul du nombre des bactéries par la méthode de Breed

• Compter les cellules ou les groupements de cellules dans 5 champs


microscopiques :

▫ n1+n2+n3+n4+n5 = 19+12+6+3+5 = 45
▫ nmoy = 45 ÷ 5 = 9
▫ Scarré = 1 cm2
▫ schamp = 2,54 10-4 cm2

▫ Appliquer la formule:

▫ N = 9 x (1 ÷ 2,54 10-4 ) x (1 ÷ 0.01 mL) = 3,54 106 bactéries /mL

Calcul du nombre des bactéries par la méthode de Breed

• Le nombre moyen de cellules comptées pour le lait 1= 0.3

▫ nmoy = 0,3
▫ Scarré = 2 cm2
▫ schamp = 2,54 10-4 cm2

▫ Appliquer la formule:

▫ N = 0,3 x (2 ÷ 2,54 10-4 ) x (1 ÷ 0.01 mL) = 2,36 103 bactéries /mL

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Calcul du nombre des bactéries par la méthode de Breed

• Le nombre moyen de cellules comptées pour le lait 2 = 600

▫ nmoy = 600
▫ Scarré = 2 cm2
▫ schamp = 2,54 10-4 cm2

▫ Appliquer la formule:

▫ N = 600 x (2 ÷ 2,54 10-4 ) x (1 ÷ 0.01 mL) = 4,72 108 bactéries /mL

Question 3
Analyser ces résultats en donnant votre conclusion concernant la qualité de ces
deux laits, sachant que pour le lait cru 5.105 germes /mL est le seuil limite
d’acceptabilité

Réponse 3
Tableau 2. Qualité du lait en se basant sur le test au bleu de méthylène et sur sa
charge microbienne totale

Lait Qualité Nombre de germes / mL de lait


Lait 1 Le temps de décoloration est 1) Technique directe:
supérieur à 4 heures donc ce 2,36 103 / mL < 5.105 / mL Ce lait est
lait est satisfaisant satisfaisant
2) Technique indirecte:
4,5 104 / mL < 5.105 / mL . Ce lait est
satisfaisant
Lait 2 Le temps de décoloration est 1) Technique directe:
inférieur à 15 min donc ce lait 4,72 108 bactéries / mL > 5.105 / mL
est Très fortement contaminé Ce lait est non satisfaisant

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Exercice 5

Exercice 5
Concentration de Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5 Tube 6
l’antibiotique
16 8 4 2 1 0
mg/L
Binôme 1 - - - + + +
Binôme 2 - - - - - -
+ : Croissance observée à l’œil nu
- : Pas de croissance
Questions
1. Interpréter ce résultat.
2. Pourquoi à votre avis ces deux binômes ont trouvé des résultats différents alors
qu’ils avaient le même matériel et le même protocole expérimental ?
3. Déterminez la CMI.
4. Le dénombrement des bactéries survivantes dans les tubes 1, 2 et 3 a donné le
résultat suivant : Tube 1= 0 colonies/mL, Tube 2= 1 colonies/mL et Tube 3= 15
colonies /mL. Déterminer la CMB sachant que 100% de survivants du tube témoin
est 4 106 UFC/mL.
5. Déterminer le caractère bactéricide ou bactériostatique de l’antibiotique testé.

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Exercice 5
Concentration de Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5 Tube 6
l’antibiotique
16 8 4 2 1 0
mg/L
Binôme 1 - - - + + +
Binôme 2 - - - - - -
+ : Croissance observée à l’œil nu. - : Pas de croissance
Question 1
Interpréter ce résultat.

Réponse 1 et 2
• Le binôme 1 a mis en évidence une croissance positive au niveau des tubes qui
contiennent une faible concentration d’antibiotique (Tubes 4et 5). La croissance
positive dans le tube 6 est normale car il ne contient pas d’antibiotique.
• Pour les tubes 1, 2 et 3, aucune croissance. Ces concentrations inhibent la
croissance de cette bactérie.
• Le binôme 2 n’a pas obtenu de croissance dans tous ses tubes y compris le
témoin. Il est fort probable qu’il n’a pas ensemencer les tubes.

Exercice 5
Concentration de Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5 Tube 6
l’antibiotique
16 8 4 2 1 0
mg/L
Binôme 1 - - - + + +
Binôme 2 - - - - - -
+ : Croissance observée à l’œil nu
- : Pas de croissance
Question 3
3. Déterminez la CMI.

Réponse 3
* La CMI correspond à la concentration 4 mg / L: c’est la plus faible concentration
qui ne montre pas de croissance visible à l’œil nu.

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Exercice 5
Concentration de Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5 Tube 6
l’antibiotique
16 8 4 2 1 0
mg/L
Binôme 1 - - - + + +
Binôme 2 - - - - - -
+ : Croissance observée à l’œil nu
- : Pas de croissance
Question 4
4. Le dénombrement des bactéries survivantes dans les tubes 1, 2 et 3 a donné le
résultat suivant : Tube 1 = 0 colonies/mL, Tube 2 = 1 colonies/mL et Tube 3 = 15
colonies /mL. Déterminer la CMB sachant que 100% de survivants du tube témoin
est 4. 106 UFC/mL.

Réponse 4
* 4. 106 100 %
? % = (15 x 100) / 4. 106 = 0,0004 donc la CMB = 4 mg / L
* 15 ?%

Exercice 5
Concentration de Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5 Tube 6
l’antibiotique
16 8 4 2 1 0
mg/L
Binôme 1 - - - + + +
Binôme 2 - - - - - -
+ : Croissance observée à l’œil nu
- : Pas de croissance
Question 5
Déterminer le caractère bactéricide ou bactériostatique de l’antibiotique testé.

Réponse 5

* Rapport CMB / CMI = 4 / 4 = 1 donc l’antibiotique est bactéricide absolu.

CMB / CMI = 1, l'antibiotique est dit bactéricide absolu,


CMB / CMI est proche de 1, l'antibiotique est dit bactéricide,
CMB / CMI est supérieur à 2, l'antibiotique est dit bactériostatique.

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Exercice 6

Exercice 6: Une suspension de bactéries de concentration 4.108 bactéries/mL est


diluée au 2.10-5.
0,1 mL de la solution diluée est étalée sur une boite de Pétri et incubée une nuit à
37°C.

1. Combien de colonies apparaitront sur la boite ?

2. On ensemence 4 mL de la solution diluée dans un volume total de 500 mL de


milieu de croissance contenant de l’ampicilline. Combien ce milieu contient de
cellules? Cette culture est incubée à 37°C pendant 10h.

3. Quelles caractéristiques doivent posséder les bactéries pour croitre dans ces
conditions ?

4. Quelle est la concentration de la culture avant incubation à 37°C ?

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Exercice 6
Une suspension de bactéries de concentration 4.108 bactéries/mL est diluée au 2.10-5.
0,1 mL de la solution diluée est étalée sur une boite de Pétri et incubée une nuit à
37°C.

1. Combien de colonies apparaitront sur la boite ?

Réponse 1:

1. Nombre en UFC / mL = N / mL x (1/Fd)


* Nombre en UFC = 4.108
* Fd = 2x10-5
* N / mL = 4.108 x 2.10-5 = 8.103 / mL
* Nombre dans la boite = 8.103 x 0,1 = 8.102 colonies /0,1 mL

Exercice 6
Une suspension de bactéries de concentration 4.108 bactéries/mL est diluée au 2.10-5.
0,1 mL de la solution diluée est étalée sur une boite de Pétri et incubée une nuit à
37°C.

2. On ensemence 4 mL de la solution diluée dans un volume total de 500 mL de


milieu de croissance contenant de l’ampicilline. Combien ce milieu contient de
cellules?

Réponse 2:

* N / mL = 4.108 x 2.10-5 = 8.103 / mL

* 8. 103 x 4 = 32. 103 bactéries / 500 mL

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Exercice 6

Cette culture est incubée à 37°C pendant 10h.

3. Quelles caractéristiques doivent posséder les bactéries pour croitre dans ces
conditions ?

Réponse 3:

* Les bactéries doivent être résistantes à l’ampicilline.

Exercice 6

Cette culture est incubée à 37°C pendant 10h.

4. Quelle est la concentration de la culture avant incubation à 37°C ?

Réponse 4:

* 32. 103 bactéries / 500 mL


* 32. 103 / 500 = 64 bactéries / mL

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