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14/12/2015

TRAVAUX PRATIQUES DE GÉNÉTIQUE


BACTÉRIENNE
MODULE 29 MICROBIOLOGIE II
SV5

FACULTÉ DES SCIENCES, AGADIR


LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE

Pr. Mimouni R. 2014/2015

Transgénèse

La transformation naturelle des plantes peut être


réalisée par une bactérie phytopathogène qui se
trouve naturellement dans le sol, et qui appartient à
la famille des Rhizobiaceae (genre Agrobacterium).

A. tumefaciens

Agrobacterium (A. tumefaciens)

Ce genre de bactéries comprend plusieurs espèces


pathogènes pour les plantes, et cause des symptômes de
type tumoral plus connu sous le nom de galle du collet.
Il est utilisé pour la transformation génétique des plantes

Tumeur
ou
galle du collet

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Transgénèse: Principe

La transgénèse ou la transformation génétique est


la modification héréditaire d'un génome à la suite
de l'intégration et de l'expression d'un gène
étranger.

Plasmide Ti (tumor inducing)

Mécanisme de la transgénèse

Processus d’infection

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Exemples de tumeurs produites par A. tumefaciens

A) Pommier
B) Pêcher

D) Carottes coupées
C) Tomates

Étapes d’un ensemencement Champ stérile


aseptique

a: Stérilisation de l’anse
bouclée par flambage

b: Prélèvement d’un
inoculum de bactéries

c: Ensemencement d’une
gélose inclinée en tube à
essai

d: Fermeture du tube à
essai et stérilisation de
l’anse bouclée

Transfert aseptique
Champ stérile
d’un inoculum

a:Tenir les tubes avec la main


droite (pour les droitiers) et
l’anse avec la main gauche

b: Stériliser l’anse par flambage

c:Tenir les cotons entre les doigts


de main gauche (pour les
droitiers) et garder l’anse dans
le champ stérile

d, e:Transférer l’inoculum d’un


tube à l’autre

f: Fermer les tubes et stériliser


l’anse

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Manipulations à réaliser au laboratoire

1. Isolement d’A. tumefaciens à


partir des galles du collet
d’une plante de tomate
infectée

2. Identification d’A. tumefaciens

3. Etude du pouvoir pathogène


et vérification des postulats
de Koch

1. Isolement de l’A. tumefaciens

Description des tumeurs


Décrire et dessiner la morphologie externe des tumeurs sur
une plantule de tomate
Observer au microscope des coupes histologiques au niveau
des tumeurs et faites un dessin (G : x 400 et x 1000)

Tumeur

FSA

Coupe histologique de la tumeur x400

Isolement d’A. tumefaciens à partir des galles du collet


d’une plante de tomate infectée

Les souches d’A. tumefaciens peuvent être isolées à partir des


tumeurs des plantes malades. L’isolement se fait à partir de jeunes
tumeurs en croissance, ayant une couleur blanche ou crème.

Matériel
Galles du collet d’une plantule de tomate
Eau de javel à 20%
Eau distillée stérile
Scalpel
Tube contenant 2,5 mL d’eau physiologique
Une baguette en verre stérile
Vortex

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Isolement d’A. tumefaciens à partir des galles du collet


d’une plante de tomate infectée

Méthode
1. On lave la tumeur dans un premier temps avec l’eau du robinet
pour enlever le sol et les impuretés qui y adhèrent
2. On désinfecte la tumeur en la trempant pendant 10 min dans une
solution d’eau de javel à 20%
3. On rince la tumeur 3 fois avec l’eau distillée stérile
4. On coupe aseptiquement la tumeur en petits morceaux
avec un scalpel
5. On place les morceaux de la tumeur dans un tube contenant 2,5
mL d’eau physiologique et on écrase les morceaux de la tumeur
6. On agite au vortex et on laisse macérer pendant 15 à 30 min
pour permettre la diffusion des bactéries dans l’eau
physiologique.

Isolement d’A. tumefaciens à partir des galles du collet


d’une plante de tomate infectée: Etapes de la technique

Eau distillée Eau de javel

Isolement de l’A. tumefaciens à partir des galles sur


milieu gélosé

Matériel :
Eau de javel à 20%
Eau distillée stérile
Eau physiologique stérile
Milieu NBY en boite de Pétri et en tube à essai
Bec bunsen
Ensemenceur (étaloir et anse nichrome)
Pipettes graduées cotonnées et stériles de 1 mL
Etuve bactériologique

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L’isolement des bactéries peut se faire de deux façons

1ère technique
On réalise une série de dilutions décimales jusqu’à 10-7 ; puis
avec une pipette de 1 mL
On prélève 0,1 mL de chaque dilution, et on la dépose à la
surface du milieu NBY
On étale l’inoculum sur toute la surface du milieu en boîte de
Pétri. On incube à 25-27°C pendant 24 à 48h.

2ème technique
On prélève avec une anse stérilisée une goutte du liquide de
macération de la tumeur et on l’étale sur la surface du milieu NBY
en boîte de Pétri en utilisant la technique des quadrants
On incube à 25-27°C pendant 24 à 48h.

Lecture

La sélection des colonies du genre Agrobacterium se fait dans un premier


temps selon les critères morphologiques suivants :
Colonies ayant une forme convexe, circulaires avec un contour régulier, lisses
non pigmentées, beige clair à crème blanchâtre, opaques.
Les colonies présentant les critères ci-dessus sont numérotées et repiquées
sur la surface du milieu NBY incliné en tubes à essai.

Ensemencement Colonie circulaire


avec contour régulier NBY

Colonie opaque
Colonies convexes
Aspect des colonies après 72 h à 25°C

2. Identification d’A. tumefaciens

Plusieurs tests biochimiques sont utilisés pour sélectionner


et identifier A. tumefaciens

Matériel
Culture jeune de 24h d’A. tumefaciens (108 ufc/mL) NBY

Milieux de culture (milieu KING B)


Bec bunsen
Ensemenceur
Lame propre
Etuve bactériologique réglée à 25-27°C
Réactifs (KOH à 3%, réactif de Bénédict)

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Fluorescence: Agrobacterium sont non fluorescentes

Un tube contenant le milieu King B incliné est ensemencé en


stries par les souches isolées. Ce milieu favorise la diffusion
d’un pigment fluorescent à partir de 24 à 48h d’incubation. La
lecture s’effectue sous rayons ultra-violets.

24 à 48 à 25°C

Culture pure Milieu King B Pas de piment


d’A. tumefaciens Miieu King B ensemencé fluorescent

Fluorescence:
Agrobacterium sont non fluorescentes

A
B
C

A: Bactérie fluorescente
B: Bactérie non fluorescente
C: Bactérie fluorescente
sous lampe ultra violet

Gram au KOH: Agrobacterium est à Gram négatif

Cette technique consiste à déposer une anse pleine de culture


bactérienne sur une lame de verre et l’émulsionner avec une goutte
de KOH à 3%. S’il y a formation d’un filament en soulevant l’anse,
la bactérie est à Gram négatif; s’il n y a pas formation de filament,
la bactérie est à Gram positif.

Cette réaction est due au fait que les enveloppes des bactéries à
Gram négatif sont lysées par le KOH. L'ADN est libéré et forme un
gel si bien qu'en moins de 60 secondes, le liquide devient visqueux.
En retirant doucement l'effilure de la pipette, il est possible de voir
la formation d'un filament

Les bactéries à Gram positif ne sont pas lysées et on n'observe


aucune viscosité du liquide.

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Gram au KOH

Filament
a: Prélever une anse pleine de bactéries
b: Ajouter une goutte de KOH à 3%
c: Emulsionner le mélange et soulever l’anse

Coloration de Gram

Réaliser 1 frottis à partir d’une culture jeune sur une lame en verre ;
Fixer le frottis en passant la lame à la flamme;
Recouvrir de quelques gouttes de violet cristal (l min), puis égoutter ;
Recouvrir de lugol (l min) ;
Entraîner le lugol par un mélange d'alcool et d’acétone jusqu'à
disparition des reflets bleus ;
Laver à l'eau du robinet ;
Colorer à la fuchsine basique (30s) ;
Observer au microscope au fort grossissement (x 1000) + huile à
immersion ;
Faire des schémas.
Les cellules à Gram + sont colorées en violet.
Les cellules à Gram - sont colorées en rose.

Coloration de Gram: technique

Gram +

Gram -

Cristal violet Lugol Alcool Fuchsine

Observation microscopique
x1000
Lavage à l’eau (avec huile à immersion)

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Observation microscopique de A. tumefaciens

Flagelles Gram négatif

Agrobacterium tumefaciens
(microscopie électronique) FSA

Agrobacterium tumefaciens
(microscopie optique x1000)

Métabolisme du glucose: A. tumefaciens est oxydative

Matériel
Milieu de HUG & LEIFSON en tubes
Huile de paraffine stérilisée
Méthode
On ensemence le milieu avec la culture bactérienne par piqure centrale.
2 tubes sont utilisés. L’un des 2 est recouvert par 0,5 mL d’huile de
paraffine stérilisée.
Lecture
Huile de paraffine

Milieu vert Milieu jaune

Partie supérieur du milieu


sans paraffine jaune

Lecture

1 Tubes tel qu'ils doivent être après ensemencement


2 Haut du Tube O jaune → il y a eu un changement de couleur dû à
l'acidification dans le haut du tube O uniquement : les bactéries ont besoin
d'oxygène pour dégrader le glucose. Les bactéries sont oxydatives.
3 Tubes O et F entièrement jaunes → il y a eu virage de l'indicateur coloré à
cause de la production d'acide dans tout le tube : les bactéries ont utilisé le
glucose en présence et en absence d'oxygène. Les bactéries sont donc
fermentatives.
4 Haut du tube O bleu → bactéries inertes au glucose : utilisation des peptides
comme source d'énergie.

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Production du 3-cétolactose: réaction positive

Matériel
Milieu lactosé
Réactif de Bénédict (détecte les sucres)

Méthode
On dépose la culture bactérienne le milieu lactose
On incube 48h à 25 °C
On inonde les cultures de 48h par le réactif de Bénédict

Lecture
Les souches qui oxydent le lactose en 3-cétolactose développent un
anneau jaune brillant caractéristique du Cu2O (oxyde de cuivre) autour
des colonies au bout de 10 à 15 minutes, et la réaction est notée alors
positive.

Production du 3-cétolactose: réaction positive

Culture sur un milieu Ajout du réactif de Bénédict


lactosé

1: positif
2. négatif
A. tumefaciens oxyde le lactose en 3-cétolactose
oxyde de cuivre (CuO)

Croissance à 2% NaCl: réaction positive

Matériel
Gélose nutritive additionnée de 2% NaCl

Méthode
On ensemence un tube du milieu
On incube pendant 2 à 5 jours

Lecture
Si les bactéries poussent sur le milieu, la réaction est notée
positive.

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Croissance à 35°C

Matériel
Milieu NBY liquide en tubes
Culture bactérienne jeune de 24h

Méthode
On ensemence le milieu NBY liquide
On incube à 35°C pendant 24h

Lecture
A. tumefaciens se développe à 35°C

Test oxydase: but du test

Ce test permet de mettre en évidence la présence de


l’enzyme cytochrome oxydase, chez les bactéries à
Gram négatif

Cette enzyme intervient à la fin de la chaîne


d’oxydoréduction pour catalyser la fixation de
l’hydrogène et des électrons sur l’oxygène

Sa recherche est basée sur l’oxydation de l’oxalate de


N-diméthyl-paraphénylène diamine qui est rouge/violet
sous forme oxydée et incolore sous forme réduite

Test oxydase: A. tumefaciens est oxydase positive

Matériel
Culture bactérienne jeune de 24 h
Papier filtre de Wathman
Réactif de N-diméthyl-paraphenylène-diamine à 1 %
Anse

Méthode
On dépose une anse pleine de culture bactérienne sur un papier filtre
Wathman imbibé avec une goutte du réactif de N-diméthyl-paraphenylène-
diamine à 1 %

Lecture
Test positif: la couleur de l’inoculum bactérien
vire vers le rose/ violet
Test négatif: la couleur de l’inoculum bactérien
ne change pas

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Test mobilité: A. tumefaciens est une bactérie mobile

Matériel
Milieu semi-solide en culot et en tube à essai contenant 0,5% d’agar
Fil droit

Méthode
On ensemence le milieu par piqure centrale
On incube à 25°C pendant 8h, 24h et 48h

Lecture
Si présence d’une zone diffuse de croissance (trouble)
s'étendant autour de la ligne d'inoculation La bactérie
est mobile
S’il y a un développement seulement au niveau de
la ligne d’inoculation La bactérie st immobile
Immobile Mobile

Utilisation du citrate de sodium: 24-79% des souches d’A.


tumefaciens sont citrate positif

Matériel
Milieu Citrate de Simmons (le citrate est la seule source de carbone)
Culture bactérienne jeune de 24h
Anse bouclée

Méthode
On ensemence la pente du milieu répartit en tubes inclinés par une strie longitudinale
(Le bouchon du tube ne doit pas être trop serré afin de permettre les échanges
gazeux car la réaction est aérobie)
On incube à 27°C pendant 24-48

Lecture
Croissance et changement de la couleur du milieu du vert vers le bleu

Utilisation du citrate de sodium: 24-79% des souches d’A.


tumefaciens sont citrate positives.

Lecture
L’utilisation du citrate, en aérobiose, conduit à une
croissance de la bactérie et à une alcalinisation du
milieu qui se traduit par le virage de l’indicateur
coloré, le bleu de bromothymol, du vert (pH 7) au
bleu (pH ›7).
La présence de colonies sur la pente du milieu
ensemencé avec ou sans virage du bleu de
bromothymol du vert au bleu indique que la
bactérie a utilisé le citrate comme seule source de
carbone.
L’absence de colonies sur la pente ensemencée
indique que la bactérie n’est pas capable d’utiliser
le citrate comme source de carbone, et le milieu
reste vert. Strie d’ensemencement

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Tableau récapitulatif et comparatif des résultats obtenus


pour la souche étudiée avec les caractères de A. tumefaciens

Caractères Caractères de: Résultats de


d’identification A. tumefaciens l’identification de la
souche étudiées
Fluorescence - -
Type de Gram - -
Utilisation du glucose Voie oxydative Voie oxydative
3-cétolactose + +
Na Cl 2% + +
Croissance 35°C + +
Oxydase + +
Mobilité + +
Citrate 24-79% sont + +

Conclusion: la souche étudiée est bien une Agrobacterium tumefaciens

3. Etude du pouvoir pathogène et vérification des


postulats de Koch

Les postulats de Koch reposent sur des critères


expérimentaux qui permettent d'établir un lien de causalité
entre l'agent pathogène et la maladie qu'il provoque. Ces
critères sont comme suit :
Le microorganisme doit être présent dans chaque plante atteinte
par la maladie et absent dans les plantes saines ;
L’agent pathogène doit pouvoir être isolé et cultivé (culture pure)
in vitro à partir de la plante malade ;
La même maladie doit être reproduite lorsqu’une culture pure du
microorganisme est introduite dans un hôte sensible sain;
L’agent pathogène doit être à nouveau isolé à partir de la plante
sensible expérimentalement infectée puis identifié comme étant
analogue à l'agent infectieux d’origine.

Etude du pouvoir pathogène de l’A. tumefaciens

Le but de cette manipulation est de déterminer le pouvoir


pathogène de la souche bactérienne isolée de la tumeur, qui se
manifeste par le développement de tumeurs sur les plantes infectées
par cette bactérie. Ces symptômes sont dus au transfère des gènes
responsables de la maladie portés par le plasmide Ti au niveau de
l’ADN de la plante.

Plante Plante
saine infectée
Plasmide de la bactéries

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Pouvoir pathogène sur plantules de tomate

Matériel
Tiges de jeunes plantules de tomate

Méthode
A l’aide d’une aiguille stérile, on blesse à 1 niveau les tiges de jeunes plantules
de tomate
On inocule la blessure en déposant dessus des gouttes de la suspension
bactérienne jeune de 24h de 108 bactéries/mL
On pique les plantes témoins négatif avec une aiguille stérile sans inoculum
On pique les plantes témoins positifs avec une aiguille inoculées avec une souche
pathogène connue d’A. tumefaciens
On place les plantes inoculées à 25°C pendant 5 jours, puis on les transmis à la
température ambiante du laboratoire dans un endroit éclairé

Lecture
Les résultats apparaissent à partir de 15 jours à 3 semaines après l’inoculation
Si la bactérie est pathogène une tumeur se développe sur la plante au niveau
de la blessure.

Pouvoir pathogène sur tranches de racines de carotte

Méthode
On lave les racines de carotte à l’eau javélisée
On rince 3 fois avec de l’eau distillée stérile
On désinfecte avec l’alcool,
On stérilise par flambage les racines désinfectées
Dans des conditions aseptiques, on coupe la carotte en tranches de 5 mm avec un couteau
désinfecté
On dispose la face inférieure des tranches de carotte sur du papier filtre Wathman stérilisé
On dispose les tranche de carotte dans une boite de Pétri stérile et mouillé avec l’eau distillée
stérile.
On inocule la face supérieure des tranches de carotte au niveau des vaisseaux avec la
suspension bactérienne de 108 bactéries/mL.
On prépare le témoin négatif (tranches de carotte inoculées avec de l’eau distillée stérile)
On prépare le témoin positif (tranches de carotte inoculées avec une souche pathogène d’A.
tumefaciens)
On maintient les boites inoculées à la température du laboratoire (20-22°C).
On observe la formation des tumeurs après 3 semaines.17

Isolement d’A. tumefaciens à partir des galles du collet


d’une plante de tomate infectée

Méthode
1. On laver la tumeur dans un premier temps avec l’eau du robinet
pour enlever le sol et les impuretés qui y adhèrent
2. On désinfecte la tumeur en la trempant pendant 10 min dans une
solution d’eau de javel à 20%
3. On rince la tumeur 3 fois avec l’eau distillée stérile
4. On coupe aseptiquement la tumeur en petits morceaux avec un
scalpel
5. On place les morceaux de la tumeur dans un tube contenant 2,5 mL
d’eau physiologique
6. On agite au vortex
7. On laisse macérer pendant 15 à 30 min pour permettre la diffusion
des bactéries dans l’eau physiologique.
8. On réalise de nouveau les tests d’isolement et d’identification sur la
bactérie isolée

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Etude de la bactérie isolée de la tumeur apparue sur la tige de


la plantule de tomate infectée expérimentalement: Etapes de
la technique

Eau de javel

Eau distillée

Isolement, identification
Apparition des symptômes
et contamination des
de la maladie: tumeur
plantules de tomates

Conclusion: la souche isolée est bien une A. tumefaciens

Vérification du postulat de Koch sur les tranches de


carotte

Lecture

Présence de symptôme de la maladie


Témoin négatif
sur les tranches de carottes infectées

Conclusion: Apparition des symptômes de la maladie sur les tranches


de carotte donc la souche isolée est bien une A. tumefaciens

Intérêt biotechnologique: Etapes de la réalisation


d'une plante transgénique grâce à A. tumefaciens

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Milieux de culture

Milieu lactose
Lactose 10g
Extrait de levure 1g
Agar agar 20g
Le pH de ce milieu est ajusté à 7,2

Réactif de Bénédict :
Solution A : Dissoudre 173g de citrate de sodium et et 100g de
carbonate de sodium dans 600 ml d’eau distillée. Chauffer la solution
puis filtrer.
Solution B : Dissoudre 173g de sulfate de cuivre (CuSO4, 6H2O) dans
150 ml d’eau distillée. Puis additionner soigneusement la solution B à la
solution A. Agiter constamment puis compléter à 1 litre avec l’eau
distillée.

Milieux de culture

NBY (Nutrient broth yeast extract agar):


Bouillon nutritif 8g
Extrait de levure 2g
Glucose 10 g
K2HPO4 2g
KH2PO4 0,5g
MgSO4,7H2O 0,2 g
Agar-Agar 20 g
Le pH de ce milieu est ajusté à 7,0.

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