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31/10/2015

Section SV5
Module: Physiologie Animale II
TP Digestion 2015/2016

Expérience
du foie lavé
chez le rat

Objectifs:

- L ’ initiation à quelques
techniques opératoires (anesthésie
et canulations) sur un animal vivant
et anesthésié.

- Montrer le rôle du foie dans


le métabolisme glucidique.

La glycémie
C’est la concentration du glucose
dans le sang.

A jeûne, elle est entre 0.7 et 1.2 g/l


En dessous de cet intervalle :
c’est l’hypoglycémie.

Au dessus de cet intervalle :


c’est l’hyperglycémie.

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Fluctuations de la glycémie avec les apports


alimentaires.

Glycémie g/l

Petit
déjeuner Déjeuner Diner

Heures de la journée

Principe de la manipe:

le taux de glucose dans le sang est un paramètre


homéostatique sous haute surveillance.

Il est maintenu constant grâce au double jeux du


pancréas (par ses hormones insuline et glucagon) et
du foie (lieu de stockage et de relargage du
glucose).

Toute variation (par apport alimentaire, effort


physique…) de la glycémie est rapidement corrigée
par l’intervention de ces organes

Glycogénolyse : production de Glycogénogénèse : synthèse


glucose par hydrolyse du (dans le foie et le muscle) de
glycogène hépatique. glycogène à partir du glucose.

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Préparation de l’animal

anesthésie et
canulations

L’anesthésie de l’animal
L’anesthésie est la suspension de la sensibilité suite
à l ’ interruption de la transmission douloureuse. Dans le
présent TP, on pratique une anesthésie profonde et
générale.
- Solution utilisée: Ethyl urétane

- Solution mère: 20 g/ 100 ml

- Dose à injecter: 1,5 g/kg de poids corporel

- Type d’injection: Intrapéritonéale


1,5 g 1000g
Xg Poids de l’animal

20g 100 ml
Xg dose à injecter

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La contention du rat

1- La contention du rat se fait en saisisssant l’animal par la


peau du dos et de la nuquetendue, est maintenue entre la pouce et
l ’ index afin de l ’ empêcher de tourner la tête et éviter ainsi les
éventuelles morsures.
2- L ’ aiguille doit être perpendiculaire à l ’ abdomen, puisqu' ’ il
s’agit d’une injection intrapéritonéale et non sous-cutanée.
3- Le choix de la zone d’injection: Eviter le foie, la vessie et
les vaisseaux sanguins axiaux (aorte et veine cave inférieure).

Incision des plans peaussier


et musculaire

• Recommandations
Eviter les incisions trop étendues, les

X A X hémorragies.
Humecter constamment avec du sérum
B
physiologique les organes desséchés
Ne fixer pas les membres antérieurs
C
Incisions
• A,B : Trachéotomie, canulations de
D
• la carotide et de la jugulaire.
F • C,D : Canulation du canal cholédoque
et de la veine porte.
E • E,F : Canulation de la vessie.

Ne pas utiliser de ciseaux pour dilacérer

LES CANULATIONS
La canulation c’est l’introduction d’une canule dans un
vaisseaux ou un canal pour injecter ou prélever une
substance donnée.

Vaisseaux

Canule Nœud serré pour


Fixer la canule

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Trachéotomie
C’est la canulation de la trachée artère pour
faciliter la respiration.

Rôle : corriger les


problèmes respiratoires en
réduisant la distance entre
l’air ambiant et les
alvéoles.

Emplacement : cou

Type de But Sens Précautions à


Canulation Prendre
Faciliter la Vers les -Préparer les nœuds
Trachéotomie respiration poumons -Canule propre et
En corrigeant sèche
l’hypoventillation
provoquée par
l’anesthésie

- Canuler la trachée vers les poumons !

- Attention, ne pas trop enfoncer le cathéter vers les poumons


- La trachée artère doit être canulée uniquement dans le cas ou
l’animal présente des problèmes respiratoires au cours de la
manipulation (effet secondaire de l’anesthésie).

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Canulation de la veine jugulaire

La veine jugulaire se trouve latéralement


sous la peau du cou

Etapes de canulation de la veine jugulaire


Type de But Sens Précautions à
Canulation Prendre
Voie Vers le -Préparer les nœuds Etape 2
Canulation de d’injection cœur -Canule remplie de
la veine dans NaCl 9‰
Jugulaire Le sang

Etape 1
Cathéter

A serrer uniquement
En cas d’hémorragie
Hémisection
Sens de circulation
du sang
Pour maintenir
La canule

Laisser la seringue de NaCl en place pour éviter le reflux sanguin et


la coagulation du sang dans le cathéter .

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Trachée artère

Type de But Sens Précautions à


Canulation Prendre
Prélèvement du Vers le
Canulation de sang cœur -Préparer les nœuds
l’artère -placer la pince
Carotide Hémostatique
-Canule remplie
d’héparine

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Canulation de la carotide

Cathéter rempli
d’héparine

Ligature serrée

Sens de circulation
du sang

Ligature serrée après


mise en place de la canule

Pince hémostatique

Ouvrir la pince hémostatique

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Pour l’étude
du rôle du foie
dans le métabolisme glucidique,
on procède

au dosage du glucose

et du glycogène dans le foie.

•Dosage de glucose

•Après laparotomie, le foie du rat est séparé de


toute adhérence aux autres viscère et prélevé en
totalité. Ensuite le foie est pesé puis découpé en
petits morceaux de taille ≈ identique qui sont mis
dans un bécher contenant 20 ml de NaCl 0.9 % à
37 °C.

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Ces morceaux sont incubés pendant 1 heure à


37°C dans un bain marie.
Le liquide d’incubation sera renouvelé toutes les 15
min (on récupère l’ancien pour faire le dosage du
glucose libéré par les morceaux de foie).

Dosage colorimétrique à la Glucose oxydase


C’est une méthode de dosage de substrat (ici le
glucose) par une méthode enzymatique qui est
constituée de 2 réactions couplées:

1ère Réaction
c’est une réaction enzymatique qui oxyde le glucose
présent dans l ’ échantillon en acide gluconique et en
peroxyde d'hydrogène par la Glucose-oxydase (GOD).
Glucose oxydase
Glucose + 2 H2O + O2 acide gluconique + 2 H2O2
2ème Réaction
Le peroxyde d'hydrogène (H2O2) sert de substrat à
la peroxydase (POD) dans une réaction couplée conduisant à
l ’ oxydation d ’ un chromogène incolore en un chromogène
coloré.
Peroxidase
Chromogène oxydé coloré
H2O 2 + chromogène réduit incolore (coloration brune)

L’intensité de la coloration est proportionnelle à la


concentration en glucose.

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Les réactifs utilisés


Réactif 1 (R1): tampon phosphate + les enzymes GOD + POD

Réactif 2 (R2): le chromogène (le 4-aminophénazone)

Réactif 3 (R3): le glucose standard ou solution étalon (1g/l)

Echantillons : 1er , 2ème et 3ème perfusat

Méthode de préparation:
- Pour obtenir le réactif final on ajoute à 4 ml de R1
1 ml de R2.

- ensuite on prépare les tubes selon le tableau


suivant:

Protocole expérimental
Tubes Blanc glucose Echantillons
Standard 1 g/l 15, 30, 45 et 60 min
Eau distillée 100 µl
Solution étalon de glucose 100 µl -
Perfusats - 100 µl*
Réactif final R1/R2 (8/2) 1 ml 1 ml 1 ml
-Ajouté le réactif final (R1(80 %) + R2 (20%)), passer au vortex puis incuber pendant
10 min à l’obscurité et à température ambiante.
- Lecture de la DO à 505nm

À partir de la DO des échantillons et celle de la


solution standard de glucose on peut déterminer la
concentration du glucose en g/l:

D.O de la solution Concentration


standard de glucose Standard 1g/l

D.O de l’échantillon [Glucose] g/l


échantillon

D.O de l’échantillon
Concentration
[Glucose] g/l = X
DO de la solution standard (1g/l)
échantillon
étalon de glucose

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DOSAGE DE GLYCOGENE
Il est dosé dans des morceaux de foie au début, à
30 min et à la fin de l’incubation. Le tissu hépatique est
pesé avec précision, broyé et filtré comme suit :
1- Broyage
Broyer les morceaux de foie dans un mortier en ajoutant
5 ml d’acide trichloracétique à 4%.

2- Filtration
Filtrer le broyat obtenu au dessus d’une
éprouvette graduée.
Le volume total doit être de 10 ml.
Centrifuger le filtrat pendant 10 min à
4000 tour/min
Dans un tube à essai, mettre 4,5 ml du
surnageant (du filtrat) et 0,5 ml du lugol.
ou 0,9 ml du filtrat ajouter 0,1 ml
du lugol Pour un tube eppendorf

•Dosage de
glycogène
La quantité de glycogène
dans les filtrats sera
déterminée, après
centrifugation, par
colorimètre (λ=520 nm) par
une méthode comparative.

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Préparer la gamme étalon


à partir de la solution d’amidon
et tracer la courbe d’étalonnage
DO = f [amidon]

Faites un blanc en ajoutant à 4,5 ml de


TCA (4%) 0,5 ml de lugol.

A partir de la courbe d’étalonnage,


déterminez la quantité de glycogène.

Filtrats

Exploitation des résultats

Evolution de la concentration du glucose au niveau des


échantillons.

Evolution de la quantité de glycogène dans le tissu hépatique


avec le temps.

Que peut-on conclure ?

Que peut-on conclure de l’ensemble des résultats de cette


expérience ?

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