Etude de la cardiotoxicité induite par les traitements

anticancéreux : Rôle d’Epac dans la cardiotoxicité

induite par la Doxorubicine
Marianne Mazevet

To cite this version:

Marianne Mazevet. Etude de la cardiotoxicité induite par les traitements anticancéreux : Rôle d’Epac
dans la cardiotoxicité induite par la Doxorubicine. Biologie moléculaire. Université Paris-Saclay, 2015.
Français. �NNT : 2015SACLS190�. �tel-01412104�

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NNT : 2015SACLS190

THESE DE DOCTORAT
DE L’UNIVERSITE PARIS-SACLAY,
préparée à Université Paris Sud

ÉCOLE DOCTORALE N° 569 ITFA

Innovation thérapeutique : du fondamental à l’appliqué
Spécialité de doctorat : Physiologie, physiopathologie

Par

Mme Marianne Hanaë Mazevet

Etude de la cardiotoxicité induite par les traitements anticancéreux :

Rôle d’Epac dans la cardiotoxicité induite par la Doxorubicine

Thèse présentée et soutenue à Châtenay-Malabry, le 7 décembre 2015:

Composition du Jury :

Mr, Poüs, Christian Professeur, Université Paris Saclay Président

Mr, Mericskay, Matthias CR1, Université Pierre et Marie Curie Rapporteur
Mme, Sarda-Mantel, Laure PU-PH, Université Paris 7 Rapporteur
Mr, Lezoualc’h, Franck DR, Université Toulouse Paul Sabatier Examinateur
Mr, Diviani, Dario MCU, Université de Lausanne Examinateur
Mme, Bourgier, Céline MCU-PH, Institut du cancer de Montpellier Examinatrice
Mr, Morel, Eric MCU, Université Paris Saclay Directeur de thèse

Page 1
 Remerciements
Pour commencer, je remercie les membres du jury, qui m’ont fait l’honneur de s’intéresser à
mes travaux. Tout d’abord je remercie au Pr Christian Poüs d’avoir accepté de présider ce
jury. Un grand merci également au Dr Frank Lezoualc’h, au Dr Céline Bourgier et au Dr
Dario Diviani, examinateurs de mon travail ainsi qu’au Dr Laure Sarda-Mantel et au Dr
Mathias Mericskay, rapporteurs de ma thèse.

Je tiens à remercier le Dr Rodolphe Fischmeister, directeur de l’unité U769 et directeur

adjoint de l’U1180. Merci de m’avoir accueillie dans ton laboratoire et de m’avoir offert cette
opportunité. Tes conseils au sujet de mon projet scientifique et de ma carrière professionnelle
ont été précieux.

Je souhaite également remercier le Dr Ana-Maria Gomez, directrice de l’équipe 3

« Signalisation calcique et Physiopathologie cardiaque » et maintenant directrice de notre
unité ainsi que le Dr Jean-Pierre Benitah de m’avoir accueillie au sein de l’équipe. Merci à
Jean-Pierre pour les résultats patch et à Ana-maria pour m’avoir appris la microscopie
confocale. Votre sens critique très aiguisé m’a également permis d’avancer dans mon projet
de thèse. Merci pour votre disponibilité et pour toutes vos explications sur la signalisation
calcique.

Je remercie bien évidemment et très sincèrement mon directeur de thèse, Eric Morel. Malgré
tes heures passées en enseignement, tu as toujours su te rendre disponible. En plus de tout ce
que tu m’as appris et toutes les discussions scientifiques ou non que nous avons eues, tu m’as
aussi donné une grande liberté dans l’organisation de mon travail ce qui m’a permis de
formuler mes propres hypothèses et d’aller au bout de mes idées. Tu m’as également
beaucoup sollicité pour tes collaborations me permettant d’appréhender de nombreux
domaines de recherche. Ces 4 ans de thèse avec toi n’ont pas été de tout repos (pour toi
également) mais je te remercie chaleureusement pour tout le soutien que tu m’as apporté et
t’en serai toujours reconnaissante.

Ce projet a été initié à mon arrivée au laboratoire. Je tiens donc également à remercier tous
ceux qui ont participés à ce projet et sans qui je n’aurais pu finir ma thèse. Je remercie donc
Bertrand Crozatier pour tous ses conseils avisés ainsi que tous nos collaborateurs et
notamment Catherine Rucker-Martin, Mathias Mericskay, Christilla Bachelot, Séverine Lorin
et Christophe Lemaire.
Je souhaite également remercier très chaleureusement Philippe, pour toutes les
échocardiographies réalisées aussi sur toutes nos souris wild-type ainsi que notre modèle
Epac1 KO, Flo et Anita pour toutes les dissoc et les données calcium des souris wild-type et
Mégane, pour l’année passée sur ce projet. J’ai adoré travailler avec vous et j’espère qu’on
aura l’occasion de retravailler ensemble.
Je souhaite remercier également tous les stagiaires qui ont également participé à ce projet et
notamment Marie-Michèle, Andjy, Gwenaëlle, Sarah et bien sûr Max qui prend maintenant la
suite de ces travaux. Je te souhaite donc bonne chance et j’espère que tu auras autant de joie à
reprendre ce projet que j’en ai eu.

Page 2
Tout au long de ces 4 ans, j’ai passé la plupart de mon temps à l’animalerie. Je tiens donc à
remercier Valérie Dommergue ainsi que tout le personnel de l’animalerie dont l’aide pour nos
souris wild-type mais également pour le maintien de la lignée Epac KO m’a été précieuse.

Au cours de ces années de thèse, j’ai eu la chance de travailler au sein de l’équipe 3 de

l’U1180. Je souhaite donc remercier Anita, Jessica, Fiona, Antoine, Yueyi, Linwei, Thassio,
Riccardo, Ale, Sasha, Jean-Jacques et Gaëlle, pour leur soutien. L’entre-aide instaurée dans
cette équipe et notamment pour la dissoc des neonats m’a permis de mener à bien mes
travaux.

Je souhaite bien sûr remercier l’ensemble du laboratoire pour m’avoir si bien accueilli. Vous
avez tous contribué à rendre cette thèse inoubliable. Merci à Françoise et à Sophie qui
garantissent au quotidien le bon fonctionnement du labo.
Merci à tous les thésards du 5ème et notamment Pierre, Milia, Delphine, Marta et Ibrahim.
Merci Pierre d’avoir essayé de me mettre au sport et notamment au badminton, sans grand
succès, désolée… et pour tes blagues, pas toujours drôles!
Merci Delphine de partager ton expérience et ta bonne humeur constante avec tous les
thésards !
Merci Marta et Ibrahim d’avoir rendu le congrès SFC en Suisse inoubliable. Ibrahim, tes
prouesses en ski resteront à jamais gravées dans ma mémoire!
Je tiens à remercier plus particulièrement le bureau du 2ème et notamment Giada, Jérôme,
Fiona, Julie, Sarah, Max et ainsi que Matthieu, Fanny, Alex et Arnaud, membres déjà partis.
Giada, Giada, Giada…Je pense que sans toi je n’aurai jamais réussi à aller jusqu’au bout de
cette thèse. Alors merci pour ta gentillesse, ton soutien sans faille mais aussi de m’avoir
plusieurs fois secouée, tu m’as permis d’évoluer scientifiquement et surtout personnellement.
Merci pour toutes les soirées passées ensembles et tous les bons petits plats que tu nous
amenais.
Merci également à Jérôme et Julie, par leurs gentillesses et leurs calmes m’ont parfois permis
de contenir mes colères et mes angoisses.
Merci aussi à Fiona et Antoine pour votre humour et vos délires (particuliers tout de même),
qui me permettaient de décompresser et de relativiser. Merci aussi à Fiona pour les
nombreuses soirées pizza/bière, mc do/bière sur fond the voice/nouvelle star.
Merci à Matthieu, à peine rencontré et déjà parti en post doc. Ta bonne humeur m’a beaucoup
manqué ces dernières années.
Merci à Fanny, avec qui je peux toujours parler du Japon, toujours de manière très
objective… et pour les nombreuses soirées en ta compagnie!
Merci à Mégane, pour l’énorme soutien apporté à ce projet et toutes les soirées filles qu’on a
pu faire !
Merci Jérôme V !!! Nos vendredis gras vont me manquer…

Je tiens maintenant à remercier chaleureusement mes amis Margaux, mon acolyte, Jérôme et
Anne-Claire.
Enorme merci à Margaux, pour avoir eu le courage de corriger ma thèse, je t’en serai
éternellement reconnaissante. Curry japonais à volonté et à vie, ça tient toujours
évidemment ! En plus d’avoir corrigé ma thèse, tu as également été à mes côtés tout au long
de cette thèse, presque tout au long de ma vie aussi. Comment tu as pu me supporter toutes
ces années reste pour moi un mystère mais j’ai apprécié chaque moment passé avec toi depuis
25 ans et j’espère que ça continuera longtemps !

Page 3
A mon acolyte, tu as été le premier à me soutenir quand j’ai dis que je voulais faire une thèse.
Tu m’as aussi toujours poussé à aller plus loin et tu as toujours été là pour moi dans les bons
et les mauvais moments et pour ça je t’en remercie sincèrement.

Enorme merci aussi à Jérôme, toi aussi tu es passé par là et pourtant tu as toujours réussi à
garder ton calme et à ne jamais stresser et je t’admire beaucoup pour ça. Tes nombreuses
blagues et péripéties américaines ainsi que nos voyages m’ont offert un espace de réconfort et
une échappatoire et je te remercie infiniment pour ça.

Je remercie du fond du cœur ma famille et notamment mon frère (et céline) et surtout mes
parents qui m’ont d’abord permis de faire une école d’ingénieur puis ont continué à me
soutenir quand je leur ai dis que je voulais continuer en thèse. Ils m’ont toujours laissé libre
de mes choix dans mes études (bon à part l’allemand…) mais également dans tous les autres
domaines. Vous vous êtes toujours sacrifiés pour nous et vous nous avez offert une enfance
remplie de voyages et de joies. Vous nous avez également toujours encouragé à donner le
meilleur de nous-même. Je vous dédie donc cette thèse.

Page 4
 Résumé
La doxorubicine induit un stress oxydant, des dommages à l’ADN conduisant aussi bien à la mort des
cellules cancéreuses que des cardiomyocytes. De nos jours, plusieurs hypothèses non reliées à la mort
cellulaire et impliquant d’autres mécanismes ou l’altération des signalisations cardiaques telles que la
signalisation β-adrénergique ont émergé. Cette thèse a donc pour objectif l’étude du rôle d’Epac,
facteur d’échange directement activé par l’AMP cyclique, lui-même produit après stimulation β-
adrénergique, dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. En effet, la doxorubicine induit une
cardiomyopathie dilatée 15 semaines après traitement associée à une altération de l’homéostasie
calcique. Ces altérations sont corrélées à la modulation temps et dose-dépendantes de la signalisation
d’Epac. Cette même altération globale de la signalisation d’Epac a également été observée in vitro
après 24h de traitement à la dox. De plus, l’inhibition spécifique d’Epac 1 a permis la prévention des
dommages à l’ADN et de façon subséquente de la mort des cardiomyocytes. L’invalidation du gène
d’Epac1 chez la souris a également permis la prévention in vivo des altérations de l’homéostasie
calcique ainsi que de la fonction cardiaque induite par la dox. Enfin, l’inhibition d’Epac n’interfère pas
avec l’efficacité antitumorale de la doxorubicine sur différentes lignées cancéreuses. En conclusion,
nous avons identifié Epac comme nouvelle cible thérapeutique de la cardiotoxicité induite par la dox
permettant sa prévention sans réduire l’efficacité du traitement anticancéreux.

Abstract
The mechanisms underlying doxorubicin (Dox)-induced cardiotoxicity involve reactive oxygen
species generation, DNA intercalation and topoisomerase II (TopII) inhibition which trigger DNA
damage, oxidative stress, alteration of calcium homeostasis and lead to cardiomyocyte death.
Now, evidences have emerged that Dox may promote cardiotoxicity by alternative mechanisms or by
signaling pathways modulation including β-adrenergic signaling unrelated directly to cell death. This
study provides in vitro and in vivo evidence of the guanine exchange factor directly activated by Epac
role, a guanine exchange factor directly activated by cyclic AMP produced after β-AR stimulation, in
cardiotoxicity induced by doxorubicin. Indeed, Dox leads to the development of a dilated
cardiomyopathy (DCM) 15 weeks post treatment in mice associated with calcium homeostasis
abnormalities. These alterations were associated with time- and dose-dependent alterations of Epac
signaling. The same alterations of Epac signaling were observed in vitro after 24h of dox treatment.
Furthermore, we first showed that the specific pharmacologic or genetic inhibition of Epac1 but not
Epac2 prevents the deleterious effects of Dox in vitro. These cardioprotection were confirmed in vivo
in transgenic Knock-out Epac1 mice. Epac 1 inhibition did not interfere with the attempted Dox
antitumor efficiency on tumor cell lines. Altogether, these findings identify the cAMP-binding protein,
Epac, as a potential therapeutic target of dox-induced cardiotoxicity.

Page 5
Sommaire

Abréviations ............................................................................................................................. 11
Listes des figures et des tableaux ............................................................................................. 15
Figures .................................................................................................................................. 15
Tableaux ............................................................................................................................... 16
Avant-propos ............................................................................................................................ 17
Introduction .............................................................................................................................. 20
1- Physiopathologie cardiaque ............................................................................................. 20
1-1 Structure du cœur ....................................................................................................... 20
1-2 Fonction cardiaque ..................................................................................................... 22
1-2-1 Système de conduction du cœur ............................................................................. 22
1-2-2 Signalisation calcique : Couplage excitation-contraction et couplage excitation-
transcription...................................................................................................................... 23
1-2-3 Contraction des myofibrilles .................................................................................. 25
1-3 Régulation cardiaque.................................................................................................. 26
1-4 Signalisation cardiaque .............................................................................................. 27
1-4-1 Signalisation β-adrénergique .................................................................................. 27
1-4-2 Les effecteurs de l’AMPc ....................................................................................... 31
1-5 Pathologies cardiaques............................................................................................... 32
1-5-1 Cardiomyopathie hypertrophique ........................................................................... 32
1-5-2 Cardiomyopathie dilatée......................................................................................... 33
1-5-3 Insuffisance cardiaque ............................................................................................ 34
2- Les traitements anticancéreux .......................................................................................... 35
2-1 La radiothérapie ......................................................................................................... 36
2-1-1 Principe................................................................................................................... 36
2-1-2 Posologie: dose, fractionnement, et étalement de la radiothérapie......................... 36
2-1-3 Indications de la radiothérapie................................................................................ 37
2-1-4 Effets secondaires ................................................................................................... 37
2-2 La chimiothérapie ...................................................................................................... 42
2-2-1 Principe de la chimiothérapie ................................................................................. 42
2-2-2 Cinétique d'action de la chimiothérapie ................................................................. 43

Page 6
 2-2-3 Types de chimiothérapie et leurs effets secondaires spécifiques ........................... 43
2-3 Les traitements combinés........................................................................................... 47
3- Physiopathologie de la cardiotoxicité des anthracyclines................................................ 49
3-1 Les anthracyclines...................................................................................................... 49
3-1-1 Historique ............................................................................................................... 49
3-1-2 Structure.................................................................................................................. 50
3-1-3 Métabolites actifs des anthracyclines ..................................................................... 51
3-1-4 Pharmacocinétique de la doxorubicine................................................................... 52
3-2 Cardiotoxicité induite par les anthracyclines............................................................. 53
3-2-1 Altérations du tissu cardiaque induites par la doxorubicine................................... 53
3-2-2 Epidémiologie......................................................................................................... 56
3-2-3 Facteurs de risque ................................................................................................... 57
3-2-4 Prévention de la cardiotoxicité des anthracyclines................................................. 58
3-2-5 Prise en charge des patients : dépistages et traitements de la cardiotoxicité induite
par la doxorubicine........................................................................................................... 60
4- Mécanismes d’action de la doxorubicine......................................................................... 64
4-1 Mécanismes d'action antitumorale de la doxorubicine .............................................. 64
4-1-1 Interaction ADN-anthracyclines............................................................................. 64
4-1-2 Inhibition de la topoisomérase II ............................................................................ 65
4-1-3 Formation de radicaux libres .................................................................................. 66
4-2 Mécanismes moléculaires de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine .............. 66
4-2-1 Induction d’un stress oxydant................................................................................. 68
4-2-2 Inhibition de la topoisomérase II ............................................................................ 70
4-2-3 Altérations des mitochondries et du métabolisme énergétique .............................. 72
4-2-4 Modulation des voies de mort induite par la doxorubicine .................................... 75
4-2-5 Altération des cellules cardiaques progénitrices .................................................... 81
4-2-6 Altérations de la signalisation de l'AMPcyclique et de la signalisation calcique... 83
4-2-7 Altérations des petites protéines G par la doxorubicine ......................................... 88
5- Signalisation d’Epac ........................................................................................................ 93
5-1 Structure et mécanisme d’activation d’Epac.............................................................. 94
5-2 Fonctions biologiques ................................................................................................ 96
5-2-1 Fonction neuronale ................................................................................................. 97
5-2-2 Sécrétion d’insuline ................................................................................................ 97
5-2-3 Fonction vasculaire................................................................................................. 97

Page 7
 5-2-4 Fonction rénale ....................................................................................................... 98
5-2-5 Fonction dans l’inflammation................................................................................. 99
5-2-6 Autres fonctions biologiques .................................................................................. 99
5-3 Rôle d’Epac dans le cœur ........................................................................................ 100
5-3-1 Régulation de l'homéostasie calcique par Epac.................................................... 101
5-3-2 Signalisation d'Epac et hypertrophie cardiaque.................................................... 102
5-3-3 Epac et fibrose ...................................................................................................... 104
5-5 Epac et cancer .......................................................................................................... 104
5-6 Epac et morts cellulaires .......................................................................................... 105
6- Problématique et objectifs de l’étude............................................................................. 107
Matériel et méthodes .............................................................................................................. 111
1-Matériel ........................................................................................................................... 111
1-1 Produits chimiques................................................................................................... 111
1-1-1 Doxorubicine et dexrazoxane ............................................................................... 111
1-1-2 Activateurs et inhibiteurs d'Epac .......................................................................... 111
1-2 Anticorps.................................................................................................................. 114
1-2-1 Anticorps primaires .............................................................................................. 114
1-2-2 Anticorps secondaires........................................................................................... 114
1-3 Adénovirus............................................................................................................... 114
1-4 Plasmides ................................................................................................................. 116
2-Modèles expérimentaux .................................................................................................. 116
2-1 Expérimentation in vitro .......................................................................................... 116
2-1-1 Culture primaire de cardiomyocytes de rats nouveau-nés.................................... 116
2-1-3 Transfection transitoire et traitements .................................................................. 118
2-1-2 Culture cellulaire de lignées cancéreuses ............................................................. 119
2-2 Expérimentation in vivo ........................................................................................... 119
2-2-1 Développement d’un modèle murin de cardiotoxicité induite par la doxorubicine
........................................................................................................................................ 119
2-2-2 Souris transgéniques Epac knock out ................................................................... 120
2-2-3 Isolation des cardiomyocytes ventriculaires de souris adulte............................... 121
3- Etude fonctionnelle in vivo............................................................................................ 122
3-1 Echocardiographie ................................................................................................... 122
3-2 Mesure électrophysiologique in vivo par télémétrie ................................................ 122
3-3 Histologie................................................................................................................. 123

Page 8
 3-4 Microscopie confocale sur cardiomyocytes isolés................................................... 123
4- Méthodes de biologie cellulaire : étude de la viabilité cellulaire par cytométrie en flux
............................................................................................................................................ 124
5- Méthodes de biologie moléculaire et de biochimie ....................................................... 124
5-1 Lyse cellulaire.......................................................................................................... 124
5-2 Dosage protéique ..................................................................................................... 125
5-3 Précipitation par affinité de Rap1-GTP et Rac1-GTP ............................................. 125
5-3-1 Préparation des protéines de fusion ...................................................................... 125
5-3-2 Couplage de la protéine de fusion à des billes de glutathion................................ 126
5-3-3 Précipitation par affinité ....................................................................................... 126
5-4 Band Depletion Assay.............................................................................................. 126
5-5 Western blot ............................................................................................................. 127
5-5-1 Electrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) .................. 127
5-5-2 Transfert des protéines sur une membrane ........................................................... 128
5-5-3 Immunomarquage................................................................................................. 128
5-5-4 Révélation............................................................................................................. 128
5-6 Activité Epac1.......................................................................................................... 128
5-7 Activité calcineurine ................................................................................................ 130
5-8 Activité luciférase .................................................................................................... 130
6-Statistiques ...................................................................................................................... 131
Résultats ................................................................................................................................. 133
1- Altération temps dépendante de l’homéostasie calcique induite par la doxorubicine ... 133
1-1 Position du problème ............................................................................................... 133
1-2 Résultats................................................................................................................... 134
1-3 Conclusion ............................................................................................................... 163
2- Identification d’Epac1 comme nouveau régulateur de la cardiotoxicité induite par la dox
............................................................................................................................................ 166
2-1 Position du problème ............................................................................................... 166
2-2 Résultats................................................................................................................... 167
2-3 Conclusion ............................................................................................................... 215
Discussion et perspectives...................................................................................................... 219
1- Modèles d’étude in vivo de la cardiotoxicité induite par la dox.................................... 219
2- La doxorubicine induit une altération globale de la signalisation d’Epac ..................... 223

Page 9
 3- L’inhibition d’Epac 1 permet la prévention des effets cardiotoxiques de la doxorubicine
............................................................................................................................................ 230
4- Les effets cardioprotecteurs d’Epac1 passent par la voie Topoisomérase II β
indépendamment de l’état d’activation de Rac1 ................................................................ 232
5- Prévention du développement de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine par
invalidation d’Epac1 chez la souris.................................................................................... 235
6- L’inhibition d’Epac1 n’interfère pas avec l’activité antitumorale de la doxorubicine in
vitro .................................................................................................................................... 239
Conclusion.............................................................................................................................. 243
Références bibliographiques .................................................................................................. 247
Annexe 1: Revue: Complications of chemotherapy, a basic science update ..................... 279
Annexe 2: Article: Epac contributes to cardiac hypertrophy and amyloidosis induced by
radiotherapy but not fibrosis .............................................................................................. 281

Page
10
Abréviations

3-MA: 3-méthyladénine
5-FU : 5-Fluorouracile
α-AR : Récepteur α-adrénergique
β-AR : Récepteur β-adrénergique
AA: Acide arachidonique
AC : Adénylyl cyclase
Ad. : Adénovirus
ADP: Adénosine diphosphate
AIF: Apoptosis inducing factor
Akt: Protéine kinase serine/thréonine spécifique
AMPc : adénosine 3’,5’-monophosphate cyclique
AMPK: 5'-AMP protéine kinase
ANF: Atrial Natriuretic Factor
Apaf-1: Adaptor protein apoptosis protease activator
ATP: Adénosine triphosphate
BDA: Band Depletion Assay
BSA: Bovine Serum Albumin
CN : Calcineurine
CaMKII: Calcium/calmodulin dependent protein kinase
CEC: Couplage excitation-contraction
CET : Couplage excitation-transcription
CICR: Calcium induced-calcium release
CK: Créatine kinase
CMV: Cytomégalovirus
CRIB: Cdc42/Rac Interactive Binding Domain
CVRN: Cardiomyocytes Ventriculaires de Rats Néonataux
DEP: Dishevelled-Egl-10 Pleckstrin Domain
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DOX: Doxorubicine
DSB: DNA double strand break
DXZ: Dexrazoxane

Page
11
ECG: Electrocardiogramme
EPAC: Exchange Protein Directly Activated by cAMP
FDA: Fluorescéine diacétate
FE: Fraction d’éjection
FR : Fraction de raccourcissement
GC: Guanylyl cyclase
GFP: Green Fluorescent Protein
Gi: Protéine G inhibitrice
GLP-1: Glucagon-like peptide-1
GMPc : Guanosine monophosphate cyclique
GRK2: Kinase de type 2 des récepteurs couplés aux protéines G
Gs: Protéine G stimulatrice
GSK3: Glycogène synthase kinase-3
GTP: Guanosine triphosphate
Gy: Gray
HC: Hypertrophie cardiaque
HCN: Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide gated cation channel
HDAC: Histone déacétylase
HES: Hématéine Eosine Safran
HRP: Horseradish peroxidase
IPTG: Iso-propyl-thio-galactopyrannoside
IL: Interleukine
IP3R: Récepteur à l'inositol 1,4,5-triphosphate
KO: Knock Out
LB: Luria Broth
LTCC: L-type calcium channel
LVEF: Left ventricle ejection fraction
Mdiv-1: Mitochondrial division inhibitor
MEC: Matrice Extracellulaire
MEF2: Myocyte Enhancer Factor 2
MMP: Matrix Metalloproteinase
MPT: Pore de transition de perméabilité mitochondriale
MTA: Material Transfert Agreement
MyBPC: Protéine C liant la myosine

Page
12
NADH: Nicotinamide adenine dinucleotide
NCS: New Calf Serum
NCX: Sodium/calcium exchanger
NFAT: Nuclear Factor of Activated T-cells
NFR1: Nuclear respiratory factor 1
NFĸB: Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
NO: Monoxyde d’azote
OD: Oreillette droite
OG: Oreillette gauche
O-GlcNAc: Beta-O-linked N-acetylglucosamine
PA: Potentiel d’action
PAK: p21-activated kinase
PBS: Phosphate Buffered Saline
PDE: Phosphodiestérase
PGC-1α: Peroxisome proliferator activator receptor γ coactivator-1α
PI3K: Phosphatidylinositol-3-kinase
PIP2: Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate
PKA: Protéine kinase A
PKG: Protéine kinase G
PLA: Phospholipase A
PLB: Phospholamban
PLC: Phopholipase C
PLD: Phospholipase D
PP: Phosphatase
PS: Pénicilline Streptomycine
RCPG : Récepteur couplé aux protéines G
RE: Réticulum endoplasmique
ROS: Reactive Oxygen Species
RNS: Reactive Nitrogen Species
RyR: Récepteur à la ryanodine
SERCA: Sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase
SIRT1: Sirtuine 1
SMA: Smooth Muscle Actine
SRE c-fos: Serum Response Element-regulated c-fos

Page
13
SOCE: Store Operated Calcium Entry
SOD: Superoxyde dismutase
SVF: Sérum de veau fœtal
TFAM: Transcription factor A mitochondrial
TGF: Transforming Growth Factor
TIMP: Tissue inhibitors of metalloproteinase
TLR: Toll like receptor
TNF: Tumor necrosis factor
TnI: Troponine I
TopII β: Topoisomérase II β
TRPC: Transient Receptor Potential Canonical
UPR: Unfolded protein response
UPS: Ubiquitin proteasome system
VD: Ventricule droit
VEGF: Vascular endothelial growth factor
VG: Ventricule gauche
WT: Wild Type
XRCC1: X-ray Repair Cross-Complementing Protein 1

Page
14
Listes des figures et des tableaux

Figures
Figure 1: Représentation schématique du cœur ....................................................................... 21
Figure 2: Le système de conduction du cœur........................................................................... 23
Figure 3: Couplage excitation-contraction............................................................................... 24
Figure 4: Représentation schématique d'un cardiomyocyte..................................................... 25
Figure 5: Structure des récepteurs couplés aux protéines G .................................................... 28
Figure 6: Voies de signalisation des récepteurs β-adrénergiques ............................................ 29
Figure 7: Activation des différentes voies induites par le TGFβ1 ........................................... 39
Figure 8: Origine hétérogène des myofibroblastes .................................................................. 40
Figure 9: Fibrose radio-induite du péricarde............................................................................ 42
Figure 10: Structure des anthracyclines ................................................................................... 51
Figure 11: Principaux métabolites de la doxorubicine............................................................. 52
Figure 12: Altérations ultrastructurelles induites par les anthracyclines ................................. 54
Figure 13: Incidence des complications cardiaques induites par la chimiothérapie chez les
survivants de cancers pédiatriques ........................................................................................... 56
Figure 14: Incidence de l'insuffisance cardiaque congestive chez les patients âgés................ 57
Figure 15: Échelle graduée d'atteintes morphologiques........................................................... 61
Figure 16: Procédure de diagnostic et de traitement des complications cardiaques associées à
la doxorubicine......................................................................................................................... 63
Figure 17: Mécanisme d'action de la topoisomérase II ............................................................ 65
Figure 18: Vue d'ensemble des voies de signalisation altérées dans la cardiotoxicité induite
par la dox .................................................................................................................................. 67
Figure 19: Voies d'induction du stress oxydant par la doxorubicine ....................................... 69
Figure 20: Mécanismes de cardiotoxicité induite par la dox ................................................... 71
Figure 21: Altérations métaboliques induites par la doxorubicine .......................................... 74
Figure 22: Voie intrinsèque et extrinsèque de l'apoptose......................................................... 76
Figure 23: Etapes de l'autophagie ............................................................................................ 80
Figure 24: Modulation des voies de mort cellulaire induite par la doxorubicine .................... 81
Figure 25: Altération des signalisations β-adrénergiques induite par la doxorubicine ............ 84
Figure 26: Altération de l'homéostasie calcique par la dox ..................................................... 88

Page
15
Figure 27: Rôle de Rac1 dans les dommages à l'ADN induits par la doxorubicine ................ 92
Figure 28: Structure des protéines Epac................................................................................... 95
Figure 29: Mécanisme d'activation d'Epac............................................................................... 96
Figure 30: Epac: effecteurs et fonctions biologiques ............................................................. 100
Figure 31: Rôle de la signalisation d'Epac dans le développement de l’hypertrophie........... 103
Figure 32: Activateurs d’Epac................................................................................................ 111
Figure 33: Inhibiteurs d'Epac ................................................................................................. 112
Figure 34: Isolement des cardiomyocytes ventriculaires de coeurs de rat nouveau-nés par
gradient de Percoll.................................................................................................................. 117
Figure 35: Construction de la sonde CAMYEL..................................................................... 129
Figure 36: Altération de la signalisation d'Epac induite par la doxorubicine ........................ 229
Figure 37: Rôle d'Epac dans la mort des cardiomyocytes induits par la doxorubicine.......... 235
Figure 38: Rôle d'Epac dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine............................ 244

Tableaux
Tableau 1: Les différentes classes de chimiothérapie : indications principales et effets
secondaires ............................................................................................................................... 45
Tableau 2: Analyse rétrospective des effets secondaires des traitements combinés utilisant le
Trastuzumab dans le cancer du sein métastatique.................................................................... 48
Tableau 3: Liste des essais cliniques testant les antioxydants contre la cardiotoxicité induite
par les anthracyclines ............................................................................................................... 60
Tableau 4: Liste des anticorps primaires................................................................................ 114
Tableau 5: Liste des anticorps secondaires ............................................................................ 114
Tableau 6: Stratégies d'obtention de souris invalidées pour le gène Epac ............................. 120
Tableau 7: Modèles murin de cardiotoxicité induite par la doxorubicine.............................. 221
Tableau 8: Résumé des altérations induites par la doxorubicine dans notre modèle............. 222

Page
16
Avant-propos

Le cancer est un problème de santé publique majeur. En 2008, il a été responsable de 8

millions de décès dans le monde pour 13,2 millions de cas diagnostiqués (1).En France,
l’incidence des cancers en 2012 a été de 355 000 nouveaux cas (200 000 chez l’homme et
155 000 chez la femme) dont 148 000 décès (85 000 chez l’homme et 63 000 chez la femme).
Les cancers les plus fréquents chez l’homme sont le cancer de la prostate (56841 cas dont
8 876 décès), le cancer du poumon (28 211 cas dont 21326 décès) et le cancer du côlon-
rectum (23 266 cas dont 9 275 décès). Chez la femme, les cancers les plus fréquents sont le
cancer du sein (48 763 cas dont 11 886 décès), le cancer du côlon-rectum (18 926 cas dont
8 447 décès) et le cancer du poumon (11 824 cas dont 8 623 décès) (2).
Le processus de cancérogénèse s’effectue en trois étapes: initiation, promotion et
progression au cours de laquelle les cellules cancéreuses acquièrent les propriétés leurs
permettant de proliférer de manière anarchique et de coloniser d’autres tissus. Ces propriétés
regroupent notamment les capacités d’indépendance vis-à-vis des signaux de prolifération
(résistance à l’apoptose et à l’élimination par le système immunitaire, potentiel réplicatif
illimité), de reprogrammation du métabolisme énergétique et de diffusion métastatique
(induction de l’angiogénèse, invasion tissulaire) (3).
Des progrès considérables faits dans la prévention et la recherche de traitements
anticancéreux ciblant ces propriétés acquises ont permis l’amélioration de la prise en charge
ainsi que de la survie des patients. Ces progrès ont ainsi permis une diminution de 1.5% par
an chez l’homme et de 1% par an chez la femme du taux de mortalité tout cancer confondu
entre 1980 et 2012. L’amélioration de la survie des patients ces dernières décennies est
d’autant plus probante que l’accroissement de la population et son vieillissement s’est traduit
par une augmentation de l’incidence des cancers à cette même période (2).
Malgré des rémissions complètes plus fréquentes conduisant à l'augmentation de la
survie, certains patients développent une toxicité tardive liée à leurs traitements anticancéreux
jusqu'à 40 ans après la fin de leur traitement. La toxicité des agents anticancéreux peut
atteindre de nombreux organes vitaux dont le cœur, les poumons, le système nerveux central,
le foie et les reins.
Parmi ces toxicités, la toxicité cardiaque ou cardiotoxicité peut se traduire par divers
dommages cardiovasculaires dont l'ischémie, la fibrose, la myocardite, les arythmies, une
hypertension, des péricardites pouvant mener à une insuffisance cardiaque parfois mortelle
(4).

Page
17
Cette cardiotoxicité aigüe ou chronique peut survenir aussi bien après des traitements
anticancéreux locorégionaux (comme la radiothérapie) qu'après des traitements systémiques
(comme la chimiothérapie) et se trouve majorée dans le cas de traitements combinés. A titre
d’exemple, le protocole FEC100 pour 5-Fluorouracile (5-FU), Epirubicine et
Cyclophosphamide fait partie de l’arsenal thérapeutique incontournable du cancer du sein.
Néanmoins, ce protocole regroupe deux agents cardiotoxiques dont le 5-FU et l’épirubicine
(famille des anthracyclines) qui, combinés, peuvent induire des complications cardiaques
sévères (5).
La cardiotoxicité des anthracyclines, bien qu'efficaces sur de nombreux types de
cancer (cancer du sein, lymphomes, cancers gastriques, leucémie, cancer du poumon etc.),
constitue ainsi un facteur limitant majeur de nombreuses chimiothérapies anticancéreuses.
Son dépistage, sa prévention et son traitement sont aujourd'hui limités par l'absence de
biomarqueurs prédictifs et de traitements spécifiques pouvant prévenir ou traiter cette
cardiotoxicité (6).
Mon travail de thèse a donc consisté à étudier les mécanismes d'action de la toxicité
cardiaque induite par les anthracyclines et plus particulièrement par la doxorubicine, toujours
fréquemment utilisée, afin de prévenir ses effets secondaires sans altérer son efficacité sur les
cellules cancéreuses.

Page
18
Introduction

Page
19
Introduction

1- Physiopathologie cardiaque

Le cœur est un organe creux et musculaire dont la fonction de pompe permet la circulation du
sang dans tout l’organisme.

1-1 Structure du cœur

Le cœur est constitué d'une paroi comportant trois couches tissulaires: le péricarde, le
myocarde et l'endocarde.
Le péricarde est la couche la plus extérieure. Il est constitué d’un sac externe fibreux et d’un
sac interne composé d'une double couche de membrane séreuse.
Le myocarde est un tissu musculaire strié constitué de cardiomyocytes, cellules musculaires
spécialisées dont la fonction est la contraction, en contact avec les fibroblastes, les cellules
endothéliales et la matrice extracellulaire (MEC).
L'endocarde est une membrane fine et lisse qui recouvre la face interne du myocarde et des
valves cardiaques permettant aux flux sanguin de s'écouler facilement à l'intérieur du cœur.
Le cœur est divisé en deux parties: le cœur droit et le cœur gauche séparés par le septum
cardiaque. Chaque partie comprend une oreillette et un ventricule (7).
Les veines caves inférieure et supérieure transportent le sang qui a parcouru tout l’organisme,
l’envoient à l’oreillette droite puis au ventricule droit (VD) pour qu’il rejoigne la circulation
pulmonaire afin d'y être réoxygéné (hématose).
Le sang réoxygéné ayant traversé les poumons via les veines pulmonaires est collecté par
l'oreillette gauche (OG). Il est ensuite acheminé vers le ventricule gauche (VG) qui éjecte le
sang riche en oxygène dans l'aorte permettant ainsi l'approvisionnement en nutriments et
oxygène les organes de l'ensemble de l'organisme.
Les valves cardiaques dont la valve tricuspide, pulmonaire, mitrale et aortique permettent au
sang de circuler dans le même sens.
Ainsi, la valve tricuspide empêche le reflux de sang depuis le VD vers l'OD, la valve
pulmonaire depuis l'artère pulmonaire vers le VD, la valve mitrale depuis le VG vers l'OG et
la valve aortique depuis l'aorte vers le VG (cf. Figure 1) (7).

Page
20
 Figure 1: Représentation schématique du cœur
Le cœur est constitué de plusieurs cavités dont les ventricules droit et gauche ainsi que les oreillettes droite et
gauche. Le cœur gauche permet d’irriguer l’ensemble de l’organisme via la circulation pulmonaire. Le cœur
droit reçoit le sang provenant de la circulation générale par les veines caves supérieure et inférieure et l’éjecte
dans les poumons via l’artère pulmonaire afin qu’il soit réoxygéné (7).

Au niveau cellulaire, le cœur est composé de trois types de cellules: les cardiomyocytes, les
fibroblastes et les cellules endothéliales. Les cardiomyocytes occupent environ 75% du
volume cardiaque mais représentent en nombre seulement 20% des cellules cardiaques. Il
existe 3 types de cardiomyocytes: les cardiomyocytes contractiles permettant la fonction de
contraction, les cellules cardionectrices (cellules nodales et cellules de Purkinje) spécialisées
dans l’initiation et la conduction de l’excitation, et les cellules myoendocrines qui assurent la
fonction endocrine. Les cardiomyocytes adultes sont des cellules spécialisées, différenciées et
qui ont perdu la capacité de se diviser. Ils sont généralement mononuclés (bien qu’il soit
fréquent de retrouver des cardiomyocytes binuclés chez les rongeurs) (8), et constitués d'un
cytoplasme riche en protéines et ions, d’un réticulum sarcoplasmique compartiment
intracellulaire spécialisé dans le stockage et la libération du calcium, et d’une grande quantité
de mitochondries qui constituent la réserve énergétique indispensable au fonctionnement du
cœur (9).
Outre les cardiomyocytes, le cœur est également composé de fibroblastes qui représentent en
nombre 70% des cellules cardiaques.

Page
21
Ils permettent la synthèse de la MEC assurant ainsi la cohésion du tissu musculaire et la
transmission des forces exercées par les cardiomyocytes (10).
Enfin, les cellules endothéliales recouvrent la paroi interne des vaisseaux sanguins (intima) et
des cavités cardiaques jouant un rôle essentiel dans le contrôle du tonus vasculaire et dans
l'hémostase.

1-2 Fonction cardiaque

1-2-1 Système de conduction du cœur

Le fonctionnement cardiaque est cyclique. Ce cycle est composé d’une période de contraction,
appelée systole au cours de laquelle les deux ventricules se contractent simultanément pour éjecter
le sang dans l’aorte (VG) et dans l’artère pulmonaire (VD) et une période de relaxation appelée
diastole au cours de laquelle les deux ventricules se relâchent pour pouvoir se remplir à nouveau
du sang qui provient des oreillettes (7).
Le cœur possède la propriété d’autorythmicité permettant la coordination entre la dépolarisation et
la repolarisation des cardiomyocytes et donc le maintien du cycle cardiaque. En effet, les
cardiomyocytes ont un potentiel de repos négatif, différent selon le type de cardiomyocytes. Ainsi,
les cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires ont un potentiel plus négatif (environ -90mV)
que les cellules cardionectrices. Tous les cardiomyocytes sont excitables, c'est-à-dire capables de
répondre à une dépolarisation transitoire de la membrane cellulaire appelée potentiel d’action
(PA). En revanche, les cellules du nœud sinusal (ou cellule pacemaker) situées au niveau de l’OD
ont la capacité de générer des PA de façon automatique. En effet, les cellules du nœud sinusal ont
une fréquence de génération des PA plus élévée permettant ainsi d’imposer le rythme à
l’ensemble du cœur (fonction pacemaker). La propagation du PA dans le muscle cardiaque
s’effectue grâce aux gap-jonctions et assure la synchronisation de la contraction musculaire.
Ainsi, la dépolarisation membranaire générée par le nœud sinusal est ensuite transmise aux
cellules auriculaires qui se contractent par le biais du couplage excitation-contraction (cf. partie 1-
2-2). Ces impulsions électriques vont ensuite se propager de façon retardée au niveau du nœud
auriculo-ventriculaire puis sont conduites au niveau des cellules ventriculaires par le biais du
faisceau de His et des fibres de Purkinje (cf. Figure 2) (11).

Page
22
 Figure 2: Le système de conduction du cœur
Le noeud sinusal génère chaque battement et le transmet sous forme d’une impulsion électrique au noeud
auriculo-ventriculaire qui la relaie aux cardiomyocytes ventriculaires par le biais des faisceaux de His et de
Purkinje permettant ainsi la contraction coordonée des cellules cardiaques (7).

Le PA est ensuite converti en réponse mécanique permettant la contraction des cardiomyocytes

ventriculaires via le couplage excitation-contraction.

1-2-2 Signalisation calcique : Couplage excitation-contraction et couplage

excitation-transcription
La membrane plasmique des cardiomyocytes ou sarcolemme est constituée de longues
invaginations appelées tubules T (transverses). Les tubules T sont en contact avec le réticulum
sarcoplasmique (RS), réservoir du calcium intracellulaire. Le point de contact entre un tubule T et
une citerne du RS constitue une diade et permet la conversion du PA en réponse mécanique par le
biais d’un médiateur chimique : le calcium.
En effet, à chaque battement, la dépolarisation de la membrane des cardiomyocytes pendant le
potentiel d’action permet l'activation des canaux calciques de type L (LTCC). L'entrée du
calcium par les LTCC et donc l'élévation locale du calcium induit l'activation des récepteurs à
la ryanodine (RyR) entraînant une sortie massive de calcium du réticulum sarcoplasmique
(RS) dans un mécanisme appelé "calcium induced-calcium release" (CICR) (cf. Figure 3)
(12,13). Le calcium libéré du RS permet l’activation de la contraction des myofibrilles (cf.
partie 1-2-3)

Page
23
 Figure 3: Couplage excitation-contraction
Représentation schématique du couplage excitation-contraction et de l’évolution temps dépendante du potentiel
d’action, de la concentration intracellulaire en calcium ainsi que de la contraction. Les fléches rouges
représentent le phénomène de CICR. Les fléches vertes représentent la recapture ou l’expulsion du calcium. AP :
action potential ; ATP : pompe ATPase ; NCX : sodium calcium exchanger, Ca : calcium, PLB :
phospholamban, Na : sodium ; RyR : récepteur à la ryanodine, SR : sarcoplasmic reticulum (14).

La calséquestrine (CSQ), dont l’isoforme prédominante dans le cœur est la CSQ2, est une
protéine présente dans le RS et qui stocke le calcium. Elle peut également intéragir
directement ou indirectement avec le RyR et joue ainsi un rôle dans la régulation de son
activité (15).
Pour permettre la relaxation cardiaque, la concentration de calcium cytosolique doit diminuer
rapidement. Le calcium est ainsi libéré par la troponine C et capté par l'ATPase SERCA
(Sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase) dans le RS. Ce phénomène est accéléré par la
phosphorylation du phospholamban (PLB) par la PKA ou la CaMKII, qui lève l'inhibition
qu'il exerce sur la SERCA. Environ 70 à 80% du calcium est ainsi recapté dans le réticulum
sarcoplasmique, le calcium restant (20 à 30%) étant extrudé de la cellule par l'échangeur
sodium/calcium (NCX) présent au niveau de la membrane plasmique (16).
Le calcium peut également jouer un rôle important dans la régulation de la transcription des
gènes. En effet, la signalisation calcique est impliquée dans l’hypertrophie des
cardiomyocytes via la transduction du calcium au niveau du noyau. De plus, ce mécanisme a
pour principal régulateur : la protéine dépendante du calcium Calmoduline (CaM).

Page
24
Le calcium nucléaire active ainsi la CaM qui a pour cibles la voie CaMKII/HDAC et la voie
Calcineurine/NFAT permettant l’activation de facteurs de transcription (respectivement
MEF-2, myocyte enhancer factor-2 et NFAT, nuclear factor of activated T-cells) impliqués
dans l’initiation du programme pro-hypertrophique des cardiomyocytes. Ce mécanisme est
ainsi appelé couplage excitation-transcription (12).

1-2-3 Contraction des myofibrilles

Les sarcomères représentent l'unité de base contractile des myofibrilles. Chaque sarcomère est
composé d'un faisceau de myofilaments. Il existe notamment deux types de filaments
permettant la contraction des fibres musculaires: les filaments fins constitués d'actine, de
tropomyosine et de troponine et les filaments épais essentiellement constitués de myosine.
Chaque sarcomère est constitué de filaments fins et de filaments épais et est relié à l’autre par un
complexe protéique appelé disque Z (cf. Figure 4) (16).

Figure 4: Représentation schématique d'un cardiomyocyte

Un cardiomyocyte est délimité par une membrane appelée sarcolemme qui forme des invaginations ou tubules
transverses. Le cytoplasme du cardiomyocyte est principalement rempli de myofibrilles qui sont entourées de
mitochondries. Un sarcomère correspond à chacune des unités anatomiques et fonctionnelles d'une myofibrille,
délimitées par les disques Z. Chaque sarcomère est constitué de filaments fins d’actine et de filaments épais de
myosine qui glissent entre eux, permettant la contraction cardiaque. La zone H contient seulement les filaments
de myosine et la strie M correspond au renflement médian de ces filaments. La bande I (Isotropique) ne contient
que des filaments fins. La bande A (Anisotropique) est la zone comprise entre deux bandes I.

Au repos, lorsque la concentration intracellulaire en calcium est faible, le complexe

tropomyosine-troponine s’intercale entre les sites actifs de liaison myosine/actine.

Page
25
Lors du CICR, Le calcium est libéré du RS et permet l’augmentation de la concentration
intracellulaire en calcium. Le calcium se fixe ensuite à la troponine C (TnC) et entraîne un
changement de conformation des complexes tropomyosine-troponine permettant l'intéraction
des filaments d'actine avec ceux de myosine.
Cette interaction stimule l'activité ATPase des têtes de myosine permettant le glissement des
filaments épais sur les filaments fins. Le raccourcissement des sarcomères est alors
responsable de la contraction cardiaque (16).

1-3 Régulation cardiaque

Les systèmes nerveux sympathique et parasympathique innervent les nœuds sinusal et

atrioventriculaire ainsi que la totalité du myocarde par le biais des fibres sympathiques et
exercent respectivement un effet chronotrope positif (augmentation de la fréquence cardiaque)
par la libération de la noradrénaline et un effet cardio-inhibiteur par la libération de
l'acétylcholine. Certaines hormones dont les catécholamines, l'endothéline 1 et l'angiotensine
II peuvent également réguler la fonction cardiaque.
Les catécholamines dont l'adrénaline et la noradrénaline sécrétées dans le sang par les cellules
endocrines de la médullo-surrénale ont un effet chronotrope positif au niveau du nœud
sinusal, en augmentant la fréquence cardiaque, un effet inotrope positif au niveau des
cardiomyocytes en facilitant le couplage excitation-contraction ce qui augmente la force de
contraction cardiaque et un effet lusitrope positif en augmentant la relaxation par une
accélération de la recapture du calcium et par une diminution de la sensibilité des myofibrilles
(12,17).
L'endothéline et notamment l'endothéline-1, peptides synthétisés par les cellules endothéliales
et les cardiomyocytes ont également un effet chronotrope et inotrope positif ainsi qu'un effet
vasoconstricteur.
L'angiotensine II (AngII), synthétisée par le système renine-angiotensine par transformation
de l'angiotensinogène d'origine hépatique en angiotensine I puis en angiotensine II par
l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE), induit la contraction du muscle lisse
vasculaire et produit un effet chronotrope positif ainsi qu'un faible effet inotrope positif (18).

Page
26
1-4 Signalisation cardiaque

1-4-1 Signalisation β-adrénergique

Les récepteurs adrénergiques sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) qui
permettent la transduction cellulaire et tissulaire de l’activation du système nerveux
sympathique. Leurs ligands endogènes sont des catécholamines dont l’adrénaline, la
noradrénaline et la dopamine. Il en existe deux sortes : les récepteurs α-adrénergiques (α-AR)
essentiellement présents dans les vaisseaux et les récepteurs β-adrénergiques (β-AR)
fortement exprimés dans le myocarde. Le ratio de β-ARs par rapport aux α-ARs est de 10
pour 1 dans le myocarde humain (19).
Les β-ARs sont caractérisés par une structure à 7 domaines transmembranaires (TM1 à
TM7), reliés par trois boucles extracellulaires (EC1 à EC3) et trois boucles intracellulaires
(IC1 à IC3). La région aminoterminale est extracellulaire et jouerait un rôle, du moins pour le
récepteur β1-AR, dans la stabilisation du récepteur à la membrane (20). La région carboxy-
terminale est intracellulaire et présente, chez les récepteurs β1- et β2-AR, des sites de
phosphorylations pour les kinases des récepteurs couplés aux protéines G (GRK), impliqués
dans le phénomène de désensibilisation des récepteurs (21,22). Les segments
transmembranaires sont les régions les plus conservées entre les espèces et sont impliqués
dans l’interaction entre le ligand et son récepteur.
La transduction des stimuli extracellulaires (hormones, neurotransmetteurs, ions Ca2+,
nucléotides, peptides, lipides…) se fait à travers la membrane jusqu’à des protéines
intracellulaires effectrices en passant par les protéines G hétérotrimériques. Les protéines G
forment un complexe hétérotrimérique composé de trois sous-unités : une sous unité Gα
capable de se lier aux nucléotides (GDP/GTP), une sous-unité Gβ et une sous-unité Gγ. Lors
de l’activation du RCPG par un stimulus, la protéine G convertit le GDP en GTP puis la sous-
unité Gα se dissocie du dimère Gβγ (cf.Figure 5).

Page
27
 Figure 5: Structure des récepteurs couplés aux protéines G
Les récepteurs couplés aux protéines G ont une structure commune faite de sept domaines transmembranaires
connectés par trois boucles intracellulaires et trois boucles extracellulaires. Ces récepteurs sont activés par des
messagers très variés. (D’après Bockaert et Pin 1999).

Les sous-unités Gα et Gβγ propagent le signal à travers la cellule en modulant l’activité de

protéines effectrices telles que des adénylates cyclases (ACs), des phospholipases (PL) ou des
canaux ioniques. Les sous-unités Gβγ sont également impliquées dans la désensibilisation et
le recyclage du RCPG.
Il existe plusieurs isoformes de la sous-unité Gα qui déterminent la nature du signal généré.
Ainsi, les RCPGs couplés à Gαs et Gαi activent ou répriment réciproquement l’activité de
l’AC entraînant l’augmentation ou la réduction de la synthèse du second messager AMPc
(adénosine 3’,5’-monophosphate cyclique). Les RCPGs couplés à Gαq activent des
phospholipases qui transforment le PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-biphosphate) en IP3
(inositol 1,4,5-triphosphate) et DAG (diacylgycérol). L’IP3 en se fixant sur ses récepteurs
(IP3Rs) induit une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire.
Afin de limiter les effets délétères d’une stimulation prolongée des récepteurs β-ARs, il existe
deux mécanismes de désensibilisation des β-AR activés lors d'une stimulation prolongée (de
l'ordre de la minute). En effet, une activation prolongée des β-AR peut être limitée par sa
phosphorylation par la PKA sur le résidu Ser 262 situé au niveau de la troisième boucle
intracellulaire (23), on parle de désensibilisation hétérologue (24,25), mais une activation
persistante des β-AR peut également déclencher leur internalisation supprimant ainsi la
possibilité de fixation de nouvelles catécholamines libérées sur le récepteur du côté

Page
28
extracellulaire (26) (Lefkowitz et Shenoy 2005). Ce dernier mécanisme, appelé
désensibilisation homologue, fait intervenir des protéines kinases des récepteurs couplés aux
protéines G (GRK pour G-protein coupled receptor kinase, principalement la GRK2 dans le
cœur mais aussi la GRK5), la β-arrestine, et des protéines d'endocytose telles que la clathrine.
Dans le myocarde humain, il existe trois sous-types de β-ARs : les β1-ARs prédominants dans
les ventricules (70-80% des β-ARs), les β2-ARs localisés dans les cavéoles et les tubules T et
représentent 20 à 30% des β-ARs et les β3-ARs majoritairement localisés au niveau des
disques intercalaires dont la proportion n’a pas été rapportée dans le cœur humain à ce jour
(27–29). Les voies de signalisation des différents sous-types de β-ARs sont représentées dans
la figure 6.

Figure 6: Voies de signalisation des récepteurs β-adrénergiques

L’activité du myocarde est régulée par différents types de RCPGs présents à la surface des cardiomyocytes et
des cellules non-myocardiques. Ces récepteurs activent un ensemble complexe de voies de signalisation
intracellulaires permettant de contrôler le rythme cardiaque (effet chronotrope), la force de la contraction (effet
inotrope) et la vitesse de relaxation (effet lusitrope). Ainsi, les β1-ARs et β2-ARs sont positivement couplés à la
protéine Gs et à la production du second messager Adénosine 3’,5’, monophosphate cyclique (AMPc) via
l’activation de l’adénylyl cyclase. Ce second messager active différents effecteurs tels que la protéine kinase A
(PKA), les protéines Exchange protein directly activated by cAMP (Epac), les phosphodiestérases (PDEs) ou les
canaux Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gatedcation channels (HCN). Les β2-ARs sont également
couplés à la protéine Gi qui inhibe l’adénylyl cyclase et active différentes voies de signalisation par
l’intermédiaire de la sous unité Giβγ. Les β3-ARs induisent des effets inotropes négatifs en activant la voie
oxyde nitrique synthétase (NOS). Enfin les récepteurs α-ARs, de l’ET-1 et de l’AngII sont couplés aux protéines
Gq qui stimulent la PLCβ (phospholipase C). Cette dernière hydrolyse les phosphoinositols de la membrane
plasmique en diacylglycérol (DAG) et en inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) qui activent respectivement les
protéines kinase C (PKC) et la libération de Ca2+ par les récepteurs de l’inositol triphosphate (IP3R) (D’après
M.Breckler thèse 2012).

Page
29
Dans les cardiomyocytes, la stimulation des récepteurs β1-ARs, couplés aux protéines G
stimulatrices (protéines Gs) active l’adénylyl cyclase (AC) qui catalyse la formation d’AMPc
à partir d’ATP (30). Deux molécules d’AMPc ainsi formées vont se fixer sur les sous-unités
régulatrices de la PKA (protéine kinase A) et permettre la libération des sous-unités
catalytiques qui ont une activité kinase. La PKA joue ainsi un rôle crucial dans la fonction
cardiaque car elle phosphoryle de nombreuses protéines cibles membranaires, cytosoliques,
nucléaires ou associées aux organites intracellulaires (31) (cf.partie 1-4-2). Il existe également
une voie de transduction des signaux AMPc indépendante de la PKA : la voie Epac
(Exchange protein directly activated by cAMP) (cf. partie 1-4-2).
La stimulation des récepteurs β1-AR est impliquée dans la signalisation pro-apoptotique des
cardiomyocytes. L’activation de la PKA suite à la stimulation de la voie Gs/AMPc/PKA
couplée aux récepteurs β1-AR conduit à l’activation de glycogène synthase 3 β (GSK3 β),
intervenant dans le métabolisme du glycogène et des protéines et pouvant activer la protéine
Bax, une protéine proapoptotique de la famille Bcl-2. Lors d’une stimulation soutenue des
récepteurs β1-AR, ceux-ci se découplent de leur protéine Gs au profit de l’activation la
CaMKII qui est le principal effecteur responsable des effets pro-apoptiques β1-AR-dépendants
(32). Il a été montré, à partir de cardiomyocytes isolés de rats, que les effets de la CaMKII
sont dus à une diminution de l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL favorisant la
libération du cytochrome c (33), ainsi qu’à une inhibition de la voie PI3K (phosphoinositide-
3-kinase)/Akt (34).
Au niveau cardiomyocytaire, la stimulation prolongée des récepteurs β2-ARs entraîne la
phosphorylation des récepteurs par la PKA qui participe à l’internalisation des récepteurs et
donc à une perte de l’activité de l’agoniste.
Les récepteurs β2-ARs sont couplés aux protéines Gs mais aussi aux protéines Gi (protéine G
inhibitrice), dont la sous-unité Gαi inhibe l’AC. L’activation des protéines Gi conduit à
l’inhibition de la voie Gs/AC/AMPc mais également au recrutement d’autres voies de
signalisation dont la voie PI3K impliquée dans la prolifération, la différenciation et la survie
celllaire ainsi que le métabolisme et la voie de la phospholipase A2 cytosolique (PLA2c)
impliquée dans la réponse inflammatoire (35–38). Ainsi, les β2-ARs participent également à la
voie Gs/AMPc/PKA mais n’ont pas la même efficacité que la stimulation des β1-ARs due en
partie à la localisation de chacun des sous-types et à une compartimentation du signal AMPc
dans les cardiomyocytes par les phosphodiestérases (PDE), enzymes dégradant l’AMPc
(39,40).

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30
En effet, l’activation des PDE et notamment des PDE 3 et 4, isoformes majoritaires dans le
cœur, permet de réguler la quantité d’AMPc et sont ainsi considérés comme les acteurs
responsables d’une compartimentation dynamique de l’AMPc (39). Les β2-ARs contribuent
également à la modulation des voies de l'apoptose. En effet, ils peuvent activer l'apoptose via
la voie Gs/AMPc/ PKA ou au contraire inhiber l'apoptose via la voie Gi/PI3K/Akt (41–43).
Les β2-ARs peuvent également activer la NADPH oxydase ce qui conduit à l'activation de la
voie MAPK (Mitogen-activated protein kinase) et à la production de ROS pouvant être
responsables de l'induction des voies apoptotiques (44).
Les récepteurs β3-AR cardiaques sont couplés aux protéines Gi et induisent l’activation de la
voie du monoxyde d’azote (NO) qui conduit à la production de la guanylyl cyclase par
l’activation de la NO synthase endothéliale (eNOS) ou la NO synthase neuronale (nNOS)
(45–47). La guanylyl cyclase permet ensuite la production de guanosine monophosphate
cyclique (GMPc) activant la protéine kinase G. Cette voie joue un rôle important dans la
relaxation des vaisseaux sanguins.

1-4-2 Les effecteurs de l’AMPc

Les cibles principales de l’AMPc dans le cœur sont : la PKA, les protéines Epac et les HCNs
(Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide gated cation channel).
La PKA activée phosphoryle différentes protéines cibles dont certaines impliquées dans le
couplage excitation-contraction : les canaux calciques de type L (LTCC), le récepteur à la
ryanodine 2 (RyR2) et le phospholamban (PLB) et des protéines myofibrillaires dont la
troponine I (TnI) et la protéine C liant la myosine (MyBPC) (12,48,49).
La phosphorylation des LTCC par la PKA entraîne une augmentation de l’entrée du calcium
participant ainsi à l’effet inotrope positif tandis que la phosphorylation du PLB permettant la
levée de l’inhibition de la SERCA participe à l’effet lusitrope positif mais également à l’effet
inotrope négatif en augmentant la charge en calcium du RS et en augmentant la sensibilité au
calcium du RyR2 (50).
Les protéines Epac font également parties de la voie de transduction des signaux AMPc,
indépendante de la PKA. En effet, l’AMPc active également les protéines EPAC (Exchange
protein directly activated by cAMP) (51). Epac est impliqué dans une multitude de fonctions
cellulaires liées à l'AMPc telles que l’adhérence cellulaire, les jonctions entre cellules,
l'exocytose et la sécrétion, la différenciation cellulaire et la prolifération.

Page
31
Il intervient notamment dans le développement de l'hypertrophie cardiaque via l’activation de
la calmoduline/Ca2+ dependent protein kinase II (CaMKII), une sérine/thréonine kinase et de
la calcineurine (CN), une phosphatase, impliquée dans l’initiation du programme
hypertrophique médié respectivement par l’activation de facteurs de transcription MEF-2
(Myocyte enhancer factor) et NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) (52,53). La voie de
signalisation d’Epac sera détaillée dans la partie 6-3.
Enfin, les HCNs, autres protéines activées par l’AMPc dans le cœur, sont exprimés dans les
cellules pacemaker où ils ont un rôle primordial dans la régulation de la fréquence cardiaque
(54).

1-5 Pathologies cardiaques

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde.
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime à 17,3 millions le nombre de décès
imputables aux maladies cardiovasculaires, soit 30% de la mortalité mondiale totale.
En France, la mortalité cardiovasculaire représente prés de 150 000 décès par an et demeure
ainsi une des priorités de santé publique.
La maladie coronarienne, les accidents vasculaires cérébraux et l’insuffisance cardiaque
chronique rassemblent 75% des pathologies cardiovasculaires et sont responsables à eux seuls
de 29% des décès annuels.
La plus récente classification des cardiomyopathies les définit comme des maladies du
myocarde associée à une dysfonction ventriculaire. Cette nomenclature permet donc de
distinguer les cardiomyopathies primitives de deux types, idiopathique et familial, qu'elles
soient dilatées, hypertrophiques, restrictives, et les cardiopathies secondaires à une cause
infectieuse, endocrinienne, métabolique, toxique ou infiltrative (55).

1-5-1 Cardiomyopathie hypertrophique

La cardiomyopathie hypertrophique est une cardiopathie définie par une augmentation de la

masse totale ou partielle du myocarde pouvant faire obstacle ou non au libre passage du sang
dans la cavité ventriculaire durant la systole. La cardiomyopathie hypertrophique se
caractérise donc par une hypertrophie ventriculaire, qu'elle soit gauche et/ou droite,
généralement asymétrique touchant le plus souvent le septum inter-ventriculaire.
L’hypertrophie cardiaque (HC) peut aussi bien toucher l’oreillette que le ventricule.

Page
32
Cependant, l’hypertrophie ventriculaire et plus précisément l’hypertrophie du VG ou HVG est
beaucoup plus fréquente. On distingue deux formes d’HC : l’hypertrophie physiologique et
l’hypertrophie pathologique (56).
Ainsi, l’HC physiologique se produit lors de la croissance du coeur durant la période post-natale,
l’exercice physique intensif ou la grossesse tandis que l’hypertension artérielle (HTA), les
anomalies valvulaires, les mutations génétiques (entre autres des protéines du sarcomère) ou un
infarctus du myocarde (IDM) entraîne une HC pathologique.
Les deux formes d’HC peuvent mener à une HC compensée, mécanisme adaptatif mis en place
par le cœur afin de s’adapter à une surcharge hémodynamique. L’hypertrophie physiologique,
caractérisée par une augmentation homogène de la masse du cœur avec une fonction cardiaque
préservée voire améliorée, est ainsi réversible et régresse après l’accouchement ou l’arrêt de
l’entraînement intensif (57,58).
En revanche, une HC pathologique peut être dans un premier temps compensée puis devenir
décompensée et mal-adaptive lorsque le stress hémodynamique est suffisamment intense ou
prolongé. L’hypertrophie décompensée, caractérisée par un déclin progressif du travail cardiaque
malgré une activation continue du programme hypertrophique, est ainsi associée à un risque élevé
d’insuffisance cardiaque (IC) et d’arythmies malignes, et donc à une mortalité augmentée (56,59).
Elle est également associée à un risque élevé de mort subite.
Enfin, selon les contraintes exercées sur le myocarde, deux phénotypes d’HC sont observés :
l’hypertrophie concentrique ou excentrique.
L’hypertrophie concentrique se caractérise par un élargissement des cardiomyocytes et se
développe suite à une augmentation de la post-charge (contrainte qui s’exerce sur le ventricule
lors de l’éjection du sang pendant la systole). L’hypertrophie excentrique, moins fréquente,
montre une élongation des cardiomyocytes et une dilatation de la cavité ventriculaire. Elle est
liée à l’augmentation de la pré-charge (contrainte qui s’exerce sur la paroi ventriculaire lors
du remplissage, en fin de diastole) causée par les valvulopathies régurgitantes comme une
insuffisance mitrale ou une insuffisance aortique (60,61).

1-5-2 Cardiomyopathie dilatée

La cardiomyopathie dilatée (CMD) est définie par l'association d'une dilatation VG et d'une
insuffisance cardiaque d'étiologie indéterminée. On admet comme critères diagnostiques un
diamètre VG > 27mm/m2 et/ou une fraction d'éjection inférieure à 0,40-0,45 (ou % de
raccourcissement < 0,30).

Page
33
La CMD est caractérisée par une altération sévère de la fonction systolique VG c'est-à-dire
une diminution de la fraction d'éjection (FE : proportion de sang éjecté par le cœur lors de
chaque systole). La dilatation du VG s'accompagne nécessairement d'une élévation de sa
pression de remplissage (pression télédiastolique VG ou pression capillaire pulmonaire
moyenne). Le mécanisme de la dysfonction systolique est expliqué dans la partie insuffisance
cardiaque. Au niveau anatomique, la CMD entraîne également une fibrose interstielle diffuse,
la présence fréquente de signes inflammatoires et des arythmies (62). Certaines formes de
CMD surviennent secondairement à une cause précise et notamment l'alcoolisme chronique,
les formes familiales, peri ou post-partum ou un traitement à la doxorubicine. Une
hypertrophie des myocytes peut être retrouvée dans la forme idiopathique. Elle est absente
dans la CMD de la doxorubicine, et se trouve marquée dans la forme alcoolique (63).

1-5-3 Insuffisance cardiaque

L’insuffisance cardiaque (IC) est un syndrome se définissant comme l’incapacité du cœur à
fournir un débit sanguin suffisant pour répondre aux besoins métaboliques et fonctionnels de
l’organisme, à un niveau normal de pression de remplissage. Un patient est diagnostiqué IC
lorsqu’il présente à la fois des symptômes et des signes cliniques typiques de l’IC
(essoufflement à l’effort ou au repos, fatigue, tachycardie, effusion pleurale, hépatomégalie),
associés à une preuve objective de dysfonction cardiaque, le plus souvent évaluée par
échocardiographie (64).
L’IC est la conséquence d'une altération de la contractilité du ventricule et se caractérise par
un remodelage cardiaque notamment au niveau du VG qui présente une augmentation de sa
masse, une dilatation, une hypertrophie excentrique ou une hypertrophie concentrique. Le
remodelage du ventricule entraîne un déclin de la fonction diastolique et/ou systolique, une
diminution du débit cardiaque et une augmentation de la pression de remplissage.
L'IC constitue un risque de morbidité et de mortalité élevé malgré les avancées
thérapeutiques. À l’échelle européenne, le rapport de 2008 de l’ESC (European Society of
Cardiology) indique que sur une population de plus de 900 millions d’individus, 15 millions
présentent une IC et autant présenteraient une dysfonction ventriculaire asymptomatique.
Bien que certains patients IC survivent des années, le pronostic est très mauvais : la moitié
des patients décède dans les 4 ans suivant le diagnostic et 40 % des patients hospitalisés pour
IC sont de nouveau hospitalisés ou décédés dans l’année qui suit (64).

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34
Les principaux facteurs de risque de l’IC sont l’âge, le sexe masculin, l’HTA, l’HC, l’IDM,
les pathologies valvulaires, l’obésité et le diabète (65).
Selon la cavité atteinte, on distingue l’IC droite qui touche le VD de l’IC gauche plus
fréquente qui atteint le VG. Dans l’IC gauche, l’augmentation de pression dans le VG finit par
atteindre l’OG, les artérioles et les capillaires pulmonaires, conduisant à des symptômes
cliniques respiratoires. On peut distinguer l’IC à fraction d’éjection (FE) préservée de l’IC à
FE altérée. L’IC à FE préservée (FE ≥ 50%) se caractérise par une dysfonction diastolique du
VG et une anomalie du remplissage et de la relaxation du VG. Elle est plus fréquente chez les
sujets âgés, les femmes et les patients atteints d’HTA. L’IC à FE altérée montre une
dysfonction systolique avec une FE ˂ 45% (65).
Dans l’IC droite, l’élévation de la pression dans le VD puis dans l’OD, la veine cave et dans
la circulation veineuse conduit à la recherche des signes d’une hypertension veineuse.

L'IC est donc un problème de santé publique majeur qui survient secondairement à des
anomalies cardiaques héritées ou acquises telles que HTA, IDM, rétrécissement aortique
ou cardiomypathies (66). Parmi ces cardiomyopathies menant à l'IC, certains
traitements anticancéreux peuvent induire des effets secondaires sévères et notamment
une toxicité cardiaque. Les traitements anticancéreux et leurs principales toxicités
feront ainsi l'objet de la partie suivante.

2- Les traitements anticancéreux

Le traitement de première intention du cancer est souvent la chirurgie. Elle peut être pratiquée
de façon adjuvante ou néo-adjuvante. La chirurgie adjuvante permet l'exérèse de la tumeur
solide parfois suivie par de la chimiothérapie ou de la radiothérapie afin de limiter les risques
de récidive. La chimiothérapie ou la radiothérapie peut également être suivie par de la
chirurgie. Dans ce cas, la chirurgie néo-adjuvante permet la diminution de la taille de la
tumeur avant l'exérèse (67).
La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires associée à la croissance
tumorale a permis l'émergence de nombreuses stratégies thérapeutiques efficaces telles que la
radiothérapie, la chimiothérapie, et les thérapies ciblées (cf. tableau1).

Page
35
2-1 La radiothérapie

La radiothérapie est aujourd'hui un composant incontournable de la prise en charge moderne

des patients atteints par le cancer. On estime qu'environ deux tiers des patients en subiront une
au cours de leurs traitements (68).

2-1-1 Principe
La radiothérapie est un traitement locorégional du cancer permettant la destruction des
cellules cancéreuses par rayonnements ionisants tout en minimisant les effets sur le tissu sain
environnant (69,70).
Au niveau cellulaire, l'excitation et l'ionisation des atomes et des molécules par un
rayonnement électromagnétique de haute énergie (rayonnements radioactifs ou rayons X)
provoquent la production de radicaux libres par radiolyse de l'eau et le développement de
lésions membranaires ainsi que des cassures (simple et double brin) de l'ADN.
La réponse cellulaire à ces lésions peut se traduire par une réparation partielle ou complète
(effet différentiel), par une mort cellulaire différée caractérisée par un arrêt prolongé des
cellules en phase G2 ou par une mort cellulaire programmée (apoptose) (71).

2-1-2 Posologie: dose, fractionnement, et étalement de la radiothérapie

La dose d'irradiation est exprimée en Gray (Gy) et correspond à une unité d'énergie absorbée
par unité de masse.
La dose nécessaire à la stérilisation de la tumeur dépend du type histologique, de la taille
tumorale et de son extansion anatomique (classification TNM (Tumor Node Metastase),
système internationale de classement des cancers selon leur extansion anatomique).
Elle dépend également de l’aspect macroscopique de la tumeur et de certains facteurs de
radiosensibilité intrinsèque. Ainsi, du plus radio-résistant au plus radio-sensible on dénombre
les cancers suivants: les sarcomes, les adénocarcinomes, les carcinomes épidermoïdes, les
lymphomes, et les séminomes. Les tumeurs infiltrantes sont également plus radio-résistantes
que les tumeurs bourgeonnantes.
La majorité des protocoles de radiothérapie utilise le fractionnement de 1.8 à 2 Gy par séance
pour un étalement sur 5 semaines. Afin de réduire le nombre de jours de traitement et
augmenter l'efficacité de la radiothérapie ainsi que la qualité de vie des patients, de nombreux
fractionnements ont été testés tels que l'hypofractionnement (dose supérieure à 2.25 Gy),
fractionnements semi-concentrés (une dose de 30 Gy en 10 fractions de 3 Gy) ou concentrés

Page
36
(dose de 20 Gy en 5 fractions de 4 Gy) ou l'hyperfractionnement (plusieurs doses d'irradiation
par jour à intervalle de 6 heures).
Le choix de fractionnement dépend du type de tumeurs et de l'état clinique du patient.
Cependant, une dose par fraction élevée ou un protocole concentré peut entraîner des effets
secondaires tardifs importants au niveau des tissus sains traversés par le faisceau tels qu'une
fibrose pulmonaire ou sous-cutanée (72,73).

2-1-3 Indications de la radiothérapie

Il existe différentes indications de la radiothérapie:
• Radiothérapie à visée curative (65% des indications):
Elle peut être exclusive (dans le cas de petites tumeurs, de tumeurs radio-sensibles ou de
tumeurs inopérables), néo-adjuvante, post-opératoire ou prophylactique. Elle peut également
être associée à la chirurgie ou à la chimiothérapie.
• Radiothérapie à visée palliative (35% des indications):
Elle est utilisée à visée antalgique, à visée décompressive ou à visée hémostatique permettant
une diminution de la masse tumorale par des protocoles concentrés à forte dose afin
d'améliorer le confort du patient (68,71,72,74).

2-1-4 Effets secondaires

Bien que l'objectif de la radiothérapie soit de cibler uniquement la tumeur, des lésions peuvent
atteindre les tissus sains périphériques de façon précoce ou tardive. Ces lésions tardives
souvent irréversibles correspondent à des atteintes vasculaires ainsi qu'à une atteinte des tissus
sous-muqueux responsables de télangiectasies (dilatation permanente d’un petit vaisseau situé
dans le derme), d'atrophie, de sclérose ou de nécrose. Cependant, le principal effet secondaire
de la radiothérapie reste la fibrose qui, elle, a été décrite dans la plupart des organes et tissus
irradiés.

• Fibrose radio-induite
La fibrose tissulaire se caractérise par une accumulation excessive de collagène et d'autres
composants de la matrice extracellulaire (MEC) (élastine, glycoprotéine, protéoglycane, etc.)
conduisant à une rupture de la balance synthèse/dégradation.
Les mécanismes conduisant à une fibrose radio-induite sont basés sur une contribution
inflammatoire, vasculaire et mésenchymal.

Page
37
La contribution vasculaire repose sur le principe des 3H: "hypoxia-hypocellularity-
hypovascularity" introduit par Marx (75,76) qui mène à une production d'espèces réactives de
l'oxygène (ROS), une augmentation de la perméabilité vasculaire, un recrutement de
leucocytes et à l'induction du transforming growth factor (TGFβ1) permettant la mise en place
du processus fibrotique (77).
En effet, les cellules épithéliales et/ou endothéliales irradiées déclenchent une phase
inflammatoire précoce par la sécrétion de facteurs de croissance et de cytokines (78). Ces
médiateurs moléculaires vont alors recruter et activer des leucocytes qui sécréteront des
cytokines importantes pour la différenciation fibrotique telles que l'interleukine 13 (IL-13) et
le TGFβ1. L'activation des fibroblastes en myofibroblastes est produite par le TGFβ1. Le
TGFβ1 se trouve en abondance dans le milieu extracellulaire sous une forme latente
(LTGFβ1) lorsqu’il est lié au peptide LAP (79). L’action directe des radiations ionisantes, de
protéases (plasmine, matrix metalloproteinase (MMP), thrombine, etc.) ou des ROS entraîne
ainsi l’activation du TGFβ1 par clivage du peptide LAP. Le TGFβ1 actif va alors se lier à des
récepteurs membranaires spécifiques (récepteurs sérine/thréonine kinase de type I et II) et
entraîner l’activation de la voie Smad. Smad agira ensuite comme facteur de transcription ou
co-facteur pour les gènes-cibles de la MEC ou du collagène.
Néanmoins, Smad n’est pas la seule voie que peut activer le TGFβ1 : les voies de p38, JNK,
Rho/ROCK ou encore ras/ERK MAP kinase peuvent également activer la différenciation
myofibroblastique (cf. Figure 7) (78).

Page
38
 Figure 7: Activation des différentes voies induites par le TGFβ1
L’activation du TGFβ1 par les radiations ionisantes entraîne l’activation de plusieurs voies de signalisation dont
les voies p38, JNK, Rho/ROCK et Smad impliquées dans la synthèse de la MEC. Une fois activé, TGF β1
phosphoryle Smad3 qui se lie à Smad4. Ce complexe est ensuite transloqué au noyau et intéragit avec SBE et les
facteurs de transcription permettant une augmentation de l’expression de gènes codant pour la MEC.Model
showing positive regulation of immediate-early TGF-β signaling resulting in the induction of ECM. (LTBP/LAP
= latent TGF-β binding protein; SBE = Smad binding element; TGF-βR = TGF-β receptor; TFBE = transcription
factor binding element, P = protéine phosphorylé) (80).

Les myofibroblastes surexpriment alors l'actine musculaire lisse alpha (αSMA) protéine
responsable de la capacité des myofibroblastes à contracter la MEC. D'autres types cellulaires
tels que les cellules épithéliales, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses
peuvent être également activées et servir de progéniteurs aux myofibroblastes dans une
transition épithélio- ou endothélio-mésenchymateuse (cf. Figure 8) (81,82).

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39
 Figure 8: Origine hétérogène des myofibroblastes
Les myofibroblastes synthétisent et sécrètent l'ECM dont le collagène I, III et contribuent à la fibrose. Ces
myofibroblastes proviennent de sources variées comprenant les suivantes: (1) différenciation des fibroblastes,
activation des pérycites (cellules stélaires hépatiques), dédifférenciation des cellules musculaires, (2) transition
endothélio-mésenchymal, (3) recrutement de fibrocyte circulant provenant de la moelle osseuse (82).

Dans un processus normal de cicatrisation, la réaction inflammatoire cesse dès que la

régénération tissulaire est terminée avec restauration de l’équilibre MMP/ TIMP (tissue
inhibitors of metalloproteinases) et normalisation de la MEC. Cependant, dans le cas d'une
fibrose radio-induite, l'activation cellulaire et moléculaire persistante devient chronique
entraînant une activation permanente des myofibroblastes et un dépôt excessif des
composants de la MEC (83).

• Cas particulier de l'atteinte cardiovasculaire radio-induite

Au cours de ces dernières décennies, des sources indépendantes ont montré l'existence d'un
risque cardiovasculaire pour des doses inférieures à 5 Gy. Il est à présent considéré que 1 Gy
ajouté à la dose moyenne reçue par le cœur augmenterait le risque cardiovasculaire de 4%
(84). L'incidence et la vitesse de développement des dommages cardiovasculaires sont dose-
dépendants et augmentent avec un suivi long des patients (10 ans ou plus). Les risques de
développer une cardiotoxicité radio-induite augmente ainsi avec le temps post-irradiation. Il
est ainsi recommandé de ne pas irradier le cœur à des doses supérieures à 30 Gy. La limitation
de la dose du cœur irradié est notamment permise par le développement de techniques de
traitements d'images qui utilisent le concept de la déconvolution (procédé algorithmique) (85).

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Les effets tardifs de la radiothérapie et notamment ceux pouvant être fatals tels que les
maladies cardiovasculaires radio-induites, sont d'une importance particulière dans les cancers
où une guérison est plus probable comme le cancer du sein et les lymphomes Hodgkinien ou
dans les cancers qui nécessitent une irradiation thoracique. La localisation de la tumeur est
notamment prise en compte. Ainsi, une irradiation du sein gauche peut entraîner des
complications cardiaques plus sévères et un taux de mortalité plus élevé que pour l'irradiation
du sein droit (86).
Les changements pathologiques associés aux atteintes cardiovasculaires radio-induites sont
tardifs et observés sur une échelle de mois ou années atteignant tous les tissus cardiaques
(péricarde, coronaires, myocarde, tissu conjonctif) après une irradiation entre 5 à 30 Gy
(84,87).
Les atteintes du péricarde (et notamment une péricardite : inflammation du péricarde) et du
myocarde sont principalement causées par une fibrose interstitielle qui peut aussi bien toucher
le ventricule gauche que le ventricule droit et plus rarement les oreillettes (cf. Figure 9).
Au niveau cellulaire, une calcification des myocytes suggérant une nécrose secondaire à une
ischémie peut également se produire. Une étude montre également une modulation des
transitoires calciques : à 1h une augmentation de ceux-ci puis à une semaine une décroissance
associée à une altération de la charge du réticulum sarcoplasmique (RS). Cette modulation se
traduit ensuite par une atteinte de la fonction systolique dose- et temps-dépendante (4 et 20
Gy à 1 heure et une semaine) (88).
D’autres atteintes cardiaques ciblant les vaisseaux peuvent apparaître sous forme de lésions
microvasculaires et macrovasculaires.
Les lésions microvasculaires sont caractérisées par une augmentation de la prolifération des
cellules endothéliales et de l'activation de marqueurs endothéliaux. Ces changements précoces
sont réversibles mais suivis par une diminution persistante de la densité capillaire (89).
Les lésions macrovasculaires se développent de manière accélérée chez les patients atteints
d'athérosclérose liée à l'âge mais peuvent également atteindre des patients sans antécédents
cardiaques. Elles se caractérisent par une atteinte générale du système vasculaire avec fibrose
de l'adventice, une destruction de la média et une prolifération inflammatoire de l'intima avec
thrombus et sténose secondaire (90,91).

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41
 Figure 9: Fibrose radio-induite du péricarde
Coupe du péricarde issue de patients sain (image de gauche) et irradié (image de droite) au niveau du cœur à une
dose de 67Gy (92).

La cardiotoxicité induite par l’irradiation reste ainsi un facteur limitant de la radiothérapie

pouvant altérer significativement la qualité de vie du patient ou conduire à l’arrêt du
traitement d’autant plus que sa combinaison avec la chimiothérapie et plus particulièrement
avec les anthracyclines augmente le risque d'insuffisance cardiaque (93).

2-2 La chimiothérapie

La chimiothérapie est un traitement systémique du cancer permettant l'élimination des cellules

cancéreuses dans l'ensemble de l'organisme. Elle a été initialement utilisée dans les tumeurs
solides métastatiques et dans les néoplasies hématologiques (leucémies et lymphomes). Elle
est aujourd'hui de plus en plus prescrite seule ou en combinaison d'autres thérapies dans de
nombreux types de cancer.

2-2-1 Principe de la chimiothérapie

La chimiothérapie est basée sur le principe d'introduction de dommages aux cellules
tumorales plus sensibles que les cellules normales et repose sur des éléments spécifiques à la
biologie tumorale et des bases cinétiques permettant d'offrir des rapports efficacité/toxicité et
bénéfices/risques positifs aux patients traités (94).

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42
Une tumeur maligne est constituée par des cellules capables de croissance excessive et
anarchique causée par des anomalies génétiques accumulées par la cellule: mutations,
amplifications, translocations d'oncogènes et/ou délétions et inactivation d'anti-oncogènes
(3,95,96).
La chimiothérapie vise donc à éliminer ces anomalies en inhibant la progression des cellules
cancéreuses à l'intérieur des phases du cycle cellulaire associée à une induction de
différenciation ou d'apoptose. Elle peut également cibler le micro-environnement de la tumeur
et notamment son adhésion à la MEC, sa vascularisation et son système immunitaire (97).

2-2-2 Cinétique d'action de la chimiothérapie

La régression tumorale dépend de la dose de la drogue administrée (effet dose), de la durée
entre chaque cycle de chimiothérapie (effet temps) et de son mode d'administration.
La cinétique d'action de nombreuses chimiothérapies est cyclique: 4 à 5 jours de traitement
suivi d'un intervalle de 21 jours permettant la reconstitution des précurseurs hématopoïétiques
plus rapide que la croissance des cellules cancéreuses, répétée 4 à 6 fois afin d'obtenir une
régression tumorale maximale et éviter le risque de récidive.
Cette cinétique n'est pas généralisable à toutes les drogues utilisées en chimiothérapie et
dépend de la dose/intensité optimale (c'est à dire un rapport élevé entre le dosage du
traitement et sa durée totale) propre à celles-ci (72,98).

2-2-3 Types de chimiothérapie et leurs effets secondaires spécifiques

Si la chimiothérapie inhibe la croissance tumorale, elle peut le faire de différentes façons. Il
existe donc une multitude de drogues utilisées en chimiothérapie, classées en 2 grandes
catégories: les médicaments cytotoxiques permettant de bloquer la synthèse, le
fonctionnement ou la multiplication cellulaire et les médicaments non cytostatiques qui
bloquent certaines fonctions anormales des cellules cancéreuses et/ou leur micro-
environnement (99).
Parmi les médicaments cytotoxiques, il existe 8 groupes d'agents:
• Agents alkylants: Les agents alkylants altèrent la fonction cellulaire par la formation
de liaison covalente avec les groupes amino, carboxyl, sulfhydryl et phosphate
d'importantes cibles telles que l'ADN, l'ARN et les protéines (92).

Page
43
 • Antimétabolites: Les antimétabolites sont des analogues structuraux de métabolites
impliqués dans la synthèse de l'ADN et de l'ARN. Ils exercent leur activité
cytotoxique en agissant comme inhibiteurs compétitifs soit de métabolites qui
normalement s'incorporent dans l' ADN ou l'ARN, soit de métabolites ou substrats
d'enzyme clé (92).
• Anthracyclines: Les anthracyclines sont des antibiotiques qui s'intercalent à l'ADN.
Ils peuvent également générer un stress oxydatif ou inhiber la topoisomérase II (TopII)
(100).
• Poison du fuseau mitotique: Ils inhibent soit la polymérisation (alcaloides de la
pervenche) soit la dépolymérisation du fuseau mitotique (taxanes). Ils induisent aussi
une apoptose par voie mitochondriale (101).
• Inhibiteurs de topoisomérase: Ils inhibent la topoisomérase I et/ou II.
• Dérivés du platine: Les dérivés du platine induisent la formation d'adduits dans
l'ADN provoquant des dommages à l'ADN similaires aux agents alkylants (102).
Les principales molécules de ces 8 groupes d'agents, leurs indications et leurs toxicités sont
regroupés dans le tableau 1.

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Agents de chimiothérapie Sous-groupes Principales molécules Principales indications Toxicités
Cyclophosphamide
Moutardes à l'azote Ifosfamide
Cancer du sein, sarcomes, Hématologique, digestive,
Phénylalanine moutarde
Agents alkylants lymphomes, mélanomes, cystite hémorragique, fibrose
Carmustine
Nitrosourées leucémies et myélomes pulmonaire
Lomustine
Triazènes Dacarbazine
Analogues de l'acide folique Méthotrexate
5Fluorouracile
Hématologique, digestive,
Analogues de la pyrimidine Cytarabine Cancers digestifs, cancers
muqueuse, nephrotoxicité,
Antimétabolites Gemcitabine ORL, sarcomes, leucémies
cardiotoxicité (5FU),
6Mercaptopurine et lymphomes
neurotoxicité
Analogues de la purine 6Thio-guanine
Fludarabine
Vincristine Leucémies, lymphomes, Hématologique, causticité
Vinblastine cancer des testicules, veineuse, alopécie,
Alcaloïdes de la pervenche
Poiseau du fuseau cancer du poumon, cancer nerveuses, allergiques,
mitotique Navelbine du sein rétention hydrosodés des
Docétaxel Cancer du sein, cancer des taxanes, cardiotoxicité
Taxanes
Paclitaxel ovaires, cancer du poumon (taxanes)
Doxorubicine
Cancer du sein, Hématologique, causticité
Epirubicine
Anthracyclines lymphomes, leucémies, veineuse, alopécie sévère,
Daunorubicine
sarcomes cardiotoxicité
Mitoxantrone
Irinotecan Cancer du côlon, cancer
Inhibiteur TopI
Topotecan ORL, cancer des ovaires
Hématologique, digestive,
Inhibiteurs Etoposide (TopI), cancer du poumon,
causticité veineuse, alopécie,
Topoisomérases lymphomes, leucémies,
Inhibiteur TopII muqueuses
cancer des testicules,
Teniposide sarcomes
Cisplatine Cancer des testicules,
Hématologique modérée,
Carboplatine cancer des ovaires, cancer
tubulopathie sévère, toxicité
Dérivé du platine du poumon, sarcomes,
auditive, neuropathie
lymphomes, cancer
périphérique
Oxaliplatine colorectal

Tableau 1: Les différentes classes de chimiothérapie : indications principales et effets secondaires

Les différentes classes de chimiothérapie sont regroupées selon leurs modes d’action et leurs cibles. Elles ont
ainsi différentes indications thérapeutiques et entraînent divers effets secondaires. (Adapté de (72))

Les médicaments non cytostatiques sont distingués selon 2 groupes:

• Anticorps monoclonaux et thérapies ciblées: Les anticorps monoclonaux et les
thérapies ciblées ont considérablement amélioré le traitement des cancers. Ils ciblent
un antigène ou une protéine surexprimée dans certains cancers et permettent ainsi de
bloquer sa fonction et/ou de provoquer l'apoptose. On peut citer de manière non
exhaustive le trastuzumab (ou Herceptine) anticorps monoclonal ciblant le récepteur
HER-2 surexprimé dans certains cancers du sein, l'avastin anticorps monoclonal dirigé
contre le vascular endothelial growth factor (VEGF), le bortezomib thérapie ciblée
inhibant le protéasome 26S responsable de la dégradation d'une variété de proteines
impliquées dans la prolifération des cellules cancéreuses ou l'imatinib autre thérapie
ciblée qui inhibe la tyrosine kinase Bcr-Abl dans la leucémie myéloïde chronique.

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 Etant donné qu'ils ciblent un antigène ou une protéine, ils ont peu d'effets secondaires
et notamment de toxicité hématologique.
En revanche, le trastuzumab peut induire une cardiotoxicité de type II réversible. Cette
cardiotoxicité de type II n'est pas dose dépendante. Elle peut avoir différents degrés de
sévérité et n'est pas reliée à des changements structuraux des cardiomyocytes. Les
mécanismes de cette cardiotoxicité sont encore peu étudiés. Cependant, l'un des
mécanismes proposé serait que le trastuzumab limite ou bloque les voies de
signalisation nécessaires à la survie des cardiomycytes telles que neureguline
1/récepteur HER2/HER4 hétérodimère/Akt/ERK/FKHR ou cardiotrophine
1/GP130/récepteur LIF et notamment ses voies de réparation (103–106). Une
altération du facteur de transcription GATA-4, régulateur clé dans le développement
cardiaque, est également impliquée dans cette cardiotoxicité (92). Une étude récente
montre également que le trastuzumab pourrait altérer la différenciation et le
fonctionnement des cellules souches résidentes humaines in vitro sans effet sur leur
taille, leur prolifération et sans induire l'apoptose de ces cellules (107). Le trastuzumab
pourrait ainsi altérer la capacité d'adaptation et/ou de régénération (déjà faible) du
cœur. Il est ainsi contre-indiqué en combinaison avec les anthracyclines également
utilisé pour le cancer du sein du fait de son potentiel cardiotoxique (92)
• Immunothérapie: L'immunothérapie permet la stimulation du système immunitaire
dirigée contre les cellules tumorales. En effet, les tumeurs entourées de cellules
immunitaires ont de meilleurs pronostics. Elle utilise des cytokines antitumorales et
notamment l'interleukine 2 (IL-2) dans le cancer du sein ou l'interféron α dans le
traitement des leucémies, lymphomes, mélanomes et cancers du sein. Cependant, elle
peut induire une hépatotoxicité, une asthénie, un syndrome dépressif, une hypotension
ou une insuffisance rénale (IL-2). Toutefois, ces différentes atteintes sont réversibles à
l'arrêt du traitement (108,109).
• Hormonothérapie: L'hormonothérapie est indiquée pour les cancers hormono-
dépendants tels que le cancer de la prostate ou le cancer du sein surexprimant les
récepteurs aux hormones. Elle consiste à utiliser des anti-androgènes ou des
œstrogènes (en traitement de 2ème ligne) dans le cas d'un cancer de la prostate ou
d'antagonistes du récepteurs aux oestrogènes (tamoxifène) pour le cancer du sein
(110,111).

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La chimiothérapie est donc une arme essentielle au traitement de nombreux types de cancer.
Elle permet d'inhiber la croissance tumorale en bloquant les fonctions de la cellule tumorale
et/ou son micro-environnement. Cependant, elle peut induire d'importants effets secondaires
qui peuvent engager le pronostic de survie du patient pendant et/ou quelques années après le
traitement. Ces effets secondaires dépendent notamment de variabilité interindividuelle. A ce
titre, de nombreuses études pharmacogénomiques sont en cours de développement.
Ces études mettent en exergue l'existence de polymorphismes chez l'hôte régulant la
biodisponibilité de l'agent anticancéreux et/ou de polymorphismes de la tumeur affectant la
sensibilité à l'agent (112).
L'un des enjeux majeurs en oncologie est ainsi d'identifier par des études
pharmacogénomiques les patients à risque.

2-3 Les traitements combinés

La combinaison des traitements anticancéreux permet une action synergique et plus efficace
de deux modalités thérapeutiques aux modes d'action différents et une augmentation de la
sensibilité de la tumeur avant l'utilisation d'une autre thérapie afin de limiter la repopulation
tumorale, les risques de récidive, et la résistance aux traitements.
Cependant, la combinaison de certains agents anticancéreux majore les risques de toxicités.
Parmi ces toxicités, la cardiotoxicité des anthracyclines est accrue si elle est associée au
paclitaxel, au cyclophosphamide, à l'actinomycine D, à la mitomycine, à la dacarbazine, à la
bléomycine, à l'étoposide, au cisplatine, au méthotrexate et à la vincristine qui modifient son
métabolisme (113).
L'association anthracyclines/radiothérapie et anthracyclines/thérapie ciblée et notamment
l'utilisation du trastuzumab est également à risque (114,115).
En effet, le risque d'insuffisance cardiaque est ainsi multiplié par 6 chez les patientes atteintes
d'un cancer du sein et ayant reçu une dose de radiothérapie supérieure à 12 Gy associée à une
dose supérieure à 250mg/m2 d'anthracyclines (93). Les pathologies cardiovasculaires
associées à ce type de traitements combinés diffèrent si le traitement aux anthracyclines est
antérieur ou postérieur à la radiothérapie. La radiothérapie provoque des effets secondaires
cardiaques additionnels à la doxorubicine aggravant la cardiomyopathie. En revanche, un
traitement aux anthracyclines postérieur à la radiothérapie entraîne un phénomène de rappel
qui conduit à des lésions des cellules endothéliales des vaisseaux cardiaques s’ajoutant aux
atteintes cardiaques (116).

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Une analyse rétrospective des effets secondaires du trastuzumab a également mis en évidence
une plus forte augmentation de risque d'insuffisance cardiaque pour la combinaison
anthracyclines/ trastuzumab comparé au trastuzumab seul ou à la combinaison
paclitaxel/trastuzumab dans une étude clinique du cancer du sein métastatique (92).
Les résultats de cette étude clinique figurent dans le tableau 2.

Trastuzumab et
Trastuzumab et
Trastuzumab seul Paclitaxel seul anthracyclines/ Anthracyclines
Paclitaxel
cyclophosphamide
Insuffisance cardiaque
symptomatique (%)
8,5 8,8 4,2 28 9,6
Insuffisance cardiaque III-
IV (NYHA) (%)
5 4 1 19 3
Dose moyenne
d'Anthracyclines (mg/m )
2 316 245 245 347 346
Nombre de patients 213 91 95 143 135
Tableau 2: Analyse rétrospective des effets secondaires des traitements combinés utilisant le Trastuzumab
dans le cancer du sein métastatique
Cette analyse de l’essai clinique HERA (Herceptin Adjuvant trial) montre que l’utilisation des anthracyclines
seules, du trastuzumab seul ou de la combinaison Trastuzumab/Paclitaxel entraîne le développement d’une
insuffisance cardiaque (symptomatique ou de stade III-IV) chez 12-13%. Le paclitaxel n’amplifie pas la
cardiotoxicité induite par le trastuzumab. En revanche, l’association du trastuzumab et des
anthracyclines/cyclophosphamide augmente considérablement le risque de développer une insuffisance
cardiaque suggérant des effets délétères additifs causés par les anthracyclines (92).

Si les taxanes seuls ne présentent pas de risque identifié de toxicité cardiaque, les
combinaisons Trastuzumab/taxanes (Paclitaxel) et Anthracyclines/Paclitaxel ou Docetaxel
peuvent être cardiotoxique, notamment en augmentant le métabolisme des anthracyclines
(117). Néanmoins, la combinaison Trastuzumab/Paclitaxel représente un risque beaucoup
moins élevé que la combinaison Trastuzumab/Anthracyclines.

En résumé, la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie représentent un arsenal

thérapeutique efficace contre de nombreux types de cancers. Ils ont permis une augmentation
significative des rémissions à 5 ans, de la survie et de la qualité de vie des patients.
Concomitant avec l'amélioration de la survie des patients, des effets secondaires importants
ont été rapportés des mois ou des années après la fin de traitement. Parmi ces effets
secondaires, la cardiotoxicité représente un facteur limitant majeur conduisant à la diminution
des doses utilisées voire à un arrêt du traitement.

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Ces traitements limités peuvent être responsables d'une diminution de l'efficacité du
traitement anticancéreux et nécessitent une surveillance supplémentaire et/ou une mise en
place de traitements spécifiques des pathologies cardiaques.

Parmi les traitements anticancéreux induisant une cardiotoxicité, les anthracyclines et

plus particulièrement la doxorubicine (Dox) restent une des drogues les plus utilisées
dans de nombreux types de cancers mais surtout une des plus cardiotoxiques. Bien que
certains mécanismes de cette cardiotoxicité aient été mis à jour, ils ne permettent pas à
l'heure actuelle la prévention ni le traitement de cette cardiotoxicité.
Les parties suivantes seront donc consacrées à l'étude bibliographique de la
physiopathologie et des mécanismes sous-jacents de la cardiotoxicité induite par la
doxorubicine.

3- Physiopathologie de la cardiotoxicité des anthracyclines

Les anthracyclines sont des agents utilisés en chimiothérapie dans le traitement du cancer et
notamment dans le cancer du sein, les lymphomes, les sarcomes et d'autres types de cancers
(leucémies, cancer ovarien, cancers gastriques, neuroblastome, cancer de la tyroïde, tumeur de
Wilm, cancer broncho-pulmonaire, sarcome de Kaposi associé au sida).
Néanmoins, les anthracyclines peuvent induire différentes toxicités dont une toxicité
hématologique, une néphrotoxicité, une hépatotoxicité et une cardiotoxicité (118–120). Parmi
ces toxicités, la cardiotoxicité fait partie des préoccupations majeures limitant l’efficacité du
traitement ou altérant la qualité de vie des patients traités aux anthracyclines (121). Nous nous
intéresserons ici uniquement à la toxicité cardiaque induite par les anthracyclines.

3-1 Les anthracyclines

3-1-1 Historique
Les anthracyclines forment une famille de médicaments anticancéreux isolés à partir de
Streptomyces peucetius découvert en 1963 par Di Marco. La daunorubicine, découverte à la
même époque par des équipes italienne et française, a été la première anthracycline utilisée
notamment dans les traitements de leucémies et de lymphomes (122,123). Les premiers cas de
cardiotoxicité induite par la daunorubicine ont été rapportés en 1967 (124).

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Deux ans après, l'adriamycine, ou doxorubicine, a été caractérisée à partir de mutants de cette
souche. La daunorubicine et la doxorubicine forment ainsi les anthracyclines de première
génération.
Afin de réduire la cardiotoxicité de la doxorubicine, une deuxième génération (épirubicine et
édarubicine), puis une troisième (amrubicine) ont par la suite été développées (125).
Ces produits de deuxième et troisième générations permettent à doses comparables de
diminuer la cardiotoxicité sans atténuer l'activité antitumorale de la doxorubicine. Cependant,
ces analogues sont utilisés à plus forte dose. L'épirubicine est notamment utilisée à 900
mg/m2, soit le double de la dose cumulée totale conseillée de la doxorubicine (450 mg/m2) et
peut donc entraîner des effets secondaires comparables à la doxorubicine.
L'encapsulation de la doxorubicine dans des liposomes a ainsi été développée. En effet, elle
permet de cibler la tumeur tout en limitant l'accumulation au niveau myocardique par
modifications des propriétés pharmacocinétiques.
Il existe maintenant 8 anthracyclines utilisées couramment en clinique: la daunorubicine
(Cérubidine®), la doxorubicine (Driblastine®), l'épirubicine (Farmorubicine®), l'idarubicine
(Zavedos®), la pirarubicine (Thépubicine®), la daunorubicine liposomale (Daunoxome®) et
deux doxorubicines liposomales (Caelyx® et Myocet®) (126,127).
La doxorubicine ainsi que l'épirubicine sont aujourd'hui les anthracyclines les plus utilisées.

3-1-2 Structure
Les anthracyclines possèdent une structure polyaromatique composée de 4 noyaux
aromatiques portant les complexes hydroquinone et quinone (accepteur et donneur
d'électrons) attachés à une partie glucique, la daunosamine par une liaison O-glycosidique. La
structure moléculaire des diverses anthracyclines différent par l'ajout de radicaux (cf. Figure
10).

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 Figure 10: Structure des anthracyclines
La structure polyaromatique est représentée en violet, et la partie glucidique en rouge. Les anthracyclines se
différencient par leurs radicaux présents aussi bien sur la structure polyaromatique que sur la partie glucidique
(D'après N.Merlet, thèse 2011).

Ces molécules diffusent à travers les membranes des cellules cardiaques ou des cellules
cancéreuses du fait de leur nature amphiphile et le mécanisme de flip-flop (ie. mouvement de
bascule de phospholipides entre les deux feuillets de la membrane) (128).

3-1-3 Métabolites actifs des anthracyclines

Deux métabolites actifs peuvent être obtenus à partir des anthracyclines : un métabolite
aglycone (appelé agly-doxorubicine dans le cas de la doxorubicine) qui résulte de la réduction
de la liaison O-glycosidique et de la perte de la daunosamine et un métabolite alcool
secondaire issue de la réduction de la fonction cétone en C13 des anthracyclines (appelé
doxorubicinol dans le cas de la doxorubicine) (cf.Figure 11).

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 Figure 11: Principaux métabolites de la doxorubicine
La doxorubicine peut former 2 métabolites de dégradation : le doxorubicinol par une réduction et l’agly-
doxorubicine, métabolite aglycone (D’après N.Merlet, thèse 2011).

Ces deux métabolites actifs jouent également un rôle dans la cardiotoxicité induite par les
anthracyclines.
En effet, les métabolites aglycones altèrent la fonction mitochondriale (129).
De plus, la surexpression de la carbonyl réductase qui entraîne un taux de conversion de
doxorubicine en doxorubicinol chez des souris conduit à une cardiotoxicité accrue (130). Bien
que le doxorubicinol ne puisse réagir et produire des ROS, ses effets cardiotoxiques sont
potentialisés notamment par l’inhibition du courant potassique IKs et l’altération du couplage
excitation-contraction (cf. partie 3-2-6) (131–133).

3-1-4 Pharmacocinétique de la doxorubicine

Chez la souris, les données pharmacocinétiques sont rares. Une ancienne étude montre
notamment la distribution tissulaire de la doxorubicine chez les souris femelles C3H portant
une xénogreffe de cellules cancéreuses mammaires et traitées à la doxorubicine (12mg/kg).
Les concentrations en dox diminue ainsi significativement dans les reins, le foie et le coeur à
partir de 24h jusqu'à atteindre une concentration d'environ 5µg/g, 4µg/g et et 1 µg/g
respectivement après 72h (134).
Selon la monographie éditée par Pfizer, la doxorubicine est rapidement éliminer du plasma
des patients et se lie fortement aux tissus (135). La doxorubicine se répartit rapidement dans
les ascites et y atteint des concentrations supérieures au taux plasmatique.

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52
La liaison aux protéines plasmatiques est de 50–85%. L'élimination se fait principalement par
la bile et les selles, à raison de 40–50% sous forme inchangée et de 23% sous forme de
doxorubicinol. L'excrétion urinaire est minime (5–15% de la dose) et sous forme inchangée.
La clairance (volume de solution totalement épuré d'une substance par unité de temps) de la
doxorubicine est de 400–583 mL/min/m², la demi-vie terminale est de 17 h (métabolites 30–
50 h).

3-2 Cardiotoxicité induite par les anthracyclines

Les anthracyclines et plus particulièrement la doxorubicine exerçent une cardiotoxicité se

traduisant par des complications diverses qui peuvent se produire précocement ou
tardivement.

3-2-1 Altérations du tissu cardiaque induites par la doxorubicine

La doxorubicine entraîne une cardiotoxicité de type I irréversible caractérisée par des
dommages permanents associés à une mort cellulaire des cardiomyocytes et des changements
ultrastructuraux (cf. Figure 12) (92).

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53
 Figure 12: Altérations ultrastructurelles induites par les anthracyclines
A: myocarde normal B: Vacuolisation des cellules myocardiques C: Atteintes des myofibrilles D: Nécrose du
myocarde (92).

Elle est le plus souvent associée à une cardiomyopathie dilatée. Cette cardiotoxicité peut
survenir au moment de l'injection ou quelques heures après (effets aigües), dans la première
année après la fin du traitement (effets chroniques précoces) ou quelques années après la fin
du traitement (effets chroniques tardifs) (136,137).

• Toxicité aigüe:
La cardiotoxicité aigüe de la doxorubicine peut toucher jusqu'à 40% des patients mais la
plupart du temps est asymptomatique. Des manifestations symptomatiques peuvent être
retrouvées chez moins de 1% des patients. Ces manifestations sont le plus souvent
caractérisées par des altérations transitoires de la fonction systolique du VG et des arythmies
(tachycardie sinusale, anomalie du segment ST et de l'onde T) mais sont réversibles et ne
justifient pas l'arrêt du traitement.
En revanche, des manifestations symptomatiques graves mais rares (1%) peuvent apparaître
sous la forme d'une tachycardie et fibrillation ventriculaire, d'une insuffisance cardiaque aigüe

Page
54
avec hypokinésie du ventricule gauche et d'une augmentation de la paroi septale et postérieure
ou d'une myocardite (atteinte inflammatoire du myocarde) ou d'une péricardite (inflammation
du péricarde) et engager le pronostic vital du patient (138).

• Toxicité chronique précoce:

Selon la durée de suivi du traitement, jusqu'à 16% des patients peuvent développer une
cardiotoxicité chronique précoce progressive causée vraisemblablement par des dommages
ou la mort cellulaire des cardiomyocytes (139,140). Elle est caractérisée par une
cardiomyopathie dilatée chez l'adulte évoluant vers une cardiomyopathie restrictive avec
dysfonctions diastoliques et des pressions de remplissage élevées en pédiatrie (141,142).

• Toxicité chronique tardive

Une cardiotoxicité tardive peut être développée au-delà d'un an et jusqu'à 20 ans après
traitement (137). Elle est caractérisée par des arythmies cardiaques ou une cardiomyopathie
dilatée et restrictive avec dysfonctions diastoliques qui peuvent être également responsables
d'une vasoconstriction des coronaires augmentant ainsi les risques d'infarctus du myocarde.
Une perte de myofibrille peut également être observée (143). La majorité des études cliniques
rapportant une toxicité cardiaque tardive de la doxorubicine concerne les patients
pédiatriques. Une étude clinique a montré notamment que 25% des patients pédiatriques
étaient touchés par ce type de cardiotoxicité (144).

Une étude a récemment mis en doute l’irréversibilité de cette pathologie ainsi que la
classification de ces toxicités. En effet, elle a notamment montré que l'incidence de la
cardiotoxicité induite par les anthracyclines était de 9% parmi les 2625 patients traités (74%
de femmes adultes, 51% pour un cancer du sein, 28% pour un lymphome non hodgkinien).
Parmi ces 9% de patients, 98% d'entre eux développaient une cardiotoxicité suivant la
première année de traitement. 11% et 71% d'entre-eux se rétablissaient respectivement
totalement ou partiellement après traitement (énalaprile, β-bloquant) suggérant ainsi une
possible réversibilité de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Il est, cependant, à noter
que l'âge médian de suivi des patients était de 5,2 ans. La cardiotoxicité induite par la
doxorubicine pouvant également se développer à des temps plus tardifs, il aurait été
intéressant d'étudier également la réversibilité de celle-ci au delà de 5 ans après la fin du
traitement. Ils démontrent également que cette cardiotoxicité est associée à la dose
d’anthracyclines et à la fraction d’éjection du patient à la fin du traitement (145).

Page
55
La détection précoce ainsi qu’un traitement rapide de la cardiotoxicité induite par les
anthracyclines apparaît donc cruciale pour un rétablissement de la fonction cardiaque.

3-2-2 Epidémiologie
Avec l'amélioration de la prise en charge thérapeutique des cancers et l'utilisation notamment
de la chimiothérapie, la proportion des survivants à long terme des cancers a augmenté
significativement ces dernières décennies.
Ainsi, le taux de survivants des cancers pédiatriques 15 ans après la fin du traitement
représentent aujourd'hui 80% (146). Malheureusement, ces traitements et particulièrement la
chimiothérapie augmentent fortement les risques de complications cardiaques jusqu'à 40 ans
après la fin du traitement (cf. Figure 13) (146).

Figure 13: Incidence des complications cardiaques induites par la chimiothérapie chez les survivants de
cancers pédiatriques
La probabilité de développer des complications cardiaques dont l’insuffisance cardiaque, l’ischémie, les
maladies valvulaires, les arythmies et/ou les péricardites augmente significativement avec le temps de suivi du
patient après la fin de son traitement (146).

Le risque de développer une toxicité cardiaque après traitement à la doxorubicine dépend de

la dose administrée et varie selon les études.
En effet, la probabilité d'apparition d'une cardiotoxicité chronique peut varier de 7 à 36%
pour une dose de 550mg/m2 ou de 4 à 36% pour une dose de 500mg/m2 selon les études
(146,147).

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56
Pour les patients ayant reçu une chimiothérapie ou une radiothérapie enfant ou adolescent, le
risque de développer une insuffisance cardiaque est multiplié par 15 et leur taux de mortalité
est 8 fois supérieur par rapport aux adultes du même âge n'ayant pas reçu de traitements
anticancéreux (148,149).
On peut également observer une forte prévalence (53% des patients) de cardiotoxicité sévère à
très sévère se développant à des temps plus précoces chez les patients âgés qui s'expliquerait
notamment par des comorbidités associés (150).

3-2-3 Facteurs de risque

Certains facteurs de risque favorisent le développement d'une cardiotoxicité induite par la
dox. Cette cardiotoxicité peut notamment être majorée par l'accumulation de ces facteurs.
Parmi les facteurs favorisant le développement d'une cardiotoxicité causée par la
doxorubicine, la dose cumulée totale représente le risque le plus important. En effet, une
cardiotoxicité à la doxorubicine peut se manifester dès 45mg/m2 et augmente
significativement au-delà de 300 mg/m2 (142). Une dose cumulée totale de 700mg/m2
augmente ainsi de 40% le risque d'insuffisance cardiaque (cf. Figure 14) (151).

Figure 14: Incidence de l'insuffisance cardiaque congestive chez les patients âgés
L’incidence de la cardiotoxicité induite par la dox augmente à partir de 400mg/m2. Les patients âgés de plus de
65 ans sont plus sensibles à cette effet dose et sont également plus nombreux à développer des complications
cardiaques après traitement à la doxorubicine (151).

Sur cette même figure, on peut observer un autre facteur de risque de développement d’une
cardiotoxicité induite par la doxorubicine : l’âge du patient au moment du traitement.

Page
57
En effet, un âge supérieur à 65 ans et les comorbidités associées à ce type de patients et
notamment une atteinte cardiaque antérieure (causée par le diabète, l'hypertension,
l'hypercholesterolemie) favorisent l'apparition d'une insuffisance cardiaque induite par la
doxorubicine (152).
Les patients pédiatriques ont également un risque 8 fois plus élevé que la population générale
de développer une maladie cardiovasculaire 30 ans après la fin de leurs traitements. Ce risque
est d’autant plus élevé que le taux de survie à 5 ans de ces patients atteint 80% (92). Le mode
d'administration représente également un risque. En effet, un pic élevé de concentration
sérique d'anthracyclines lors de la perfusion majore ce risque (153).
De plus, selon plusieurs études de cohortes pédiatriques, les patients pédiatriques de sexe
féminin, ne disposant pas encore d'une maturation hormonale, seraient plus sensibles dû
probablement à un stockage préférentiel de la dox dans la masse lipidique et à une clearance
diminuée (154,155). Cependant, une étude réalisée au sein de notre unité chez le rat adulte
traité à 14 mg/kg pendant 7 semaines, montre que les mâles sont plus sensibles que les
femelles à la doxorubicine.
Tandis que les mâles développent des complications cardiaques sévères menant à 50% de
mortalité, le traitement à la doxorubicine chez les femelles ne conduisait qu’à une altération
modérée de la fraction d’éjection (156). Le dismorphisme sexuel dans la cardiotoxicité induite
par la doxorubicine est ainsi encore débattu.
Enfin, il existe une variabilité interindividuelle et notamment des polymorphismes tels que la
carbonyl réductase 1 expliquant une sensibilité accrue. Ces patients souffrent d'effets
secondaires pour des doses inférieures à celles indiquées dans les recommandations (157).

3-2-4 Prévention de la cardiotoxicité des anthracyclines

Afin de prévenir les effets cardiotoxiques de la doxorubicine, différentes stratégies peuvent
être employées dont la diminution de la dose cumulée totale, le mode d'administration,
l'utilisation de dérivés de doxorubicine ou de différents vecteurs transportant la doxorubicine
ou l'administration d'antioxydants.

• Diminution de la dose cumulée totale de la doxorubicine

La diminution de la dose cumulée totale de doxorubicine chez l'adulte est à ce jour la
prévention la plus efficace contre les complications cardiaques. Néanmoins, ce protocole
limite l'efficacité du traitement antitumoral. La prise en compte du bénéfice sur l'activité

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58
antitumorale et du risque cardiaque est donc indispensable avant la diminution ou l'arrêt du
traitement compte-tenu des variations interindividuelles importantes.

• Mode d'administration de la doxorubicine

Une autre approche consiste à modifier le protocole d'administration de la doxorubicine.
Ainsi, une perfusion continue sur plusieurs jours plutôt qu'une injection en bolus permet de
diminuer les risques de complications cardiaques (125). Toutefois, cette méthode est
controversée chez les patients pédiatriques.
En effet, plusieurs études cliniques réalisées chez des patients pédiatriques atteints de
leucémie lymphoblastique aiguë ont montré qu’il n’y a aucun avantage à administrer la
doxorubicine sur 48 heures par rapport au bolus (142,158).

• Dérivés et vecteurs transportant la doxorubicine

La limitation de la dose diminuant l'efficacité du traitement, la recherche s'est ensuite portée
sur le développement de dérivés de doxorubicine dont l'épirubicine ou de transporteurs actifs
ou passifs permettant de cibler plus spécifiquement les cellules tumorales et ainsi d'augmenter
les doses de doxorubicine tout en diminuant la toxicité cardiaque. Ainsi, le Doxil forme de
doxorubicine liposomale pégylée permet de délivrer le principe actif directement au niveau de
la tumeur en réduisant les complications cardiaques. En effet, la taille supérieure du doxil
empêcherait de franchir les capillaires cardiaques et favoriserait sa pénétrance dans le tissu
tumoral permettant ainsi de limiter la dose reçue au cœur (159).

• Utilisation d'antioxydants
Pendant de nombreuses années, la génération d'un stress oxydant était l'hypothèse la plus
favorisée expliquant les effets cardiotoxiques de la doxorubicine (cf. partie 3-2). Efficaces sur
de nombreux modèles animaux, de nombreux antioxydants ont été testés dans des essais
cliniques dont l'acétylcystéine, la vitamine E, polyphenols, probucol etc. Cependant, ils se
sont avérés inefficaces dans la prévention de la cardiotoxicité induite par la dox voire
délétères pour l'efficacité thérapeutique de la dox (cf. Tableau 3) (160).

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 Dose de l'agent
Prévention des effets Influence négative sur
Antioxydants Agents anticancéreux anticancéreux Références
2 cardiotoxiques l'activité antitumorale
(mg/m )
Myers et al , Semin Oncol, 1983; Dresdale et
N-acétylcystéine Doxorubicine 75-500 non
al, Am J Clin Oncol 1982

Vitamine E Doxorubicine 550 non Legha et al, Ann N Y Acad Sci,1982

Flavonoïdes non + augmentation de la

Doxorubicine 300 oui Bruynzeel et al , Br J Cancer, 2007
(monoHER) cardiotoxicité
Doxorubicine ou oui (mais étude clinique sur
Carvedilol Dox: 525 Epi:788 Kalay et al , J Am Coll Cardiol, 2006
Epirubicine 25 patients)

Tableau 3: Liste des essais cliniques testant les antioxydants contre la cardiotoxicité induite par les
anthracyclines
Plusieurs essais cliniques ont testé les antioxydants afin de prévenir les complications cardiaques associées à la
doxorubicine. Cependant, aucun de ces essais cliniques n’a permis le développement d’une nouvelle stratégie
thérapeutique permettant la prévention de ces effets secondaires sans influencer l’efficacité du traitement.

Une seule molécule, le dexrazoxane (Cardioxan) est aujourd'hui utilisée en prévention de la

cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Le dexrazoxane est un chélateur de fer qui permet
une diminution du stress oxydant induit par la dox.
Cependant, Lyu et ses collaborateurs ont démontré que son efficacité cardioprotectrice
proviendrait d'une dégradation protéasomale de la TopIIβ plus que de la chélation du fer.
Ils ont notamment utilisé un autre chélateur de fer, l'ICL670A (deferasirox), qui n'avait aucun
effet cardioprotecteur (161).
Si les effets cardioprotecteurs du dexrazoxane ne font aucun doute, il est aujourd'hui utilisé
uniquement dans le cancer du sein métastatique et à une dose de doxorubicine supérieure à
300 mg/m2 en raison de ses effets négatifs sur l'efficacité de la dox et le développement de
pathologies secondaires malignes (162). Cependant, un essai clinique réalisé sur des patients
pédiatriques atteints de leucémie lymphoblastique a montré que l'utilisation du dexrazoxane
permettait une diminution des atteintes cardiaques (mesurées par la concentration sérique de
la troponine cardiaque) sans influencer l'efficacité de la dox (115,163).
Le développement de nouvelles molécules cardioprotectrices et efficaces sur l'activité
tumorale est donc indispensable.

3-2-5 Prise en charge des patients : dépistages et traitements de la cardiotoxicité

induite par la doxorubicine

• Dépistages
L'évaluation du risque d'atteinte cardiaque par la doxorubicine se réalise à l'aide de différentes
techniques dont l'échocardiographie, l'électrocardiogramme ou la mesure de différents
biomarqueurs cardiaques.

Page
60
L'objectif est d'identifier les patients à risque par la mesure de différents paramètres cliniques
tels que la fraction d'éjection, la fraction de raccourcissement, les intervalles systoliques, les
modifications électrocardiographiques ou par la mesure de biomarqueurs tels que la créatine
phosphokinase, marqueur d'un dommage myocardique associé à l'ischémie. Néanmoins, ces
mesures ne permettent pas l'évaluation des atteintes cardiaques précoces. Parmi les marqueurs
biochimiques utilisés dans le cadre de cardiomyopathies telles que l’hypertrophie ou
l’insuffisance cardiaque tels que le proBNP, le BNP et les troponines I, C et T, seule la
troponine I est utilisée comme marqueurs de la perte cardiomyocytaire précoce associée à la
cardiotoxicité chronique tardive (164). L'échocardiographie de strain (ou strain rate qui
mesure la déformation du tissue (165) est ainsi utilisé afin de dépister plus précocement le
retentissement myocardique (166,167). Cependant, ces méthodes non invasives ne permettent
ni la prédiction du risque ni l'identification précise des patients à risque.
La méthode biopsique septale du tissu myocardique est en outre le seul test spécifique et
sensible permettant d’identifier les altérations ultrastructurales et histologiques et de
diagnostiquer de manière précoce une toxicité cardiaque induite par la dox.
En effet, la biopsie myocardique permet d'établir un score qui est corrélé avec le risque estimé
d'apparition d'une cardiotoxicité (cf. Figure 15) (168).

Figure 15: Échelle graduée d'atteintes morphologiques

Ce tableau permet de classifier le degré d'atteinte histologique du patient traité aux anthracyclines à l'aide d'une
biopsie septale (92).

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61
Néanmoins, cette méthode étant très invasive, elle est aujourd'hui rarement utilisée.

• Traitements
Les traitements utilisés aujourd'hui ne sont pas spécifiques de la cardiotoxicité. Ainsi, les β-
bloquants, les inhibiteurs d'ACE sont les traitements les plus utilisés dans le cadre d'une
cardiotoxicité induite par la dox. Leur but est d'atteindre une pression sanguine inférieure à
140/90 mmHg et une fréquence cardiaque inférieure à 70 bpm avec une augmentation de
doxorubicine jusqu'à sa dose maximum tolérée (146).
En outre, l’étude clinique de Cardinale et al a notamment montré qu’ une surveillance précoce
et régulière (tout les 3 mois pendant le traitement et 1 an après le traitement puis tout les 6
mois pendant 4 ans) et l'utilisation d'énalapril (inhibiteur de ACE) et/ ou de β-bloquant a
permis un rétablissement dans 82% des cas et notamment un retour à des valeurs normales de
LVEF chez 11% des patients (145).
Cependant, une étude clinique antérieure n'avait montré aucun bénéfice de l’énalapril sur la
fonction cardiaque des patients atteints de cardiotoxicité symptomatique ou non traités (169).
L'utilisation chez les patients adultes et pédiatriques et le réel bénéfice accordé à ces
traitements ne sont donc pas encore établis (170).
Les antagonistes de l'aldostérone, les digitaliques, les diurétiques, l'ivabradine, l'inhibiteur du
récepteur à l'angiotensine II telmisartan peuvent également être utilisés (171,172).

Le protocole de référence de suivi et de traitement des patients traités à la doxorubicine est

représenté dans la figure 16.

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62
 Figure 16: Procédure de diagnostic et de traitement des complications cardiaques associées à la
doxorubicine
Les patients traités à la doxorubicine sont examinés avant et après traitement par un cardiologue qui permettra
d’identifier les patients à risque. Les patients à risque sont ainsi examinés tous les mois après la fin de leur
traitement tandis que les patients ne présentant aucune anomalie cardiaque sont examinés tous les trois mois.
Enfin, l’utilisation d’un traitement (β-bloquant), le changement ou l’arrêt de la thérapie anticancéreuse est
discuté par les médécins des patients présentant des effets secondaires cardiaques. ECG: Electrocardiogramme,
LVEF: Left ventricular ejection fraction (146).

Ainsi, aucun médicament ne permet aujourd'hui de prévenir ni de traiter

spécifiquement la cardiotoxicité induite par la doxorubicine.
L'objectif de cette thèse a donc été d'étudier les mécanismes moléculaires d'action de la
doxorubicine afin d'identifier une nouvelle cible thérapeutique permettant la prévention
et/ou le traitement de cette cardiotoxicité.

Page
63
4- Mécanismes d’action de la doxorubicine

La doxorubicine est un antibiotique cytotoxique anthracyclinique. Elle exerce ses effets

anticancéreux et toxiques selon plusieurs mécanismes dont l’intercalation à l’ADN,
l’inhibition de la topoisomérase II et la formation de radicaux libres. Ces mécanismes
induisent différentes réponses cellulaires et moléculaires dans la mesure où la toxicité de la
dox peut atteindre aussi bien les cellules tumorales que les cellules cardiaques.

4-1 Mécanismes d'action antitumorale de la doxorubicine

Les anthracyclines constituent un groupe d'agents anticancéreux important fréquemment

utilisés dans de nombreux types de cancer (cf. partie 4).
Les anthracyclines sont administrées par intraveineuse et sont rapidement éliminées du
plasma et captées par différents organes: cœur, poumons, foie, reins et rate. Leurs temps
d'élimination est de 30 heures (173).
L'activité antitumorale des anthracyclines n'a pas encore été complètement élucidée mais
plusieurs mécanismes semblent jouer un rôle dont les interactions avec l'ADN, l'inhibition de
la topoisomérase II, et la formation de radicaux libres.

4-1-1 Interaction ADN-anthracyclines

Les anthracyclines s'intercalent directement dans le petit sillon de la double hélice d'ADN par
formation de liaisons hydrogènes. De plus, la partie glucidique des anthracyclines interagit
avec les protéines régulatrices de l'ADN ce qui a pour conséquence une inhibition de la
réplication et de la transcription de l'ADN (174,175).
Des adduits peuvent également se former après intercalation dans l'ADN par une liaison
covalente anthracyclines-ADN en présence d'une molécule de formaldéhyde, métabolite des
acides aminés et de méthylation/déméthylation des protéines et de l'ADN (176,177).
La réaction entre la doxorubicine et le formaldéhyde forme un conjugué appelé doxazolidine
qui, s'ils s'associent, forment un adduit de dox appelé le doxoforme (178).
Le doxoforme induit ainsi une apoptose 4 fois plus importante dans les cellules de cancer du
côlon ou de leucémie en culture sans induire d'arrêt de la phase G2/M, mécanisme dépendant
de la topoisomérase II contrairement à la doxorubicine. Le doxoforme est ainsi beaucoup plus
efficace sur l'activité antitumorale que la doxorubicine d'autant plus que la concentration en
formaldéhyde est plus importante dans les cellules cancéreuses et est potentialisée en présence
d'anthracyclines ((179–181).

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64
 4-1-2 Inhibition de la topoisomérase II
La topoisomérase II est une enzyme régulant l'état d'enroulement de l'ADN en générant des
coupures double brin transitoires de l'ADN. Elle est indispensable à différents processus
cellulaires tels que la réplication, la transcription, la condensation de la chromatine et la
ségrégation chromosomique (182).
Les changements topologiques de l'ADN nécessitent l'introduction de cassures double brin
transitoires produites par les topoisomérases II sans générer de dommages à l'ADN. Ce
mécanisme est décrit dans la figure 17.

Figure 17: Mécanisme d'action de la topoisomérase II

a:Réaction catalyzée par la TopIIβ: Mécanisme d'introduction de cassures double brin de l'ADN par la TopII.
b: La topoisomérase intéragit avec les deux brins d’ADN, générant ainsi des cassures transitoires double brin de
l’ADN et permettant d’exercer ses fonctions notamment dans la réplication et la transcription des gènes (183).

La Top II interagit avec les deux brins d'ADN afin de générer des coupures. Elle introduit une
cassure double brin de l'ADN en interagissant d'abord avec le brin d'ADN nommé segment G
puis l'autre brin appelé segment T.

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65
En présence de Mg2+, l'enzyme clive l'ADN sur 4 paires de base en formant un complexe
ADN-Top II lié de manière covalente appelé complexe de clivage. L'hydrolyse de deux
molécules d'ATP permet le passage du segment T au travers de la coupure puis réassemble
l'ADN clivé à l'aide d'une ligase (183–185).
Les anthracyclines inhibent la topoisomérase II en stabilisant le complexe de clivage par
formation de liaisons hydrogènes de l'enzyme qui ne peut alors plus assurer ses fonctions ce
qui conduit à l'induction de dommages à l'ADN (186).
Il existe deux isoformes de la topoisomérase II: la TopIIα exprimée dans les cellules
prolifératrices et impliquée dans la réplication de l'ADN et la ségrégation chromosomique et
la TopIIβ impliquée dans la transcription et la réparation des cassures de l'ADN (187).
Il est à noter que certains types de cellules cancéreuses surexpriment la TopIIα. Le ciblage de
celle-ci par les anthracyclines permet ainsi de diminuer la prolifération des cellules
cancéreuses et la croissance tumorale. Néanmoins, les anthracyclines inhibent également la
TopIIβ, exprimée dans le coeur et participeraient ainsi à leurs effets cardiotoxiques.

4-1-3 Formation de radicaux libres

La formation de radicaux libres et par conséquent la génération d'un stress oxydant est d'une
importance particulière dans l'induction d'une cardiotoxicité induite par les anthracyclines.
Néanmoins, elle joue un rôle secondaire dans ses effets antitumoraux (92). La production de
radicaux libres et la génération d'un stress oxydant cardiotoxique induite par la dox sera
détaillée dans la partie 4-2-1.

4-2 Mécanismes moléculaires de la cardiotoxicité induite par la

doxorubicine

Les mécanismes d’action de la doxorubicine sont associés à l’intercalation dans l’ADN, la

génération d’un stress oxydant et l’inhibition de la topoisomérase II. L’induction de ces
mécanismes par la dox est à l’origine de l’activité antitumorale de la dox qui conduit à
l’apoptose des cellules cancéreuses.
Cependant, l’induction de ces mêmes mécanismes est également à l’origine des atteintes des
cardiomyocytes et de leurs voies de signalisation, conduisant à un remodelage cardiaque
important (cf. Figure 18).

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66
 Figure 18: Vue d'ensemble des voies de signalisation altérées dans la cardiotoxicité induite par la dox
La couleur verte indique une augmentation, la couleur rouge une diminution causée par la dox. La doxorubicine
induit l’altération d’une multitude de voies de signalisation dans le cœur dont les voies de signalisation
impliquées dans la synthèse de la MEC, la signalisation calcique, les signalisations mitochondriales ainsi que les
voies de mort cellulaire.A, anthracycline; CK, creatine kinase; Cr, creatine; Cyt c, cytochrome c; MLC, myosin
light chains 1 and 2; MMPs, metalloproteinases; PCr, phosphocreatine; RyR, ryanodine receptor; SERCA, sarco-
/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; SR, sarco-/endoplasmic reticulum; ROS, reactive oxygen species; TOP2,
topoisomerase II; VIM, vimentin; UBI, ubiquitin (147).

Parmi ces mécanismes de cardiotoxicité des anthracyclines, on retrouve l’intercalation dans

l’ADN (développée dans la partie 3-1-1) qui inhibe la synthèse d’ADN et d’ARN et induit des
dommages à l’ADN (188,189).

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67
 4-2-1 Induction d’un stress oxydant
Le mécanisme de cardiotoxicité induite par la dox le plus largement étudié est la génération
d’un stress oxydant. En effet, la doxorubicine produit des radicaux libres et plus
particulièrement des espèces réactives de l’oxygène (ROS) via différents mécanismes
(cf.Figure 19) (190,191).
La doxorubicine peut être réduite en un dérivé semi-quinone radicalaire par les flavoprotéines
(telles que la NADH déshydrogénase ou la NADPH réductase mitochondriale) ou par la
libération d’un électron suite à la liaison de la dox à l’ADN. Ce dérivé peut alors subir une
deuxième réduction pour former une hydroquinone ou bien pour revenir à sa forme quinone
grâce à une réaction d’oxydation catalysée par une NAD(P)H oxydase. Cette réaction aboutit
à la production de radicaux superoxydes (O2•-). La dismutation du O2•- conduit à la formation
du peroxyde d’hydrogène (H2O2). Cette réaction peut être catalysée par la superoxyde
dismutase (SOD) ou peut se produire de façon spontanée (147). Le peroxyde d’hydrogène est
une molécule stable qui peut être éliminé par la catalase ou la glutathione peroxydase.
Cependant, l’ion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène peuvent générer des radicaux
hydroxyles, très réactifs et très toxiques par la réaction d’Haber-Weiss. Cette réaction, lente,
peut être catalysée par certains métaux et plus particulièrement le fer (192).
Le deuxième mécanisme d’induction de stress oxydant implique la formation de complexes
Dox-Fer. En effet, le complexe Dox-Fe3+ peut être réduit notamment par la NADH
cytochrome P450 réductase en Dox-Fe2+ qui peut réagir avec l’oxygène et former du O2•-. Sa
dismutation entraîne la production d’H2O2 qui formera des radicaux hydroxyles par la
réaction d’Haber-Weiss (193).

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 Figure 19: Voies d'induction du stress oxydant par la doxorubicine
Fe, fer; Fp, flavoprotéine; GSH, glutathion réduite; GSSG, glutathion oxydée; H2O2, peroxyde d’hydrogène;
NAD(P), nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate); •O2−, radical superoxyde ; •OH, radical hydroxyle;
SOD, superoxyde dismutase (147).

La doxorubicine peut également altérer le métabolisme du fer et ses protéines. La dox inactive
les protéines IRP1 et 2 (Iron regulating protein) et augmente in vivo la synthèse de ferritine
(protéine permettant le stockage du fer) (117,194). L’augmentation de la synthèse en ferritine
serait ainsi un mécanisme de défense limitant l’accumulation de fer qui peut être délétère
(195).
En effet, des études in vitro et in vivo ont montré que l’accumulation de fer potentialise la
cardiotoxicité induite par la dox (196,197). Les patients atteints de cardiomyopathie induite
par la dox ont également un taux de fer mitochondrial élevé et participerait à la voie
apoptotique mitochondriale dépendante des ROS (198). Une autre étude clinique a également
montré que les patients pédiatriques porteurs d’une mutation sur le gène HFE mis en cause
dans l’hématochromatose (pathologie caractérisée par une surcharge de fer dans l’organisme)
sont plus sensibles à la doxorubicine (199). Ces observations ont été consolidées par
l’utilisation du dexrazoxane, chélateur de fer, et seul agent cardioprotecteur utilisé en clinique.
Néanmoins, l’hypothèse d’accumulation du fer a été infirmée par une étude récente qui
montre que l’accumulation de fer ne conduisait pas à une cardiotoxicité plus sévère (200).

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69
De plus, les effets cardioprotecteurs du dexrazoxane ne peuvent être attribués uniquement à la
chélation du fer. En effet, le dexrazoxane dégrade également la TopII β et possède des
propriétés antioxydantes.
La doxorubicine peut également produire via une production importante de ROS et de
monoxyde d’azote (NO) des espèces réactives de l’azote (RNS) et plus particulièrement le
peroxynitrite (ONOO-) (201).
La production de ces radicaux libres entraîne l’oxydation de divers types de macromolécules
dont les lipides, les protéines, les acides nucléiques et altère ainsi la fonction de tous les
constituants cellulaires situés à proximité des lieux de leur formation et notamment du noyau,
des mitochondries et du réticulum sarcoplasmique.
De plus, quelques études récentes montrent que le cœur est d’autant plus vulnérable que la
dox diminue les défenses enzymatiques antioxydantes et notamment diminue l’expression de
la SOD, de la glutathion peroxydase et de la catalase (202,203). Néanmoins, une étude
antérieure n’a observé aucune modification de l’expression ni de l’activité de la catalase et de
la glutathion peroxydase après un traitement à la doxorubicine (204). La variabilité
importante des modèles et des protocoles utilisés pour l’étude de la cardiotoxicité induite par
la dox ne permet pas d’établir une conclusion définitive sur l’altération des défenses
antioxydantes du cœur par la dox.

4-2-2 Inhibition de la topoisomérase II

Bien que les atteintes des cardiomyocytes par la production de ROS aient été clairement
définies, l’ancien paradigme identifiant le stress oxydant en cause unique de la cardiotoxicité
induite par la dox est aujourd’hui débattu. L’échec de certains antioxydants ayant même des
effets délétères sur la cardiotoxicité et/ou sur l’ efficacité antitumorale dans plusieurs essais
cliniques (cf. partie 3-2-4) a notamment permis l’émergence d’hypothèses alternatives.
Parmi ces voies alternatives, une étude récente a montré l’implication de la TopII β dans la
cardiotoxicité induite par la dox. En effet, des souris transgéniques KO TopII β∆/∆ traitées à la
dox à 25mg/kg (5mg/kg, injections en intrapéritonéal (ip), une fois par semaine, pendant 5
semaines) ne développent pas de cardiotoxicité (205). Ces souris étaient notamment protégées
des dysfonctions mitochondriales, de la phosphorylation oxydative ainsi que des cassures
double brin de l’ADN suggérant que la TopII β est le premier médiateur de la cardiotoxicité
induite par la dox (206).
Ces résultats ont ainsi permis l’élaboration d’un nouveau paradigme identifiant la TopII β
comme premier médiateur de la cardiotoxicité induite par la Dox (cf.Figure 20).

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70
De plus, Lyu et al ont démontré que le dexrazoxane changeait la conformation des TopII (en
conformation « closed-clamp ») en se liant directement sur les sites de liaison à l’ATP. Il
évite ainsi la liaison de la dox sur les Top II (161) (cf. Figure 20).

Figure 20: Mécanismes de cardiotoxicité induite par la dox

La doxorubicine perturbe le cycle catalytique de la TopII et induit ainsi des dommages à l’ADN. Ceci entraîne
des changements dans le transcriptome qui conduisent aux altérations mitochondriales et à la génération d’un
stress oxydant. Le dexrazoxane, en se liant à la TopII, permet de prévenir la liaison de la doxorubicine sur celle-
ci. A : anthracycline D : Dexrazoxane (206).

De plus, l’autre mécanisme de cardioprotection du dexrazoxane, proposé par ces mêmes

auteurs, est la fixation du dexrazoxane sur le complexe ADN-TopII β et la stabilisation de la
conformation « closed-clamp » conduisant à la dégradation protéasomal de la Top II β (207).
Une étude a également montré que deux inhibiteurs catalytiques de la Top II, le sobuzoxane et
le merbarone ainsi que le dexrazoxane protègent les cardiomyocytes des effets toxiques de la
dox et de la daunorubicine sans altérer l'effet antiprolifératif de ces drogues notamment sur
une lignée cancéreuse HL-60 (leucémie) (208). Le sobuzoxane est un analogue du
dexrazoxane, inhibiteur catalytique de la TopII, qui n'induit pas de cassure double brin de
l'ADN. Il est notamment autorisé au Japon dans le traitement de lymphome et de leucémie
(209).
Il a également des effets protecteurs sur la toxicité cardiaque et rénale de la dox (7,5 mg/kg)
chez des souris portant une xénogreffe de cellules cancéreuses du colon (209,210).

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71
L'incubation concomittante de dox et de sobuzoxane provoque également l'arrêt de la mitose
des cellules cancéreuses mammaires (MDA-MB 435) (211).
De plus, le sobuzoxane et le merbarone ne peuvent pas chélater le fer ce qui démontre que la
chélation de fer ne serait pas un facteur important pour l'efficacité de la cardioprotection.
Cependant, le dexrazoxane et ses analogues ne sont pas spécifiques de la topoisomérase II β.
Ils diminuent également l’expression de la topoisomérase II α, cible antitumorale de la
doxorubicine dans certains types de cellules cancéreuses (212).
Le développement de nouvelles molécules ciblant uniquement la Top II α pourrait ainsi être
aussi efficace que la doxorubicine sans induire d’effets cardiotoxiques. Les patients
surexprimant la TopII β pourraient également être plus susceptibles de développer une
cardiotoxicité. L’utilisation de la TopII β en biomarqueur est en cours d’investigation (Yeh et
al, Cancer and the Heart, 2014 MD Anderson Cancer Center, Texas, USA).
En effet, le HU-331 est un inhibiteur catalytique spécifique de la Top II α qui diminue la
formation des liaisons ADN-TopII α et inhibe sa fonction ATPase sans induire de cassures
double brin de l'ADN (213–215). De plus, des études cellulaires ont montré son efficacité
antitumorale sur plusieurs lignées cancéreuses et notamment sur celles de lymphome et de
leucémie. Ses mécanismes d'action antitumorale sont néanmoins méconnus: il n'induit pas la
mort des cellules cancéreuses via l'apoptose, l'activation de caspase, l'arrêt du cycle cellulaire
ou l'induction de dommages à l'ADN (215). En revanche, une étude comparative entre le HU-
331 et la dox sur des modèles murins portant des xénogreffes de tumeurs montre que le HU-
331 a une action antitumorale plus efficace que la dox tout en étant moins cardiotoxique
(216). Ainsi, le HU-331 pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique de certains cancers.
Cependant, d'autres études sont nécessaires afin de déterminer ses mécanismes d'action
antitumorale.

4-2-3 Altérations des mitochondries et du métabolisme énergétique

Les mitochondries, qui représentent 40% du volume du cardiomyocyte, sont la source la plus
importante de ROS en conditions physiopathologiques (217). Ils sont donc une des cibles de
la doxorubicine. En effet, la dox possède une forte affinité pour la cardiolipine, un
phospholipide de la membrane interne mitochondriale.
La dox est donc fortement concentrée dans la mitochondrie et plus particulièrement au niveau
des protéines associées à la cardiolipine dont la NADH déshydrogénase et le complexe I de la
chaîne respiratoire mitochondriale (218).

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72
Les complexes III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale sont également altérés par la
dox ce qui conduit à la réduction du gradient électrochimique de protons et donc à une
diminution de la synthèse d’ATP par l’ATP synthase (219–221). La dox est ensuite réduite en
un radical semiquinone et génère un stress oxydant par les mécanismes décrits précédemment.
Les radicaux libres générés par la dox induisent l'oxydation de lipides, de protéines et des
molécules de la signalisation énergétique.
Une diminution du potentiel membranaire mitochondrial a également été décrit (222).
L'ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (MPT) par la dox induit la
perte de capacité de charge en calcium de la mitochondrie et peut ainsi initier l'induction de la
mort cellulaire (223,224). La génération d'un stress oxydant, l'accumulation de calcium ainsi
que la dépolarisation irréversible des mitochondries conduisent à l'augmentation de la
perméabilité de la membrane interne des mitochondries menant ainsi à l'ouverture non
sélective de pores et le passage de molécules (inférieures à 1,5 kDa) (225). L'ouverture du
MPT cause également un gonflement et des dommages structuraux des mitochondries et peut
déclencher la libération de protéines pro-apoptotiques telles que le cytochrome c (226,227).
La dox peut également induire des dommages au niveau de l'ADN mitochondrial par
formation d'adduits (228–230). Une étude récente a notamment montré que les souris
invalidées pour le gène mitochondrial de la topoisomérase I (Top1mt) développaient une
cardiotoxicité fatale après injection de dox. La Top1mt serait ainsi un nouveau facteur
limitant de la cardiotoxicité induite par la dox (231). L'oxydation de l'ADN mitochondrial
entraîne une dysfonction de la chaîne respiratoire qui serait ainsi incapable de répondre aux
besoins énergétiques de la cellule et de produire des électrons. Ceci cause une augmentation
des ROS et contribue à la prolongation des altérations du métabolisme énergétique (232,233)
(cf. Figure 21).

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 Figure 21: Altérations métaboliques induites par la doxorubicine
La dox induit une altération métabolique cardiaque à différent niveaux. En effet, la dox induit une perturbation
de la phosphorylation oxydative qui inclut l’inhibition de l’activité du Complexe I de la chaîne respiratoire ainsi
que d’autres protéines impliquées dans les voies métaboliques. L’activité de l’AMPK est également inhibée ce
qui a pour conséquence une diminution de la β-oxydation. La diminution de l’expression de l’AMPK influence
de manière négative les transporteurs de glucose et inhibe ainsi une voie de compensation qui stimule la capture
du glucose qui suit la perturbation de la phosphorylation oxydative. DOX, doxorubicine; AMPK: 5'-AMP-
activated protein kinase; OXPHOS: phosphorylation oxydative; GLUT1: glucose transporter 1; NADH:
nicotinamide adenine dinucleotide; CK: créatine kinase; PCr: phosphocréatine; Cr, créatine; ATP, adénosine
triphosphate; ADP, adénosine diphosphate (233).

En effet, une altération du métabolisme énergétique après traitement à la dox conduisant à une
baisse des réserves énergétiques du cœur est observée. Cette altération est associée à la
diminution de la production d'ATP par la mitochondrie et notamment à l'altération par la dox
des enzymes créatine kinase (CK) dont la créatine kinase mitochondriale (MtCK) et l'AMPK
(5'-AMP activated protein kinase) (234). L'inhibition de l'AMPK par la dox a pour
conséquence une inhibition de l'import mitochondrial et de la β-oxydation des acides gras. La
dox régule de manière négative la glycolyse par l’inhibition de la phosphofructokinase,
enzyme clé de cette voie énergétique.
De plus, l'altération de l'AMPK réduit également les capacités compensatrices des cellules à
augmenter la glycolyse et la prise de glucose (235,236). Il a été récemment montré que
l'inhibition de l'AMPK était liée à une dysfonction de SIRT1 (Sirtuine 1) et à l'accumulation
de p53 (237).

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SIRT1 élimine également la cardiotoxicité induite par la dox en régulant le stress oxydant et
les voies p38MAPK (238).
De plus, les métabolites de la dox ont des effets délétères sur la fonction mitochondriale
(129). Une accumulation du fer plus importante dans les mitochondries a également été mise
en évidence (198).
Enfin, la dynamique mitochondriale ainsi que la biogénèse mitochondriale sont également
altérées par la dox. L'expression de PGC1α (Peroxisome proliferator activated receptor) et de
ses effecteurs NFR1 (Nuclear respiratory factor 1) et TFAM (Transcription factor A
mitochondrial) est diminuée (239). L'inhibition de la fission mitochondriale et notamment
l'utilisation du mdivi-1 (Mitochondrial division inhibitor) protège des effets cardiotoxiques
dans un modèle de cœur perfusé avec de la dox chez le rat (240).

4-2-4 Modulation des voies de mort induite par la doxorubicine

L'induction d'un stress oxydant, de dysfonctions mitochondriales, de l'altération de
l'homéostasie calcique et la signalisation β-adrénergique ainsi que l'inhibition d'un certain
nombres de gènes cardiaques contribuent à l'activation de voies de mort des cardiomyocytes.
Différentes voies de mort cellulaire peuvent alors être activées par la doxorubicine:
l'apoptose, la nécrose et l'autophagie.

• Apoptose
L'apoptose est un processus de mort cellulaire programmée provoquant des changements
morphologiques de la cellule en réponse à un signal dont la fragmentation de l'ADN, la
condensation de la chromatine, la convolution des membranes cytoplasmiques et nucléaires et
la condensation du cytoplasme. Ces changements morphologiques conduisent à la formation
de corps apoptotiques éliminés par phagocytose.
Le mécanisme d'apoptose est gouverné par deux voies principales d'activation: la voie
extrinsèque et la voie intrinsèque (241) (cf. Figure 22).

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75
 Figure 22: Voie intrinsèque et extrinsèque de l'apoptose
Deux voies principales d’activation sont impliquées dans l’apoptose: la voie extrinsèque et la voie intrinsèque.
Les lymphocytes T cytoxiques déclenchent la voie apoptotique extrinsèque par la liaison des ligands Fas à leurs
récepteurs et induisent ainsi l’activation de la caspase-8 puis l’activation de protéines effectrices menant à la
mort cellulaire. La voie intrinsèque est déclenchée à la suite de signaux internes de stress de la cellule.Ces
signaux induisent l’activation de protéines pro-apoptotiques et conduisent à la libération du cytochrome c
menant ainsi à l’activation de la caspase 9 et de la caspase 3. L’activation de ces caspases conduit ainsi au
clivage du substrat et à la mort cellulaire (242).

Dans la voie extrinsèque, la liaison des ligands FasL, TNF-α et TRAIL à leurs récepteurs de
mort activés par le contact membrane à membrane de lymphocytes T cytotoxiques induit le
recrutement de la protéine adaptatrice FADD (Fas-Associated Death Domain protein) qui
induit l'activation de la caspase 8 (protéases) ainsi que ses effecteurs dont la caspase 3.
La voie intrinsèque est induite par des signaux internes de la cellule, notamment par
l'activation de p53 lors de dommages importants à l'ADN, par la formation de MPT et par la
libération du cytochrome c par les mitochondries. Ce processus est régulé par les membres de
la famille Bcl-2 qui inclut 3 groupes: des protéines anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-XL, et Mcl-
1), des protéines pro-apoptotiques (Bax, Bak) et les protéines à BH3 (Bad, Bid, Nix et BNip3)
qui induisent l'apoptose via l'inhibition des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 ou l'activation
des protéines proapoptotiques Bax et Bak (121,243). L'activation des protéines BH3 induit la
translocation de Bax/Bak du cytosol à la membrane externe de la mitochondrie ce qui a pour
conséquence l'augmentation de la perméabilité de la membrane interne de la mitochondire et
la libération de protéines telles que le cytochrome c dans le cytoplasme.

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Le cytochrome c forme ensuite un complexe avec les Apaf-1 (Adaptor protein apoptosis
protease activator), le dATP et la caspase 9, appelé apoptosome, conduisant à l'activation de
la caspase 9. Les voies extrinsèque et intrinsèque conduisent à l'activation de caspases
effectrices (caspase 3,6 et 7) responsables du clivage de plusieurs molécules qui se traduit par
des changements morphologiques des cellules (121).

Altération de la voie intrinsèque par la doxorubicine:

La doxorubicine induit un stress oxydant et une altération de l'homéostasie du calcium
cytosolique (cf. partie 5-2-6) ce qui a pour conséquence l'augmentation de la concentration en
calcium dans la mitochondrie. L'accumulation de calcium dans la mitochondrie conduit à la
formation de MPT responsables de la perte du potentiel mitochondrial, au gonflement de la
mitochondrie et à la rupture de la membrane externe puis à la libération du cytochrome c et de
l'apoptosis inducing factor (AIF) dans le cytoplasme (244–246). L'augmentation de
l'expression et de l'activité de p53 a également été mise en cause dans l'apoptose induite par la
dox (247–249). De nombreuses études ont notamment montré l'effet bénéfique de p53 sur la
survie des cardiomyocytes traités à la dox dans différents modèles in vitro et in vivo (modèle
murin p53 knock out) (249,250).
D'autres études ont montré l'implication de facteur de transcription GATA-4 dans la
régulation de l'apoptose induite par la dox notamment par l'activation du gène anti-
apoptotique Bcl-XL (251,252).

Altération de la voie extrinsèque induite par la dox:

Les cardiomyocytes sont généralement résistant à l'induction de l'apoptose via Fas.
Cependant, plusieurs études ont montré que l'apoptose des cardiomyocytes induite par la dox
peut se produire via la voie Fas (253). En effet, la voie calcineurine et plus particulièrement
NFAT-4 (Nuclear Factor of Activated T cells) ainsi que le facteur de transcription NF-κB
activé par les ROS conduisent à la surexpression de Fas et à l'activation des gènes
apoptotiques (FasL, Fas, cMyc et p53) (254,255).
Le récepteur TLR-2 (Toll like receptor-2) joue également un rôle dans la voie extrinsèque de
l'apoptose (256,257). En effet, la doxorubicine stimule ces récepteurs (258). L'invalidation de
ceux-ci permet notamment une diminution des effets cardiotoxiques de la doxorubicine via
notamment l'inhibition de NFκB et la diminution de la production de cytokines pro-
inflammatoires (257).

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 • Nécrose
La nécrose est un processus de mort cellulaire qui se traduit par la perte de l'intégrité
membranaire et par le gonflement des organites. Cette perte de contenu cellulaire est associée
à une réponse inflammatoire dans le tissu environnant (259).
De nombreuses études ont observé une augmentation de l'expression cardiaque de cytokines
proinflammatoires, de l'infiltration de cellules inflammatoires et d'une nécrose dans les cœurs
des souris traitées à la dox (260–262).
La dox induit un stress oxydant, des dommages à l'ADN mitochondrial, une altération de la
respiration mitochondriale et des dysfonctions mitochondriales. Tout ces mécanismes
contribue à la nécrose (260,263–265).
La nécrose induite par la dox serait ainsi causée par l'induction d'un stress oxydant et
l'accumulation de calcium dans les mitochondries (232).
De plus, la dégradation de la titine, protéine du myofilament impliquée dans le contrôle de
l’assemblage des protéines sarcomériques et qui régule l’élasticité du sarcomère, est
augmentée de façon précoce après traitement à la dox par l'activation des calpaines (enzymes
responsables de la protéolyse calcium-dépendante). Ceci pourrait représenter une étape
importante qui mènerait à l'accélération de la dégradation des myofilaments et à la nécrose
induite par la dox (266).

• Stress du réticulum endoplasmique

Le protéasome permet de dégrader les protéines mal repliées, dénaturées ou obsolètes de
manière ciblée. Le protéasome joue également un rôle dans la cardiotoxicité induite par la
dox. Cependant, son rôle n’est pas clairement défini. En effet, deux études ont montré que le
traitement à la dox induit l'activation du système UPS (Ubiquitin proteasome system) tandis
qu'une autre étude montre que le traitement à la dox induit une inhibition de l'activité
protéasomale associée à une diminution de la dégradation des protéines pro-apoptotiques
telles que ASK1 et p53 (267–269). L’altération de ce mécanisme entraîne une dysfonction des
protéines menant à un déséquilibre des voies de synthèse protéiques qui a pour conséquence
l’induction d’un stress du réticulum endoplasmique (RE) (270).
Le stress RE, réponse induite par une perturbation du fonctionnement du RE est déclenché par
différents types de stress comme une perturbation de l'homéostasie calcique, un défaut de la
traduction ou un stress oxydant.

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Ce stress se traduit par l'accumulation de protéines mal repliées et par la mise en place de la
réponse UPR (Unfolded Protein Response) et peut ainsi mener à des mécanismes de mort
cellulaire et notamment l’autophagie (271). A ce titre, l'implication du stress RE dans la
cardiotoxicité induite par la dox a été étudiée. Il a été ainsi montré que la dox induit un stress
RE in vitro dans des cardiomyocytes de rats nouveau-nés et dans des H9c2 et que son
inhibition protège les cellules de la cardiotoxicité induite par la dox (272,273). Toutefois,
aucune étude in vivo n'a été réalisée pour confirmer ces résultats. L’induction d’un stress RE
ne pouvant être endigué peut également mener à l’apoptose via l’activation des calpaïnes par
un relargage excessif de calcium du RS qui peuvent à leur tour activer la caspase 12. Une
étude a ainsi montré que l’activation de la caspase 12 est associée à l’induction de l’apoptose
induite par la dox chez des rats mâles et femelles (274).

• Autophagie
L’autophagie est un processus de dégradation d'une partie du cytoplasme de la cellule par ses
propres lysosomes. L'autophagie joue un rôle important dans la croissance cellulaire, la
biogénèse des organites et le contrôle de la balance synthèse/dégradation des protéines. Elle
peut se produire aussi bien dans des situations pathologiques (mort cellulaire, remodelage
tissulaire) que dans des conditions physiologiques. L'autophagie conduit à la dégradation du
cargo (ie. protéines cytosoliques et organites) par le lysosome. Ce processus se déroule en 3
étapes: 1/la nucléation de la membrane, 2/ l'autophagosome délimité par une double couche
lipidique se forme et englobe une partie du cytosol et son contenu et 3/ l'autophagosome
fusionne avec les endolysosomes pour former l'autolysosome dans lequel le contenu
vésiculaire sera détruit (cf. Figure 23) (275).

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 Figure 23: Etapes de l'autophagie
L’autophagie se déroule en trois étapes : 1/ la nucléation de la membrane, 2/ la formation de l’autophagosome
qui englobe une partie du cytosol et de son contenu et 3/ l’autophagosome fusionne avec le lysosome pour
former l’autolysosome dans lequel le contenu vésiculaire sera détruit (275)

In vitro, la majorité des études montre une activation de l'autophagie par la doxorubicine
(268,276–279).
Cependant, d'autres études ont montré l'effet opposé (280,281). Cette différence de résultats
semblerait être due aux modèles utilisés. En effet, l'autophagie est activée par la dox dans des
modèles de cultures primaires de cardiomyocytes de rats (néonatales et adultes) tandis qu'elle
est inhibée par la dox dans des modèles de cultures primaires de cardiomyocytes de souris
nouveau-nés et dans la lignée cellulaire de myoblastes H9c2. Ces différences ont également
été observées in vivo. Sur les 4 études in vivo concernant l'implication de l'autophagie dans la
cardiotoxicité induite par la dox, 2 études ont montré une activation de l'autophagie par la dox
chez le rat (276,282) et 2 autres ont montré l'inverse dans des modèles murins (280,281). Les
études montrant une stimulation de l'autophagie par la dox associe cette activation à une
diminution de l'expression de Bcl-2 et du facteur de transcription GATA-4 (277). La
stimulation de l'autophagie par la dox dans ces conditions contribue ainsi aux dysfonctions
cellulaires et à l'apoptose.
De plus, l'activation de l'autophagie par la dox était prévenue par l'utilisation d'inhibiteurs de
l'autophagie et notamment le 3-méthyladénine (3-MA) et inversement l'inhibition de
l'autophagie par la dox était prévenue par l'utilisation d'activateurs de l'autophagie et
notamment la rapamycine. Le 3-MA et la rapamycine permettrait ainsi une protection contre
la cardiotoxicité induite par la dox respectivement dans un modèle de rats et de souris.

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Cette protection s'est traduite par une amélioration de la fonction cardiaque, une diminution
des altérations mitochondriales et de l'apoptose des cardiomyocytes et une augmentation
globale de la survie des animaux (276,281).
Le rôle de l'autophagie dans le développement de la cardiotoxicité n'est donc clairement pas
défini et diffère selon le modèle. En revanche, l'inversion des effets de la dox sur l'autophagie
est cardioprotectrice (283).
L'induction des différents processus de mort cellulaire joue donc un rôle important dans la
cardiotoxicité induite par la dox (cf. Figure 24).

Figure 24: Modulation des voies de mort cellulaire induite par la doxorubicine
La doxorubicine induit une production massive de ROS. Cette production conduit à un stress oxydant qui induit
l’activation des voies intrinsèque et extrinsèque de l’apoptose, de la nécrose, de l’autophagie et de la sénescence
des cardiomyocytes (121).

Néanmoins, des études sont encore nécessaires afin de comparer l'importance de chaque type
de mort cellulaire et de comprendre comment ces mécanismes intéragissent pendant le
développement de la cardiomyopathie.

4-2-5 Altération des cellules cardiaques progénitrices

Pendant la maturation post-natale du cœur, la prolifération des cardiomyocytes cesse (284).
Cependant, plusieurs études montrent maintenant que le cœur adulte serait capable de se
régénérer (285). Cette capacité de régénération proviendrait des cellules souches cardiaques
résidantes ou circulantes capables de réaliser une différenciation myocardique.

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Le renouvellement des cardiomyocytes est notamment de 1% par an à l’âge de 20 ans et de
0,3% par an à l’âge de 75 ans (286). Ces cellules progénitrices cardiaques jouent donc un rôle
essentiel dans la capacité de régénération du cœur mais également dans sa réponse à différents
stress. Ainsi, plusieurs études récentes montrent l'importance des cellules progénitrices
cardiaques dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine (287–289). En effet, une étude
sur des souris juvéniles traitées à la dox montre que ces souris possédaient moins de cellules
progénitrices cardiaques. De plus, la doxorubicine inhibait leur prolifération et leur
différentiation (287). Une autre étude a également montré une diminution de la population de
ces cellules chez des rats traités à la doxorubicine. L'exposition à la dox conduit à une
augmentation des dommages à l'ADN, de l'expression de la protéine p53 et de l'apoptose des
cellules progénitrices cardiaques. Toutefois, la progression de la cardiotoxicité induite par la
dox chez ces rats était inhibée et leur survie améliorée par l'injection de cellules cardiaques
progénitrices dans le myocarde (288). Ces observations ont été confirmées par des analyses
hystologiques et d'immunohistochimie chez 6 patients traités aux anthracyclines à des doses
situées entre 122 et 421 mg/m2 décédés des suites d'une insuffisance cardiaque congestive 1 à
5 ans après la fin de leurs traitements (289).
Dans cette étude, ils ont notamment mis en évidence que la plupart des cellules progénitrices
cardiaques étaient sénescentes. Ils ont également mis en évidence une augmentation du
dommage à l'ADN, un raccourcissement des télomères ainsi qu'une inhibition de la
différenciation et de la migration de ces cellules chez les patients traités aux anthracyclines.
La doxorubicine altère ainsi la capacité régénératrice du cœur. Cette altération peut persister
des années après la fin du traitement et peuvent ainsi expliquer le développement tardif de
cette cardiotoxicité. L'injection en thérapie cellulaire de cellules souches cardiaques ou
l'utilisation de médicaments restaurant les fonctions des cellules progénitrices cardiaques
peuvent représenter une nouvelle stratégie thérapeutique de la cardiotoxicité induite par la
dox. Néanmoins, cette technique est difficilement réalisable à l’échelle clinique. Il a
notamment été montré par De Angelis et al, que l'activation de la SIRT1 permettait le
rétablissement des fonctions de ces cellules. L'activation de la SIRT1 in vitro diminue
significativement le stress oxydant et l'apoptose des cellules progénitrices, et empêche leur
sénescence et l'arrêt de leur prolifération. Ces mêmes résultats ont été observés in vivo dans
un modèle de rats traités à la doxorubicine et au resveratrol, antioxydant et activateur de
SIRT1 (290).

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Enfin, une autre étude a montré que l'Iloprost, analogue de la prostacycline PGI2, permettait
de prévenir la génération d'un stress oxydant et l'apoptose de cellules progénitrices cardiaques
humaines traitées à la dox (291).
L'altération des cellules progénitrices cardiaques induite par la dox conduit à une limitation
des capacités régénératrices à long terme du cœur et fait ainsi partie des mécanismes
multifactoriels d'induction de la cardiotoxicité par la dox.

Le dogme initial présente ainsi la génération de ROS comme facteur principal

déclenchant les altérations mitochondriales et les voies de mort cellulaire dans les
cardiomyocytes. Ces dernières années, un nouveau dogme mettant en perspective cette
ancienne hypothèse a été développé par l’équipe du Dr Yeh. Il a notamment montré que
la topoisomérase II β est un médiateur clé des altérations mitochondriales, de l’ADN et
du stress oxydant induite par la dox. Cependant, les atérations, induites par la dox, des
voies de signalisation mises en jeu dans le cœur sont relativement peu étudiées. L’étude
bibliographique des altérations de la signalisation de l’AMPcyclique, de la signalisation
calcique et de la signalisation des petites protéines G, voies impliquées dans les
pathologies cardiovasculaires, feront l’objet des parties 3-2-6 et 3-2-7.

4-2-6 Altérations de la signalisation de l'AMPcyclique et de la signalisation calcique

• Altération de la signalisation β-adrénergique

Les patients développant une cardiotoxicité chronique aux anthracyclines ont un tonus
sympathique élevé et une dysfonction diastolique précoce, suivie plus tardivement d’une
dysfonction systolique VG globale (292). En effet, l'expression des récepteurs β1 et des
protéines Gs ainsi que l'activité cyclasique (AC 5 et 6) sont diminuées dans des modèles de
rats traités à la dox pendant 2 semaines ou chez le lapin pendant 16 semaines (293–295).
Cependant, la dox altère de façon différente les sous-types des récepteurs β-adrénergiques.
Alors que l'expression des β1-ARs est diminuée, l'expression des β3-ARs est augmentée et
l'expression des β2-ARs est inchangée dans différents modèles animaux (rats traités à la dox
pendant 2 ou 4 semaines ou lapins pendant 16 semaines) (293,296). Bien que l'expression des
β2-ARs soit inchangée, la dox induit une surexpression de la protéine Gi qui peut alors activer
la voie anti-apoptotique Gi/PI3K/Akt ce qui indique un couplage préférentiel du récepteur β2
avec la protéine Gi (296).

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Néanmoins, la dox conduit à la diminution de l'expression d'Akt ainsi que de la protéine
GSK3, protéine effectrice d'Akt, favorisant ainsi l'apoptose (297,298).
Ceci suggère que la voie β2-AR joue un rôle cardioprotecteur tandis que la voie β1-AR semble
être associée au développement de la cardiotoxicité aigüe ou subchronique (2-4 semaines) de
la dox.
Une étude montre notamment que l'activation différentielle des isoformes de MAPK est
associée aux différents effets des sous-types des récepteurs β-ARs induit par la dox in vivo
(299).
La voie β3-AR, quant à elle, est également altérée après traitement à la dox. Cette altération
est notamment corrélée à une surexpression de la protéine Gi et conduit à l'altération de la
voie du NO. Ainsi, la dox induit un découplage de NOS, et plus particulièrement de iNOS et
eNOS, qui conduit à la production d’espèces réactives de l’azote (RNS) et à une altération de
la voie du NO avec diminution de la concentration en GMPc et une augmentation de
l'apoptose (300–302). Ces mécanismes d'altération des voies β-ARs sont résumés dans la
figure suivante.

Figure 25: Altération des signalisations β-adrénergiques induite par la doxorubicine

La doxorubicine induit un remodelage de la signalisation β-adrénergique. Une inhibition de la voie β1 est
observée avec une diminution de l’expression de ces récepteurs, de Gs ainsi qu’une diminution de l’activité de
l’AC et un découplage AC/Gs. La voie β2/Gi devient ainsi préférentielle et favorise l’apoptose des
cardiomyocytes. Le récepteur β3 est surexprimé. La dox induit également une augmentation d’iNOS favorisant
le stress oxydant et l’apoptose (N.Merlet, thèse 2011) AA : acide arachidonique ; AC : adénylyl cyclase ; Akt :
protéine Akt ; AMPc : adénosine monophosphate cyclique ; ATP : adénosine triphosphate ; eNOS : synthase de
monoxyde d’azote endothéliale ; GC : guanylyl cyclase ; Gi : protéine G inhibitrice ; β-AR : récepteur β-
adrénergique : CaMKII : protéine kinase calcium/calmoduline dépendante; GMPc : guanosine monophosphate
cyclique ; GRK2 : kinase de type 2 des récepteurs couplés aux protéines G ; Gs : protéine G stimulatrice ; GSK3
: ; glycogène synthase kinase-3 ; GTP : guanosine triphosphate ; NO : monoxyde d’azote ; PDE4 :
phosphodiesterase de type 4 ; PKA : protéine kinase A ; PKG : protéine kinase G ; PI3K : Phosphoinositol-3-
kinase ; PLA2c : phospholipase 2 cytosolique ; PP : phosphatases.

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84
De plus, l'inhibition de la PDE-5, enzyme dégradant le GMPc produit après stimulation des
β3-ARs, atténue les effets secondaires de la doxorubicine sur le cœur. Deux études ont
notamment montré que l'inhibition de la PDE-5 par le sildenafil permet de prévenir
l'apoptose, les dysfonctions mitochondriales, et l'intégrité myofibrillaire induite par la dox via
l'augmentation de l'activité de la PKG et des synthases du monoxyde d'azote (303,304). Ces
effets cardioprotecteurs du sildenafil s'accordent également avec une augmentation de la
sensibilité à la doxorubicine ainsi qu'à d'autres chimiothérapies de certains types de cancer
(305). Néanmoins, une étude clinique a montré que l'utilisation du sildenafil était associée à
une augmentation du risque de développement de mélanome chez l'homme (306).
Enfin, les β-bloquants et plus particulièrement le carvedilol possédant à la fois des capacités
α-adrénergiques et des propriétés antioxydantes sont aujourd'hui utilisés chez le patients
développant des effets secondaires cardiaques suite au traitement à la dox. Ceci est d'autant
plus intéressant que les β-bloquants peuvent également avoir des effets anticancéreux (307).

• Altération de l’homéostasie calcique

La dox peut induire une altération de l'homéostasie calcique conduisant à une dysfonction
diastolique et systolique. En effet, la doxorubicine induit une modification des concentrations
en calcium intracellulaire de façon dose et temps dépendants. Ainsi, dans les cardiomyocytes
ventriculaires de rats adultes, un traitement de dox de 1 à 5µM pendant 18 heures ou de 10µM
pendant 3h augmente la concentration en calcium systolique et diastolique et entraîne une
augmentation de la contraction. En revanche, cette même étude montre qu’un traitement de
10µM pendant plus de 6h conduit à une diminution de l’amplitude de la contraction mais la
concentration en calcium diastolique reste toujours augmentée (308). Dans les
cardiomyocytes ventriculaire de cobaye, le traitement aigüe à la doxorubicine ou au
doxorubicinol conduit à une diminution de l’amplitude des transitoires calciques et ralentit
ainsi la contraction et la relaxation, bien qu’ils aient un effet contraire sur les potentiels
d’action (PA) (133). Ces altérations dans la cinétique ont été attribuées au stress oxydant. En
effet, la génération d’un stress oxydant par la dox peut altérer les transitoires calciques
notamment en les ralentissant (309).

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85
De plus, la daunorubicine et son métabolite daunorubicinol peuvent lier la calséquestrine et
exercent une action biphasique sur le RyR : dans un premier temps ils se lient au RyR et
augmentent sa probabilité d’ouverture puis oxydent le RyR et diminuent ainsi fortement son
activité, bien que plusieurs études montrent que l’oxydation du RyR augmente son activité
(310–312).
La doxorubicine se lie également au RyR et à la calséquestrine (313). Dans plusieurs modèles
in vivo de cardiotoxicité aigüe et chronique de la dox, il a été observé une diminution de
l’expression du RyR tardivement (13 à 18 semaines) mais pas précocement (1 semaine) après
traitement à la dox, à une dose cumulée totale de 7,5 mg/kg chez des rats. En contradiction
avec les études portant sur la daunorubicine, une étude a montré que le traitement à la
doxorubicine sur cardiomyocytes ventriculaires isolés de rats induit une augmentation de la
probabilité d’ouverture du RyR médiée par la génération de ROS. Ceci qui résulte en une
augmentation de la concentration intracellulaire de calcium [Ca2+]i qui est également
impliquée dans la production de ROS (314). Ainsi, les éléments du couplage E-C dont le
RyR peuvent être modulés par les ROS (et vice versa) participant ainsi à l’amplification des
effets délétères de la dox (315).
Ces effets sur le RyR ont été attribués au métabolite de la dox, le doxorubicinol, puisqu’un
analogue de la doxorubicine qui ne peut être métabolisé en doxorubicinol ne produisait pas
ces effets (132,316). Ainsi, bien que le doxorubicinol ne puisse réagir avec l’oxygène
moléculaire et induire la production de ROS, il exerce ses effets cardiotoxiques en altérant
l’homéostasie calcique (131). Le doxorubicinol inhibe notamment le courant potassique
sortant IKS, responsable de la phase de repolarisation du potentiel d’action cardiaque ce qui se
traduit par un allongement de la durée du PA et donc un allongement de l’intervalle QT sur
l’ECG (133). De plus, le doxorubicinol altère le couplage excitation-contraction en
participant à la diminution d’expression des RyR et altère la relaxation cardiaque en inhibant
directement SERCA2a, isoforme majoritaire dans le cœur (132,317).
L’altération du couplage excitation-contraction par la dox implique également la CaMKII,
protéine participant au maintien de l’homéostasie calcique. En effet, Sag et al ont montré
qu’après 30 minutes de traitement à la dox sur cardiomyocytes isolés, l’augmentation en
[Ca2+]i en diastole et la production de ROS était associées à une augmentation de la fréquence
des « sparks calciques » (ou étincelle calcique provenant du RyR) et à une diminution de la
charge en calcium du RS ce qui a pour conséquence l’affaiblissement des transitoires
calciques (318).

Page
86
L’utilisation d’antioxydants n’a pas permis la prévention de ces effets. En revanche,
l’utilisation d’inhibiteur de la CaMKII et l’invalidation de la CaMKIIδ a permis l’atténuation
des effets de la dox sur les transitoires calciques (318). Ceci suggère ainsi que les altérations
de l’homéostasie calcique par la dox dépendent surtout de la CaMKII plutôt que du stress
oxydant.
La SERCA est également la cible de la doxorubicine et du doxorubicinol. En effet, ils
induisent la diminution de l’expression et de la fonction de recapture du calcium de SERCA
dans des modèles de cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture et dans des muscles
papillaires isolés (131,308,319). L’oxydation des groupements S-H peut notamment être
impliquée dans ces effets sur la SERCA. Cependant, la surexpression de la SERCA chez des
souris aggrave ces effets chroniques de la doxorubicine (20 mg/kg) (320). La diminution de
l’expression de la SERCA pourrait donc être un phénomène compensatoire.
L’expression de tous les acteurs de l’homéostasie calcique et notamment le PLB, la
SERCA2a, le NCX et le RyR2 est ainsi diminuée. En revanche, l’expression des LTCC est
inchangée après traitement à la dox (321). Une étude a ainsi montré que l’utilisation du
Fosinopril, un inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine, permettait d’atténuer la
diminution d’expression de SERCA et du PLB et de restaurer l’activité de SERCA dans le
ventricule gauche dans un modèle de rats traités à la dox (15mg/kg) (322).
Les altérations de l’homéostasie calcique par la dox concernent donc toutes les protéines
impliquées dans le couplage excitation-contraction ce qui a pour conséquence une altération
de la contraction et de la relaxation cardiaque (cf. Figure 26). Néanmoins, la grande majorité
des études dans ce domaine provient de modèles in vitro. Les mécanismes à long terme et le
rôle de la signalisation calcique dans le développement de la cardiotoxicité reste à être
caractériser.

Page
87
 Figure 26: Altération de l'homéostasie calcique par la dox
Sur la partie gauche de la figure est représenté un exemple du couplage excitation-contraction en conditions
physiologiques. A droite, la représentation symbolique résume les altérations induites par un traitement à la
doxorubicine du couplage excitation-contraction. On remarque une diminution de l’expression du récepteur à la
ryanodine RyR2, de la pompe SERCA2 ainsi qu’une diminution de la charge calcique du RS (N.Merlet, thèse
2011). ADP : adénosine diphosphate ; ATP : adénosine triphosphate ; Ca2+ : ions calcium; Ca2+ ,L: canal
calcique de type L ;NCX: échangeur sodium/calcium; PKA: protéine kinase A; PLB: phospholamban ; RyR2 :
récepteur à la ryanodine de type 2 ; SERCA2a : pompe calcique sarco-endoplasmique dépendante de l’hydrolyse
d’ATP, isoforme 2a ; Tn : troponine

4-2-7 Altérations des petites protéines G par la doxorubicine

A ce jour, la doxorubicine est connue pour altérer trois petites protéines G dont Ras et Rho de
la famille des petites protéines G monomériques Ras et Rac de la famille des petites protéines
G monomériques Rho. En réponse à divers stimuli extracellulaires, ces petites protéines G
sont activées par des facteurs d’échange GEF (Guanine nucleotide exchange factor) qui
permettent l’échange du GDP (conformation inactive) pour du GTP (conformation active).
Cet échange permet l’intéraction de ces petites protéines G avec divers effecteurs. Ils sont
ainsi impliqués dans de nombreux mécanismes cellulaires tels que la division, la migration et
la différenciation cellulaire (323). A ce titre, l’implication de ces petites protéines G a été
démontrée dans le développement tumoral mais également dans la résistance aux traitements
chimiothérapeutiques (Ras) et dans la cardiotoxicité de ces traitements (Rac et Rho).

Page
88
 • Altération de Ras induite par la dox
Les protéines Ras régulent la croissance cellulaire. Néanmoins, la mutation oncogénique des
gènes de la famille Ras dont H-Ras, K-Ras et N-Ras est observée dans de nombreux types de
cancers participant ainsi à plusieurs aspects du développement d’une tumeur maligne. Le
ciblage de Ras permettrait ainsi l’inhibition de la croissance, la survie ainsi que l’expansion
tumorale (324).
De plus, il a été montré que H-Ras induit la sénescence via l'activation des voies PI3K ou
MAPK impliquées dans l'induction des cassures de l'ADN et l'initiation de la réponse aux
dommages à l'ADN (325). L’oncogène H-Ras conduit à l’activation du programme de
sénescence associé à l’altération de la réplication et l’induction de cassures double brin de
l’ADN permettant d’inhiber l’initiation des lésions néoplasiques (326).
Dans une autre étude, la répression du mutant K-Ras par l’enzyme 10-23DNAzyme
permettait l’augmentation de la sensibilité à la doxorubicine et à l’irradiation dans des cellules
cancéreuses du colon (SW480) (327).
De plus, Wesierska-Gadek et al ont montré que la prévention de la farnesylation
(modification lipidique) de Ras permettait de potentialiser la cytotoxicité de la dox dans les
cellules tumorales sans atteindre les cellules quiescentes (328).
Enfin, dans une lignée de cancer de la prostate (DU-145) ainsi que dans une lignée de cellules
endothéliales (MDCK), H-Ras et R-Ras augmentent la résistance à la dox médiée par le SF
(Scatter factor), cytokine qui s’accumule au niveau de la tumeur et prévient l’apoptose et la
cytotoxicité des cellules cancéreuses, par l’activation de la voie PI3K/Akt/ NFκB (329).
L’activation de Ras semble ainsi contribuer à la croissance tumorale ainsi qu’à la résistance à
la dox. Le ciblage des cellules tumorales exprimant Ras activé notamment par le réovirus ou
herpes simplex virus de type II pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique et sont en
cours de développement (330,331).Cependant, à ce jour, il n’existe aucune étude portant sur
le rôle et les effets de la modulation de Ras sur la cardiotoxicité induite par la dox.

• Altération de Rho induite par la dox

La famille Rho compte une vingtaine de protéines dont les plus connues et les plus étudiées
sont Rho, Rac et cdc42. La forme active des petites GTPases stimule des protéines effectrices
dont plusieurs Ser/Thr kinases telles que ROCK (Rho kinase) ou PKN (Protéine kinase N)
pour RhoA et PAK (Sérine/ Thréonine kinase protéine) pour Rac et Cdc42.

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89
Les protéines Rho régulent l'organisation du cytosquelette et contrôlent la formation de fibres
de stress ancrées au niveau de la plaque d'adhésion. Elles peuvent également participer avec
les autres GTPases de la famille Ras à de nombreux processus cellulaires qui impliquent la
réorganisation du cytosquelette d’actine comme la sécrétion, l’endocytose, la phagocytose et
la présentation antigénique. Les protéines Rho régulent également la signalisation nucléaire et
la transcription de certains gènes. De plus, les protéines Rho pourraient jouer un rôle essentiel
dans la prolifération cellulaire et il a été montré qu'elles participaient à la transformation par
l'oncogène Ras (323,332).
Ainsi, Rho A, tout comme Ras, est impliquée dans la résistance à la doxorubicine notamment
dans une lignée cellulaire de cancer du colon (HT29). En effet, l'inhibition de Rho A,
pharmacologique (Simvastatin) et par siARN, conduit à l'activation de NFκB puis à
l'augmentation de l'expression et de l'activité de la NO synthase ce qui a pour conséquence
une augmentation de la cytotoxicité de la dox dans les HT29 (333). L'inhibition de Rho A
permettrait ainsi de diminuer la résistance de la dox dans une lignée cellulaire de cancer du
colon via notamment l'activation de NFκB (334).
Cette même voie est également impliquée dans la résistance à la dox dans les HT29.
L'inhibition de RhoA et l'activation de NFκB permettent de réguler la nitration de MRP3
(Multidrug resistance protein-3 transporter) et l'expression de de Pgp (P-glycoprotéine), deux
protéines jouant un rôle important dans l'acquisition de la résistance à la chimiothérapie (335).
La voie Rho A/ ROCK est également impliquée dans la résistance aux drogues des myélomes
multiples (336).
En concordance avec ces résultats, plusieurs études ont montré l'implication de la voie RhoA/
ROCK/ NFκB dans la cardiotoxicité induite par la dox. En effet, l'inhibition de la voie
RhoA/ROCK par le fasudil prévient les changements hémodynamiques, histopathologiques et
ultrastructuraux induits par la dox (337). De manière intéressante, l'inhibition de cette voie par
le fasudil entraîne une diminution de l'activité de NFκB dans les cardiomyocytes de rats tandis
que dans les cellules cancéreuses, l'inhibition de RhoA induit l'activation de NFκB. Ceci
suggère que la cardiotoxicité induite par la dox et la résistance des cellules cancéreuses à la
dox impliquent les mêmes acteurs mais régulés de façon différente selon le type de cellules.
L'inhibition de RhoA/ROCK peut également atténuer la cardiotoxicité induite par la dox de
façon ROS-dépendante et en prévenant l'inhibition de l'activité phosphatase et notamment de
PP2A (338,339).

Page
90
De plus, Rho B peut également augmenter la sensibilité des cellules à l'apoptose induite par la
dox en modifiant la réponse p53 (340). Une étude supplémentaire montre également que la
délétion de RhoB augmente la résistance à la dox des cellules néoplasiques transformées
(341). RhoB est ainsi nécessaire au déclenchement de l'apoptose suite à des dommages à
l'ADN ou à une alkylation dans les cellules cancéreuses (341,342). Ceci suggère que RhoA et
RhoB ont des effets opposés et qu'une régulation fine de ces deux protéines est nécessaire
dans la prévention des effets cardiotoxiques et de la résistance des cellules cancéreuses à la
dox.

• Altération de Rac induite par la dox

Le Rho GDP dissociation inhibitor (RhoGDI) joue un rôle essentiel dans le contrôle de
plusieurs fonctions cellulaires via son intéraction avec les Rho GTPases et notamment Rho,
cdc42 et Rac. Zhang et al ont démontré que la surexpression du RhoGDI augmente la
résistance de lignées cancéreuses mammaires et de lymphomes (respectivement MDA-
MB231 et JLP-119) à l’étoposide et à la doxorubicine. Sa délétion permettrait ainsi de
sensibiliser ces cellules à l’apoptose par ces agents de chimiothérapie.
De plus, ce mécanisme était dépendant de Rac1, nécessaire pour une réponse apoptotique
maximale aux drogues cytotoxiques (343). En effet, Rac 1, une petite protéine G de la famille
de Rho, régule la mobilité, l’adhésion, la mitose, la méiose, la mort cellulaire ainsi que la
formation de métastase.
Rac1 est également impliqué dans le remodelage cardiaque de type hypertrophique des
cardiomyocytes via la voie ASK-1 (Apoptosis signal regulating kinase-1)/NFκB (344). De
plus, il adapte la réponse cellulaire à différents agents génotoxiques et notamment les agents
alkylants et les UV via l’activation de protéines kinases activées par le stress telles que
SAPK/JNK et p38 ainsi que des facteurs de transcriptions tels que AP-1 et NFκB (345,346).
Le rôle de Rac1 dans la cardiotoxicité induite a ainsi été étudié dans plusieurs articles. Une
étude montre notamment que l’inhibition de Rac1 par le lovastatine permet d’atténuer la
cardiotoxicité induite par la dox sans réduire son efficacité dans trois modèles de souris
portant des tumeurs (cellules Co-ion-26, cellules de sarcome v-Ha-ras-transformed NIH-3T3,
et cellules de carcinome de poumon Lewis) (347).
Ces résultats concordent avec d’autres études montrant l’efficacité de l’inhibition de Rac1 par
le lovastatine, le pitavastine ou des inhibiteurs spécifiques de Rac comme le EHT1864 ou le
NSC23766 dans la prévention des effets cardiotoxiques de la doxorubicine (348–350).

Page
91
Les effets de l’inhibition de Rac1 sont multifactorielles et dépendent de la voie de dommage à
l’ADN ATM/p53, de la voie de la TopII β et sont également ROS dépendant. En effet,
l’inhibition de Rac1 atténue l’apoptose des cardiomyocytes via la diminution de l’activité
caspase-3 et de la fragmentation de l’ADN en réponse à la dox. Ceci est également corrélé à
une diminution de la production de ROS, une inhibition de l’activité de la NADPH oxydase,
une diminution de l’acétylation de p53 ainsi qu’une diminution de l’expression de la
phosphorylation de l’histone H2AX, marqueur de dommages à l’ADN médiés par les cassures
double brin de l’ADN. De plus, l’inhibition de Rac1 permettait de prévenir la diminution de
l’activité des histones déactylases (HDAC) induite par la dox. Ces effets protecteurs ont
également été retrouvés dans un modèle de souris KO pour Rac1 traitées à la dox (350).
Enfin, un article récent montre la nécessité de Rac1 dans la réponse aux dommages à l’ADN
induite par la dox via TopIIβ (351) (cf. Figure 27).

Figure 27: Rôle de Rac1 dans les dommages à l'ADN induits par la doxorubicine
Rac1 est nécessaire à la stabilisation du complexe ADN-TopII induit par la dox ce qui a pour conséquence
l’induction de cassures double brin et de dommages à l’ADN ainsi qu’une réponse à ces dommages médiée par
la voie ATM (352).

En effet, un autre article de la même équipe montre que Rac1 est nécessaire à la formation des
complexes clivables ADN-TopII β qui mènent à la formation de cassures double brin de
l’ADN (ou DSB : DNA double strand breaks) irréversibles induites par de faibles doses de
dox, des fortes doses de dox conduisant préférentiellement à son intercalation dans l’ADN
(352).

Page
92
De plus, l’inhibition de Rac1 prévient également des effets hépatotoxiques de la dox mais pas
de l’irradiation via la diminution de la réponse inflammatoire et fibrotique et la diminution du
dommage à l’ADN (351). Ces études montrent ainsi le potentiel thérapeutique de l’inhibition
de Rac1 ou de la modulation de GEFs (guanine exchange factor) regulant l’activité de R ac1
dans la prévention des effets cardiotoxiques et hépatotoxiques de la dox et le maintien de
l’efficacité de la dox sur les cellules cancéreuses.
Ainsi, l’inhibition de Ras, Rho ou Rac peut représenter de nouvelles stratégies thérapeutiques
de la cardiotoxicité induite par la dox. De plus, Epac, facteur d’échange directement activé par
l’AMPc, peut activer dans les cardiomyocytes Ras et notamment H-Ras et R-Ras impliqué
dans l’homéostasie calcique et l’autophagie via respectivement l’activation de la
phospholipase C (PLC) et la phospholipase D (PLD), deux processus altérés par la dox
(250,353,354). Epac peut également activer Rac et participerait ainsi aux effets cardiotoxiques
de la dox (52).
Aucune donnée ne montre de lien entre Epac et RhoA dans le cardiomyocyte. Cependant,
plusieurs études ont montré qu’Epac diminue l’activité de RhoA via Rap1 dans les cellules
musculaires lisses (355–357).

Tous les mécanismes de cardiotoxicité induite par la doxorubicine impliquent les petites
protéines G Ras, Rac et RhoA. Or on sait que ces petites protéines G ont un seul
activateur ou régulateur commun : Epac. L’objectif de cette thèse a donc été d’étudier le
rôle d’Epac dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. La structure et les
fonctions cellulaires d’Epac feront donc l’objet de la partie 4.

5- Signalisation d’Epac

Epac est un facteur d’échange directement activé par l’AMPc qui active directement certaines
GTPases de la famille Ras dont Rap1 et Rap2 (358–360). Depuis sa découverte en 1998, il est
maintenant admis que les protéines Epac sont des nouveaux senseurs de l’AMPc régulant
différents processus cellulaires : homéostasie calcique, prolifération cellulaire, survie
cellulaire, différenciation cellulaire, polarisation cellulaire, adhésion cellule-cellule,
transcription de gène, sécrétion, transport des ions et signalisation neuronale (353).

Page
93
5-1 Structure et mécanisme d’activation d’Epac

Il existe 2 isoformes de la protéine Epac : Epac1 et Epac2 issues respectivement des gènes
RAPGEF3 et RAPGEF4.
On dénombre deux variants de Epac2, une forme longue appelée Epac2a et un variant épissé
en N-terminal qui a été mis en évidence dans le cortex de la glande surrénale, nommé Epac2b
(361,362). Une 3ème isoforme d’Epac2, en cours de caractérisation, a également été observée
uniquement dans le foie (363). Chez l’homme, les ARN messagers (ARNm) codants pour
Epac1 sont ubiquitaires mais plus abondants dans le cœur, le rein, la thyroïde et les ovaires et
plus faiblement exprimés dans le cerveau. Epac2 est exprimé dans le cerveau ainsi que dans
les tissus endocriniens (358,359). Epac est présent dans différents compartiments cellulaires
comme le noyau, le cytosol, la membrane plasmique et nucléaire et les mitochondries (364).
Epac1 est ainsi associé au complexe mAKAP (A-kinase anchoring protein) au niveau de la
membrane nucléaire des cardiomyocytes par l’intéraction direct avec la PDE4D3. En effet,
lorsque le taux d’AMPc diminue, l’inhibition de la voie ERK5 par Epac est levée. Il s’en suit
la phosphorylation de la PDE4D3 par ERK ce qui conduit à la diminution de l’activité PDE
permettant l’accumulation de l’AMPc (365).
De plus, une étude récente montre que la localisation subcellulaire est différente selon les
isoformes.
Ainsi, dans les cardiomyocytes, Epac1 serait localisé dans le noyau et ainsi impliqué dans la
signalisation nucléaire, tandis que Epac2 serait localisé au niveau des tubules T où il
régulerait la fuite de calcium du RS impliquée dans les arythmies (366). Sa localisation
intracellulaire varie selon le type cellulaire et le cycle cellulaire (367).
Une étude récente montre également une compartimentation des protéines Epac1 et Epac2 :
tandis que Epac1 est principalement périnucléaire, Epac2 est plus largement cytoplasmique
dans les cellules HEK293T (lignée de cellules rénales humaines) (368).
Les protéines Epac sont constituées d’une région régulatrice en N-terminal et d’une région
catalytique en C-terminal. La région régulatrice est composée d’un domaine DEP
(Dishevelled-egl 10-Pleckstrin) impliqué dans la localisation membranaire et d’un ou de deux
(pour Epac2a) domaines de liaison à l’AMPc appelé CNB (Cyclic nucleotide binding) (369).
Le domaine de liaison à l’AMPc supplémentaire d’Epac2a n’est pas impliqué dans son
activation par l’AMPc et sa fonction reste encore méconnue (370).
La région catalytique comprend un domaine d’homologie cdc25 (cell division 25) appelé
domaine GEF qui exerce sa fonction de facteur d’échange, un domaine REM (Ras exchange

Page
94
motif) qui stabilise le domaine GEF et un domaine RA (Ras associating) qui permet
l’interaction directe entre Epac2 et Ras-GTP (364,371) (cf. Figure 28).

Figure 28: Structure des protéines Epac

Les protéines Epac sont des protéines multi-domaines. Elles sont constituées d’une région régulatrice située du
côté N-terminal et d’une région catalytique du côté C-terminal. La région régulatrice comprend un domaine DEP
responsable de la localisation membranaire de Epac et un domaine CNB-B capable de lier l’AMPc. La région
catalytique comprend un domaine GEF responsable de l’activité d’échange du GDP contre le GTP sur les petites
protéines G effectrices de Epac, un domaine RA capable de s’associer avec la forme active de Ras et un domaine
REM qui stabilise le domaine GEF. L’isoforme Epac2a possède un domaine de liaison à l’AMPc supplémentaire
appelé CNB-A. CNB: Cyclic Nucleotide Binding domain, DEP: Dishevelled, Egl-10, Pleckstrin domain, GEF:
Guanine nucleotide Exchange Factor, RA: Ras-Associating, REM: Ras Exchanger Motif (372).

En absence d’AMPc, la région régulatrice inhibe la région catalytique empêchant l’accès de

ses effecteurs au domaine GEF. L’AMPc produit par l’AC se fixe sur le domaine CNB
d’Epac ce qui permet un changement conformationnel libérant la partie catalytique de la
contrainte exercée par la région régulatrice (373) (cf. Figure 29).

Page
95
 Figure 29: Mécanisme d'activation d'Epac
En l’absence d’AMPc, la région régulatrice N-terminale d’Epac inhibe le domaine catalytique. La liaison de
l’AMPc à son site de fixation CNB-B pour Epac1 (CNB-A pour Epac2) provoque un changement de
conformation de la région charnière (VLVLE) située entre le REM et le CNB-B qui libère le site catalytique
GEF. CNB: Cyclic Nucleotide Binding domain, DEP: Dishevelled, Egl-10, Pleckstrin domain, GEF: Guanine
nucleotide Exchange Factor, RA: Ras-Associating, REM: Ras Exchanger Motif (374).

Epac, une fois actif, catalyse l’échange du GDP en GTP, forme active des petites protéines G
effectrices. L’AMPc produit peut également activer la PKA avec une affinité similaire à celle
d’Epac (2,9µM pour PKA, 2,8 µM pour Epac1 et 1,2µM pour Epac2). Les protéines Epac
sont aussi capables d’activer leurs effecteurs via le domaine REM sans lien avec l’activité
GEF (375). Epac peut également activer indirectement Rit, petite protéine G de la famille de
Ras, sans lien avec son activité GEF ni son activité Rap GTPasique (376).

5-2 Fonctions biologiques

Les protéines Epac sont impliquées dans divers processus cellulaires dont l’adhésion
cellulaire, la sécrétion, l’inflammation, la prolifération cellulaire, la transmission synaptique,
l’excitabilité, la croissance et la différenciation neuronale. Ils exercent ainsi différentes
fonctions biologiques notamment dans la fonction cardiaque, dans la fonction rénale, dans les
tissus adipeux, dans l’inflammation, dans la fonction neuronale, dans la sécrétion d’insuline et
dans la fonction vasculaire (cf. Figure 30) (377).
Epac1 est impliqué dans le couplage excitation-contraction, le couplage excitation-
transcription, l’hypertrophie cardiaque, la fibrose, et réduit la perméabilité de l’endothélium
des vaisseaux. Epac2 régule la sécrétion d’insuline des cellules β-pancréatiques ainsi que les
processus de mémorisation et d’apprentissage. Néanmoins, plusieurs études montrent une
coopération entre Epac1 et Epac2 dans la régulation de ces fonctions biologiques (378–380).

Page
96
 5-2-1 Fonction neuronale
Dans la fonction neuronale, Epac régule la croissance, la différenciation et l’orientation des
axones, la neurotransmission, l’excitabilité des neurones sensoriels, l’apprentissage et la
mémorisation via respectivement les voies Rit PI3K/ERK, la signalisation calcique, les voies
PLC/PLD, PKC et la voie ERK. Epac peut également jouer un rôle dans diverses processus
pathologiques dont le remodelage des protéines synaptiques, l’apoptose des cellules
neuronales et est ainsi impliqué dans diverses pathologies neuronales telles que l’anxiété, la
dépression et la maladie d’Alzheimer (372).

5-2-2 Sécrétion d’insuline

Dans les cellules pancréatiques, la sécrétion d’insuline induite par le glucose est potentialisée
par la voie Epac2-Rim2-Piccolo en réponse à la stimulation des récepteurs GLP-1 (glucagon-
like peptide-1). En effet, l’intéraction Epac2-SUR1 induit la fermeture des canaux potassiques
sensibles à l’ATP et l’activation de la PLC-ε par Epac2-Rap augmente la sensibilité à l’ATP
de ces canaux par l’hydrolyse du PIP2 (Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate). La
dépolarisation membranaire induit ensuite l’ouverture des canaux calciques voltage
dépendants et facilite la sécrétion d’insuline via la fusion des granules d’insuline avec la
membrane plasmique. Epac2-Rim2-Rab3 intéragit également avec la glucokinase et accroît
ainsi le métabolisme du glucose (381). La signalisation d’Epac pourrait ainsi avoir un rôle
prépondérant dans les pathologies liées au diabète.

5-2-3 Fonction vasculaire

L’endothélium vasculaire constitue la paroi interne des vaisseaux sanguins et forme ainsi une
barrière contrôlant les échanges en ions, en soluté, en macromolécules ou en cellules.
L’extravasation entre cellules est régulé par les jonctions serrées et les jonctions adhérentes
formées par l’interaction entre les cadhérines et l’actine du cytosquelette (382).
La perméabilité de la barrière endothéliale est essentielle pour l’extravasation des leucocytes
pendant l’inflammation. Cependant, une fuite endothéliale importante peut conduire à des
oedèmes et à une inflammation chronique (383).
L’élévation de l’AMPc, en réponse à une stimulation β2 par les prostanoïdes ou la forskoline
permet une diminution de la fuite de la barrière endothéliale par l’inhibition de la dynamique
actine-microtubule. Cette dynamique est associée aux jonctions adhérentes et serrées sous le
contrôle des Rho-GTPases et de Rap.

Page
97
Epac peut ainsi réduire les fuites de la barrière endothéliale via l’altération de la balance
RhoA/Rac1 en faveur de Rac1 entraînant une diminution de la phosphorylation de la chaîne
légère de la myosine, cible des Rho-rho-kinases et de la formation de fibres de stress d’actine.
Epac peut également directement interagir avec la PDE4D au contact cellule-cellule portant la
VE-cadhérine. Ce processus permet le maintien de sa fonction de stabilisation de la barrière
endothéliale (381).
Dans le muscle lisse vasculaire, Epac inhibe les canaux potassiques sensibles à l’ATP via la
calcineurine suggérant que Epac est impliqué dans la régulation du tonus vasculaire et du flux
sanguin (384).
De plus, l’activation d’Epac induit la relaxation de l’aorte de rat ainsi que de l’artère
pulmonaire de rat et de lapin via l’inhibition de RhoA et la phosphorylation de la chaîne
légère de la myosine (385). Epac peut ainsi moduler les fonctions du muscle lisse vasculaire
et atténuerait ainsi les dysfonctions vasculaires associées à l’athérosclérose et à l’hypertension
artérielle pulmonaire (386–388).

5-2-4 Fonction rénale

Epac1 est fortement exprimé dans le rein et localisé dans différents segments des tubules
rénaux (389,390). Dans l’épithélium rénal, Epac1 est situé au niveau des bordures en brosse
suggérant un rôle d’Epac dans l’absorption d’eau et d’ions médiés par l’AMPc. En effet, dans
les canaux corticaux collecteurs, divers types cellulaires régulent la réabsorption des ions et
de l’eau en réponse à l’élévation de l’AMPc. Plusieurs hormones sont associées à cette
augmentation de l’AMPc et agissent aux niveaux des récepteurs adrénergiques, des récepteurs
de la calcitonine (hormone régulant l’excrétion du calcium par les reins) et des récepteurs de
la vasopressine (hormone anti-diurétique).
Il a ainsi été montré que l’activation de Epac1 est responsable de la stimulation de l’activité
H,K-ATPase induite par la calcitonine dans les cellules intercalaires de type α (389).
Néanmoins, l’activation de l’H,K-ATPase en réponse à une stimulation β-adrénergique
dépend uniquement de la PKA dans les cellules intercalaires de type β.
De plus, l’activation d’Epac induit le recrutement d’aquaporine-2 à la membrane apicale des
cellules des canaux collecteurs ce qui conduit à une augmentation de l’extravasation apicale
de l’eau (391,392).

Page
98
 5-2-5 Fonction dans l’inflammation
La signalisation de l’AMPc peut directement moduler l’inflammation en régulant la réponse
immunitaire des leucocytes dans lesquels Epac1 est exprimé.
Néanmoins, la contribution de PKA et d’Epac varie selon le type de leucocytes. Tandis que la
PKA est présente dans les monocytes, Epac1 inhibe la phagocytose associée à FcγR
(récepteurs de la région constante des immunoglobulines G) (393–395). Dans les
macrophages du foie, l’activation d’Epac1 inhibe la production de ROS induite par des
pathogènes bactériens alors que la PKA n’y joue aucun rôle (396). L’activation d’Epac1
module ainsi la production de divers médiateurs de l’inflammation dans différents types de
leucocytes (397–401).
Epac peut également avoir des effets pro-inflammatoires qui passent par l’augmentation de
l’adhésion et la migration des leucocytes et l’augmentation de la production de cytokines dont
l’IL-1 et l’IL-6 et de chimiokines telles que CXCL5 et CCL2 (399,402).
Les effets anti-inflammatoires de l’activation d’Epac passent par l’activation du facteur de
transcription C/EPBs (CCAAT/Enhancer-Binding Protein) qui induit l’expression de SOCS-3
(Suppressor of Cytokin Signaling-3). SOCS-3 inhibe ensuite la voie de signalisation
JAK/STAT du récepteur à l’IL-6 (403–405).

5-2-6 Autres fonctions biologiques

Les protéines Epac ont également un rôle dans le tissu adipeux et notamment dans la
différenciation des adipocytes et l’inhibition de la lipogénèse (406–408).
Au niveau pulmonaire, Epac joue un rôle important dans la régulation des fonctions
respiratoires dont la libération de cytokine inflammatoire, la prolifération et la contraction des
cellules du muscle lisse bronchique ainsi que la production des protéines de la MEC par les
fibroblastes. Epac pourrait ainsi être impliqué dans des maladies pulmonaires telles que
l’asthme et les maladies pulmonaires obstructives chroniques (381).

Page
99
 Figure 30: Epac: effecteurs et fonctions biologiques
Les protéines Epac sont impliquées dans divers processus cellulaires dont l’adhésion cellulaire, la sécrétion,
l’inflammation, la prolifération cellulaire, la transmission synaptique, l’excitabilité, la croissance et la
différenciation neuronale. Elles sont ainsi impliquées dans la fonction rénale, vasculaire, inflammatoire,
pulmonaire, cardiaque, pancréatique et neuronale (367).

Ainsi, Epac joue un rôle prépondérant au cours de nombreux processus cellulaires prenant
place dans des organes vitaux tels que le cerveau, le rein, le pancréas mais également le cœur
(cf.figure 30).

5-3 Rôle d’Epac dans le cœur

Bien que le rôle d’Epac ne soit pas entièrement élucidé, plusieurs études montrent qu’Epac est
impliqué dans la régulation de l'homéostasie calcique et le remodelage cardiaque (409).
L'altération du signalosome d'Epac est ainsi impliquée dans plusieurs pathologies cardiaques
dont l'hypertrophie, les arythmies et la fibrose (381).

Page
100
 5-3-1 Régulation de l'homéostasie calcique par Epac

Bien que deux études précédentes n’ont pas mis en évidence une implication d’Epac dans la
modulation de la durée du PA (410,411), une autre étude a montré que Epac prolonge la durée
du PA en diminuant le courant potassique dans les cardiomyocytes de ventricule de rats
adultes (412). En effet, la stimulation β-adrénergique prolongée induit la diminution de
l'ARNm et des protéines KCNE1 (potassium voltage-gated channel subfamily E member 1)
ainsi que la densité du courant potassique IKS via la voie Epac1/ Calcineurine/NFAT (413).
Concernant l’effet sur la [Ca2+]i, il a été montré que l’activation d’Epac module le couplage
excitation-contraction et le couplage excitation-transcription. Ainsi, Oestreich et al. ont
montré, en utilisant des souris PLC (phospholipase C) KO, que Epac participe à
l’augmentation transitoire de la [Ca2+]i par l’activation β-adrénergique de façon PLC-
dépendante (414). Dans une autre étude, il a été montré que Epac active la CaMKII ce qui
induit la phosphorylation des RyRs et augmente la fréquence des sparks calciques spontanées.
Ceci sans significativement altérer le pic de courant ICa (410). L’implication de la CaMKII et
l’absence de modulation aigüe sur le courant ICa a été confirmée ultérieurement (415), ainsi
que l’implication de la PLC (416). En effet, une étude plus fine de l’homéostasie calcique a
mise en évidence que Epac, par l’activation de la PLC, induit une augmentation de l’IP3
(Inositol triphosphate). Cette IP3 active ses récepteurs qui sont concentré au niveau de
l’enveloppe nucléaire dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes permettant d’augmenter
la concentration en calcium dans le noyau et ainsi d’activer le couplage excitation-
transcription (416). A long terme, l’activation du couplage excitation-transcription (E-T)
conduit à l’augmentation de l’expression de la calmoduline ce qui augmente le courant fenêtre
du ICa induisant ainsi l’entrée de calcium et un effet inotrope positif (417).

Epac est impliqué dans le couplage excitation-contraction également par la phosphorylation

des protéines de myofilaments telles que la troponine I cTnI et cMyBPC via la voie PLC/
PKCε/ CaMKII, bien que les sites de phosphorylation d'Epac sur ces protéines soient encore à
caractériser (418).

Enfin, la formation de jonction gap est également une condition préalable pour la conduction
et la contraction synchrone des cardiomyocytes.

Page
101
L'activation d'Epac augmente la phosphorylation de la connexin-43 via PKCε ainsi qu'une
augmentation de l'expression de la cadhérine, protéine impliquée dans les jonctions
adhérentes, et induit ainsi une augmentation de la communication intercellulaire (419,420).
Ainsi, Epac est un important régulateur du CICR et de l’homéostasie calcique.

En outre, l’activation d’Epac peut également avoir des effets proarythmiques (409,417). En
effet, l'activation d'Epac dans le cœur de souris entraîne des arythmies ventriculaires
dépendantes de la CaMKII (411). Récemment, une étude montre une autre voie
arythmogénique dépendante d’Epac. En effet, Dominguez-Rodriguez et al ont montré que
l’activation d’Epac conduit à une surexpression des canaux TRPC3 et C4 (Transient Receptor
Potential Canonical) menant à une activité proarythmique de type SOCE (Store Operated Ca2+
Entry) (421). De plus, les deux isoformes d’Epac semblent avoir un rôle différent relatif à
leurs compartimentations cellulaires. Ainsi, une étude récente montre notamment que c'est
l'isoforme Epac2 qui est responsable de ces effets arythmogènes par l'induction d'une fuite du
RS via la phosphorylation CaMKII-dépendante du RyR2 sur la sérine 2814 (422). L'isoforme
Epac1 est impliqué dans la réponse cardiaque au stress via la phosphorylation du
phospholamban. En effet, les souris Epac1 KO possèdent une contractilité diminuée avec une
forte diminution de la phosphorylation du PLB sur la sérine 16. A l'inverse, l'activation d'Epac
(par le 8-CPT donc non spécifique d’une des deux isoformes d’Epac) induit une augmentation
de la phosphorylation du PLB sur ce site via la PLC et la PKCε (423).

5-3-2 Signalisation d'Epac et hypertrophie cardiaque

Plusieurs études montrent qu'Epac est surexprimée dans l'hypertrophie cardiaque (52,424).
L'hypertrophie cardiaque (HC) induite par Epac est dépendante des petites protéines G Ras et
Rac qui activent les voies de signalisation de la calcineurine (CN) et de la CaMKII induisant
respectivement l'activation de facteurs de transcription NFAT (Nuclear Factor of Activated T-
cells) et MEF-2 (Myocytes enhancer factor) et ainsi un remodelage cardiaque (52,53).
L'activation de la calcineurine et de la CaMKII lors de l'HC est également dépendante du
calcium. En effet, Epac module la signalisation calcique nucléaire et le couplage excitation-
transcription en augmentant la concentration nucléaire en calcium via la voie PLC/ IP3R
(récepteur à l'inositol triphosphate)/ CaMKII. L'activation de la CaMKII permet ensuite
l'initiation d'un programme pro-hypertrophique par l'export nucléaire de l'histone déacétylase
4 et 5 (HDAC4, HDAC5) et l'activation de MEF-2 (354,425,426).

Page
102
Une autre étude montre que l'activation d'Epac induit l'activation de H-Ras par la voie PLC/
IP3R/ Calcium et permet la translocation de l'HDAC4 du noyau vers le cytoplasme et induit la
dissociation du complexe HDAC/MEF-2 et ainsi l'activation de MEF-2 (354,426). Ainsi
Epac, par la régulation de l’homéostasie calcique, est impliqué dans l'hypertrophie (cf. Figure
31).

Figure 31: Rôle de la signalisation d'Epac dans le développement de l’hypertrophie

Epac conduit à l’activation des petites protéines G H-Ras et Rho. L’activation d’Epac contribue ainsi aux effets
prohypertrophiques de la stimulation β-adrénergique via l’activation des petites protéines G H-Ras et Rho. Ces
effets ne passent pas par Rap1A, effecteur direct d’Epac. En revanche, il peut activer une autre petite protéine
G : Rac. Les effets prohypertrophiques d’Epac implique également les protéines sensibles au calcium : la
CaMKII et la calcineurine ainsi que leurs facteurs de transcription MEF-2 et NFAT respectivement. Epac
stimule également la phosphorylation du RyR2 via la CaMKII et à la fuite calcique des réservoirs intracellulaires
qui contribue à l’activation de la CaMKII et de la calcineurine. AC : Adenylyl cyclase, CaMKII :
Calcium/calmodulin dependent protein kinase, MEF-2 : Myocyte enhancer factor-2, NFAT : Nuclear factor of
activated T cells, RyR : ryanodin receptor, SR : sarcoplasmic reticulum

La signalisation calcique initié par Epac active deux voies prohypertrophiques : la voie
CaMKII par le calcium nucléaire mais aussi la voie calcineurine par le calcium cytosolique
(425). Le calcium nécessaire à l’activation de la CaMKII nucléaire est fourni principalement
par la libération du calcium de l’enveloppe nucléaire par les récepteurs IP3 mais aussi par les
RyRs. Le calcium nécessaire à l’activation de la calcineurine peut provenir d’entrée plus
importante par le courant fenêtre des canaux calciques de type L et par les TRPC (417,421).
L’activation de la calcineurine induit ensuite la déphosphorylation de NFAT qui permet alors
sa translocation nucléaire et l’activation de facteurs de transcription impliqués dans le
programme hypertrophique.

Page
103
 5-3-3 Epac et fibrose
Epac et PKA induisent l'adhésion à la fibronectine des fibroblastes et des myofibroblastes
cardiaques ainsi que la migration des fibroblastes cardiaques.
Tandis que TGF-β1 induit une diminution de l'expression d'Epac1 dans les fibroblastes
cardiaques via Smad et JNK, cette cytokine augmente l'expression d'Epac1 dans les
myofibroblastes cardiaques via ERK1/2, JNK, p38, Akt et Smad-3 suggérant un rôle d'Epac1
dans la fibrose cardiaque (427). En concordance avec cette étude, Yokoyama et al. montrent
que la surexpression d'Epac1 inhibe la synthèse de collagène induite par le TGF- β1 ce qui
suggère qu'une diminution de l'expression d'Epac1 est nécessaire au maintien du phénoytpe
fibrotique (428). Epac stimule la migration via Rap1 mais inhibe la synthèse de collagène de
façon Rap-indépendante. Ainsi, une autre étude a montré que la régulation de la synthèse de
collagène par les fibroblastes se produit via la voie des récepteurs multiples à l'adénosine qui
active l'AC ce qui a pour conséquence une augmentation de l'AMPc, PKA-indépendante, et
l'activation d'Epac et de la PI3K (429).
La diminution de l'expression d'Epac1 induite par les agents profibrotiques dont le TGF-β1 et
l'angiotensine pourrait ainsi être un des mécanismes conduisant à la fibrose cardiaque (82).
De plus, Epac1 augmente la dégradation de la protéine XRCC1 (X-ray Repair Cross-
Complementing Protein 1) et diminue ainsi la réparation des dommages à l'ADN induits par
les rayons γ dans les cellules tumorales pulmonaires (430). Dans ce contexte, une étude
portant sur le rôle d'Epac dans la fibrose cardiaque radio-induite a été réalisée en collaboration
avec notre équipe (cf.annexe 2).

5-5 Epac et cancer

Epac, étant impliqué dans la migration et l'adhésion cellulaire par l'activation des petites
protéines G, joue un rôle important dans le cancer (431) et notamment dans l'invasion
tissulaire et la formation de métastases. En effet, Epac1 induit la migration des cellules de
mélanome de façon calcium dépendante in vitro et in vivo (432). L'invalidation d'Epac1 dans
une lignée de cellules de mélanomes permet une diminution de la migration et ainsi de la
formation de métastases et confirme ainsi ces premières observations (433). Cependant, l'effet
d'Epac dépend du type de cellule tumorale. Ainsi, Epac1 augmente la migration et l'invasion
dans le mélanome et le cancer du pancréas mais son activation inhibe la prolifération et la
migration des cellules cancéreuses de la prostate (434,435). L'inhibition d'Epac1,
pharmacologique ou par invalidation du gène chez la souris, permet ainsi de réduire les
métastases dans le cancer du pancréas in vivo (436).

Page
104
De manière intéressante, une étude montre que PKA et Epac contrôlent de façon différentielle
la migration d'une lignée de cancer utérin (Hela). En effet, l'inhibition de la PKA induit une
diminution de l’activité de Rac mais augmente la migration de cette lignée cellulaire.
Cependant, l'activation d’Epac entraîne une augmentation de l’activité de Rac et augmente la
migration de ces cellules. Ces résultats suggérent ainsi que la migration des cellules Hela
médiées par la voie AMPc est indépendante de Rac1 (437).

En plus des cancers du pancréas et de l'utérus, d'autres études suggèrent que l'inhibition
d'Epac serait également bénéfique dans plusieurs autres types de cancer et notamment dans le
mélanome, la leucémie (438) et le cancer du sein métastatique (439), les deux principales
indications thérapeutiques de la doxorubicine. En revanche, l'activation d'Epac1 semble être
bénéfique dans le traitement des cancers de la prostate et du cancer du poumon (440,441).

5-6 Epac et morts cellulaires

L'AMPc peut stimuler ou inhiber la mort cellulaire programmée (apoptose) selon le type
cellulaire via ses deux effecteurs PKA et Epac. Dans les cellules cardiaques, l'AMPc peut
induire la stimulation et l'inhibition de l'apoptose (442). La PKA induit certains changements
par phosphorylation de protéines cibles ou par la modification de l'expression de celles-ci qui
sont associées à une réponse pro-apoptotique. Quant à Epac, il semblerait qu'il soit impliqué
dans la réponse anti-apoptotique de la signalisation de l'AMPc (443–446). Ainsi, une étude a
montré que le roflumilast , un inhibiteur de la PDE4, protège les cardiomyocytes de l'apoptose
induite par le NO par l'activation de la voie Epac1/Rap1 (447).
De plus, une étude montre que Epac est nécessaire à l'inhibition du stress oxydant et de
l'apoptose des cardiomyocytes induite par la stimulation de GLP-1R (Glucagon like peptide-1
receptor).
En effet, la diminution de l'expression d'Epac1 par l'utilisation de siRNA conduit à la perte
des effets bénéfiques de l'exedin-4, activateur des GLP-1R (448). Une autre étude montre
également que le liraglutide, analogue de GLP-1 protège les cardiomyocytes de l'apoptose
induite par une concentration élevée en glucose par l'activation de la voie Epac1/Akt (449).
De manière intéressante, l'activation d'Epac permettrait la diminution de la néphrotoxicité
induite par le cisplatine, agent anticancéreux (450).

Page
105
Néanmoins, d'autres données ont montré qu'Epac peut également induire des réponses pro-
apoptotiques (451). Dans la lignée HEK293 (Human Embryonic Kydney), Epac active
l'export nucléaire de la DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) et diminue la réparation
des cassures double brin de l'ADN tandis que la PKA a le rôle inverse (452).
Une autre étude montre que l'activation d'Epac1 et 2 (par 50µM de pMe-cAMP, analogue
d'AMPc qui active sélectivement Epac) et la surexpression d'Epac1 induisent une
fragmentation de l'ADN et une augmentation de l'apoptose dans les cellules neuronales mais
pas dans les cardiomyocytes, et inversement pour la PKA qui est pro-apoptotique dans les
cardiomyocytes et anti-apoptotique dans les cellules neuronales (453).
Ainsi, le rôle d’Epac dans l’apoptose dépend également du type cellulaire. Toutefois, dans les
cardiomyocytes, toutes les études présentées ci-dessus montrent que l’activation d’Epac
permet une protection de ceux-ci contre différents stress cellulaire et notamment le stress
oxydant et les dommages à l’ADN et serait donc associée à une réponse anti-apoptotique. Il
serait donc intéressant de caractériser le rôle d’Epac dans l’apoptose induite par la
doxorubicine.
Aucune étude ne porte sur le rôle d'Epac dans la nécrose des cardiomyocytes. Cependant,
quelques études montrent qu'Epac joue un rôle dans l'autophagie. En effet, une étude montre
que Epac et Rap2b via l'activation de la calpaine sont impliqués dans le développement de
l'autophagie induite par la toxine α-hémolysine (454).
Une étude récente montre également que l'activation d'Epac conduit à l'autophagie induite au
cours de l'hypertrophie cardiaque (455). En effet, l’activation de l’autophagie induite par la
stimulation β-adrénergique est dépendante d’Epac dans les cardiomyocytes de rats nouveau-
nés. La voie Ca2+/calmodulin dependent kinase kinase β (CaMKKβ)/AMPK est notamment
impliquée dans ce processus. De plus, l’invalidation du gène d’Epac1 permet de prévenir le
remodelage cardiaque induit par les β-ARs ainsi que l’induction de l’autophagie.
Le rôle d'Epac dans la mort cellulaire n'est donc pas clairement défini et dépend du type
cellulaire et du type de stress appliqué aux cellules.
L'étude de la signalisation d'Epac et de son rôle dans la mortalité cellulaire est donc nécessaire
dans le contexte de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine d'autant plus que l'inhibition
de Rac1, petite protéine G activée par Epac, a un effet protecteur sur cette cardiotoxicité.

Page
106
6- Problématique et objectifs de l’étude

La doxorubicine est un agent anticancéreux toujours utilisée à ce jour et efficace dans de

nombreux types de cancer dont les cancers du sein, les cancers ovariens, les cancers
gastriques, les lymphomes et les leucémies.
Son utilisation est toutefois limitée par ses effets secondaires cardiotoxiques qui peuvent
mener à l’insuffisance cardiaque et au décès du patients jusqu’à 20 ou 40 ans après l’arrêt du
traitement (206). La cardiotoxicité induite par la dox relève donc d’un problème de santé
publique d’autant plus que l’incidence des cancers est augmentée et que la survie des patients
ayant subis un traitement anticancéreux s’améliore également.
Les dérivés de la dox ou les différents vecteurs associés à la dox utilisés aujourd’hui
permettent d’augmenter la dose de dox chez le patient et d’augmenter ainsi l’efficacité du
traitement mais ne permettent pas de prévenir la cardiotoxicité (126). De plus, aucun
traitement spécifique de la cardiotoxicité induite par la dox n’existe à ce jour.
Les recherches mises en œuvre actuellement portent donc sur l’étude des mécanismes
d’action de la doxorubicine afin d’identifier et de développer une cible thérapeutique pouvant
prévenir sa cardiotoxicité sans en réduire son efficacité.
La cytotoxicité de la doxorubicine implique différents mécanismes tels que l’intercalation
dans l’ADN, la génération d’un stress oxydant et l’inhibition de la biosynthèse de
macromolécule ce qui a pour conséquence une inhibition de la réplication et de la
transcription qui mène à la mort des cellules cancéreuses. Malheureusement, la dox peut
altérer les cardiomyocytes par les mêmes mécanismes et entraîner des complications
cardiaques sévères aigües et chroniques de façon dose-dépendante (146).
Les mécanismes de cardiotoxicité induite par la dox sont ainsi associés à la génération d’un
stress oxydant, l’intercalation dans l’ADN et l’inhibition de la topoisomérase II (206,456).
L’hypothèse la plus favorisée dans la littérature est la génération d’un stress oxydant par
production massive de radicaux libres par la dox. Les approches actuelles pour réduire la
cardiotoxicité de la dox concernaient donc l’utilisation d’antioxydants. Cependant,
l’utilisation d’antioxydants dans des modèles animaux ou dans des essais cliniques ne permet
pas de prévenir efficacement cette cardiotoxicité et/ou diminue parfois l’efficacité du
traitement (457).

Page
107
Le seul agent cardioprotecteur ayant une autorisation de mise sur le marché pour la prévention
des effets cardiotoxiques de la doxorubine est le dexrazoxane (ou cardioxane) qui est un
chelateur de fer. Son utilisation est néanmoins limitée aux cancers du sein métastatiques due à
son interférence avec l’efficacité de la dox et le potentiel développement de tumeurs
secondaires (458).
Récemment, une nouvelle hypothèse de mécanisme d’action de la dox s’est distinguée. En
effet, Zhang et al. ont montré que l’invalidation de la topoisomérase II β conduit à une
prévention de la cardiotoxicité induite par la dox en diminuant le stress oxydant, les
altérations mitochondriales et la mort cellulaire des cardiomyocytes subséquente (205). Ceci
est d’autant plus intéressant que le ciblage spécifique de la topoisomérase II β sans
modification de la topII α surexprimée dans les cellules tumorales mais peu exprimée dans le
cœur permettrait ainsi une prévention de la cardiotoxicité induite par la dox sans réduire sa
cytotoxicité sur les cellules cancéreuses.
Ces résultats ont néanmoins été nuancés par une étude de Lyu et al. montrant que la
prévention du dexrazoxane serait due essentiellement à la dégradation protéasomale de la
TopIIβ plus qu’à ses propriétés de chelation du fer (207). Ceci suggère que le ciblage de la
TopIIβ pourrait avoir des effets secondaires similaires au dexrazoxane sur l’efficacité de la
dox et le développement de tumeurs secondaires.
La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la suppression des effets
cardiotoxiques de la dox sans altérer son activité anti-tumorale a ainsi émergé ces dernières
années. Les études portant sur les petites protéines G Rac1 et RhoA en sont de bons exemples.
En effet, ces études ont montré que l’inhibition des ces deux cibles indépendantes permettrait
la prévention de la cardiotoxicité induite par la dox in vitro et in vivo et la diminution de la
résistance à la dox de certains types de cellules cancéreuses (335,337,352,459,460).
Néanmoins, aucune étude clinique portant sur des inhibiteurs spécifiques de ces petites
protéines G n’a été, à ce jour, réalisée.
Bien que peu étudiée, une altération de l’homéostasie calcique et du couplage excitation-
contraction a également été désignée comme mécanisme aigü important induisant les
complications cardiaques sévères de la dox (313,318,461,462). Cependant, les effets à long
terme de ces altérations n’ont à ce jour pas été étudiés.
Tous ces mécanismes pourraient avoir un seul activateur ou régulateur commun : Epac, un
facteur d’échange directement activé par l’AMPc.

Page
108
En effet, Epac est impliqué dans de nombreux processus cellulaires mis en cause dans la
cardiotoxicité induite par la dox tels que l’apoptose, la migration cellulaire, l’adhésion
cellulaire mais également dans le couplage excitation-contraction et la régulation de
l’homéostasie calcique (52,409,463).
L’objectif de cette thèse a donc été d’étudier le rôle d’Epac dans la cardiotoxicité induite par
la doxorubicine.
Ce projet s’inscrit dans le cadre du TEAM 1.3 appelé cardiotox du LabEx LERMIT
(Laboratoire d’excellence en recherche sur le médicament et l’innovation thérapeutique) qui a
permis le financement de cette thèse.
Le LabEx LERMIT rassemble des biologistes, chimistes, médecins et physico-chimistes dans
le but d’étudier les mécanismes moléculaires, de développer de nouvelles cibles
thérapeutiques et d’améliorer les thérapies actuelles du cancer, des maladies cardiovasculaires
ainsi que des maladies infectieuses et du système immunitaire. Ce LabEx a ainsi permis la
création en 2012 d’un groupe de réflexion TEAM 1.3 « Cardiotox » dirigé par M-C.Vozenin
et E.Morel ayant pour principaux objectifs :
- L’analyse de la cinétique de développement des cardiotoxicités et de leurs
mécanismes associés avec la mise en place de modèles spécifiques (monothérapie
et notamment la chimiothérapie et la radiothérapie et combinatoire)
- La caractérisation des voies de signalisation des petites protéines G et leurs GEF
impliquées dans le remodelage cardiaque et la mort cellulaire (Collaboration
C.Lemaire et M-C.Vozenin)
- L’étude des altérations de l’homéostasie calcique induites par les traitements
anticancéreux (collaboration Dr A.M.Gomez, Dr J-P.Benitah)
- L’identification de cibles thérapeutiques ou de biomarqueurs prédictifs de maladies
cardiaques
Les objectifs de ma thèse ont donc été :
1/ La mise en place d’un modèle de cardiotoxicité induite par la chimiothérapie et plus
particulièrement par la doxorubicine chez la souris
2/ La caractérisation des altérations aigües et chroniques de l’homéostasie calcique induite par
la doxorubicine in vivo
3/ L’étude des effets de la doxorubicine sur la signalisation d’Epac
4/ Le rôle d’Epac dans la mortalité cellulaire induite par la doxorubicine
L’ensemble de cette étude permettera ainsi de conclure sur le potentiel thérapeutique d’Epac
dans la cardiotoxicité induite par la dox.

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109
Matériel et méthodes

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110
Matériel et méthodes

1-Matériel
1-1 Produits chimiques

1-1-1 Doxorubicine et dexrazoxane

La doxorubicine à 2mg/mL (solution pour perfusion) utilisée pour les expérimentations in
vitro et in vivo provient d’ACCORD. Le dexrazoxane (DXZ) provient de Sigma.

1-1-2 Activateurs et inhibiteurs d'Epac

La découverte des nombreuses fonctions cellulaires d'Epac dans différents types de cellules a
permis l'essor de nouvelles perspectives dans le traitement de pathologies causées par une
dérégulation de la signalisation de l'AMPc et a ainsi conduit au développement de
modulateurs pharcomologiques d'Epac (cf. Figure 32).

Figure 32: Activateurs d’Epac

La figure représente les différentes structures chimiques des activateurs d’Epac. Le 8-pCPT, le Sp-8-CPT et le 8-
CPT-AM sont des activateurs des deux isoformes d’Epac. Le Sp-8-BnT-2’-O-Me-cAMPS est, quant à lui, un
activateur sélectif d’Epac2.

L’activateur sélectif d’Epac, 2’-O-Me-AMPc, a été isolé après méthylation du groupement 2'-
OH du ribose de l'AMPc qui se lie au résidu glutamate. L'amélioration de l'affinité du
composé pour Epac a été permise par l'ajout du groupement 8-CPT (8-chloro-phenyl-thio) et
donne lieu ainsi au 8-pCPT-24-O-Me-AMPc.

Page
111
L’hydrophobicité du groupement 8-CPT confère également une meilleure perméabilité
membranaire au 8-pCPT (464). Cependant, plusieurs études ont montré que les métabolites
secondaires du 8-pCPT peuvent avoir un effet sur les PDEs et augmenter la concentration en
AMPc (465,466).
Deux analogues du 8-CPT ont ainsi été produits: le Sp-8-CPT résistant à l'hydrolyse par les
PDE et le 8-CPT-AM qui présente une meilleure perméabilité membranaire grâce à son
groupement acétoxy-éthyl (467–469). Récemment, un activateur spécifique d’Epac2 a été
développé par Schwede et al et est commercialisé sous le nom : le Sp-8-BnT-2'-O-Me-
cAMPS (Biolog) (470) (cf. Figure 32). Cependant, à ce jour, aucune molécule pouvant
activer spécifiquement Epac1 n'a été mise au point.

Figure 33: Inhibiteurs d'Epac

La figure représente les différentes structures chimiques des inhibiteurs d’Epac. L’ESI09, le HJC0197 et le
NY0123 sont des inhibiteurs de deux isoformes d’Epac. L’ESI05 est un inhibiteur sélectif d’Epac2 et le CE3F4
est un inhibiteur sélectif d’Epac1.

Les différentes méthodes de screening ont permis l'identification d'inhibiteurs d'Epac1 et 2

(cf. Figure 33), ESI-09 et d'inhibiteurs spécifiques d'Epac2, ESI-05 qui se fixerait sur la
région située entre ces deux domaines CNB (471,472). L'ESI09 ne permet pas de différencier
l'inhibition d'Epac1 de celle d'Epac2 et est ainsi capable d'inhiber de nombreuses fonctions
cellulaires d'Epac dont la sécrétion d'insuline, la migration d'une lignée de cellules tumorales
pancréatiques et la phosphorylation d'Akt (434). Cependant, une récente étude soulève des
problèmes de sélectivité et de dénaturation des protéines induites par l'ESI09 (473).

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112
Ces observations sont nuancées par les résultats de l'équipe de Zhu montrant que l'ESI09 est
un inhibiteur compétitif d'Epac à des concentrations inférieures à 20µM et que la dénaturation
des protéines n'apparaît qu'à de fortes doses d'ESI09 (au delà de 25µM) (474). L'ESI09 doit
ainsi être utilisé à des concentrations inférieures à 20µM in vitro.
Afin d'améliorer les propriétés de l'ESI09, l'équipe de Ye a développé très récemment trois
nouveaux inhibiteurs d'Epac 1 et d'Epac2: le HJC0726, le NY0123 et le NY0173 (475).
Un inhibiteur spécifique d'Epac1 a également été identifié par le Labex LERMIT. Cet
inhibiteur, appelé CE3F4 est un inhibiteur non compétitif de la liaison de l'AMPc ou du 8-
CPT sur Epac1 (476,477).
Les activateurs et antagonistes d'Epac permettent ainsi le développement de nouvelles
approches d'une thérapie basée sur l'AMPc. A titre d'exemple, les agonistes sélectifs d'Epac2
pourraient ainsi induire la sécrétion d'insuline par les cellules pancréatiques tandis que les
agonistes sélectifs d'Epac1 pourraient être utiles dans le traitement de l'inflammation
vasculaire. Au contraire, les antagonistes d'Epac1 et d'Epac2 pourraient tous les deux être
utiles dans le traitement de l'insuffisance cardiaque (478,479).

Le 8-CPT (8-(4-Chlorophenylthio)-2’-O-methyl-cAMP), activateur d’Epac 1 et d’Epac 2,

l’ESI09 et l’HJC0197 inhibiteurs d’Epac1 et d’Epac2 ainsi que l’ESI05 inhibiteur spécifique
d’Epac2 proviennent de Biolog Life Science Institute.
Le CE3F4 est un inhibiteur non compétitif sélectif d’Epac1 a été développé par Dr
F.Lezoualc’h, D.Courilleau et leurs collaborateurs au sein du Labex LERMIT. L’énantiomère
(R)-CE3F4, étant 10 fois plus efficace pour inhiber l’activité du facteur d’échange, a été
préféré à la forme racémique et la configuration (S) (476,480).

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113
1-2 Anticorps

1-2-1 Anticorps primaires

Anticorps Fournisseur Dilution Type et espèces Taille

β-actine couplée à la péroxydase Santa-cruz 1/30 000 IgG1 monoclonales de souris 43 kDa
Beclin-1 Cell Signaling 1/1000 IgG polyclonale de lapin 60 kDa
Caspase 3 Santa-cruz 1/1000 IgG polyclonale de lapin 32 kDa
Epac1 (5D3) Cell Signaling 1/2500 IgG2a monoclonale de souris 100 kDa
Epac2 (5B1) Cell Signaling 1/2500 IgG2a monoclonale de souris 115 kDa
H2AX pS139 (clone JBW301) Millipore 1/1000 IgG1 monoclonales de souris 17 kDa
LC3B (D11) XP Cell Signaling 1/1000 IgG polyclonale de lapin 14,16 kDa
NCX Swant 1/1000 IgG1 monoclonales de souris 70 et 110 kDa
p53 couplée à la péroxydase Santa-cruz 1/250 IgG polyclonale de lapin 53 kDa
Phospholamban total (L-15) Santa-cruz 1/500 IgG polyclonale de chèvre 7 kDa
PLB phospho THR17 (CAMKII) Badrilla 1/2000 IgG polyclonale de lapin 7 kDa
PLB phospho SER16 (PKA) Badrilla 1/2000 IgG polyclonale de lapin 7 kDa
Rac1 (clone 23A8) Millipore 1/1000 IgG2b monoclonales de souris 21 kDa
Rap1A/1B Cell Signaling 1/1000 IgG polyclonale de lapin 21 kDa
Rho A (26C4) Santa-cruz 1/250 IgG1 monoclonales de souris 24 kDa
Ryanodine receptor total Pierce 1/2000 IgG1 monoclonales de souris 565 kDa
RyR phospho S2814 Badrilla 1/2000 IgG polyclonale de lapin 565 kDa
RyR phospho S2808 (PKA, CAMKII) Badrilla 1/2000 IgG polyclonale de lapin 565 kDa
Serca 2 (F-1) Santa-cruz 1/1000 IgG1 monoclonales de souris 100 kDa
Topoisomérase II β Abcam 1/1000 IgG polyclonale de lapin 183 kDa
Tableau 4: Liste des anticorps primaires

1-2-2 Anticorps secondaires

Anticorps Fournisseur Dilution

Anti-souris couplé à la péroxydase Santa-cruz 1/10 000
Anti-lapin couplé à la péroxydase Santa-cruz 1/10 000
Anti-chèvre couplé à la péroxydase Santa-cruz 1/10 000
Tableau 5: Liste des anticorps secondaires

1-3 Adénovirus

Différentes constructions adénovirales (Ad.) ont été utilisées pour surexprimer ou inhiber
(sh.) les protéines citées ci-dessous dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés. Ces
adénovirus de sérotype 5 ont été invalidés pour les gènes précoces E1/E3 afin d’inhiber leur
capacité de réplication. La proportion des virus administrés par rapport au nombre de cellules,
ou MOI (Multiplicity Of Infection), permettant une expression protéique optimale est
indiquée pour chaque construction adénovirale.

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114
Ad.GFP (MOI 100): Adénovirus comportant la séquence codante pour la GFP (Green
Fluorescent Protein, deux maxima d’excitation : la 1ère à 395nm, la 2ème à 475nm, longueur
d’onde d’excitation : 395nm, longueur d’onde d’émission : 504nm) extraite de l’espèce
Aequoria Victoria utilisée comme contrôle. Il a été amplifié par l’hôpital universitaire de
Nantes (France) sur la plateforme de production de vecteurs viraux (Dr C.Darmon).

Ad.Epac1 WT (MOI 100): Adénovirus comportant la séquence codante pour la forme sauvage
d’Epac1 humain dont la séquence plasmidique d’origine a été fournie par le Dr J.L.Bos
(Utrecht, Pays Bas)

Sh.Contrôle (MOI 500) : Adénovirus comportant un scramble contrôle d’Epac1 fourni par
WelgenINC (Dr Keith Luo)

Sh.Epac1 (MOI 500) : Adénovirus comportant une séquence complémentaire à Epac amplifié
par l’hôpital universitaire de Nantes (France) sur la plateforme de production de vecteurs
viraux (Dr C.Darmon). Cet adénovirus permet la dégradation ou l’inhibition de la traduction
en protéine par interférence avec l’ARN messager d’Epac1.

Ad.Rac G12V (MOI 100) : forme dominante positive de Rac dont la mutation ponctuelle en
position 12 d’une glycine en valine entraîne un changement de conformation permettant
l’activation constitutive de Rac. Il a été amplifié par l’hôpital universitaire de Nantes (France)
sur la plateforme de production de vecteurs viraux (Dr C.Darmon).

S17N
Ad.Rac (MOI 100) : forme dominante négative de Rac obtenue par la mutation
ponctuelle de la sérine 17 en asparagine conduisant à la perte de ses fonctions. Il a été
amplifié par l’hôpital universitaire de Nantes (France) sur la plateforme de production de
vecteurs viraux (Dr C.Darmon).

L’ensemble de ces adénovirus contiennent la séquence codante pour la GFP placée en

bicistronique par rapport à celle de la protéine d’intérêt. Ces adénovirus possèdent une
séquence IRES (Internal Ribosomal Entry Site) reconnue par les ribosomes permettant de
traduire la protéine GFP simultanément et indépendamment de la protéine d’intérêt. Le niveau
de fluorescence de la GFP permet ainsi de vérifier l’efficacité de l’infection.

Page
115
1-4 Plasmides

L’activité transcriptionnelle de l’ANF (Atrial Natriuretic Factor), de l’α-actine squelettique

(α-skM) a été mesurée à l’aide d’un plasmide contenant le gène de la luciférase Firefly placé
sous le contrôle de promoteurs de l’ANF (ANF-Luc), de l’α-skM (α-skM-Luc) ou d’éléments
de réponse de type cfos SRE dans les cardiomyocytes de rats néonataux. Le plasmide ANF-
Luc a été fourni par le Dr K. Knowlton, et l’α-skM-Luc et le c-fos-SRE-luc par le Dr M. D.
Schneider.
Les plasmides rapporteurs contiennent : le gène de la luciférase FireFly placé sous le contrôle
de 4 sites de liaisons consensus NFAT (NFAT-Luc) qui a été acheté chez Stratagene et un
autre placé sous le contrôle de 3 sites de liaisons MEF2 (MEF2-Luc) qui a été construit et
donné par le Dr.K.C.Wollert (Université médical de Hanovre, Allemagne).
Ces activités luciférases ont été normalisées par l’activité Renilla, plasmide du gène
rapporteur de la luciférase Renilla placé sous le contrôle des éléments régulateurs du
promoteur CMV (fournis par Promega).

2-Modèles expérimentaux
2-1 Expérimentation in vitro

2-1-1 Culture primaire de cardiomyocytes de rats nouveau-nés

Le modèle de CVRN (Cardiomyocytes de rats néonataux) permet l’étude des caractéristiques
morphologiques, biochimiques et électrophysiologiques du cœur. Il est notamment utilisé
pour des études de toxicité de drogues (481) et offre plus d’avantages que les lignées
immortalisées cardiaques HL-1 et H9c2. Cependant, ce modèle est immature, notamment au
niveau de la signalisation calcique (absence de tubules transverses, expression de SERCA2a
diminuée) (482). Il permet également l’étude de l’activité transcriptionnelle de gènes
d’intérêts par la transfection de plasmique, qui n’est pas possible dans le modèle de
cardiomyocytes de rats adultes. La plasticité de ce modèle permet ainsi l’étude de nombreux
mécanismes d’action dans le cœur.
Les CVRNs sont isolés à partir de coeurs de rats Wistar âgés d’un ou deux jours. Après
prélèvement des cœurs et élimination des oreillettes, les tissus ventriculaires sont coupés en
petits morceaux afin d’augmenter le contact avec la solution enzymatique qui va les digérer.

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116
Cette solution enzymatique contient de la collagénase A (Roche Applied Science) et de la
pancréatine (Sigma Aldrich) diluées dans un tampon ADS (1,16M de NaCl, 200mM d’Hépès,
10mM de NaH2PO4, 55,5 mM de glucose, 3,4mM de KCl et 8,3mM de MgSO4 (pH 7,35).
Le mélange de tissus ventriculaires et de solution enzymatique est incubé 20 min à 37°C sous
agitation modérée. Le surnageant est récupéré, ajouté à 1ml de sérum de veau nouveau-né
(NCS) pour inactiver les enzymes, puis centrifugé 5 min à 1500 rpm. Après élimination du
surnageant, le culot cellulaire est à nouveau repris dans du NCS afin d’inactiver le reste
d’enzymes et de conserver les cellules et est placé à 37°C. L’ensemble de ces opérations est
répété 5 à 7 fois jusqu’à digestion complète des cœurs. Les suspensions cellulaires obtenues
après chaque digestion sont regroupées en une seule.
Afin d’isoler les cardiomyocytes des autres types cellulaires (fibroblastes, cellules
endothéliales et hématies), une centrifugation de la suspension cellulaire est effectuée sur un
gradient de Percoll (Sigma Aldrich) pendant 30 min à 3000 rpm. Le Percoll, composé de
particules de gel de silice, permet de produire un gradient de densité. Deux solutions de
densités différentes, le Top et le Bottom Percoll sont réalisées et déposées l’une sur l’autre.
Chaque type cellulaire ayant une densité propre, se déposera à un endroit différent du gradient
et sera ainsi séparé.

Hématies

Figure 34: Isolement des cardiomyocytes ventriculaires de coeurs de rat nouveau-nés par gradient de
Percoll
Deux solutions de densités différentes appelées Top et Bottom Percoll, sont préparées et déposées l’une sur
l’autre. Les cardiomyocytes ont une densité intermédiaire à celle de ces deux solutions tandis que les fibroblastes
ont une densité inférieure. Ainsi après centrifugation à 3000 rpm pendant 30 min de la suspension cellulaire
déposée sur le gradient de Percoll, les cellules sont séparées. Les cardiomyocytes se situent entre le Top et le
Bottom Percoll, les fibroblastes, au-dessus du Top Percoll et les hématies, au fond du tube.

Après aspiration des fibroblastes, les fractions de cardiomyocytes sont recueillies, regroupées
et remises en suspension dans de l’ADS permettant de diluer et d’éliminer le Percoll. Une
dernière centrifugation est effectuée pour récupérer les cardiomyocytes.

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117
Les cellules sont ensuite ensemencées dans différents supports préalablement tapissés par de
la gélatine (Sigma) diluée à 0,1% dans du PBS à raison de 250 000 cellules par puits (boîtes
24 puits) pour les tests luciférase ou 2 000 000 cellules par puits (boîtes 6 puits) pour les
western blot dans un milieu composé de DMEM (Gibco) et de Milieu 199 (Gibco)
supplémentés par 10% de sérum de cheval, 5% de NCS, 1% de glutamine et 1%
d’antibiotiques (pénicilline + streptomycine). Un jour après leur ensemencement, les cellules
sont incubées dans le même milieu mais sans sérum afin de sevrer les cellules et d’empêcher
l’activation des voies de signalisation par les sérums. Les cultures cellulaires sont maintenues
dans un incubateur avec atmosphère contrôlée (37°C dans une atmosphère humidifiée
contenant 5% de CO2).

2-1-3 Transfection transitoire et traitements

Une transfection optimale est obtenue lorsque les cellules sont à 50-70% de confluence.
Ainsi, 12 h après l’isolement, les cardiomyocytes ont été transfectés avec 1µg (boites 24
puits) de plasmides d’intérêt et de 25ng de plasmide contrôle Renilla.
Les transfections ont été réalisées à l’aide d’un polymère cationique, la Lipofectamine 2000
(Invitrogen). Ce polymère est caractérisé par une tête polaire chargée positivement et par une
queue hydrophobe. Une fois en solution, ces polymères forment des liposomes dont la surface
formée par les têtes polaires chargées positivement, s’associe à l’ADN plasmidique. Les
complexes ADN-liposomes sont endocytés. L’acidification des endosomes libère l’ADN
plasmidique dans le cytosol.
Les plasmides et la lipofectamine (2µl de Lipofectamine pour 1µg d’ADN) ont été dilués
séparément dans du milieu Optimem (Gibco GRL). Après 5 min, le milieu contenant les
plasmides a été ajouté à celui de la lipofectamine, puis incubé à température ambiante pendant
20 min. Les cardiomyocytes ont ensuite été incubés pendant 4 h à 37°C avec le milieu de
transfection ainsi obtenu. Ce milieu a ensuite été remplacé par du milieu sans facteur de
croissance et les cellules ont été incubées en présence ou non de doxorubicine et/ou des
modulateurs pharmacologiques d’Epac pendant 24h.

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118
 2-1-2 Culture cellulaire de lignées cancéreuses

Afin de tester l’efficacité antitumorale de la doxorubicine, deux lignées cellulaires provenant

de cancers habituellement traités par celle-ci ont été choisies :
MCF7 : lignée cancéreuse mammaire isolée à partir d’un adénocarcinome ER positif
d’une femme de 69 ans. Elle se cultive dans du milieu DMEM (Gibco) supplémenté
par 10% de Sérum de Veau Fœtal (SVF) et 1% de pénicilline streptomycine (PS).

A549 : lignée cancéreuse pulmonaire isolée à partir d’un adénocarcinome alvéolaire

humain. Elle se cultive dans du milieu F12 (Gibco) supplémenté par 10% de SVF et 1
% de PS.
Les cellules ont été ensemencées à raison de 50 000 cellules par puit (boîte 24 puits) puis
incubées dans leurs milieux respectifs en présence ou non de doxorubicine et/ou des
modulateurs pharmacologiques d’Epac pendant 24h puis analysées en cytométrie en flux.
Ces cellules ont été fournies par le Dr M-C.Vozenin (CHUV Lausanne).

2-2 Expérimentation in vivo

2-2-1 Développement d’un modèle murin de cardiotoxicité induite par la
doxorubicine

Des souris C57Bl6/J mâles (Janvier) ont été divisées en deux groupes : un groupe contrôle
recevant une solution saline et un groupe DOX recevant de la doxorubicine (solution pour
perfusion 2mg/mL diluée dans de la solution saline, Accord, fournie par la pharmacie centrale
de l’IGR). Afin de reproduire le mode d’injection de la doxorubicine chez les patients, les
souris de 12 semaines ont été injectées en intraveineuse (dans leur queue) 3 fois à intervalle
de 4 jours à une dose de 4 mg/kg par injection pour une dose cumulée totale de 12 mg/kg. La
dose cumulée totale a été choisie pour induire des dysfonctions cardiaques sans entraîner la
mort de la souris (483).
Un suivi hebdomadaire des souris a été réalisé, les points limites de souffrance de l’animal
choisi étant une diminution de poids de 20% et l’état de prostration de l’animal en accord
avec la directive européenne 2010/63/EU et le décret 2013–118 du 1er février 2013.
L’exploration de la fonction cardiaque des souris traitées a été effectuée par
échocardiographie à 2, 6 et 15 semaines après la fin du traitement (cf. paragraphe 3-1). Les
souris ont été ensuite euthanasiées par dislocation cervicale à ces mêmes temps d’analyse.
L’analyse fonctionnelle des transitoires calciques a été réalisée à ces mêmes temps par
microscopie confocale sur les cardiomyocytes isolés à partir des souris traitées.

Page
119
Ces cardiomyocytes dissociés à partir des ventricules des souris traitées ainsi que le ventricule
gauche et le ventricule droit ont également été utilisés pour les analyses biochimiques aux
mêmes temps d’analyse (après avoir été conservés à -80°C).

2-2-2 Souris transgéniques Epac knock out

Les modèles murins KO de Epac1 ou Epac2 et les double KO Epac1-Epac2 permettent, quant
à eux, l'étude et la découverte de nouvelles fonctions cellulaires spécifiques aux isoformes
d'Epac (484).
Bien que le phénotype complet des souris KO Epac1 et Epac2 n'ait pas encore été reporté
(453,485), la génération de souris Epac KO dans tout l'organisme a permis l'étude in vivo de
l'implication d'Epac dans le métabolisme lipide, les arythmies, les douleurs chroniques et le
cancer (422,423,486–488).

Génotype Invalidation d'Epac Equipe Références

Epac1 KO Excision entre les introns 2 et 5
1 Epac2 KO Excision de l'exon 7 Ju Chen San Diego (USA) Pereira et al, Circ, 2013
Double KO accouplements Epac1 et Epac2 KO
Epac1 KO Excision entre exon 1 et 2
Ishikawa/ Okumura RIKEN Okumura et al, J Clin
2 Epac2 KO Excision entre l'exon1 et l'intron 1
(Japon) Invest, 2014
Double KO accouplements Epac1 et Epac2 KO
Laurent et al, Cardiovasc
3 Epac1 KO Excision des exons 8 à 15 Lezoualc'h
res, 2015

Tableau 6: Stratégies d'obtention de souris invalidées pour le gène Epac

Les différents modèles de souris KO Epac (Epac1, Epac2 et double KO) utilisés dans le monde sont répertoriés
dans cette figure.

La prise de poids des souris Epac1 KO est diminuée par rapport aux souris contrôles, et
résistent ainsi à l'obésité induite par un régime riche en graisse et sont protégées de
l'intolérance au glucose (486). Ces souris ont également une capacité réduite à développer des
métastases de cancer du pancréas (436).
Les souris Epac1 KO, Epac2 KO et double KO n'ont aucune altération de la fonction
cardiaque, de l'homéostasie calcique. De plus, ces souris transgéniques ne seraient pas
protégées de l'hypertrophie induite par constriction aortique transverse. En revanche, la fuite
calcique du RS induite par l'activation d'Epac est abolie chez les souris Epac2 KO et double
KO mais pas Epac1 KO. Ces souris présentaient également moins d'arythmies que les souris
wild type (422).
Les souris Knock Out (KO) Epac1 utilisés dans cette étude ont été obtenues dans le cadre
d’un accord (Material Transfert Agreement ou MTA) avec le Dr. Ju Chen de l’Université de
San Diego (USA).

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120
Ces souris ont été obtenues après insertion de deux sites loxP dans les introns 2 à 5 afin
d’exciser les exons 2 à 4 qui codent pour le domaine DEP (Dishevelled-Egl-10 Pleckstrin
Domain) présent dans la région régulatrice d’Epac1 (422).
Afin de vérifier l’invalidation du gène Epac1 des souris, le génotypage a été effectué avec les
amorces suivantes :
Pour la bande wild-type :
E1genoP1: 5’- CTG GCC TCT CCT GAA TCT Tg -3’
E1genoP2: 5’- CCT CGC TGT TGG TAA GTG GT -3’

Pour la bande KO:

FRTneo: 5'- AAT GGG CTG ACC GCT TCC TCG T -3'
E1genoP4: 5’- GCC ATA GCC TCA ACA AGC TC -3’

L’invalidation du gène Epac1 a également été vérifiée par western blot.

Ces souris ont permis d’étudier in vivo le rôle d’Epac1 sur la cardiotoxicité induite par la
doxorubicine. Pour ce faire, un protocole expérimental identique à celui utilisé sur les souris
WT a été appliqué aux souris transgéniques Epac1 KO (cf. paragraphe 2-2-1).

2-2-3 Isolation des cardiomyocytes ventriculaires de souris adulte

Les cardiomyocytes ventriculaires ont été isolés à 2, 6 et 15 semaines après la dernière

injection des souris traitées ou non à la doxorubicine par digestion enzymatique. Après
injection d’héparine (anticoagulant), les cœurs ont été prélevés et placés dans une solution de
tyrode sans calcium à 4°C (composé de 130nM NaCl, 5.4nM KCl, 0.4 nM NaH2PO4, 0.5nM
MgCl2, 25nM HEPES, 22 nM glucose et 0.01 µg/ml d’insuline ; pH=7.4).
La digestion enzymatique est ensuite réalisée après cannulation de l’aorte par perfusion
rétrograde (système Langendorff) de la même solution supplémentée par de la collagenase
(Type 2, Worthington (1 mg/ml) et CaCl2 (0.1mM) jusqu’à la digestion de la valve aortique
indiquée par l’accélération du flux. Les ventricules ont ensuite été émincées puis filtré (maille
de nylon 300mm) afin d’éliminer les débris. Les cellules sont ensuite centrifugées ( à 20g
pendant 3 min) afin d’éliminer le surnageant contenant la collagénase. Les cellules sont
ensuite incubées dans une solution contenant 0.5mM CaCl2 sans collagénase.

Page
121
Enfin, les cellules ont été utilisées immédiatement après la dissociation pour l’étude des
transitoires calciques ou centrifugées puis congelées à -80°C pour l’étude biochimique.

3- Etude fonctionnelle in vivo

3-1 Echocardiographie

Afin d’évaluer la fonction cardiaque, nous avons réalisé une échocardiographie à 2, 6 et 15

semaines après traitement à la doxorubicine. Nous avons utilisé un échocardiographe (Vivid
9, General Electric Healthcare) avec une sonde spécifiquement dédiée aux petits animaux (15
MHZ). Une anesthésie gazeuse est réalisée par inhalation de 3% d’isoflurane et de 100%
d’oxygène (débit 1L/min) conduisant à une anesthésie modérée permettant d’immobiliser la
souris tout en limitant l’effet sur la fréquence cardiaque. Les images ont été enregistrées en
mode TM (temps mouvement) permettant l’obtention d’images en deux dimensions à partir
desquelles le diamètre de la cavité du ventricule gauche en diastole (Dtd) et en systole (Dts),
l’épaisseur totale des parois ainsi que la fréquence cardiaque ont pu être déterminés. Ces
données brutes ont également été utilisées afin de déterminer les paramètres de la contraction
du myocarde, notamment la fraction de raccourcissement (FR= [(Dtd-Dts)/Dtd] x100, les
volumes télédiastoliques (Vtd) et télésystoliques (Vts) à l’aide de la formule de Teicholz
(Vtd= 7Dtd3/ (2,4+Dtd)) et la fraction d’éjection (FE= [(Vtd-Vts)/Vtd] x 100). Les
échocardiographies ont été réalisées en collaboration avec P.Matéo et B.Crozatier.

3-2 Mesure électrophysiologique in vivo par télémétrie

Afin d’évaluer la présence d’arythmies sur les souris éveillées, des émetteurs TA11ETA-F10
faisant partie du système de télémétrie PhysioTel™ (Data Science International, USA) ont été
implantés en sous-cutanée au niveau de la cavité péritonéale des souris de 11 semaines
anesthésiées (isoflurane). Ce système permet d’enregistrer la fréquence cardiaque et
l’électrocardiogramme (ECG) de l’animal.
Une semaine après la chirurgie d’implantation, les souris âgées de 12 semaines ont été
injectées avec de la doxorubicine (12 mg/kg) ou une solution saline en contrôle. Les ECG ont
été enregistrés à 2 et 6 semaines après traitement. Les informations ont été traitées à partir des
données transmises de l’animal via un signal radiofréquence au receveur RPC-1 (DSI).
L’analyse des ECG a été réalisée à l’aide du logiciel ecgauto v3.0 (Emka Technologies).

Page
122
3-3 Histologie

L’analyse des atteintes du tissu cardiaque de ces souris a été réalisée à ces mêmes temps sur
coupes histologiques par inclusion en paraffine. En effet, après fixation dans 4% de
paraformaldéhyde, les coupes des coeurs des souris traitées ou non à la doxorubicine ont été
inclues dans de la parafine puis sectionnées (3µM).
Différents marquages ont été utilisés dont le marquage HE (hématéine qui colore les noyaux
en violet et éosine qui colore les cytoplasmes en rose) permettant l’observation de la
morphologie et l’inflammation du cœur, le marquage tunel qui permet de quantifier les
cellules apoptotiques et le marquage au rouge sirius (picrosirius red F3BA) permettant la
mesure du collagène interstitiel et donc la quantification de la fibrose.
Le marquage tunel a été réalisé à l’aide du kit ApopTag (ApopTag® Fluorescein Direct In
Situ Apoptosis Detection Kit, Millipore) en accord avec les instructions du fournisseur. En
effet, cette technique permet de détecter la coupure du terminal deoxynucleotidyltransferase-
mediated dUTP-biotine après fragmentation de l’ADN localisée dans les noyaux et les corps
apoptotiques.
Deux à trois sections par animal et 5 à 10 champs par sections ont été analysés au
grossissement 20X et 40X. Les images ont été enregistrées par microscopie (AxioCam MRc
(Carl Zeiss)).

3-4 Microscopie confocale sur cardiomyocytes isolés

Les cardiomyocytes des ventricules de souris témoins et des souris Dox ont été dissociés par
digestion enzymatique (1 mg/ml collagenase de type II, Worthington) en utilisant le système
de perfusion Langendorff. Seules les cellules quiescentes et excitables ont été utilisées pour
ces expériences. Le calcium intracellulaire ([Ca2+]i) des cardiomyocytes ventriculaires
intactes chargés avec une sonde calcique fluorescente (Fluo 3-AM, excitation par laser blanc à
une longueur d’onde de 500nm, émission collectée à >510nm, à 5µM pendant 30 min à
température ambiante) a été enregistré par le microscopie confocale (Leica TCS SP5X,
objectif 40x, mode balayage de ligne, selon l’axe longitudinal de la cellule à 1,43ms/ligne).
Les transitoires calciques ont été obtenus sur des cellules perfusées avec une solution Tyrode
(140 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 1.1 mM MgCl2, 1.8 CaCl2
mM; pH=7.4) puis stimulées électriquement à 2 Hz par field stimulation en utilisant deux
électrodes en platine en parallèle.

Page
123
Les sparks calciques spontanés ainsi que les vagues calciques ont été obtenus sur des cellules
quiescentes après stimulation.
Afin d’estimer la charge en Ca2+ du réticulium sarcoplasmique (RS), les cellules ont été
stimulées à 2 Hz permettant une charge stable en Ca2+ du RS puis rapidement exposées à
10mM de caféine.
L’analyse des images enregistrées par le microscope confocal a été réalisée à l’aide du
logiciel IDL 8.2 (Exelis Visual Information Solutions, Inc.) en utilisant des protocoles créés
par notre laboratoire.
Les expérimentations et les analyses ont été effectuées en collaboration avec A-M.Gomez et
A.Llach.

4- Méthodes de biologie cellulaire : étude de la viabilité cellulaire

par cytométrie en flux

Les cellules (CVRN, MCF7, A549) après traitement de 24h en présence ou non de
doxorubicine ont été détachées par de la trypsine (incubation 5 min 37°C) puis ont été
marquées avec la sonde fluorescente perméante fluorescéine diacétate (FDA 0,1µg /mL,
Sigma) pendant 5 min à température ambiante et analysés par cytomètrie (cytomètre FC500
Beckman Coulter) à hauteur de 5 000 à 10 000 cellules par condition.
Le FDA est clivé par les estérases de la cellule vivante en fluorescéine (fluorescence verte,
émission à 520nm). Dans les cellules mortes, les estérases n’étant plus actives, le FDA n’est
pas clivé et n’émet donc pas de fluorescence. Le marquage au FDA permet ainsi d’évaluer la
viabilité cellulaire.

5- Méthodes de biologie moléculaire et de biochimie

5-1 Lyse cellulaire

Afin d’extraire les protéines, les CVRNs ont été lysés mécaniquement (grattage sur glace)
dans du tampon RIPA (50mM Tris pH 8, 150mM NaCl, 20mM MgCl2, 0,1% SDS, 0.5 %
DOC et 1% Triton X100) supplémenté avec un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de
phosphatases (Roche Applied Science). Les lysats tissulaires ou cellulaires ont été centrifugés
à 15 000 g pendant 20 min à 4°C.

Page
124
Les tissus ventriculaires de souris ont été lysés mécaniquement à l’aide d’un broyeur-
homogénéiseur Precellys® (Bertin Technologies) dans 250µl pour une moitié de ventricule
gauche et 150µL pour une moitié de ventricule droit dans un tampon de lyse RIPA.

5-2 Dosage protéique

La concentration en protéine des surnageants a été déterminée par la technique colorimétrique

du kit SMARTTM BCA (iNtRON Biotechnology) utilisant de l’acide bicinchoninique à 98%
et du sulfate de cuivre II à 2% (Sigma Aldrich).
Les ions cuivriques Cu2+ sont réduits en ions cuivreux Cu+ par les protéines et forment avec
l’acide bicinchoninique un complexe pourpre dont l’absorbance à 540 nm, proportionnelle à
la quantité de protéines, est mesurée par un spectrofluorimètre (TECAN-Genios). Leur
concentration est déterminée par rapport à une gamme de BSA (sérum albumine bovine).

5-3 Précipitation par affinité de Rap1-GTP et Rac1-GTP

Cette technique permet de mettre en évidence l’activation des petites protéines G Rap1 ou
Rac1. Elle repose sur la capacité de la forme active Rap1 (Rap1-GTP) ou Rac1 (Rac1-GTP) à
se lier respectivement au domaine GDS des protéines de fusion GST RalGDS (RalGDS étant
son effecteur) et Cdc42/Rac Interactive Binding Domain (CRIB) de la p21-activated kinase
(PAK). La méthode consiste ainsi à précipiter Rap1-GTP ou Rac1-GTP à l’aide de billes de
sépharose/glutathion sur lesquelles sont greffées des protéines de fusion contenant les
domaines Ral(GDS) ou CRIB-PAK et la glutathion S transférase (GST).

5-3-1 Préparation des protéines de fusion

Des bactéries HB101 transformées par le plasmide PGEX2T (Amersham Pharmacia Biotech)
contenant l’insert Ral(GDS)-GST ou CRIB-PAK ont été cultivées à 37°C dans du milieu LB
(Lysogeny Broth) en présence de 100µg/mL d’ampicilline jusqu’à ce que la densité optique
de la culture bactérienne à 600 nm atteigne une valeur de 0,6. La synthèse protéique a été
induite pendant 4h par ajout d’iso-propyl-thio-galactopyrannoside (IPTG, 1mM). Après
centrifugation à 3500 g pendant 15 min à 4°C, le culot bactérien a été lysé par sonication dans
un tampon de lyse (20% de sucrose, 10% glycérol, 50mM tris pH 7,5, 2 mM MgCl2, 0,2 M
Na2S2O5, 2mM dithiothreitol (DTT), 1 mM PMSF, supplémenté avec un cocktail
d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Roche Applied Science)).

Page
125
Après centrifugation à 15000g pendant 20min à 4°C, les surnageants contenant la protéine de
fusion ont été congelés à -80°C. La pureté de la préparation a été évaluée par électrophorèse
dénaturante en gel de polyacrylamide après coloration du gel au bleu de Coomassie.

5-3-2 Couplage de la protéine de fusion à des billes de glutathion

Les lysats bactériens contenant les protéines Ral(GDS)-GST ou CRIB-PAK ont été incubés
sous agitation pendant 1h à 4°C avec des billes de sépharose couplées au glutathion réduit.
L’enzyme GST présente un haut degré d’affinité pour le glutathion ce qui permet la fixation
de la protéine de fusion aux billes de sépharose. Après centrifugation à 5000 g pendant 1 min,
les culots sont lavés dans un tampon contenant 50mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 20 mM
MgCl2, 0,1% Triton X100, 1mM PMSF supplémenté avec un cocktail d’inhibiteurs de
protéases et de phosphatases.

5-3-3 Précipitation par affinité

30µL de billes/Ral(GDS)-GST ou billes/CRIB-PAK-GST ont ensuite été incubées 1h à 4°C

avec 250µg de protéines obtenues après traitement et lyse des cardiomyocytes. Après lavage
et centrifugation, les complexes Rap-GTP/Ral(GDS)-GST/billes ou Rac-GTP/CRIB-PAK-
GST ont été repris dans 35µL de tampon de charge puis ont été dissociés par 5 min de
chauffage à 95°C. Parallèlement, 20µg de lysats cellulaires bruts sans traitement (lysat totaux)
ont été dilués 2 fois dans du tampon de charge. Ceux-ci contiennent les petites protéines G
sous leur forme active (liée au GTP) et inactive (liée au GDP). Ils permettent de comparer le
niveau d’activation de Rap1 ou Rac1 de chaque puit en s’assurant que leur niveau
d’expression est identique dans chaque échantillon cellulaire. Les protéines sont ensuite
révélées par la technique de western blot.

5-4 Band Depletion Assay

Le Band Depletion Assay (BDA) permet d’étudier la formation du complexe de clivage

ADN-Topoisomérase II β à l’origine des cassures double brin de l’ADN. La topoisomérase
liée de manière covalente à l’ADN ne peut pénétrer dans le gel de polyacrylamide (SDS-
PAGE) et ne sera pas détectée par Western Blot.

Page
126
Ainsi, dans le cas d’une formation de complexes clivables ADN-TopII β, l’intensité de la
bande de la TopII β diminuera significativement (habituellement entre 70 et 90%).
L’étoposide (100µM pendant 1h), inhibiteur de la TopII, sera utilisé comme contrôle positif
de formation de complexes clivables (351).
Cette technique consiste à lyser les cellules dans le tampon Roti-Load (Roth Karlsruhe)
chauffé au préalable à 96°C avant sonication. Les étapes suivantes sont identiques à celle d’un
western blot.

5-5 Western blot

Cette technique permet de mettre en évidence une protéine spécifique au sein d’un lysat
cellulaire. Elle est composée d’une étape d’électrophorèse permettant de séparer les protéines,
d’une étape de transfert indispensable au marquage des protéines par des anticorps spécifiques
et enfin d’une étape de révélation.

5-5-1 Electrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)

Les protéines sont d’abord séparées selon leur poids moléculaire par électrophorèse
dénaturante en gel de polyacrylamide. Les échantillons (30µg de protéines) sont dilués dans
du tampon de charge de Laemmli (dilution 1 :1 ; 125mM Tris, 10% glycérol, 0,001% bleu de
bromophénol, 2% SDS, 5% β-mercaptoéthanol), puis incubés ou non pendant 5 min à 95°C
ou pendant 20 min à 37°C suivant les protéines. Les protéines sont ainsi dénaturées et
chargées négativement par le sodium dodécyl sulfate (SDS) et le β-mercaptoéthanol. Les
échantillons migrent ensuite sous l’action d’un champ électrique de 80 V pendant 30 min dans
un premier gel de tassement à 5% d’acrylamide (17% bis acrylamide 30:0.8, 0.125mM Tris
pH 6.8, 0.1% SDS, 0.1% ammonium persulfate, 0.001% Temed). Les protéines sont ensuite
séparées pendant 1h30 à 120 V dans un gel à 8, 10 ou 15% d’acrylamide (suivant la taille de
la protéine d’intérêt) (pH 8,8) immergés dans un tampon de migration (0.3% Tris, 1.44%
glycine, 0.1% SDS).

Page
127
 5-5-2 Transfert des protéines sur une membrane

En fin d’électrophorèse, les protéines sont transférées du gel de polyacrylamide sur une
membrane de PVDF (polyvinylidène difluoride) (Immobilon, Millipore) pendant 1h30 à 4°C
sous l’action d’un champ électrique de 110 V. La membrane a été préalablement activée par
du méthanol et équilibrée par du tampon de transfert (0.3% glycine, 0.3% Tris, 20%
méthanol). Cette étape permet de charger la membrane positivement afin qu’elle retienne les
protéines (chargées négativement).
Les transferts des pull down (précipitation par affinité de Rap1-GTP et Rac1-GTP) ont été
effectués à 40V à 4°C pendant la nuit.

5-5-3 Immunomarquage

Les sites de liaisons non spécifiques des anticorps sont saturés par incubation des membranes
pendant 1h dans du tampon 0,1% TTBS (0.1% Tween, 24.2% Tris, 292.2% NaCl) contenant
5% de lait. Les membranes sont ensuite incubées toute la nuit à 4°C avec l’anticorps primaire
dirigé spécifiquement contre la protéine d’intérêt puis 1h avec un anticorps secondaire couplé
à la HRP (Horseradish peroxidase). Entre chaque étape, les membranes sont lavées avec du
0,1% TTBS 3 fois pendant 10 min.

5-5-4 Révélation

Les protéines d’intérêt sont mises en évidence par chimioluminescence. Les membranes sont
incubées pendant 5 min avec le substrat de la peroxydase (Luminata Forte, Millipore ou
Femto, ThermoScientific). Le substrat est oxydé par l’enzyme et émet un signal lumineux
visible à l’aide d’une caméra CCD (ChemiDoc XRS+Bio-rad). Le signal est quantifié à l’aide
du logiciel Quantity One (Bio-rad) et normalisé par un contrôle de charge (β-actine).

5-6 Activité Epac1

L’activité d’Epac1 a été mesurée à l’aide de la technique BRET (bioluminescence resonance

energy transfer) d’après le protocole de Brown et al (489). Lors de ces expériences, une sonde
CAMYEL (cAMP sensor using YFP-Epac-RLuc) a été utilisée.

Page
128
Il s’agit donc d’une sonde composé d’un donneur la coelentérazine, molécule luminescente
dont l’excitation est déclenchée par réaction enzymatique effectuée par la renilla luciférase
(RLuc) et d’un accepteur qui est ici la citrine, protéine fluorescente dérivée de la YFP (yellow
fluorescent protein) (cf.Figure 35).

Figure 35: Construction de la sonde CAMYEL

Ainsi, la liaison de l’AMPc sur Epac1 induit un changement de conformation qui résulte en
une diminution du BRET se traduisant par l’éloignement de la luciférase et de la citrine. En
effet, en absence de toute interaction, l’ajout de coelenterazine sur les cellules co-exprimant
les deux protéines recombinantes se traduit par un spectre d’émission avec un pic centré à 465
nm. Toutefois, si les deux protéines sont en interaction un deuxième pic caractéristique du
BRET apparaît aux environs de 535 nm. Ce pic correspond à l’émission de la citrine excitée
par le transfert d’énergie provenant de la réaction enzymatique. Ainsi, les CRNVs exprimant
la sonde CAMYEL sont lysés dans le tampon CAMYEL (40nM Hepes, pH 7.2, 140 mM KCl,
10mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5% triton X-100, 1% d’inhibiteur de protéases). Après
centrifugation (20 000g pendant 10 min), le surnageant a été récupéré et dilué à la
concentration voulue. 100µL du surnageant sont ensuite déposé dans une plaque 96 puits et
traités pendant 5 min à température ambiante avec de la coelentérazine (2µM) avant la mesure
du BRET. L’émission de la RLuc et de la citrine est ensuite mésurée simultanément à 465 et
535nm par le luminomètre (Beckman Coulter).
Le BRET est ensuite déterminé ratiométriquement en divisant l’émission du donneur par
l’émission de l’accepteur ( 465nm/565 nm). Afin de s’abroger de l’hydrolyse de l’AMPc par
les PDEs conduisant à une diminution du BRET, les expériences ont été réalisées à
température ambiante, l’hydrole de l’AMPc étant température-dépendante.

Page
129
5-7 Activité calcineurine

La mesure de l’activité calcineurine (PP2B) a été réalisée à l’aide du kit colorimétrique

« Calcineurin cellular activitiy assay » (réf 207007, Merck Millipore). Après extraction des
protéines des cellules traitées ou non à la dox pendant 24h et l’étape de dessalage des
échantillons, l’activité phosphatase de la calcineurine est déterminée après ajout du substrat de
la calcineurine (RII phosphopeptide). L’ajout d’un réactif vert (vert malachite) permettra
ensuite la détection de phosphate libre par un spectro-fluorimètre (Tecan) à 620nm. Le
substrat pouvant être clivé par d’autres phosphatases, l’ajout d’inhibiteur sélectif ou non
permettra ensuite de discriminer la calcineurine ou PP2B des autres phosphatases (PP1, PP2A
et PP2C). En effet, pour chaque échantillon, nous avons incubés différents inhibiteurs ou
agents permettant de déterminer l’activité spécifique de la calcineurine. Ainsi, la calcineurine
étant une protéine calcium dépendante, la condition contenant de l’EGTA, chélateur de
calcium, représentera ainsi l’activité totale-activité calcineurine (CN= Total-EGTA).
Enfin le tampon contenant de l’EGTA et de l’acide okadaic inhibe la PP1, la PP2A et la
PP2B, mais pas la PP2C. L’acide okadaic inhibant la PP1 et la PP2A, les conditions acide
okadaic (OA)-(acide okadaic+EGTA) permettra ainsi également d’obtenir une mesure de
l’activité calcineurine (CN= OA-(OA+EGTA)). Enfin, une gamme étalon de différentes
concentrations en phosphate, servant de contrôle de la réaction, est également effectuée et
permet ainsi de mesurer la concentration en phosphate libérée.

5-8 Activité luciférase

L’objectif de ce test est de mesurer l’activité transcriptionnelle du promoteur des marqueurs

de stress et de remodelage cardiaque (ANF, SRE c-fos et α-skM) ainsi que des facteurs de
transcription (MEF2, NFAT, NFĸB) en présence ou non de doxorubicine et/ou de
modulateurs pharmacologiques d’Epac.
Les CVRNs sont transfectés avec une construction plasmidique comportant un gène
rapporteur codant pour la luciférase sous contrôle d’un promoteur ou d’un élément de réponse
spécifique correspondant à celui de l’ANF, SRE c-fos, α-skM, MEF-2, NFAT, NFĸB (voir
paragraphe 2-1-3).

Page
130
L’induction d’expression du gène rapporteur par les traitements est proportionnel à la quantité
protéique de luciférase produite et donc à l’activité du promoteur des gènes d’intérêt. La
luciférase oxyde son substrat : la luciférine conduisant à l’émission de photons enregistrés par
un luminomètre.
L’activité de la luciférase a été déterminée à l’aide du kit Dual Luciferase Reporter Assay
System (Promega).
Les cellules ont été lysées avec un tampon contenant 25mM Tris-phosphate pH 7.8, 2mM
DTT, 2mM acide 1,2-diaminocyclohexane-N, N, N´, N´-tétra-acétique, 10% glycérol, 1%
Triton X-100 et des inhibiteurs de protéases. 20 µl de surnageant ont été prélevés et déposés
dans une plaque 96 puits blanche puis incubés pendant 15 sec avec un tampon contenant le
substrat de la luciférase Firefly, la luciférine dans le tampon Luciferase Assay Substrate
(Promega). La quantité de photons libérés suite à l’oxydation de la luciférine par la luciférase
présente dans les extraits cellulaires, a été analysée par luminométrie. Cette activité luciférase
a ensuite été normalisée par l’activité renilla mesurée à l’aide du substrat de la luciférase
Renilla, la coelentérazine dans le tampon Stop&Glo (Promega).

6-Statistiques

Les valeurs indiquées dans les résultats sont des moyennes ± SEM ou des variations indiquées
en % de ces valeurs. Les résultats obtenues dans cette étude ne suivent pas une loi normale
(normalité des distributions) ni l’égalité des variances. Nous avons donc choisi d’utiliser un
test statistique non paramétrique. Un test non paramétrique est réalisé pour les comparaisons
entre 2 groupes (Mann-Whitney). Les comparaisons réalisées pour plus de 2 groupes ont été
analysées par un test non paramétrique Krustal Wallis. Les valeurs sont considérées comme
statistiquement différentes à partir de P<0.05. Les étoiles représentent les différences
significatives avec p<0,05 (*), p<0.01 (**) ou p<0.001 (***) vs contrôle.

Page
131
Résultats

Page
132
Résultats

1- Altération temps dépendante de l’homéostasie calcique induite

par la doxorubicine

1-1 Position du problème

Les bénéfices thérapeutiques de la chimiothérapie sont incontestables dans le traitement de
nombreux types de cancers et notamment dans les cancers pédiatriques, les cancers du sein et
les lymphômes. Néanmoins son utilisation est parfois limitée du fait de leurs effets
secondaires tardifs. Parmi ces effets secondaires, la toxicité cardiaque induite par la
chimiothérapie et plus particulièrement la doxorubicine est un facteur limitant majeur (259).
En effet, la doxorubicine peut entraîner des arythmies et une altération de l’homéostasie
calcique menant à une dysfonction cardiaque se caractérisant par une cardiomyopathie dilatée
plusieurs années après la fin du traitement (313). En effet, le maintien de l’homéostasie
calcique est essentiel à l’activité électrique ainsi qu’à la contractilité cardiaque. Lors de la
systole, le courant calcique active les canaux sensibles à la dépolarisation (LTCC) qui
permettent l’entrée du calcium dans la cellule. L’entrée du calcium permet d’activer
l’ouverture des récepteurs à la ryanodine (RyR2) qui libèrent ensuite les stocks calciques du
RS dans le cytosol. Le calcium ainsi libéré dans le cytosol permet la contraction des
myofilaments. Lors de la diastole, le Ca2+ est rapidement capté vers le RS par la Ca2+/ATPase
SERCA2a et hors de la cellule par l’échangeur Na+/Ca2+ (NCX) et permet ainsi la relaxation
cardiaque (12). A ce titre, il a été montré in vitro que la doxorubicine entraîne une altération
biphasique de la concentration intracellulaire en Ca2+ ([Ca2+]i ): une augmentation de la
[Ca2+]i à faible dose ou en traitement aigü puis une diminution de l’amplitude de contraction
temps dépendante à forte dose. De plus, la doxorubicine se lie à plusieurs protéines de la
signalisation calcique et notamment RyR2, la calséquestrine et SERCA2a et altère ainsi de
façon ROS dépendante le couplage excitation-contraction. Néanmoins, les mécanismes exacts
à long terme de l’altération de l’homéostasie calcique induite par la dox ne sont pas connus.

Page
133
Cette étude a donc pour objectifs :
- La mise en place d’un modèle de cardiotoxicité induite par la dox
- L’analyse de la cinétique de développement de cette cardiotoxicité
- La caractérisation des altérations de la fonction cardiaque associées au
traitement à la dox
- La caractérisation des altérations de l’homéostasie calcique induite par la dox
- La caractérisation des voies de signalisation impliquées dans le processus
pathologique
Dans ce but, nous avons ainsi mis en place un modèle murin de cardiotoxicité induite par la
dox. Les atteintes physiologiques et fonctionnelles cardiaques induites dans ce modèle ont été
évaluées par échocardiographie à différents temps post traitement (2, 6 et 15 semaines après
traitement).
Les altérations de l’homéostasie calciques induites par la dox ont été caractérisées dans ce
même modèle par l’étude des effets de la doxorubicine sur les transitoires calciques
(augmentation transitoire de la [Ca2+]i observée au cours du couplage excitation-contraction),
les sparks calciques (qui correspondent à l’ouverture brèse et rapide des canaux RyR2) ainsi
que la charge en calcium du RS. Enfin, une étude biochimique a également été réalisée afin de
de caractériser les altérations de l’expression des protéines impliquées dans le couplage
excitation-contraction dont la SERCA2a, le PLB, le RyR2 et le NCX aux mêmes temps
d’analyse. Cette étude permettra ainsi de déterminer les altérations de la signalisation calcique
par la dox et son rôle dans le développement de la cardiotoxicité.

1-2 Résultats
Les résultats de cette étude sont présentés dans l’article suivant :
Ca2+ handling alterations in cardiac dysfunction following chronic doxorubicin treatment in
mice; Anna Llach, PhD, Marianne Mazevet, MSc, Philippe Mateo, MSc, Olivier Villejouvert,
MD, Bertrand Crozatier, PhD, Jean-Pierre Benitah, PhD, Eric Morel, PhD, Ana M Gómez,
PhD.

Page
134
 1-Title page

Full title: Ca2+ handling alterations in cardiac dysfunction following chronic doxorubicin

treatment in mice

First author’s surname and short title (50 characters max): Llach, calcium and Doxorubicin

cardiotoxicity

Author’s names, academic degrees and affiliations:

Anna Llach, PhD, Marianne Mazevet, MSc, Philippe Mateo, MSc, Olivier Villejouvert, MD,

Bertrand Crozatier, PhD, Jean-Pierre Benitah, PhD, Eric Morel, PhD, Ana M Gómez, PhD.

Inserm UMR-S 1180, LabEx Lermit-DHU Torino, Châtenay-Malabry cedex, France

Corresponding author:

Éric Morel, Inserm UMR-S 1180, LabEx Lermit-DHU Torino, Université Paris-Sud, Faculté

de pharmacie, Signalisation et Physiopathologie Cardiovasculaire, Tour D4, 5ème étage, 5 rue

Jean-Baptiste Clément 92296 Châtenay-Malabry cedex, France.

Fax number: 01 46 83 54 75 Telephone number: 01 46 83 53 20 email: eric.morel@u-psud.fr

Total word count of the manuscript: 6078 words

Two to five subject codes that best classify your manuscript, chosen from the subject code list

for authors: [11] Other heart failure, [130] Animal models of human disease, [138] Cell

signalling/signal transduction, [136] Calcium cycling/excitation-contraction coupling

Page
135
 2-Abstract and Key words

Abstract

Cardiac failure is a common complication in cancer survivors treated with Anthracyclines.

Here we have examined cardiac function and excitation-contraction coupling in a mice model

of in vivo Doxorubicin treatment. Animals were injected i.v. 3 times with either Dox (10

mg/Kg) or saline solution. Cardiac function by echocardiography was evaluated at 2, 6 and 15

weeks after the last injection. EC coupling and protein level was measured in ventricular

cardiomyocytes isolated at the same time points. We found that in vivo cardiac function was

normal at 2 and 6 weeks, but significantly reduced at 15 weeks after the last injection. In

order to evaluate the mechanisms underlying this dysfunction, we measured [Ca2+]i transients

by confocal microscopy and action potential characteristics by patch-clamp technique in

cardiomyocytes isolated at these times. We found a significant depression and slowing of the

[Ca2+]i transients as early as 2 weeks after the last injections, which was overcome at 6 weeks,

but finally failed again at 15 weeks, coinciding with echocardiographic evidences. These

defects are due, at least in part to a decrease in the SERCA2a expression at these 2 time

points, and a significant decrease in the SR Ca2+ load at 15 weeks. Ca2+ leak through

spontaneous Ca2+ sparks was enhanced at 2 and 15 weeks, coinciding with the [Ca2+]i

transients alteration. While total RyR2 was maintained at 15 weeks, its phosphorylated level

both at the PKA and CaMKII sites was enhanced at 2 weeks. At this time, proarrhythmogenic

Ca2+ waves were enhanced. In summary we show that Dox treatment induces alterations in

Ca2+ handling. While from the Ca2+ handling point of view the alterations echo those found in

other models of heart failure, there is no prolongation of the AP duration nor hypertrophy.

Thus Doxo induced cardiac dysfunction is specific and should be specifically prevented or

treated.

Keywords: Calcium homeostasis, doxorubicin, cardiotoxicity

Page
136
Introduction

Early detection and efficacious management of anticancer therapies have enhanced the

number of cancer survivors. However, on top of the acute side effects, some toxicities

manifest later, sometimes years, after ending the chemotherapy, which are severe enough to

hamper their life. Among these, cardiotoxicity of anticancer therapy is a severe condition in

cancer survivors1. The cardiac complications are often progressive and irreversible and

include myocardial infarction, conduction defects, and heart failure (HF)1, 2. Anthracyclines

are a group of efficacious antineoplastic agents, but their use is limited by the severity of
2, 3
cardiotoxic side effects, (reviewed in ). Doxorubicin belongs to the Anthracycline family

and is used in several cancers including breast cancer, hematological cancers, lymphomas,

both in adult and pediatrics. However their use is limited by the risk of cardiotoxicity, which

is dose-dependent 4. It is thus important to elucidate the underlying mechanisms of cardiac

side effects in order to prevent or limit the cardiotoxic manifestations, maintaining the

anticancer effects. Among different proposed mechanisms, oxidative stress has been pointed

out from in vitro analyses and antioxidants have been used in an attempt to prevent them, but
4, 5
without satisfactorily results . Cell death and metabolic alterations are other mechanisms

that may be involved in doxorubicin cardiac toxicity, among others such as autophagy and

intracellular Ca2+ deregulation 4, 6, 7.

Ca2+ has a key role in the cardiac function, being essential, among others roles, for electrical

activity, excitation-contraction (EC) coupling, and excitation-transcription coupling 8. For

cardiac contraction, the membrane depolarization of the cardiomyocytes activates the L-type

Ca2+ channels, allowing the entry of some Ca2+ from the extracellular space. The local [Ca2+]i

elevation activates neighboring Ca2+ release channels located at the sarcoplasmic reticulum

(SR), named ryanodine receptors type 2 (RyR2). The opening of RyR2s induces a global

elevation on [Ca2+]i able to activate contractile myofibrils and contraction.

Page
137
This [Ca2+]i elevation is transient, as cytosolic [Ca2+]i regain diastolic levels, allowing cell

relaxation by Ca2+ extrusion and uptake into the SR. Extrusion is mainly accounted by the

Na+/Ca2+ exchanger (NCX) and uptake to the SR Ca2+ ATPase (SERCA), although other

systems participate to a minor degree 8. Alterations in this mechanism of EC coupling is

involved in depressed contraction/relaxation function in the failing heart. As heart failure

evolve with time, the alterations may vary with the severity and experimental model, but most

studies point out to a prolongation of the action potential (AP) duration, maintenance on the

L-type Ca2+ current density, and depressed [Ca2+]i transients 9.

However, depressed contractile function in heart failure of different etiologies may reflect

different alterations in the EC coupling. In this sense, while hypertension and myocardial
10-12
infarction induce the alterations cited above , diabetes-induced cardiac dysfunction

include a reduction in the L-type Ca2+ current density 13

. Thus, doxorubicin-induced heart

failure might share some alterations together with heart failure of other etiologies. Knowing

the underlying mechanism is important in order to prevent or treat this heart failure. Up to

date, while there are some data on acute effects of doxorubicin on EC coupling, very few

analyses have addressed the question in doxorubicin-induced cardiac dysfunction after

chronic treatment6. Most of collected data have found a decreased expression of SERCA14,15

and phospholamban14, consistent with prolongation of the [Ca2+]i transient16. However, other
17
studies have found no alteration on SERCA expression , or even a deleterious effect on

survival and histological alterations by Anthracycline treatment on SERCA overexpressing

mice18. RyR expression has also been found depressed by Anthracycline chronic treatment17,
19
.

In this paper, we have adressed the analysis of cardiac function and Ca2+ dynamics in mice

treated intravenously with doxorubicin, at different times after the end ot the treatment. We

have found an initial depression in [Ca2+]i transient amplitudes, at two weeks after the end of

Page
138
the treatment, that is compensated at 6 weeks. Cardiac function analyzed by echocardiography

showed an impairement at 15 weeks after the end of the treatment, that was correlated with a

depression in the [Ca2+]i transients at this time point. We thus conclude that intracellular Ca2+

alterations precede overt cardiac dysfunction in doxorubicin-induced cardiotoxicity.

Methods

Doxorubicin treated mice

All experiments were carried out according to the ethical principles laid down by the French

and European Union Council Directives for the care of laboratory animals. 12 weeks old,

C57BL/6 male mice received 3 i.v injections (3 days interval) of doxorubicin (DOX) up to a

total accumulated dose of 10.1±0.4 mg/kg. Control animals were injected likewise but with

saline solution (NaCl 0.9%). Data were obtained at 2, 6 and 15 weeks after last i.v. injection.

Echocardiography

Transthoracic echocardiography (Vivid 9, General Electric Healthcare, Piscataway, NJ) was

performed the day previous to the experiment using a 5MHz transducer under 3% isoflurane

gas anesthesia. Two-dimensional-guided (2D) M-mode echocardiography was used to

determine contractile parameters such as fractional shortening (FS) or ejection fraction (EF).

Myocyte isolation

Ventricular cardiac myocytes were isolated from control and treated mice 2, 6 and 15 weeks

after last i.v. injection using a standard enzymatic digestion20. Briefly, after heparine injection,

hearts were removed and placed in ice cold oxygenated Ca2+-free Tyrode solution containing

(in mM) NaCl 130, KCl 5.4, NaH2PO4 0.4, MgCl2 0.5, HEPES 25, glucose 22 and insulin

Page
139
0.01 µg/ml; pH=7.4 with NaOH. The aorta was cannulated and perfused retrogradely in a

Langendorff system with the same solution supplemented with collagenase type 2,

Worthington (1 mg/ml) and CaCl2 (0.1mM) until the flow was accelerated, indicating aortic

valve digestion. Then, the ventricles were minced and the cells were dispersed mechanically

in the same enzymatic digestion for 3 minutes, and filtered through a nylon mesh (300mm) to

eliminate debrys. Cells solution was gently centrifuged (20g) to eliminate supernatant with

collagenase and redisperse cells in the same solution solution containing no collagenase and

0.5mM CaCl2. This procedure was repeated to increase Ca2+ concentration to 1 mM. Only

rod-shaped cells, quiescent when unstimulated and excitable were used for the experiments.

Intracellular Ca2+ handling measurement

Intracellular calcium ([Ca2+]i) dynamics were recorded in intact ventricular myocytes loaded

with fluorescence Ca2+ dye Fluo-3 AM, (5 µM for 30min at RT) with a confocal microscope.

To record [Ca2+]i transients, cells were electrically stimulated at 2 Hz by field stimulation

using two parallel platinum electrodes21 while perfused with normal Tyrode solution (in mM):

NaCl 140, KCl 4, HEPES 10, MgCl2 1.1, CaCl2 1.8, glucose 10; pH=7.4 with NaOH. In order

to estimate Sarcoplasmic Reticulum (SR) Ca2+ content, cells were rapidly exposed to 10 mM

caffeine just after field-stimulated at 2 Hz to allow for stable SR Ca2+ load. Spontaneous Ca2+

sparks and waves were obtained in quiescent cells after field-stimulation recordings.

Images were obtained with a laser scanning confocal microscope (TCS SP5X Leica

Microsystems) equipped with an x40/x63 water-immersion objective (N.A. 1.4-1.2) in the

line scan mode (1.43 ms/line). The scanning line was selected parallel to the longitudinal cell

axis to be able to measure cell shortening. Fluo-3 was excited with a White light laser tuned at

500 nm, and emission measured at wavelengths above 510 nm. Image analyses were

Page
140
performed by homemade routines running in IDL 8.2 software (Exelis Visual Information

Solutions, Inc.). Images were corrected for the background of fluorescence.

Immunoblottinng

Mice left ventricular were lysed with RIPA lysis buffer containing protease and phosphatase

inhibitors (Roche). Sampling was done 2, 6 and 15 weeks after doxorubicin-treatment.

Immunodetection by Western-blot was performed by electrophoresis of proteins (20µg) in a

10%, 15% or 4-12% SDS-PAGE gel, followed by transfer to a PVDF membrane (GE

Healthcare). Membranes were blocked with TBS-Tween 0,1% - Milk 5% and incubated with

primary antibodies included SERCA2a (Santa Cruz; 1:1000), total PLB (Santa Cruz; 1:500),

phosphorylated PLB at Ser16 and Thr17 (Badrilla; 1:2000), total RyR2 (Pierce, 1:2000),

phosphorylated RyR at Ser 2814 and 2808 (Badrilla; 1:2000) and NCX (Swant; 1:1000).

Membranes were incubated with corresponding HRP secondary conjugated antibody (Santa

Cruz; diluted at 1∶10 000 in TBST containing 5% milk). Reactive proteins were visualized by

chemiluminescence detection system. Images were acquired using ChemiDocTM MP imaging

system (Biorad). Incubation with β-actin antibody (Santa Cruz Biotechnology, diluted at

1:30000) was performed to normalize the chemiluminescence levels and exposure times.

Statistics

Experimental data are expressed as means ± S.E.M. Differences between groups were

analysed by unpaired Student’s t-test. Differences were considered statiscally significant

when *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

Page
141
Results

Depressed Cardiac Function 15 weeks after last Dox injection

Here we aimed to investigate the effect of DOX treatment on a mice model. All animals

appeared normal in terms of body mass and behavior before treatment. Figure 1A shows

weekly monitoring of mice weight. Dox-treated animals did not grow for the first 3 weeks

after injection, and then grew steadily, but did not recover the initial retard. Because of the

difference in body weight, the ratio heart weight / tibia length was used as a morphometric

parameter of hypertrophy. Because this parameter changes with age, for display purposes data

are normalized at each age with respect to saline values. Fig. 1B shows that our model of

cardiotoxicity doesn’t cause cardiac hypertrophy as evidenced by unaltered ratio heart weight/

tibia length between saline and Dox-treated mice. Echocardiography characterization showed

only differences at 15 weeks after last injection (examples in Fig. 1C). Namely, the end

diastolic diameter was increased in the Dox-treated animals (3.68 mm in Dox treated mice vs

3.45 mm saline treated animal, n=7 p<0.05) and the Ejection Fraction (Fig. 1D) were

significantly depressed in Dox-treated animals.

[Ca2+]i transients Differently Modulated over time

Because we found a depressed contractile function at 15 weeks after Dox treatment, and

intracellular Ca2+ fluxes underlie cell contraction, we investigated intracellular Ca2+ handling

in mice treated with Dox. Figure 2A shows representative examples of line scan images taken

from ventricular cardiac myocytes under field-stimulation at 2 Hz. Dox treatment had

differents effects over time after last i.v. injection. Summarized data for [Ca2+]i transients

amplitude (F/F0) and constant of transient decay (Tau) are displayed in Fig. 2B and 2C.

[Ca2+]i transient amplitude (peak F/F0) was depressed at 2 weeks after Dox treatment.

Page
142
However, this initial depression was overcome at 6 weeks, where there was even an increase

in the [Ca2+]i transient amplitude. But this compensation was not maintained over time and,

consistent with the depressed cardiac function observed at 15 weeks after DOX treatment in

vivo, at the cellular level we observed a significant decrease in the [Ca2+]i transient amplitude

(Fig.2B) and slowing of its decay time (Fig. 2C). Unloaded cell shortening was significantly

depressed only at 15 weeks after last Dox injection (in % of cell length: at 2 weeks: 5.9±1.4 in

14 Saline cells vs 6.8±0.9, in17 Dox cell, p>0.05; at 6 weeks: 5.7±1.0 in 9 saline cells vs

6.2±1.1 in 12 Dox cells, p>0.05; at 15 weeks: 7.4±1.0 in 24 saline cells vs 4.4±0.7 in 18 Dox

cells, p<0.05)

No Altered Action Potential Duration

As [Ca2+]i transients are triggered by action potentials, the differences presented in Fig. 2

could be the result of alteration on action potential (AP) characteristics. Moreover, a common

characteristic of heart failure of other etiologies is a prolongation on the AP duration. Figure

3 summarize AP duration data in saline and Dox treated mice over time. Onset graph

recordings are examples of APs from saline and Dox treated mice at each time. No alterations

were observed in AP duration at 20 (APD20%), 50 (APD50%) nor 90% repolarization

(APD90%). This cellular data was consistent with no alteration of the QTc measured by

telemetry in mice (data not shown). Thus the [Ca2+]i transients alterations do not seem to be

due to AP duration alterations.

SR Ca2+ Load Reduced 15 weeks after last DOX injection

Thus if the trigger (AP) is not altered, alterations in the [Ca2+]i transient could be the result of

alterations in the amount of Ca2+ stored in the SR. We next studied whether or not the SR

Ca2+ load, estimated by caffeine-evoked [Ca2+]i transients, was altered by Dox.

Page
143
Cells were field-stimulated at 2 Hz allowing to achieve stable SR Ca2+ load, as during [Ca2+]i

transient measurements and then they were rapidly exposed to 10 mM caffeine. Figure 4

shows line scan images examples of cardiac myocytes during 2 Hz field-stimulation and

caffeine application (Fig. 4A) and the averaged amplitudes of the caffeine-evoked [Ca2+]i

transients (Fig. 4B). The pattern of alterations at different times after the last Dox injection

paralleled the alterations in [Ca2+]i transients amplitudes. Thus alterations in the SR Ca2+ load

could account for the decrease in the [Ca2+]i transients and contractions.

One cause of the decreased SR Ca2+ load could be due to altered expression or function of the

proteins involved in Ca2+ release, uptake and/or extrusion such as SERCA-phospholamban,

RyR, NCX. The decay phase of the electrically evoked [Ca2+]i transient in the mouse is

mainly due to Ca2+ uptake into the SR by SERCA, and in a minor extension to extrusion
22
through the NCX. Other slow systems account for about 1% . As shown in Fig. 2B, the

[Ca2+]i transient decay phase was slowed at 2 and 15 weeks after last Dox injection,

suggesting that SERCA and/or NCX function or expression are depressed at these time points.

During caffeine application, the RyR are kept open, thus any Ca2+ pumped back by SERCA is

immediately released through the open RyR. Thus the decay phase of the caffeine-evoked

[Ca2+]i transient is only due to extrusion, through NCX. We analyzed the constant time of

decay of the caffeine-evoked transients and found no significant difference at any time point

after Dox treatment (decay time constant, in saline vs dox: at 15 weeks 5.7±0.8, n=13 vs

6.4±1.4, n=25), suggesting that NCX function/expression is not altered after Dox treatment

and that the slowing of the electrically-evoked [Ca2+]i transient is due to SERCA depression.

This could explain the depressed SR Ca2+ load. Alternatively, in other models of heart failure,

an increase in the diastolic Ca2+ leak explained by a high activity of RyRs has been invoked to

account for reduced SR Ca2+ load.

Page
144
Spontaneous Ca2+ release in Dox treated mice

We analyzed the occurrence of spontaneous Ca2+ sparks in quiescent cells. Figure 5 shows

Ca2+ sparks frequency and characteristics in isolated cardiomyocytes from saline and Dox

treated mice. Representative line scan images examples of one cell from mouse after 15

weeks of Dox injection (right) or saline (left) are displayed in Fig. 5A, and averaged data on

Ca2+ sparks frequency at every time point in Fig. 5B. Coinciding with the time points of

depressed [Ca2+]i transients and SR Ca2+ load (2 and 15 weeks), there was an increase in the

frequency of Ca2+ sparks. Ca2+ sparks characteristics were also analyzed and we found a

decrease in their amplitudes consistent with the decrease in Ca2+ load (Fig. 5C). However, this

weaker amplitude would not limit Ca2+ leak since the frequency was greatly enhanced, and

also the duration of each Ca2+ spark (Fig. 5D). Ca2+ sparks width was only higher in Dox

treated animals at 15 weeks (Fig. 5E). Thus the calculated Ca2+ leak through Ca2+ sparks was

significantly enhanced in Dox-treated animals. Under pathological circumstances, Ca2+ sparks

may be propagated, generating arrhythmogenic Ca2+ waves (Fig. 5F). The occurrence of

spontaneous Ca2+ waves was significantly enhanced early after the Dox treatment (Fig. 5G).

Ca2+ handling protein expression and phosphorylation underlie the functional

alterations in Dox-cardiomyopathy

We then addressed the evaluation of Ca2+ handling protein expression in our Dox mice model.

The analysis of [Ca2+]i transient decay phase (Fig.2) suggests that SERCA function may be

impaired at 2 and 15 but not at 6 weeks after Dox injection. Fig. 6A shows western blots

examples and averaged data of each animal group, indicating a significant decrease in

SERCA expression at 2 and 15 weeks after Dox treatment, compared to the saline-treated

animals. SERCA function is depressed by unphosphorylated phospholamban.

Page
145
We thus analyzed total and phosphorylated phospholamban levels. Total phospholamban

levels were normal at 2 and 15 weeks, but reduced at 6 weeks after Dox treatment compared

to saline treated mice (Fig. 6B). This could help the compensatory phase at 6 weeks.

Phospholamban phosphorylation levels were similar at S16 neither at T17 between Dox and

saline treatment at any analyzed time point following Dox treatment (Supp. Fig. 1A).

Consistent with the decay phase of caffeine-evoked Ca2+ transients, dox treatment failed to

significantly modulate NCX expression (Supp. Fig. 1B). Taken together, these data could

explain the effects on [Ca2+]i transients and SR Ca2+ load. However, Ca2+ sparks frequency is

enhanced at times where the SR Ca2+ load is depressed. We addressed then the measurement

of RyR amount and its phosphorylation level. Images in Fig. 6C are representative western

blots of RyR total and phosphorylated at the PKA (equivalent to S2808) and CaMKII

(equivalent to P2814) sites. As shown in the averaged data (Fig. 6C bottom), Total RyR

expression was initially reduced at 2 weeks after Dox treatment, and normalized afterwards

(left). RyR phosphorylation at the PKA site was significantly enhanced at 2 and 15 weeks.

However, RyR2 phosphorylation at the CaMKII site was only significantly elevated

compared to control group at the early time point, 2 weeks after Dox treatment (right).

Discussion

Here we analyzed the cellular and molecular mechanisms of cardiac dysfunction, focusing in

excitation-contraction coupling. We found that doxorubicin treatment induced an initial

increase in diastolic Ca2+ leak, which returned later to normal. However, long time after the

treatment, the animals presented a slight but significant enlargement of the left ventricle

diameter and depressed ejection fraction, which can be at least in part explained by a

Page
146
depression in the [Ca2+]i transients, but without alteration in the electrical properties as

opposed to other heart failure models.

Doxorubicin is an effective antineoplastic drug whose use is hampered by its cardiac side

effects. While these cardiotoxicity may be acute during Dox treatment, some may appear even

years after the end of chemotherapy 4, with progressive decrease in the contractile function

(measured as ejection fraction) that may lead to irreversible heart failure 3. Once clinical signs

of heart failure appeared, the patients are treated as any patient with heart failure of other

etiologies including inhibitors of angiotensin-renin-aldosterone system and β-blockers 1.

However, the cellular and molecular mechanisms involved in doxorubicin cardiotoxicity are

not completely understood.

Several experimental data have been collected upon acute Anthracyclines application.
23
In this sense and concerning the EC coupling, Sag. et al found that isolated cardiac

myocytes perfused 30 minutes with Dox increased the Ca2+ sparks occurrence and decreased

[Ca2+]i transients. These effects were attenuated, but not completely prevented by CaMKII

inactivation. Because Ca2+ sparks reflect RyR2 openings 24, a direct effect of Dox on the RyR

may also contribute to the acute effects. In fact, Dox can bind and have a direct effect on the
25
RyR2 enhancing its activity . In this sense, Hanna et al have shown that Dox and its

metabolite have direct effects on the RyR2, inducing an initial and washable increase in its

opening which might contribute to the elevated Ca2+ sparks rate, and then an inhibition. While

the first effect might be prevented by antioxidants, the latter could not 26, 27. Direct effects on

SERCA2a activity have also been shown, diminishing its activity 27, which could account for

the depressed [Ca2+]i transients and SR Ca2+ content 27. In guinea pig papillary muscles, Dox

acute effects are on one side positive inotropic by AP duration prolongation and NCX

extrusion depression, but also inhibits RyR2 28.

Page
147
However, although these data are important and may account for cardiotoxicity during

chemotherapy, the alterations in EC coupling after chronic Dox treatment and its evolution

over time after the end of chemotherapy are not known.

Here we have established a model of in vivo Dox treatment by 3 i.v. Dox injections

and analyzed EC coupling parameters at 3 time points. Although this is a mice model on

healthy animals, we tried to be closer to the clinical situation and chose the total accumulated

dose away from toxic values, but within therapeutic levels. The Dox animals did not grew for

the first 3 weeks but then continued growing normally without overcoming the delay.

Echocardiographic data showed normal contractile function at 2 and 6 weeks after last

injection. However, there were a significant depression in the ejection fraction and fractional

shortening in dox-treated mice compared to saline, 15 weeks after the end of treatment.

There is limited number of studies on some elements of EC coupling after in vivo Dox

treatment. Biochemical analyses on hearts during doxo treatment have shown a decrease both
14-16
in SERCA and PLB levels . However, SERCA may not be a target to limit cardiotoxic

actions of Dox, since SERCA overexpressing mice have lower survival than WT (20

mg/Kg)18 to Dox treatment. Here we found also an early decrease in SERCA expression

(Fig.6A), which may account for the slowing of the [Ca2+]i transient decay time (Fig. 2C) but

this was returned to normal 6 weeks after the end of treatment. Thus it is unlikely that SERCA

early depression accounts for the defective function at later stages (Fig. 6A), although at the

stage of cardiac diminished contractile function, we found again a decrease in SERCA

expression and slowing of the [Ca2+]i transient. Interestingly, during the compensatory phase

(6 weeks), the phospholamban level was depressed (Fig.6). Because PLB depresses SERCA

function, this decrease may result in improving of SR reloading, which is consistent with the

enhanced SR Ca2+ load (Fig. 4) and higher peak [Ca2+]i transient (Fig.2).

Page
148
Slowing of the [Ca2+]i transient has been found after Dox treatment in rats, although in this

study the peak [Ca2+]i transient was normal 16. The doses and the animal model, may account

for the different effects on [Ca2+]i transient amplitude, although in this study, the experiments

were taken at a single time point. Thus one may guess that later on the [Ca2+]i transient peak

could decrease, accounting for contractile dysfunction.

Although some of the results (decreased and slowed [Ca2+]i transient) at the advanced state

may be similar to those found in other models of heart failure10, 29, 30, the alteration in EC

coupling are not equivalent, as here we did not observe any modification on the AP duration

(Fig.3) at any repolarization time, suggesting that no alteration in ionic currents activated

during the repolarization phase. This contrasts with other models of HF, where AP duration is

prolonged due to a reduction in potassium currents, with maintained calcium current30-33.

Consistent with this, the QTc was similar between all analyzed groups (data not shown).

It has been shown that Dox directly affects RyR activity by a rapid washable activation of the
26, 27
channel and latter an irreversible inhibition . In our experimental model, Dox was

administered in vivo and experiments were made several weeks after the end of the treatment,

thus the direct washable effects would not be present anymore. We have found an increased

Ca2+ spark frequency at the periods of depressed [Ca2+]i transient (2 and 15 weeks, Fig. 5).
23
This echoes the effect of short incubation of cardiac myocytes in the presence of Dox , but

contrasts with the reported depressed expression of RyR2 in rabbit in vivo Dox treatment 15, 17.

We also found a depression in RyR2 expression but only early after Dox end of treatment (2

weeks, Fig. 6C). However, even at this time point, Ca2+ sparks were more frequent in Dox

treated cells (Fig. 2B). This could be accounted by different phosphorylation level of the RyR
23
. In fact, we found that the relative RyR2 phosphorylation level at the PKA site was more

elevated in Dox treated cells, being statistically significant at 2 and 15 weeks after the

treatment, coinciding with the times where Ca2+ sparks were more frequent (Fig. 6D).

Page
149
Regarding RyR2 phosphorylation level at the CaMKII site, we found an initial increase that

was normalized with time (Fig. 6E). This could be related to the enhanced occurrence of

spontaneous Ca2+ waves (Fig. 5F).

In summary, we found that mice treated with Dox at low doses, significantly induce a

cardiotoxic effect at 15 weeks after treatment. This is may be due, at least in part, to a

depressed [Ca2+]i transient. The latter may be the reflect of a low SR Ca2+ load due to SERCA

expression depression and enhanced Ca2+ leak through RyR2s. However, before there is any

in vivo sign of cardiac alteration, Ca2+ handling is altered, which can be important in the

evolution of the signs. It is worth to note that this cardiac dysfunction seems to be specific to

Dox toxicity different from HF from other etiologies, notably by the lack of AP alterations.

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Figures

Figure 1: Doxorubicin induces a cardiotoxicity in mice at 15 weeks after the last injection

A: Body weight of mice treated with doxorubicin or vehicle (Saline solution NaCl 0.9%) for

15 weeks.

B: Ratio of heart weight/tibia length of treated mice at 2, 6 and 15 weeks after the last

injection. The number of treated mice are indicated in the column of the graph. Results are

expressed as fold activation of control mice. No significant difference of the ration heart

weight/tibia lenght between control and doxorubicin-treated mice after 2,6 and 15 weeks have

been observed.

Page
154
C: Representative M mode echocardiograms of mice from saline and doxorubicin treatments

groups.

D: Ejection fraction of treated mice at 2, 6 and 15 weeks after the last injection. The number

of treated mice are indicated in the column of the graph.

Figure 2: Evolution of [Ca2+]i transients after chronic Doxo treatment. A. Representative line

scan confocal microscopy images taken from cardiomyocytes at 2 (left), 6 (middle) and 15

weeks after last saline injection (top) or Doxo (bottom). B. Normalized peak [Ca2+]i transient

in ventricular cardiomyocytes evoked by electric field stimulation in saline treated (green

bars, S) or Doxo treated (red bars, D) at 2, 6 and 16 weeks (2w, 6w, 15w) after the last

injection. Number of cells is noted in the bars. B. Normalized decay time constant of the

[Ca2+]i transients (obtained by fitting the decaying phase to a single exponential). Colors and

symbols as in B. *p<0.05, **p<0.005, ***p<0.001

Figure 3: Action potential duration is unaffected by doxo treatment. Averaged values of

action potential duration at 20 (APD20%), 50 (APD 50%) and 90 (APD90%) % of

repolarization in saline and doxo treated mice at 2 weeks (2w, top left), 6 weeks (6w, top

right) and 15 weeks (15w, bottom) after the last injection. Color and labelings as in Fig. 2.

Inset representative AP traces recorded in saline (black line) or Doxo (gray line) treated mice.

Figure 4: SR Ca2+ load is depressed 15 weeks after the last doxo injection. A. Representative

line scan images of a cardiac myocyte treated with saline (top) or doxo (bottom) 15 weeks

after the last injection during field stimulation and subsequenc caffeine (10mM) rapid

application. B. Normalized averaged values of peak caffeine evoked [Ca2+]i transients at

Page
155
different times after the last injection. Colors and symbols as in Fig. 2. *p<0.05 Doxo vs.

Saline

Figure 5: Spontaneous Ca2+ release in enhanced early and late after Doxo treatment. A.

Representative line-scan images showing individual Ca2+ sparks in cardiac cells isolated 15

weeks after the last saline (left) or Doxo (right) injection. B. Normalized Ca2+ sparks

frequency in each experimental group. N represents the number of cells. Ca2+ sparks

characteristics are displayed in C (Ca2+ spark amplitude, expressed in peak F/F0 where F is

the fluorescence and F0 the diastolic fluorescence), D (duration at half the maximum), and E

(width at half maximum). N here indicates the Ca2+ sparks number. F. Ca2+ sparks wave

frequency. Color and symbols as in Fig. 2.

Figure 6: Time-dependent modulation of Calcium handling proteins induced by Doxorubicin

at 2, 6 and 15 weeks after the last injection in vivo. Quantitative protein expression of Serca2

(A), phospholamban total and phosphorylated (B), Ryanodine receptor (RyR2) total (C) and

phosphorylated (D) from the left ventricle of mice injected or not (saline) with Dox at 2, 6 or

15 weeks after the last treatment. Numbers of mice are indicated as above. Immunoblots were

quantified and normalized to β-actin expression and internal control. Data are mean±SEM and

are expressed as percentage of the control value (saline-injected mice). *P<0.05, ** P<0.01,

***P<0.001 compared to saline.

Supplemental figures:

Page
156
Supplemental Figure 1: Expression of phosphorylated phospholamban and NCX-1 in mice

treated or not with Doxorubicin at 2, 6 and 15 weeks after the last injection in vivo.

Quantitative protein expression of phosphorylated phospholamban at Ser16 and Thr17 (A)

and NCX-1 (B) from the left ventricle of mice injected or not (saline) with Dox at 2, 6 or 15

weeks after the last treatment. Numbers of mice are indicated as above. Immunoblots were

quantified and normalized to β-actin expression and internal control. Data are mean±SEM and

are expressed as percentage of the control value (saline-injected mice). *P<0.05, ** P<0.01,

***P<0.001 compared to saline.

Page
157
Figure 1:

A B
150
34

33

HW/Tibia (% of saline)
32

31 100
30
Weight (g)

Saline
29
Dox

28

27
50
26

25

24 5
13 7
12 5
14 7
14 5
10 7
12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 0
Weeks
Saline Dox Saline Dox Saline Dox
2 weeks 6 weeks 15 weeks

100
C D
80
*
15 weeks
60
EF (%)

Saline Dox

40

20

5 7 5 7 5 7
0
Saline Dox Saline Dox Saline Dox
12
2 weeks 6 weeks 15 weeks

Page
158
Figure 2:
2w 6w 15w
50 µm

Saline

Dox

250 ms

B C
150 150
* ** *

Tau (% of Saline)
F/F0 (% of Saline)

100 100
* ***

50 50

19 23 12 14 37 57 19 23 12 14 37 57
0 0
S D S D S D S D S D S D
2w 6w 15w 2w 6w 15w

Page
159
Figure 3:

80 2w 80 6w

Duration (ms)
0 0
60 60
Duration (ms)

20 mV
20 mV
20 msec
40 20 msec
40

20 20

5 8 19 21
0 0
APD20% APD50% APD90% APD20% APD50% APD90%
S D S D S D S D S D S D

80 15w
Duration (ms)

0
60
20 mV

40 20 msec

20
15 5
0
APD20% APD50% APD90%
S D S D S D

Figure 4:

A 10 mM CAF
Saline 15w

1s
Dox 15w

25 µm

B *
150
F/F0 (% of Saline)

100
*
50

17 21 9 7 15 26
0
S D S D S D
2w 6w 15w

Page
160
 Figure 5:
** F
B

Ca2+ Sparks Frequency

A Saline 15w Dox 15w 300 600 **

Ca2+ Waves Frequency

*

(% of Saline)
500

(% of Saline)
200 400

300

100 200
250 ms
100
17 22 11 11 12 24
17 22 11 11 12 24 0
0
50 µm 2w 6w 15w
2w 6w 15w
4
C D 60 ***
**
E **
2 50 ***
Duration50% (ms)

µm)
40

Width50% (µ
F/F0

30 2
1
20
1
10
165 554 58 79 92 405 165 554 58 79 92 405
0 0 165 554 58 79 92 405 0
2w 6w 15w 2w 6w 15w 2w 6w 15w

Figure 6:
2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX

A Serca2 B PLB tot

β-actin β-actin
Relative protein expression of total PLB (%

1,5 1,5
Relative protein expression of Serca2

1 1
(% of saline)

**
of saline)

***
0,5 0,5
*

7 9 7 9 5 7 7 9 7 9 5 7
0 0
Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox
2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks
C
2 weeks 6 weeks 15 weeks D 2 weeks

CT DOX
6 weeks

CT DOX CT
15 weeks

DOX E CT
2 weeks

DOX CT
6 weeks

DOX
15 weeks

CT DOX
CT DOX CT DOX CT DOX
RyR tot RyR tot
RyR tot
RyR RyR
pS2808 pS2814
β-actin
β-actin β-actin
Relative protein expression of total RyR

Relative protein expression of RyR pS2808

3,5
4,5
3 4
*
Relative protein expression of

7
2,5 3,5
RyRpS2814 (% of saline)

6 *
(% of saline)

3
(% of saline)

2
5
2,5 *
1,5 2 4

1 1,5 3

0,5 *** 1 2
0,5 1
7 9 3 5 5 7
0 3 5 3 5 5 7 3 5 3 5 3 3
0 0
Saline Dox Saline Dox Saline Dox
Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox
2 weeks 6 weeks 15 weeks
2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

Page
161
Supplemental figure 1:
2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX

A PLB tot PLB tot
Relative protein expression of PLB pSER16 PLB PLB
pSER16 pTHR17

Relative protein expression of PLB pTHR17

2,5
β-actin 2,5 β-actin

2 2
(% of saline)

1,5

(% of saline)
1,5

1 1

0,5 0,5

7 9 7 9 5 7 7 9 7 9 5 7
0 0
Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox Saline Dox
2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

2,5

Relative protein expression of NCX-1

2

(% of saline)
B 2 weeks 6 weeks 15 weeks
1,5

CT DOX CT DOX CT DOX 1

NCX-1
0,5
β-actin
7 9 7 9 5 7
0
Saline Dox Saline Dox Saline Dox
2 weeks 6 weeks 15 weeks

Page
162
1-3 Conclusion

L’étude des altérations cardiaques induites par la doxorubicine a été réalisée à l’aide d’un
modèle murin (C57Bl6) exposé à 3 injections iv de dox pour une dose cumulée totale de
12mg/kg. Ce modèle a permis d’établir une cinétique de développement de la cardiotoxicité
par la mise en évidence d’une cardiomyopathie de type dilatée à partir de 15 semaines post
traitement sans mortalité notable et sans hypertrophie. Cette cardiomyopathie dilatée est
associée à une diminution de la fraction d’éjection ainsi qu’à une augmentation modérée du
diamètre télédiastolique du VG. Cependant, le traitement à la dox induit une modulation
temps-dépendante des transitoires calciques. En effet, une altération initiale des transitoires
calciques caractérisée par une diminution de l’amplitude des transitoires a été observée à 2
semaines. Ces altérations sont ensuite compensées à 6 semaines après la fin du traitement
avec même une augmentation des transitoires calciques. Néanmoins, cette compensation n’est
pas maintenue dans le temps. En effet, une diminution de l’amplitude des transitoires et un
ralentissement de la vitesse de relaxation associée à une diminution de la contraction des
cardiomyocytes ont été observés à 15 semaines après traitement à la dox correspondant ainsi
aux altérations de la fonction cardiaque à ce même temps.
La modulation temps dépendante des transitoires calciques ne peut être expliquée par une
altération de la durée des PA, aucune modification significative n’ayant pu être observée chez
les souris traitées à la dox. En revanche, l’altération des transitoires calciques et de la
contraction peuvent être le résultat d’une modification de la quantité de calcium stocké dans
le RS. En effet, la charge en calcium du RS, évaluée par application de la caféine permettant
la déplétion en calcium du RS, est diminuée à 15 semaines post traitement. Cette diminution
peut être due à une altération de l’expression ou de la fonction de SERCA2a-PLB, du RyR2
et/ou du NCX. La vitesse de relaxation à 2 et 15 semaines est diminuée suggérant une
diminution de l’expression et/ou de l’activité de SERCA et/ou du NCX. Or l’application de la
caféine permet de maintenir ouvert les canaux RyR. Le calcium ainsi recapté par la SERCA
est immédiatement libéré du RS par les RyR. La phase de décroissance des transitoires
calciques après application de la caféine correspond donc à l’extrusion du calcium par le
NCX. Aucune modification de ce paramètre n’a été observée dans les souris traitées à la
doxorubicine suggérant aucune altération du NCX, confirmée par western blot.

Page
163
Le ralentissement de la vitesse de relaxation des cardiomyocytes à 2 et 15 semaines post
traitement serait donc du à une inhibition de la SERCA et pourrait ainsi expliquer la
diminution de la charge du RS. En effet, l’expression de SERCA est diminuée à ces mêmes
temps.
Par ailleurs, une diminution de la charge du RS peut également être expliquée par une
augmentation de la fuite en calcium durant la diastole causée par une activité accrue du RyR.
Ainsi, de façon concordante avec les résultats précédents sur la charge calcique du RS, la dox
induit une augmentation de la fréquence de sparks et une diminution de leurs amplitudes à 2
et 15 semaines. De plus, l’altération initiale à 2 semaines est également associée à une
augmentation significative de vagues calciques arythmogéniques, résultante de la propagation
de sparks calciques. Cependant, le traitement à la dox n’induit aucune arythmie ventriculaire
dans notre modèle à 2 semaines. L’augmentation de l’activité du RyR pourrait ainsi être
expliquée par une hyperphosphorylation du RyR aux sites de la CaMKII ainsi que de la PKA
à 2 semaines d’autant plus marquée que l’expression du RyR total est diminuée à deux
semaines.
En conclusion, la dox induit une altération temps-dépendante de l’homéostasie calcique
caractérisée par une diminution des transitoires calciques et de la charge calcique du RS ce
qui a pour conséquence une diminution de la contraction des cardiomyocytes à 15 semaines
post traitement, temps correspondant à l’altération de la fonction cardiaque. En conditions
physiopathologiques, Epac joue un rôle important dans la signalisation calcique et notamment
dans le couplage excitation-contraction et le couplage excitation-transcription. Son rôle dans
les altérations de l'homéostasie calcique a donc été étudié (cf.Figure supplémentaire).

Page
164
 Dox
Dox 8-CPT
180

160

Effect 8-CPT, Dox

5
140
F/F0

120

3
100

80

1 60
1 3 5 7 9 11 13 15 17 1 3 5 7 9 11 13 15 17

Cells Cells

Figure supplémentaire : Effet de l'activation d'Epac sur l'altération des transitoires calciques induites par
la doxorubicine. La figure de gauche représente l'amplitude des transitoires calciques (F/Fo) des cellules
provenant des souris traitées à la dox (dox) ou de ces mêmes cellules incubées en présence de 8-CPT (10µM). La
figure de droite représente l'amplitude des transitoires calciques normalisées par leurs contrôles respectifs (souris
traitées à la dox).

Ainsi, on peut distinguer deux populations distinctes de souris traitées à la doxorubicine à 15

semaines qui présentent des effets contraires sur l’amplitude des transitoires calciques après
l’activation d’Epac par le 8-CPT. Cette étude n’a donc pas permis d’identifier le rôle d’Epac
dans les altérations de la signalisation calcique induite par la doxorubicine.
On peut donc se poser les questions suivantes :
- Quel rôle joue Epac dans les altérations de l’homéostasie calcique induite par la dox ?
- Quel rôle joue Epac dans la cinétique de développement de la cardiotoxicité induite par
la dox ?
L’étude du rôle d’Epac dans la cardiotoxicité induite par la dox fera ainsi l’objet de la
partie 2 des résultats.

Page
165
2- Identification d’Epac1 comme nouveau régulateur de la
cardiotoxicité induite par la dox

2-1 Position du problème

L'étude précédente montre que le traitement in vivo à la doxorubicine conduit à une altération
de l’homéostasie calcique temps dépendante avec une altération initiale des transitoires
calciques ainsi que de la charge calcique du RS à 2 semaines, une compensation à 6 semaines
qui n’est pas maintenue dans le temps conduisant à une autre diminution des transitoires ainsi
que de la charge du RS à 15 semaines. De façon concomittante, la fraction d’éjection est
diminuée et le diamètre télédiastolique du VG est augmenté suggérant le développement
d’une cardiomyopathie de type dilatée sans hypertrophie à 15 semaines post-traitement. Nous
avons ainsi montré que l’altération de la signalisation calcique module la cinétique de
développement de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Cependant, nous n’avons pas
pu clairement élucider le rôle d’Epac, régulateur clé du couplage excitation-contraction et du
couplage excitation-transcription, dans l’induction de ces altérations. Cette nouvelle étude a
donc pour objectif d’identifer le rôle d’Epac dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine.
En effet, Epac est un facteur d’échange directement activé par l’AMP cyclique. Il exerçe
différentes fonctions biologiques via l’activation de petites protéines G telles que Rap1, Rac1
et Ras dans les cardiomyocytes et RhoA dans les cellules musculaires lisses. Epac est
notamment impliqué dans de nombreux processus cellulaires mis en cause dans la
cardiotoxicité induite par la dox tels que l’apoptose, la migration cellulaire, l’adhésion
cellulaire mais également dans le couplage excitation-contraction et la régulation de
l’homéostasie calcique. En outre, plusieurs études ont montré que l’inhibition de Rac1 ou de
RhoA permettait d’augmenter l’activité antitumorale de la doxorubicine et/ou de diminuer la
cytotoxicité de la doxorubicine sur les cardiomyocytes. En effet, Rac1 est nécessaire à la
stabilisation par la dox du complexe de clivage ADN-TopII β et participe ainsi aux dommages
à l’ADN et à la mort cellulaire induits par la dox via la signalisation des TopII.

Page
166
Cette étude permettra de répondre aux questions suivantes :
- Quels effets a la doxorubicine sur la signalisation d’Epac in vivo et in vitro ?
- Quel rôle joue Epac dans les dommages à l’ADN et la mort cellulaire induits par
la dox via la signalisation TopII β ?
- Epac est-il une nouvelle cible thérapeutique de la cardiotoxicité induite par la
dox?
Afin de déterminer le rôle d’Epac dans la cardiotoxicité induite par la dox, nous avons utilisé
un modèle murin identique à l’étude précédente dans lequel nous avons caractérisé aux
mêmes temps d’analyse les altérations cardiaques par échocardiographie et par histologie
ainsi que les altérations de la signalisation d’Epac. Les altérations de l’expression protéique
d’Epac et de ses effecteurs ont également été évaluées in vitro dans des cultures primaires de
cardiomyocytes de rats nouveau-nés. L’étude du rôle d’Epac dans la signalisation TopII et
dans la formation de complexes de clivage a été réalisée respectivement par western blot et
par bland depletion assay. Le rôle d’Epac dans les dommages à l’ADN et la mort cellulaire
induits par la dox a été déterminé respectivement par western blot permettant de quantifier
l’expression protéique de l’H2AX, marqueur de dommage à l’ADN et par cytométrie. Le rôle
précis d’Epac a ainsi été étudié à l’aide de modulateurs pharmacologiques de l’activité d’Epac
(8-CPT, ESI09, ESI05, CE3F4) ou à l’aide d’adénovirus permettant la surexpression ou
l’inhibition spécifique d’Epac1 (Ad-Epac ou shEpac1). Enfin, l’effet protecteur ou délétère
d’Epac a également été étudié in vivo dans un modèle de souris KO Epac1 exposées à la
même dose de doxorubicine et analysées aux mêmes temps d’analyse que précedemment.
Enfin, les effets de la modulation d’Epac sur l’activité antitumorale de la dox ont également
été vérifiés sur différentes lignées cellulaires (MCF-7 et A549). Cette étude permettra ainsi
de conclure sur les potentiels effets thérapeutiques de la modulation d’Epac sur la
cardiotoxicité induite par la dox.

2-2 Résultats

Les résultats de cette étude sont présentés dans l’article suivant :

Identification of Epac1 as a novel regulator of Doxorubicin-induced cardiotoxicity; Mazevet,
Ribeiro, Llach, Mateo, Lefebvre, Laudette, Rucker-Martin, Crozatier, Lezoualc’h, Chen,
Benitah, Lemaire, Gomez, Vozenin, and Morel.

Page
167
Full title: Identification of Epac1 as a novel regulator of Doxorubicin-induced

cardiotoxicity

First author’s surname and short title (50 characters max): Mazevet Epac and Doxorubicin

cardiotoxicity

Author’s names, academic degrees and affiliations:

Marianne Mazevet1, MSc, Maxance Ribeiro1, MSc, Anna Llach1,PhD, Philippe Mateo1, MSc,

Florence Lefebvre1, Marion Laudette4, MSc, Catherine Rucker-Martin3, PhD, Bertrand

Crozatier1, MD, Frank Lezoualc’h4, PhD, Ju Chen, PhD5, Jean-Pierre Benitah1, PhD,

Christophe Lemaire1, PhD, Ana Maria Gomez1,PhD , Marie-Catherine Vozenin2,PhD, and

Eric Morel1, PhD.

1- Inserm UMR-S 1180, LabEx Lermit-DHU Torino, Châtenay-Malabry cedex, France

2- Laboratory of Radio-oncology, CHUV, Lausanne, Switzerland

3- Inserm UMR-S 999, LabEx Lermit, Le plessis-robinson, France

4- Inserm U1048, Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires - I2MC,

Toulouse, France

5- Basic Cardiac Research UCSD School of Medicine La Jolla, California, US

Page
168
Corresponding author:

Éric Morel, Inserm UMR-S 1180, LabEx Lermit-DHU Torino, Université Paris-Sud, Faculté

de pharmacie, Signalisation et Physiopathologie Cardiovasculaire, Tour D4, 3ème étage, 5 rue

Jean-Baptiste Clément 92296 Châtenay-Malabry cedex, France.

Fax number: 01 46 83 54 75 Telephone number: 01 46 83 53 20 email: eric.morel@u-psud.fr

Total word count of the manuscript: 9202

Two to five subject codes that best classify your manuscript, chosen from the subject code list

for authors: [11] Other heart failure, [130] Animal models of human disease, [138] Cell

signalling/signal transduction, [136] Calcium cycling/excitation-contraction coupling

Page
169
 2-Abstract and Key words

1.Rationale-
Cardiotoxicity is a major complication of anticancer treatment with limited unspecific
prevention. The small G protein activator Epac has been shown to regulate common
molecular targets from the chemotherapeutic doxorubicin (Dox), cellular functions and shape
remodelling. Epac may thus represent a new cardioprotective target against adverse effect of
anticancer therapy.

2.Objective-
The present study investigates the new role of Epac as a potent therapeutic target against
doxorubicin-induced cardiotoxicity.

3.Methods and Results-

In vivo, the follow up of a Dox injection in mice (iv, 10 mg/kg) at 2, 6 and 15 weeks post
treatment showed the development of a dilated cardiomyopathy (DCM) (15 weeks) with
calcium handling impairments. This cardiotoxicity was correlated with a time-dependent
modulation of Epac signaling. In vitro, while Epac activity was increased by Dox, an Epac
signaling alteration with reduced Epac (1 and 2), small G protein (Rac, Rap) expression and
activity was observed 24h after dox treatment in neonatal rat cardiomyocytes. In addition,
Calcineurin/NFAT and CamKII/MEF2 showed a selective down and upregulation by Dox
respectively.
The specific inhibition of Epac1 but not Epac2 prevented Dox cardiotoxicity in vitro and in
vivo in a TopII β-dependent pathway. In addition, transgenic KO Epac1 mice exhibited
calcium handling recovery and no DCM development (15w). In contrast, a pharmacological
Epac1 inhibition didn’t protect cancer cell lines from Dox treatment suggesting that Epac1
may prevent doxorubicin-induced cardiotoxicity without interfering with its antitumoral
activity.

4.Conclusions-
The inhibition of Epac1 may represent o novel therapeutic strategy to avoid doxorubicin-
induced cardiotoxicity.

Keywords: Epac, Topoisomerase II β, Doxorubicin, cardiotoxicity, DNA damage

Page
170
Introduction
The effectiveness of Anthracyclines and especially of its leader compounds of first

generation Doxorubicin (Dox) and Epirubicin still justify its wide use in the clinical practice

over the past 50 years. These chemotherapeutic drugs are efficient anti-neoplastic agents used

nowadays in several types of cancers among them lymphomas, leukemia, solid tumors, breast

cancers, etc (1,2). In addition, the therapeutic management of cancer improved during the past

decade and thus significantly increased patient’s survival rates. However, the benefit/risks

ratio may be imbalanced in a large extent by the development of acute and chronic toxicities

that alter quality of life of patients and may even affect patient’s survival.

The identified mechanisms of Dox antitumor activity involve DNA intercalation,

oxidative stress and inhibition of macromolecular biosynthesis, which finally induce tumor

cell death. Unfortunately, Dox can also hamper cardiomyocytes survival, which is supposed

to be the main cause of cardiotoxicity. The same toxic mechanisms in relation to the intended

effects in cancer treatment are unfortunately the same as those observed in cardiotoxicity,

which thus lead to severe cardiac complications in a dose-dependent manner. Indeed, Dox

treatment leads to acute, chronic and delayed side effects with various onset of clinical

manifestations. Nevertheless, this time dependent classification of clinical malignancies

dogma existing since the Nineties has been recently challenged by a recent publication of the

group of Cardinale with the main occurrence of reversible pathologies in the first year

following Dox treatment (3). The main cardiac pathologies encountered ranges from

arrhythmia, myocarditis syndrome and left ventricular failure in the acute phase to the

development of cardiomyopathy such as dilated cardiomyopathy and ultimately congestive

heart failure for the chronic phase. However, Dox-induced left ventricular dysfunction may be

insidious with subclinical cardiac dysfunction and progressive settlement with cumulative

dosage or comorbidities (4).

Page
171
Depending on the clinical trail concerned and cumulated Dox dose received, 4 to 36% of

survival cancer patient treated by Dox will suffer from heart failure (5).

Oxidative stress has been initially described as the major mechanism of Dox

cardiotoxicity since it induces a massive free radical production leading to a subsequent cell

function and organelle alteration such as calcium homeostasis and mitochondriale failure (6).

Therefore, actual approaches to reduce Dox cardiotoxicity implicated the use of antioxydants

to prevent the excess of ROS generation. Nonetheless, antioxidant treatments with anterior

promising results in various animal models failed to improve Dox cardiotoxicity in many

clinical trials (7). Actually, only one agent, the iron chelator dexrazoxane has been clinically

approved to protect the heart against doxorubicin cardiotoxicity. However, its therapeutic

approach is limited to metastatic breast cancer and it has been reported potential interference

with cancer cure and may lead to the development of secondary tumours (8).

Another proposed mechanism discovered by Zhang et al, leading to a protection against Dox

toxicity is related to the beneficial effects on overall cardiac functions and oxidative stress by

silencing Topoisomerase II β (TopII β) (9). However, this could be limited by the findings of

Lyu et al indicating that the dexrazoxane’s prevention in Dox-induced cardiotoxicity was a

result of proteasomal degradation of TopII β and was not relying on its iron chelation

property. However, dexrazoxane's use is limited to metastatic breast cancer due to its

interference with dox efficiency and the development of secondary tumors (10).

Thus, new therapeutic strategies, which contribute to prevent or decrease the anthracycline-

induced cardiotoxicity without impairing the efficiency of the cancer cure by chemotherapy,

are definitely needed.

Now, evidences have emerged that Dox may promote cardiotoxicity by alternative

mechanisms or by signaling pathways modulation unrelated directly to cell death through

interaction of Dox or its degradation metabolite with molecular actors.

Page
172
These signalling pathway interactions could occurs prior, concomitantly or after the recorded

different form of cell death (apoptosis, necrosis, etc).

For example, several studies showed the implication of small G proteins such as Rac 1 and

RhoA as well as proteins like mTOR or calcium homeostasis alteration in cardiotoxicity

induced by Dox. In fact, the inhibition of Rac 1 attenuated the side effects of Dox both in

vitro and in vivo (11, 12). Huelsenbeck et al also demonstrated that Rac 1 is necessary for

DNA damage mediated by TopII β induced by Dox (13). Moreover, inhibition and/or

silencing of RhoA have been shown to prevent cardiotoxicity induced by Dox and reverse the

resistance to Dox in several types of cancer (14-15). In addition, mTOR and its inhibition may

be of particular importance with its regulator role of autophagy, a process involved in dox

induced cardiotoxicity (16-17).

Finally, alterations of calcium homeostasis induced by Dox have been slightly studied but

need further investigation as arrhythmia can be a side effect of Dox-induced cardiotoxicity.

The second messenger calcium is part of complex phenomena called the E-C and E-T

coupling (excitation-contraction and excitation-transcription coupling) which lead to cycle of

contraction/relaxation and long term adaptation with potential remodeling in the heart (18-

19). It has been shown that Reactive Oxygen Species (ROS) generation can influence

excitation-contraction coupling in cardiac pathology (20-23).

Thus, all these mechanisms with calcium homeostasis and molecular actors such as small G

proteins Rac1, RhoA and mTOR, which are involved in cardiotoxicity and or resistance to

dox, may have one common activator or regulator: the GEF Epac, a Guanine Exchange Factor

directly activated by cyclic AMP. Indeed, Epac is involved in a various cellular mechanisms

such as apoptosis, autophagy, cellular adhesion, cellular migration and shape remodeling.

Page
173
This GEF is also involved in calcium homeostasis through its role in E-C and E-T coupling

(24, 25). Thus, these mechanisms set of cellular function is implicated in Dox- induced

cardiotoxicity.

Moreover, Epac has been shown to play a role in various pathologies such as memory

disorders, Alzheimer’s disease, fibrosis, inflammation, immune disease, diabetes, cancer (26).

In the heart, over-expression of Epac1 is observed in cardiac tissue from failing heart patient

(26). Pioneering study from our team highlighted for the first time the pathological role of

Epac in the heart (26, 28). Epac activates the small G proteins Rap, Ras and Rac, modulates

Ca2+ signaling under β-adrenergic stimulation and activates the pro hypertrophic

calcineurin/NFAT and CamKII/Mef2 to promote cardiac hypertrophy (24-28). These

observations prompted us to focus our research on a potential role of Epac in doxorubicin-

induced cardiotoxicity.

Here we found that Dox leads to the development of a dilated cardiomyopathy (DCM) 15

weeks after a fractionated soft Dox injection (iv, 12 mk/kg total dose) associated with calcium

homeostasis abnormalities. These alterations were associated with time- and dose-dependent

alterations of Epac signaling. In vitro mechanism examination in primary culture of neonatal

rat showed a complete and specific alteration of the known Epac signalling 24h after Dox

treatment. Our data showed for the first time an Epac involvement in the DNA damage

induced by Dox. Furthermore, we first showed that the specific pharmacologic or genetic

inhibition of Epac1 but not Epac2 prevents the deleterious effects of Dox in vitro. These facts

were confirmed in vivo in transgenic Knock-out Epac1 mice which exhibit neither CMD

anymore nor calcium alterations 15 weeks post treatment. Epac 1 inhibition did not interfere

with the attempted Dox antitumor efficiency on tumor cell lines.

Page
174
Altogether, these findings identify the cAMP-binding protein, Epac, as a new regulator of

Dox-induced cardiotoxicity and a potential therapeutic target, which could help to prevent

cardiac toxic side effects for cancer patients.

Methods

Animal studies

12 weeks old C57Bl6 male mice were injected intravenously (tail vein) with of Doxorubicin

(or saline solution NaCl 0.9%) 4 mg/kg 3 times at 4 days intervals for a cumulative dose of

12mg/kg. This dose was chosen to induce alterations of cardiac physiological parameters

without leading to death according to Desai and colleagues (29). The development of

cardiotoxicity induced by Doxorubicin was measured by echocardiography at 2, 6 and 15

weeks after the last injection. Ventricular myocytes were then isolated at the same times for

intracellular Ca2+ handling measurements and western blot analysis.

The same protocol was applied to Epac1 knock out (KO) mice (provided and characterized by

Dr Chen (University of San Diego, USA)) (30) and their littermates treated with Doxorubicin

or saline solution. The measurements of calcium handling and protein expression of Epac1

KO mice was performed at 15 weeks after the last.

Investigations were performed in accordance with European Community legislation relating

to the care and use of animals (Directive 2010/63/EU), and the corresponding French

legislation (French decree 2013–118 du 1er février 2013).

Page
175
Histological assessments

Hearts were fixed in 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin and serial sectioned (3µm).

Sections were stained with Picrosirius Red F3BA for interstitial collagen evaluation, or

hemateine and eosine for global morphology and tissue inflammatory status, or used

unstained for terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling

(TUNEL) (ApopTag® Fluorescein Direct In Situ Apoptosis Detection Kit, Millipore)

conducted in accordance with the manufacturer's instructions.

Two to three sections per animal were examined at 20X and 40X magnification, 5-10 fields

per section were recorded with an AxioCam MRc camera (Carl Zeiss) and analyses were

conducted by two independent investigators.

Echocardiography

Physiological parameters of mice hearts treated or not with Doxorubicin were measured by

Trans-thoracic echocardiographic using an ultrasonographic system (Vivid 9, 15 MHZ,

General Electric Healthcare) under isofluorane anesthesia (3%). The mouse heart was imaged

in a two-dimensional mode followed by M-mode to measure ejection fraction (EF) and left

ventricle telediastolic volume. Left ventricle telediastolic volume (LVtd) was calculated with

the Teichholz formula.

Intracellular Ca2+ handling measurement

Ventricular cardiac myocytes were isolated by the dissociation from heart withdrawn from

saline and doxorubicin-treated mice 2 and 15 weeks after the last injection. Cells were loaded

with the fluorescence Ca2+ dye Fluo-3 AM as previously described (31). To record [Ca2+]i

transients, cells were recorded following electrically stimulated at 2 Hz using two parallel Pt

electrodes.

Page
176
Images were obtained with a laser scanning confocal microscope (TCS SP5X Leica

Microsystems) equiped with an x40 water-immersion objective in the line scan mode (1.43

ms/line). Fluo-3 was excited with a White light laser tuned at 500 nm, and emission measured

at wavelengths above 510 nm. Image analyses were performed by homemade routines

running in IDL 8.2 software (Exelis Visual Information Solutions, Inc.). Images were

corrected for the background of fluorescence.

Materials and cell culture

All media, sera and antibiotics used in the cell culture were purchased from Invitrogen.

Doxorubicin (2mg/mL) and Dexrazoxan were obtained respectively from ACCORD (central

pharmacy of Institut Gustave Roussy) and Sigma.

8-(4-chloro-phenylthio)-2’-O-methyladenosine-3’-5’cyclic monophosphate (8-pCPT-2’-O-

Me-cAMP), ESI09 and ESI05 was from Biolog Life Science Institute. Epac1 specific

inhibitor (R) CE3F4 was kindly provided by Dr Fischmeister (labex Lermit, University Paris

Sud, France) (32).

Neonatal rat ventricular myocytes were isolated according to the protocol described by

Wollert and colleagues (33). MCF7 and A549 cell lines were provided by Céline Leuter from

the Institut Gustave Roussy (Villejuif, France).

Neonatal rat cardiomyocytes, MCF7 and A549 cells were cultured respectively in

DMEM/Medium-199, DMEM supplemented with 10 % fetal bovine serum or F12K medium

and antibiotics.

Page
177
Plasmid Constructs and Transfection

The luciferase reporter plasmid driven by four NFAT consensus binding sites was purchased

from Stratagene consensus. The luciferase reporter plasmid NFκB-Luc and MEF-2-Luc were

kindly provided by Dr.K.C.Wollert. The NFAT, MEF-2 or NFκB promoters fused to

luciferase reporter gene were used to assess the transcriptional activity of these downstream

effectors of Epac in neonatal rat cardiomyocytes.

Cells were transfected with 1µg of plasmids fused to the luciferase reporter gene and

cytomegalovirus promoter fused to renilla luciferase reporter gene using Lipofectamine 2000

(Invitrogen Life Technologies) in optimum medium. After 4 hours of incubation, the medium

was changed to serum-free (SF) DMEM/Medium-199 overnight.

After 24h treatment with Doxorubicin or control solutions, the Renilla and firefly luciferase

activity was measured with the Promega Dual luciferase reporter assay system (Promega) in a

microplate luminometer (TristarTM LB941 Berthold Technologies). The luciferase

transcriptional activity was normalized with the renilla luciferase gene.

Adenoviral infection

Bicistronic adenoviruses (Ad5) bearing either EpacWT under the control of a cytomegalovirus

promoter, adenoviruses containing shRNA for Epac1 or adenoviruses of negative

(Ad.RacS17N) and positive (Ad.RacG12V) dominants of Rac1 and green fluorescent protein

(GFP) under internal ribosomal entry site control were constructed and amplified at the

Genethon Center of Evry (France).

Adenoviruses containing shRNA control was provided by WelgenINC (Dr Luo). Neonatal rat

cardiomyocytes were incubated for 12 hours with recombinant adenoviruses. After removal of

the virus suspension, cells were replaced in maintenance medium, pre-treated with various

drugs for 2 hours and treated or not with Doxorubicin for 24 hours.

Page
178
Viruses were used at a multiplicity of infection (MOI) of 100 for Ad-Epac1, 500 for shEpac1

and shControl, and 200 for Ad.RacG12V and Ad.RacS17N. GFP was used at the same MOI for

each condition.

Epac1 activity assay

Epac1 activity assay was assessed using CAMYEL assay, a BRET-based cAMP construct

composed of Epac1 sandwiched between renilla luciferase and citrine according to Brown et

al (34). Briefly, NRCs were lysed in CAMYEL buffer (40nM Hepes, pH 7.2, 140 mM KCl,

10mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5% triton X-100, 1% protease inhibitors) and centrifuged at

20,000g for 10 min. 100µL of diluted supernatant was added to 96-well white plates and

treated for 5 min at room temperature with the indicated treatments (coelenterazine 2µM)

before measuring BRET. Emission from RLuc and citrine was measured simultaneously at

465 and 535 nm in a plate-reader (Beckman coulter). Upon binding of cAMP, Epac1

undergoes conformational changes that result in a decrease in BRET, as measured by

465:535nm ratio, due to luciferase moving away from citrine.

Calcineurin activity assay

Calcineurin activity was assessed by a colorimetric assay using Calcineurin Cellular Activity

Assay kit purchased from Merck Millipore.

Protein isolation and Western blot

Mice ventricular myocytes or neonatal rat cardiomyocytes were lysed with RIPA lysis buffer

(100µL), and then centrifuged at 13200 rpm at 4°C for 20min to remove the insoluble

material. Supernatants were collected to detect Epac signaling proteins.

Briefly, equal amount of protein (30µg) were loaded and separated by a 10%, 15% or 4-12%

SDS-PAGE gel, followed by transfer to a PVDF membrane.

Page
179
After blocking with milk (5%), the membrane was incubated with primary antibodies

including Epac1 (Cell Signalling diluted at 1/2500), Epac2 (Cell Signaling; diluted at 1/2500),

Rap1 (Cell Signaling; diluted at 1/1000), Rac1 (Cell Signaling, diluted at 1/1000), RhoA

(Santa Cruz Biotechnology; diluted at 1/500), H2AXpS139 (Millipore; diluted at 1/1000) or

Topoisomerase II β (Abcam; diluted at 1/1000). Specific proteins were detected using

corresponding HRP-conjugated secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology) and

visualized with an electrochemiluminescence (ECL) system. Incubation with β-actin antibody

(Santa Cruz Biotechnology, diluted at 1/30000) was performed to normalize the

chemiluminescence levels and exposure times.

Small G proteins Activation Assay

Rap1 and Rac1 pull down experiments were performed using a GST fusion protein containing

the Rap1-binding domain of Ral-GDS and a GST fusion protein containing the Cdc42/Rac

Interactive Binding Domain (CRIB) of p21-activated kinase (PAK) respectively. The

activation state of these small G proteins was determined as previously described (35).

Analysis of TopII-DNA complex

The formation of TopII-DNA complex was assessed by Band depletion assay, a new

technique described in Wartlick et al (36). This technique is based on western blot in which

TopII-DNA complex will not be able to enter the SDS gel. This will lead to a decrease in the

expression of free TopII β by 70 to 90%. TopII β antibody used in this assay was provided by

Abcam.

Page
180
Cell viability assay

Cell viability assay was assessed in neonatal rat cardiomyocytes as well as cancer cell lines

MCF7 and A549 by flow cytometry (FC500 Beckman Coulter) using fluorescent probe

fluorescein diacetate (FDA, Sigma).

Cells were seeded in 24-well multidishes and were pre-treated with Epac inhibitors or

activator and Dexrazoxan, and treated with Doxorubicin for 24 h.

Then, they were incubated for 5 min at 37 °C with FDA at 0.1 µg/ml. Living cells are FDA

positive, whereas dead cells are FDA negative.

Statistical analysis

Results are expressed as means±SEM. Differences between groups have been analyzed by

non parametric Mann-Whitney test. The comparaison between 2 groups of treated mice was

analyzed by Krustal Wallis test. Differences were considered significant at P<0.05, P<0.01,

and P<0.001.

Results

The development of Doxorubicin-induced dilated cardiomyopathy in vivo is associated

with time-dependent alteration of Epac signaling

To study the development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity, we examined

physiological and histological parameters at different time points following 3 dox injections

(iv 12 mg/kg cumulative dose). Mice body weight treated with dox was significantly

decreased indicating a growth delay starting at 2 weeks after the last injection which was

never restored (Figure 1A). This growth delay did not result neither in cardiac atrophy nor in

cardiac hypertrophy as no statistical differences were found in the ratio heart weight/tibia

length in dox-treated mice compared to saline mice (Figure 1B).

Page
181
Moreover, dox mice were proned to decreased ejection fraction and increased left ventricle

end-diastolic volume suggesting a dilated cardiomyopathy (DCM) starting at 15 weeks post-

treatment (Figure 1 C, D and E). No alteration of cardiac function was found at 2 and 6 weeks

post-treatment. However, structural alterations in particular sarcomeric loss associated with

myolysis were found in the right ventricle of dox-treated mice at 2 weeks. These same

alterations later spread to the left ventricle at 6 and 15 weeks (Supplemental figure 1).

The cardiac morphological changes were not associated with increased cardiomyocytes

apoptosis measured by tunel assay (Supplemental figure 2) as it has been shown in several

other models of dox-induced cardiotoxicity. Thus, architectural alterations are scarces from 2

to 15 weeks, time of DCM. We then examined the expression profiles of Epac signaling

proteins Epac1, Epac2, Rap1, Rac1 and RhoA during the settlement of DCM. We observed a

statistically significant Epac signaling modulation between 2 and 15 weeks: an alteration at 2

weeks with a decreased expression of Epac2 and Rac1, a compensation at 6 weeks with an

increased expression of Epac1 and RhoA, and a strong decrease of the expression of Epac1,

Epac2, Rac1 and RhoA at 15 weeks, at the time of DCM (Figure 2). These results are

associated with the time dependent morphological and functional alterations suggesting that

Epac signaling is associated with the development of dox-induced cardiotoxicity.

Doxorubicin treatment leads to a global alteration of Epac signaling in vitro

To understand the underlying mechanisms of dox induced cardiotoxicity, we first determined

the effect of doxorubicin on Epac signaling. NRVMs were treated with different doses of

doxorubicin for 24 hours. Dox treatment induced a decrease in the expression level of both

Epac isoforms: Epac1 and Epac2, respectively by 70% and 60% (Figure 3A). However,

Doxorubicin induced an increase in Epac1 activity as measured by BRET experiments (Figure

3B). Indeed, Epac1 activity was increased significantly after 1h of Dox treatment.

Page
182
Epac1 activity was also 10% higher after 2h of dox treatment than after 8-CPT treatement, a

selective agonist of cAMP which activates Epac but not PKA used as a positive control.

Moreover, elevation of Epac1 activity was also sustained after 24h of dox treatment indicating

an increased activity of Epac1 despite its diminished expression.

The expression of Rap1 and Rac1, small G proteins activated by Epac also declined after

doxorubicin treatment. Moreover, dox induced a decrease in Rac1 and Rap1 activity as shown

by a lower amount of Rac and Rap-GTP (Figure 3C). These results suggest that Epac

signalosome is modulated by doxorubicin.

As Epac had also been implicated in cardiac remodelling in particular hypertrophy through

Calcineurin/NFAT and CaMKII/MEF-2 pathways (24,28), we then determined the effect of

dox on these two pathways by measuring calcineurin activity and transcriptional activity of

NFAT and MEF-2. Cardiomyocytes were transfected with luciferase (Luc) constructs under

the control of promoter for MEF-2 or NFAT and treated or not with doxorubicin for 24 hours

(Figure 4B). Figure 4B showed a 60% increase in the transcriptional activity of MEF-2

whereas calcineurin activity and NFAT transcriptional activity was decreased respectively by

60% and 50% in neonatal cardiomyocytes treated with 1µM of doxorubicin. These results

indicate an activation of CaMKII/MEF-2 pathway and an inhibition of Calcineurin/NFAT

pathway.

Similar results were obtained with the transcriptional activity of NFκB, a transcription factor

activated by RhoA and implicated in differentiation, inflammation and cell proliferation (37).

From these results, we conclude that dox induces a global alteration of Epac signaling with a

specific response of CamKII/MEF-2 and Calcineurin/NFAT pathways to Dox.

Page
183
Epac inhibition exerts protective effects against dox-induced DNA damage and cellular

mortality

Further studies were undertaken to determine the role of Epac in other features of dox-

induced cardiotoxicity such as DNA damage and cardiomyocytes loss. We examined the level

of phosphorylation of histone γH2AX on the serine 139, a well known DNA damage marker

mediated through DNA double strand breaks (38), under pharmacological modulation of

Epac. As expected, Dox induced a strong increase (12X fold increase compared to control) of

the level of phosphorylation of γH2AX in NRVMs. Interestingly, DNA damage was further

increased by the application of 8-CPT (40X fold increase compared to control) (Figure 5A).

Conversely, inhibition of both Epac isoforms by ESI09 abolished the DNA damage induced

by dox (Figure 5A). However, Epac2 selective inhibition by ESI05 generated the same

amount of DNA damage as dox alone suggesting a preferential protective role of Epac1

inhibition. To test this hypothesis, we either overexpressed Epac1 using Ad-Epac1WT or

inhibited Epac1 using shRNA adenovirus for Epac1 as compared to respectively Ad-GFP or

scramble shRNA in NRVMs treated or not with Dox (1µM, 24h) (Figure 5B). The

overexpression of Epac1 did not further increase DNA damage induced by dox. However,

Epac1 specific inhibition significantly decreased DNA damage compared to scramble

shRNA. In addition, scramble shRNA had also non specific interaction with Epac1 leading to

decreased expression of Epac1. Moreover, DNA damage was further reduced as Epac1

expression decreased (Figure 5B). These results indicate that specific inhibition of Epac1, but

not Epac2, can prevent dox-induced DNA damage.

We then further investigated the role of Epac in dox-induced cardiomyocyte death by flow

cytometry using fluorescein diacetate, a general marker of cell viability. Surprisingly, the

application of 8-CPT did not further potentiate dox-induced mortality of neonatal

Page
184
cardiomyocytes. As dox induced an increase in Epac1 activity, the additional activation of

Epac by 8-CPT could not induced more damage as dox alone explaining this result.

Nonetheless, cardiomyocytes death was partially blocked with ESI09 and CE3F4, a specific

inhibitor of Epac1 (Figure 5C). In addition, ESI09 and CE3F4 presented the same protection

as Dexrazoxane, a FDA-approved cardioprotective agent. Absolute values of cell death were

39.5% ± 4.5% for dox alone, 26.7% ± 3.4% for ESI09, 22.6% ± 4.5% for CE3F4 and 21% ±

3.5% for dexrazoxane. Therefore, Epac1 could be a new potential therapeutic target against

doxorubicin cardiotoxicity by preventing DNA damage and subsequently cardiomyocytes

death.

The protective effects of Epac1 inhibition are mediated through Topoisomerase II β

pathway regardless of Rac1 activation state

Then we further investigated the signaling pathways involved in Epac protection against dox-

induced DNA damage. Topoisomerase II β (TopII β) has been recently identified as a new

potential therapeutic target of dox induced cardiotoxicity. Indeed, doxorubicin stabilizes the

cleavable complex DNA-TopII β which generate DNA double strand break (39). Therefore

we determined the role of Epac in TopII β-mediated DNA damage.

Figure 6A shows that Epac modulates the expression of TopII β. Whereas Epac activation led

to a surexpression of TopII β, Epac1 inhibition by ESI09 and CE3F4 resulted in a decreased

TopII β protein expression to the same level as dexrazoxane.

Next, we determined the role of Epac in the formation of DNA-TopII β cleavable complexes

by band depletion assay (Figure 6B). Doxorubicin treatment resulted in a decrease of free

TopII β protein level (90%) indicating a strong increase in DNA-TopII β complexes.

No statistical differences were observed after the application of 8-CPT. However, Epac

inhibition by ESI09, but not Epac2 inhibition, led to a decrease in the formation of DNA-

Page
185
TopII β complexes as shown by an increase in free TopII β protein level (by 34% compared to

dox alone). Similar results were obtained by using Epac1 shRNA (Figure 6C). Moreover, the

concomitant inhibition of Epac1 (by shRNA) and Epac2 (by ESI05) inferred the same effect

on TopII β indicating that the inhibition of dox-induced formation of the cleavable complex

is mediated specifically through Epac1 (Figure 6C).

As Rac1 has been shown to be required for DNA damage induced by Dox through TopII β

(13), we then elucidated the role of Rac1 in the protective effect of Epac1 inhibition against

DNA damage induced by dox. In order to determine whether Rac1 is an integral part of Epac

effects on TopII β pathway, NRVMs were infected with either positive dominant of Rac (Ad-

RacG12V) and treated with ESI09 or CE3F4, or negative dominant of Rac (Ad-RacS17N) and

treated with 8-CPT. DNA damage and cleavable complex formation were then analyzed

(Figure 6D). The inhibition of Rac1 by Ad-RacS17N prevented the formation of cleavable

complex as well as DNA damage, and vice versa (Figure 6D and E). However, Epac

activation by 8-CPT led to a partial increase of cleavable complex formation but not DNA

damage, regardless of Rac inhibition.

Moreover, Epac1 specific inhibition was sufficient to prevent both DNA damage and

cleavable complex formation despite Rac activation by Ad-RacG12V.

These results demonstrate that Epac1 inhibition blocks the deleterious effect of doxorubicin

through TopII β pathway independently from Rac1.

Doxorubicin-induced cardiotoxicity is prevented in Epac1 knock-out mice

To further confirm the protective effects of Epac1 inhibition in vivo, Epac1 knock-out (KO)

mice were subjected to dox injection (with the same protocol as wild type mice) and analyzed

at 15 weeks after the last injection, time of DCM development.

Page
186
Dox-treated Epac1 KO mice display a growth delay from 2 weeks after dox-treatment but

recover the initial delay between 6 to 10 weeks. However, this recover was not sustained and

led to a decrease in mice body weight at 10 weeks post treatment.

However, Epac1 KO mice exhibit a preserved cardiac function after dox treatment as

evidenced by unaltered ejection fraction and left ventricule end-diastolic volume (Figure 7A).

Data from our lab showed that dox induced a decrease in [Ca2+]i transients and cell shortening

as a result of reduced SR Ca2+ load (data submitted).

In the present study, Epac1 deletion prevented calcium homeostasis alterations induced by

dox. Indeed, calcium transients and SR load were increased in Epac1 KO mice without an

impact on cell shortening (Figure 7B). At the molecular level, the decreased expression of

Epac2 and RhoA in dox-treated mice was completely recovered in Epac1 KO mice. Rac1

expression was also decreased by 46% in Epac1 KO mice treated with dox without any

change of this protein level at basal conditions (Figure 7C). As Rac1 inhibition prevents dox

induced DNA damage (13), this could suggest that Epac1 KO mice are protected against dox

cardiac side effects in part through Rac1 inhibition.

These results suggest that dox induced cardiotoxicity is prevented in Epac1 KO mice. Thus,

Epac1 inhibitors could be a relevant therapeutic target of dox-induced cardiomyopathy.

Epac1 inhibition does not interfere with doxorubicin antitumoral activity

The major issue in dox side effects is to prevent the cardiotoxicity without interfering with

dox antitumoral efficiency. Therefore, we measured antitumoral activities of ESI09 as

compared to dexrazoxane in cancerous cell lines. We choosed a breast cancer cell line (MCF-

7) as breast cancer is one of the most frequent therapeutic indication. To determine whether

ESI09 could potentiate dox antitumoral activity, we also choosed a pulmonary cancer cell line

(A549), as pulmonary cancer with a rare therapeutic indication for dox.

Page
187
In this both cell lines, dexrazoxane treatment did not result in neither increase in cell

proliferation nor in a decrease of MCF-7 viability. Moreover, Epac inhibition by ESI09 did

not interfere with dox efficiency on MCF7 cell line and even potentiate it at high dose of dox

(Figure 8). Although ESI09 was not able to increase dox efficiency, it did not worsen the

resistance to doxorubicin in A549 cell line.

Therefore, Epac1 inhibition did not interfere with doxorubicin antitumoral activity in vitro.

Discussion

The present study shows for the first time the involvement of Epac in doxorubicin-induced

chronic cardiotoxicity. Indeed, in vivo dox treatment resulted in a time-dependant modulation

of Epac signaling associated with calcium homeostasis disregulation. In vitro, Dox treatment

led to a global alteration caracterized by an increased Epac activity, despite a decrease in Epac

expressions, associated with a specific response of CaMKII/MEF-2 and Calcineurin/NFAT

pathways to dox. Moreover, Epac1 specific inhibition by pharmacological modulators or

adenovirus shEpac1 prevented the formation of DNA-TopII β cleavable complexes, DNA

damage and subsequently cardiomyocytes death through downregulation of TopIIβ. The

protective effect of Epac was confirmed in vivo in Epac1 KO mice indicating that Epac1

inhibition prevents dox induced cardiotoxicity. We also showed that Epac inhibition does not

interfere with dox efficiency in vitro.

In our in vivo model, we also reported slight structural changes that result in sarcomere loss

and myolysis which start 2 weeks post-treatment in the right ventricle then reach the left

ventricle at 6 and 15 weeks post-treatment and led to dilated cardiomyopathy at 15 weeks

post-treatment. These changes were not associated with cardiomyocytes mortality or fibrosis

as shown in several rodent models of dox-induced cardiotoxicity.

Page
188
The discrepancy is likely caused by different doses, different methods of administration

and/or different time focus used in several models of dox-induced cardiotoxicity. In other

mouse models, high doses of doxorubicin is used which resulted in cardiomyocytes loss and

led to a non-clinically relevant increase of mice death shortly after the last injection (29, 40,

41). In this study, we reported time-dependent alterations of Epac signaling in vivo which

worsen with the development of dox-induced cardiotoxicity. This suggests that dox-induced

cardiotoxicity may be primarily caused by modifications of these signaling pathways, in

particular Epac signaling rather than cardiomyocytes loss.

The underlying mechanisms of Epac signaling alterations induced by dox were further

investigated in vitro in NRVMs treated or not with dox (1µM, 24h). The expression of Epac,

as well as the expression and activity of Rap1 and Rac1, small G proteins activated by Epac,

were also strongly decreased by doxorubicin-treatment. Despite decrease expression of Epac,

Epac1 activity was increased early after dox treatment. This increase was associated with a

specific response of Calcineurin/NFAT and CaMKII/MEF-2 pathways. Indeed, in our

previous studies, we showed that activation of Epac induces hypertrophy through the Ras and

Rac-dependent activation of calcium sensitive proteins such as Calcineurin and CaMKII and

downstream transcription factors NFAT and MEF-2 (24, 28). However, dox induced the

inhibition of Calcineurin/NFAT pathway and did not lead to hypertrophy in our in vivo and in

vitro models. Nonetheless, dox induced the activation of CaMKII/MEF-2 pathway which

didn’t cause hypertrophy in vitro as activation of both pathways are required to induce

hypertrophy (28). Interestingly, the activation of CaMKII by dox was rather incriminated in

dox-induced alteration of calcium homeostasis by increasing SR calcium leak (20). As dox

induced calcium homeostasis alteration through decreased SR load, the activation of CaMKII

by dox might participate to the deleterious effects of Epac activation.

Page
189
This dual role of Epac can result in either inhibition or activation of cardiomyocytes

apoptosis. Indeed, this discrepancy has been observed in several studies showing that Epac

can trigger pro- and anti-apoptotic pathways in the heart and other tissues (42-47). In our

study, we found that DNA damage induced by dox was increased by the pharmacological

activation of Epac which was not correlated with increase of cardiomyocyte mortality. As,

dox treatment led to an increase in Epac activity, additional activation of Epac by 8-CPT

could not lead to a a synergy of dox deleterious effects. In addition, a limited 8-CPT

stimulation could have limited effect on a reduced Epac level expression. However, the

inhibition and downregulation of Epac1 induced a strong decrease of DNA damage induced

by dox. Moreover, the inhibition of Epac1 partially prevented cardiomyocytes death and

offered the same protection as Dexrazoxane in cardiomyocytes treated with dox for 24 hours.

The cardioprotective effects of Epac1 were also observed in Epac1 KO as evidenced by

unaltered cardiac function in Epac1 KO mice treated with doxorubicin.

The doxorubicin cardiotoxicty in Epac1 KO was countered by the prevention of calcium

homeostasis and calcium signaling proteins as well as Epac signaling impairments. This

prevention may partially act through Rac1 as its expression was decreased after dox treatment

in Epac1 KO mice. These results suggest an important role of Epac1 in dox-induced

cardiomyopathy.

Indeed, a previous study showed a beneficial effect of Epac1 inhibition in autophagy induced

by hypertrophy (48). These results suggest that Epac1 inhibition could be a valuable

therapeutic target in heart failure of different etiologies such as doxorubicin-induced

cardiotoxicity, hypertrophy and ischemia.

One of the major mechanisms of dox-induced cardiomyocytes death involves TopII β.

Topoisomerase II is an enzyme that regulates over- or underwinding of DNA by the formation

of DNA-TopII cleavable complexes and the generation of DNA double strand breaks (49).

Page
190
Topoisomerase II has an important role in replication and transcription and is therefore of

particular interest in anticancer therapy (50). Recently, Zhang et al discovered a new

paradigm in dox-induced cardiotoxicity in which TopII β plays a central role. Indeed, they

showed that TopII β is required for ROS generation, DNA damage and cell death, the 3 major

mechanisms involved in doxorubicin side effects (51). In our study, inhibition of Epac

induced the downregulation of TopII β. As dexrazoxane prevention against dox induced

cardiotoxicity was mainly attributed to proteasomal degradation of TopII β (10), further

investigation on the regulation of TopII β expression by Epac is therefore required.

Additionally, Epac1 inhibition was able to prevent dox-induced formation of DNA-TopII β

cleavable complex as evidenced by a higher protein level of free TopIIβ.

We hypothesize that the protective effect of Epac was mediated by Rac1 as it is activated by

Epac and is required for TopII β-mediated DNA damage (13,28). In particular, Rac1

inhibition prevented DNA-TopII β cleavable complex formation and subsequent DNA

damage response induced by Dox (11-13). According with this study, we observed a

significant decrease of DNA-TopII β formation and DNA damage induced by Dox with

negative dominant of Rac1 (Ad-RacS17N) and conversely with positive dominant of Rac1 (Ad-

RacG12V). However, inhibition of Epac still induced a decrease in cleavable complex

formation as well as in DNA damage regardless of the deleterious effects of Rac activation.

Moreover, activation of Epac partially counteracted the beneficial effect of Rac inhibition on

the same two parameters. These findings indicate two distinct pathways in which Epac and

Rac exert their TopII β-mediated protective effects against dox-induced cardiotoxicity.

Finally, the beneficial effects of TopII β inhibition on dox cardiotoxicity and antitumoral

efficiency rely on the fact that cancerous cells overexpresse TopII α suggesting that targeting

TopII β could have potential therapeutic effects.

Page
191
The role of Epac in TopII α had not been investigated in this study. However, we showed that

Epac doesn’t interfere with dox cytotoxicity in breast (MCF7) and pulmonary (A549) cancer

cell lines and could potentiate it at high doses of dox. To determine if there is a crosstalk

between cardioprotection and dox efficiency, investigation in in vivo models are also required.

In conclusion, despite 50 years of research, our study provides new insights in doxorubicin-

induced cardiotoxicity. Indeed, we have identified Epac1 a key regulator of this cardiac

pathology. Inhibition of Epac1 prevented TopII β-mediated DNA damage and

cardiomyocytes death in vitro. In vivo, Epac1 KO mice showed preserved cardiac function

after dox-treatment. Moreover, Epac inhibitors did not counteract dox antitutomal activity.

Thus, Epac inhibitors constitute a valuable therapeutic strategy in doxorubicin-induced

cardiotoxicity.

Acknowledgments

This work was supported by grants from Labex LERMIT, TORINO and INSERM. Marianne

Mazevet was recipients of grants from Labex LERMIT. We gratefully thank Dr Chen from

University of San Diego (USA) for providing us with Epac1 knock out mice. We are grateful

to Valérie Dommergue and the animal facility for mice care. The authors thank

NicolasRaymond for his excellent histologic work and Microscopy Facility of the Centre

Chirurgical Marie Lannelongue.

Sources of funding

This study was supported by Labex LERMIT, TORINO and INSERM.

Page
192
Disclosures

None

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Figures (1205 words)

Figure 1: Doxorubicin induces a cardiotoxicity in C56Bl6 mice at 15 weeks after the last

injection

A: Body weight of mice treated with Doxorubicin or vehicle (Saline solution NaCl 0.9%) for

15 weeks.

B: Ratio of heart weight/tibia length of treated mice at 2, 6 and 15 weeks after the last

injection. Numbers of mice are indicated as above. Results are expressed as fold activation of

control mice. No significant difference of the ration heart weight/tibia length between control

and Doxorubicin-treated mice after 2, 6 and 15 weeks have been observed.

C: Representative M mode echocardiograms of wild type, Epac1 KO and littermate mice from

saline and Doxorubicin treatments groups.

D: Ejection fraction of treated mice at 2, 6 and 15 weeks after the last injection. Numbers of

mice are indicated as above. *P<0.05 compared with control.

E: Left ventricule telediastolic volume of treated mice at 2, 6 and 15 weeks after the last

injection. Numbers of mice are indicated as above. Results are expressed as fold activation of

control mice. *P<0.05 compared with control.

Figure 2: Time-dependent modulation of Epac signaling induced by Doxorubicin at 2, 6 and

15 weeks after the last injection in vivo.

Page
202
Quantitative protein expression of Epac1 (A), Epac2 (B), Rap1 (C), Rac1 (D) and Rho A (E)

performed on cardiomyocytes obtained from mice injected or not (saline) with Dox at 2, 6 or

15 weeks after the last treatment. Numbers of mice are indicated as above. Immunoblots were

quantified and normalized to β-actin expression and internal control. Data are mean±SEM and

are expressed as percentage of the control value (saline-injected mice). *P<0.05, ** P<0.01,

***P<0.001 compared to saline.

Figure 3: Doxorubicin impairs Epac signaling by increasing Epac activity and by modulating

small G proteins activated by Epac

A: Doxorubicin induces a decrease in Epac 1 and Epac 2 expression. Representative

immunoblot showing Epac1 and Epac2 protein expression level in neonatal rat

cardiomyocytes exposed or not to various Dox concentration for 24h. Experiments were

performed 3 times on 3 independent cardiomyocytes primary cultures.

B: Doxorubicin induces a increase in Epac1 activity. Experiments were performed 3 times on

3 independent cardiomyocytes primary cultures using BRET CAMYEL assay.

C: Doxorubicin induces a decrease in the expression and activity of small G proteins Rac1 but

not Rap1 activated by Epac1. Representative immunoblot showing Rap1 and Rac1 protein

expression level (B1) as well as representative pull down assay showing Rap1 and Rac1

activity in neonatal rat cardiomyocytes exposed or not to various Dox concentration for 24h.

Experiments were performed 3 times on 3 independent cardiomyocytes primary cultures.

Results are expressed as fold activation of control mice.*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001

compared with control.

Figure 4: Increased activity of Epac induced by Dox leads to cardiac remodelling via a

specific response of Calcineurin/NFAT and CaMKII/MEF-2 pathways in vitro

Page
203
A: Calcineurin activity assay

B: Dose-dependent modulation of downstream effectors of Epac1: NFAT, MEF-2 and NFκB

by Doxorubicin. Rat neonatal cardiomyocytes were transfected with MEF2-Luc, NFAT-Luc

or NFKB-Luc and exposed or not to various Dox concentrations (0.1 or 1 µM) for 24 hours.

Two days after transfection, cells were assayed for Luc activity and normalized to renilla

luciferase transcriptional activity. Experiments were performed 3 times on 3 independent

cardiomyocytes primary cultures.

Results are expresses as percentage activation of control. *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001

compared with control.

Figure 5: Specific inhibition of Epac1 prevents cardiomyocytes death induced by

Doxorubicin in vitro

A: Epac1 inhibition prevents DNA damage induced by Doxorubicin. Representative

immunoblot and quantification showing γH2AXpS139 protein expression level in neonatal rat

cardiomyocytes exposed or not to Dox (1µM), pharmacological modulator of Epac (Epac’s

specific activator (8CPT 1µM) and Epac’s inhibitors (ESI09 1µM, ESI05 1µM)) and

dexrazoxane (200µM) for 24h.

B: Representative immunoblot and quantification showing γH2AXpS139 protein expression

level in neonatal rat cardiomyocytes exposed or not to Dox (1µM) and previously infected

with Ad-Epac1WT or shEpac1. Experiments were performed 5 times on 5 independent

cardiomyocytes primary cultures.

B: Epac1 inhibition prevents cell death induced by Doxorubicin. Flow cytometry using FDA

(0.1µg/mL) on neonatal rats cardiomyocytes treated or not with doxorubicin (1µM), 8-CPT

(1µM), ESI09 (1µM), ESI05 (1µM), (R)-CE3F4 (10µM) or dexrazoxane (200µM).

Page
204
Experiments were performed 5 times on 5 independent cardiomyocytes primary cultures.

*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 compared with control.

Figure 6: Cardioprotective effect of Epac1 inhibition is mediated by TopIIβ pathway but not

by Rac1 in vitro

A: Modulation of TopII β protein expression by Epac. Representative immunoblot TopII β

protein expression level in neonatal rat cardiomyocytes exposed or not to Epac’s specific

activator (8CPT 1µM) and Epac’s inhibitors (ESI09 1µM, ESI05 1µM)), Dexrazoxane

(200µM) for 24h. Experiments were performed 4 times on 4 independent cardiomyocytes

primary cultures.

B: Epac inhibition decreases the formation of DNA- TopII β complexes induced by

Doxorubicin. Band depletion assay showing the formation of DNA-TopII β cleavable

complex measured by immunoblot and quantification of free TopII β protein expression level

in neonatal rat cardiomyocytes exposed or not to Dox (1µM), pharmacological modulator of

Epac (Epac’s specific activator (8CPT 1µM) and Epac’s inhibitors (ESI09 1µM, ESI05

1µM)) and dexrazoxane (200µM) for 24h. Experiments were performed 5 times on 5

independent cardiomyocytes primary cultures.

C: Band depletion assay showing the formation of DNA-TopII β cleavable complex measured

by immunoblot and quantification of free TopII β protein expression level in neonatal rat

cardiomyocytes exposed or not to Dox (1µM) and previously infected with Ad-Epac1WT or

shEpac1. Experiments were performed 5 times on 5 independent cardiomyocytes primary

cultures.

D: Rac1 is not involved in the beneficial effects of Epac1 on Doxorubicin-induced

cardiotoxicity. Band depletion assay showing the formation of DNA-TopII β cleavable

complex measured by immunoblot and quantification of free TopII β protein expression level

Page
205
in neonatal rat cardiomyocytes exposed or not to Dox (1µM), pharmacological modulator of

Epac (Epac’s specific activator (8CPT 1µM) and Epac’s inhibitors (ESI09 1µM) for 24h and

previously infected with Ad-RacG12V or Ad-RacS17N. Experiments were performed 4 times on

4 independent cardiomyocytes primary cultures.

E: Representative immunoblot showing γH2AXpS139 protein expression level in neonatal

rat cardiomyocytes exposed or not to Dox (1µM), pharmacological modulator of Epac

(Epac’s specific activator (8CPT 1µM) and Epac’s inhibitors (ESI09 1µM) for 24h and

previously infected with Ad-RacG12V or Ad-RacS17N. Experiments were performed 4 times on

4 independent cardiomyocytes primary cultures.

Figure 7: Doxorubicin-induced cardiotoxicity is prevented in Epac1 knock out mice

A: Echocardiography : Body weight of Epac1 KO mice treated with Doxorubicin or vehicle

(Saline solution NaCl 0.9%) for 15 weeks, ejection fraction of Epac1 KO treated mice at 15

weeks after the last injection. Left ventricule telediastolic volume of Epac1 KO treated mice

at 15 weeks after the last injection. Numbers of mice are indicated as above. Results are

expressed as fold activation of control mice for left ventricule telediastolic volume. *P<0.05

compared with control.

B: Calcium transients in Epac1 KO mice treated or not with doxorubicin at 15 weeks. Data

are mean±SEM and are expressed as percentage of the control value (saline-injected mice).

*P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001 compared to saline.

C: SR load in Epac1 KO mice treated or not with doxorubicin at 15 weeks. Data are

mean±SEM and are expressed as percentage of the control value (saline-injected mice).

*P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001 compared to saline.

D: Modulation of Epac and calcium signaling in Epac1 KO mice treated with doxorubicin.

Quantitative protein expression of Epac1, Epac2, Rap1, Rac1, Rho A, Serca2a, PLB,

Page
206
phosphorylated PLB, RyR, phosphorylated RyR and NCX performed on cardiomyocytes

obtained from Epac1 KO mice injected or not (saline) with Dox at 15 weeks after the last

treatment. Numbers of mice are indicated as above. Immunoblots were quantified and

normalized to β-actin expression. Data are mean±SEM and are expressed as percentage of the

control value (saline-injected mice). *P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001 compared to saline.

Figure 8: Epac inhibition does not interfere with Doxorubicin efficiency on cancer cell lines.

Flow cytometry using FDA (0.1µg/mL) on neonatal rats cardiomyocytes treated or not with

doxorubicin (1µM), ESI09 (1µM), or dexrazoxane (200µM). Experiments were performed 3

times on 3 independent cardiomyocytes primary cultures. A: Breast cancer cell lines (MCF-

7). B: Lung cancer cell lines (A549) *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 compared with control.

Supplemental figures:

Supplemental figure 1: Doxorubicin induces structural alterations of right and left ventricles

in C57Bl6 mice.

Representative histological analysis by hematoxylin and eosin staining of left and right

ventricle sections from treated mice at 2, 6 and 15 weeks after the last injection.

A,B,C: Right ventricles of saline-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after the last

injection

A’,B’,C’: Right ventricles of doxorubicin-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after

the last injection

D,E,F: Left ventricles of saline-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after the last

injection

D’,E’,F’: Left ventricles of doxorubicin-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after

the last injection

Page
207
Supplemental figure 2: Structural alterations of mice treated with Doxorubicin is not caused

by increased apoptosis.

Representative histological tunel analysis of left and right ventricle sections from treated mice

at 2, 6 and 15 weeks after the last injection.

A,B,C: Right ventricles of saline-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after the last

injection

A’,B’,C’: Right ventricles of doxorubicin-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after

the last injection

D,E,F: Left ventricles of saline-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after the last

injection

D’,E’,F’: Left ventricles of doxorubicin-treated mice at respectively 2,6 and 15 weeks after

the last injection

Page
208
Figure 1

A 34
B 1,4
32
1,2

Heart weight/ Tibia lenght

Body weight (g)

30
1

(% of control)
28
Vehicle 0,8
Dox
26
0,6

24 0,4

22 0,2
19 21 20 24 15 19
20 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox
Weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks
15 weeks
C Saline Dox

D 100 E
Left ventricule end-diastolic volume
0,16
*
80
Ejection Fraction (%)

* 0,12
60
(mL)

0,08
40

0,04
20

19 21 20 24 15 19 19 21 20 24 15 19
0 0
Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox

2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

Figure 2
2 weeks 6 weeks 15 weeks
2 weeks 6 weeks 15 weeks
CT DOX CT DOX CT DOX
A Epac1
CT DOX CT DOX CT DOX
B Epac2

β-actin
β-actin

3,5
Relative protein expression of Epac2

2
Relative protein expression of Epac1

1,5 2,5
*
2

1 1,5

* 1
0,5 **
0,5 *
8 7 9 8 7 8
8 7 9 8 7 8 0
0 Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox
Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox 2 weeks 6 weeks 15 weeks
2 weeks 6 weeks 15 weeks

C D E
2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX CT DOX

Rap1 Rac1 Rho A

β-actin β-actin β-actin

3
Relative protein expression of Rac1 protein

2
Relative protein expression of Rap1

1,5
**
Relative protein expression of RhoA

2,5
1,5
2
1
1,5 1

1 *
0,5 *
0,5
0,5

8 7 9 8 7 8 8 7 9 8 7 8
0 0 8 7 9 8 7 8
Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox 0
Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox
2 weeks 6 weeks 15 weeks Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox
2 weeks 6 weeks 15 weeks
2 weeks 6 weeks 15 weeks

Page
209
Figure 3
Doxorubicin (µM)
Doxorubicin (µM)
Control 0.01 0.1 1 Control 0.01 0.1 1
A Epac1 Epac2

β-actin β-actin
1,5
Relative protein expression of Epac1

1,5

Relative protein expression of Epac2

1 1

0,5
*** 0,5 *

0 0
CT DOX 0.01µM DOX 0.1µM DOX 1µM CT DOX 0.01µM DOX 0.1µM DOX 1µM

Doxorubicin (µM)

Relative expression of Rac GTP/ Total

1
Control 1 10

B C Rac1

(% of control)
β-actin

0,5
Doxorubicin (µM)
Control 0.1 1

Rac-GTP
Total Rac
0
CT DOX 0.1µM DOX 1µM

Relative expression of Rap1-GTP/ Total

1,5

Doxorubicin (µM)
1

(% of control)
Control 0.1 1

Rap1
Rap1-GTP

0,5
Total Rap1
Rac1

0
CT DOX 0.1µM DOX 1µM

Figure 4

A B
2
***
Relative activity Luciferase/Renilla

2
1,5
Relative calcineurin activity

1,5 MEF-2
(% of control)

1 NFAT
NFkB
1
***
***
0,5
* 0,5

0 0
CT DOX 0,1 µM DOX 1µM CT DOX 0,1µM DOX 1µM

Page
210
Figure 5 :

Relative protein expression of H2AX pS139

A 50 #
***
Doxorubicin (µM) 40
Control 8-CPT ESI09 ESI05
Control 0.01 0.1 1 DOX 1µM - + - + - + - +

H2AXpS139 H2AXpS139
30 **
β-actin β-actin
20 *
10 #
** *
* compared with control. # compared with doxorubicin alone.
0

µM

DO 05
T

M
I0
C

P
1µ
1µ

1µ

1µ
1µ

I
8C

ES

ES
01

0.

X
X
B

0.

O
X
X

D
D
O
Relative protein expression

+
D

5
PT

I0

I0
GFP Ad-Epac1 CT shCT shEpac1 15

8C

ES

ES
Epac1 Epac1
of H2AX pS139 **
β-actin β-actin
10

GFP Ad-Epac1 shCT shEpac1 *

DOX 10µM - - + - - + - - + - - +
DOX 1µM - + - - + - - + - - + -
$$
5
H2AXpS139 ###
β-actin
0
DOX 1µM - + - + - + - +
GFP Ad-Epac1 shCT shEpac1
* compared with GFP. # compared with shCT. $ compared with shCT+DOX1µM

C
Percentage of cell death

50
45 ***
40 ***
##
35
*
30 #
##
25
20
15
10
5
0
DOX 1µM - + - + - + - + - +
CT 8-CPT ESI09 CE3F4 DRZ

* compared with control. # compared with doxorubicin alone.

Page
211
Figure 6

Relative protein expression of TopII

2

A CT ESI09 8-CPT DXR CE3F4 *

1,5
TopII β
1 **
β-actin * **
0,5

0
Control 8-CPT ESI09 CE3F4 DXR

B 2
##

Band depletion assay of TopII

CT 8-CPT ESI09 ESI05
1,5
###
Dox 1µM - + - - + - - + - - + -
Dox 10µM - - + - - + - - + - - +

TopII β 1

**
β-actin 0,5
***
*** *** ***
*** *** ***
* compared with control. # compared with doxorubicin alone. 0
Dox 1µM - + - - + - - + - - + -
Dox 10µM - - + - - + - - + - - +
CT 8-CPT ESI09 ESI05

C Band depletion assay of TopII

2,5

2
GFP Ad-E1 shCT shCT+5 shE1 shE1+5
Dox 1µM - + - + - + - + - + - + 1,5
TopII β
1 #
# # #
β-actin ** **
0,5 * ** **
***
Légende: 0
Dox 1µM - + - + - + - + - + - +
Ad-E1: Ad-Epac1;shCT: shcontrol; 5: ESI05; shE1: shEpac1
GFP Ad-E1 shCT shCT+5 shE1 shE1+5
* compared with GFP. # compared with GFP+DOX1µM.

D
2,5
# $
Band depletion assay of TopII

GFP Rac S17N

#
8-CPT - - + + - - + +
Dox 1µM - + - + - + - + 2 #
TopII β
1,5 #
β-actin
1
* ** ** ***
GFP Rac G12V 0,5 ** ***
8CPT ESI09 ESI09 CE3F4
Dox 1µM - + - + - + - + - + - + ***
0
TopII β Dox 1µM - + - + - + - + - + - + - + - +
µM
µM
X1
10

8-CPT ESI09 ESI09 CE3F4 8-CPT

O
F4

β-actin
E3

GFP RAC G12V RAC S17N

+
µM
E3 R)C
10
(
V+

F4
12
12 acG

)C
(R
R

E
V+
H2AX pS139 protein expression level

30
ac

$
R

*
*
(% of control)

20 $
GFP Rac G12V Rac S17N
ESI09 8CPT ESI09 8CPT *
**
Dox 1µM - + - + - + - + - + - + - +
10
H2AX pS139
#
# #
β-actin
#
0
Dox 1µM - + - + - + - +
- + - + - +
ESI09 8-CPT ESI09 8-CPT
GFP RAC G12V RAC S17N
* compared with control. # compared with doxorubicin alone.

Page
212
Figure 7 :

A 0,16

Left ventricule end-diastolic volume

36
100
34

0,12 80
32

Ejection fraction (%)

(% of vehicle)
Body weight (g)

30
60
28
Epac1 KO vehicle 0,08
Epac1 KO Dox

26 40

24 0,04
20
22

20
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Weeks Vehicle Dox Vehicle Dox

B
1,5
1,5
1,5
**
Time to peak (% of vehicle)

Shortening (% of vehicle)
* 1
F/Fo (% of vehicle)

1
1

0,5 0,5
0,5

N=3; n=12 N=3; n=22

N=3; n=41 N=3; n=49 N=3; n=41 N=3; n=46
0 0 0
Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox

C
1,5 1,5
**
F/Fo (% of vehicle)

Tau (% of vehicle)

1 1

*
0,5 0,5

N=3; n=23 N=3; n=27 N=3; n=18 N=3; n=22

0 0
Vehicle Dox Vehicle Dox

D
Epac1 KO CT
LT Epac1 KO CT
LT Epac1 KO CT
LT

Epac 1 Epac 2 Rap 1

β-actin β-actin β-actin

Epac2 3
Rap1 Rac1 RhoA
1,5
Relative protein expression of Rap1

* 10
Relative protein expression of Epac 2

1,5
Relative protein expression of Rho A
Relative protein expression of Rac 1

2,5
8
1 2
1
6
1,5

0,5 1
0,5
* 4

0,5 2

6 5 3 2 6
0 0 0 5 0 3 2
Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox

Total PLB 1,5 Serca 2a RyR2 NCX

Relative protein expression of total PLB

Relative protein expression of Serca2

2
Relative protein expression of total RyR2

2,5 1,5
Relative protein expression of NCX

1,5 2
1
1
1,5
1

1
0,5 0,5
0,5
0,5

3 2 6 5 6 5 6 5
0 0 0 0
Vehicle Dox Vehicle Dox Vehicle Dox
Vehicle Dox

Page
213
Figure 8
A B
40 15
Percentage of cell death

Percentage of cell death

30
$$$
10
DOX DOX
20 ESI09 ESI09
DEXRAZOXANE DEXRAZOXANE
***
5
10 *
* * * **

0 0
µM

M
T

M
µM
C

T
0µ

0µ

0µ
X1

0µ

0µ

0µ
X1

X2

X5

X1
O

X1

X2

X5
O

O
D

O
D

D
Supplemental figure 1
A B C D E F

2 weeks 50 µm 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

A’ B’ C’
D’ E’ F’

2 weeks 50 µm 6 weeks 15 weeks

2 weeks 6 weeks 15 weeks

Suppl emental figure 2

A B C D E F

50 µm

2 weeks 6 weeks 15 weeks 2 weeks 6 weeks 15 weeks

A’ B’ C’
D’ E’ F’

50 µm
2 weeks 6 weeks 15 weeks
2 weeks 6 weeks 15 weeks

Page
214
2-3 Conclusion

Le traitement à la doxorubicine conduit à une diminution de la fraction d’éjection et à une

augmentation du volume télédiastolique du VG à 15 semaines post traitement, de façon
identique à l’étude précédente. La dox induit donc une cardiomyopathie dilatée sans effet
notable sur la mortalité des souris et sans aucune hypertrophie. De plus, les coupes
histologiques permettant d’analyser la mortalité cellulaire, la fibrose et la structure du
myocarde des souris traitées à la dox ne montrent aucune altération induite par la dox au
niveau de la mortalité des cardiomyocytes ainsi qu’au niveau de la synthèse de collagène par
la MEC (aucune fibrose). Cependant, des atteintes précoces se traduisant par une perte
sarcomérique associée à une myolyse légère à 2 semaines post traitement ont été observées au
niveau du VD. Ces altérations du tissu cardiaque sont croissantes à 6 semaines jusqu’à
atteindre les deux ventricules à 15 semaines post traitement. Ces résultats montrent qu’un
traitement à la dox conduit à une cardiomyopathie dilatée modérée, initiée dès l’injection et
s’installant à 15 semaines après la fin du traitement. De plus, les altérations cardiaques
induites par la dox ne sont pas associées dans notre modèle à une mortalité cardiomyocytaire
ni à une fibrose suggérant que ces altérations seraient dues à une modulation des
signalisations cardiaques. En effet, on a montré précédemment que la dox induit une
modulation temps-dépendante de la signalisation calcique. Au cours de cette étude, nous
avons pu démontrer qu’il y a également une modulation temps-dépendante de la signalisation
d’Epac. En effet, l’altération initiale à 2 semaines est associée à une diminution de
l’expression d’Epac2 et de Rac1. La phase de compensation à 6 semaines se traduit par un
retour au niveau basal de l’expression protéique d’Epac2 et de Rac1 ainsi qu’à une
augmentation de l’expression d’Epac1, et de RhoA. Cette phase de compensation n’est, de
façon identique à l’étude précédente, pas maintenue dans le temps ce qui conduit à une
nouvelle altération de la signalisation d’Epac avec une diminution de l’expression d’Epac1,
d’Epac2 et de RhoA.
On retrouve ces mêmes altérations dans des cultures primaires de cardiomyocytes de rats
nouveau-nés traités à 1µM de dox pendant 24 heures. En effet, le traitement in vitro à la dox
induit une réduction de l’expression d’Epac1 et d’Epac2 de respectivement 70% et 60%.

Page
215
Cependant, la diminution de l’expression d’Epac par la dox s’accompagne par une
augmentation temps dépendante de l'activité d'Epac1 et augmente de 25% à 24h de traitement
à la dox. Néanmoins, le traitement à la dox de 24h conduit également à une diminution de
l’expression et de l’activité des petites protéines G activées par Epac : Rap1 et Rac1.
De plus, le traitement à la dox induit au bout de 24 heures une activation de la transcription de
MEF-2 tandis qu’une diminution de l’activité transcriptionnelle de NFAT et de NFκB est
observée. Ces résultats suggèrent ainsi une altération globale d’Epac et de son signalosome
avec une réponse spécifique de la voie CaMKII/MEF-2 et Calcineurine/NFAT à la dox. Nous
avons ensuite étudié le rôle d’Epac dans la mort cellulaire induite par la dox. Ainsi,
l’expression du marqueur de dommage à l’ADN γH2AX phosphorylé sur la sérine 139
augmente fortement après traitement à la dox. Le traitement concomittant avec l’ESI09,
inhibiteur d’Epac1 et 2 ou le CE3F4, inhibiteur spécifique d’Epac1 ainsi que l’inhibition
spécifique d’Epac1 par application d’un adénovirus shEpac1 permet une diminution
significative du dommage à l’ADN. De manière intéressante, l’inhibition spécifique d’Epac2
par ESI05 n’a aucun effet sur le dommage à l’ADN induit par la dox suggérant ainsi que
l’inhibition spécifique d’Epac1 permet de prévenir les dommages à l’ADN induit par la dox.
De façon concordante, une diminution de la mortalité des cardiomyocytes a été observée
après pré-traitement à l’ESI09 et de façon identique après pré-traitement au CE3F4. De plus,
Epac module l’expression de la TopII β. L’inhibition d’Epac permet ainsi de réduire la
formation de complexe de clivage ADN-TopII β nécessaire à l’induction du dommage à
l’ADN induit par la dox. De plus, les effets protecteurs d’Epac sur la signalisation TopII et les
dommages à l’ADN induits par la dox ne dépendent pas de l’état d’activation de Rac1. En
revanche, l’activation d’Epac peut influencer négativement les effets protecteurs de
l’inhibition de Rac1 suggérant une efficacité plus élévée de l’inhibition d’Epac1 sur la
cardiotoxicité induite par la dox.
Ces résultats in vitro ont été confirmés in vivo chez des souris KO Epac1 exposées à la même
dose de dox (12mg/kg total). En effet, les altérations cardiaques ainsi que les altérations de
l’homéostasie calcique induites par la dox sont prévénues dans les souris KO Epac1. De plus,
on a pu observer une diminution de l’expression de Rac1 induite par la dox dans ce même
modèle murin suggérant que les effets protecteurs d’Epac1 pourraient passer partiellement par
Rac1.

Page
216
En conclusion, l’inhibition spécifique d’Epac1 permet la diminution de la formation des
complexes de clivage ADN-TopII β et ainsi la réduction des dommages à l’ADN mais
également de la mortalité cellulaire induits par la dox. Ceci permet également de prévenir les
effets délétères de la dox sur la fonction cardiaque et l’homéostasie calcique.
De plus, nous avons pu observer que l’inhibition d’Epac ne diminue pas la cytotoxicité de la
dox sur deux lignées cancéreuses différentes (MCF7 et A549). Ces résultats montrent donc le
potentiel thérapeutique de l’inhibition d’Epac1 dans la prévention de la cardiotoxicité induite
par la dox.
Afin de confirmer qu’Epac1 est une cible thérapeutique solide dans la prévention de la
cardiotoxicité induite par la dox, plusieurs études sont encore nécessaires et notamment:
- étude du rôle d’Epac dans le stress oxydant induit par la doxorubicine
- étude du rôle d’Epac dans les altérations mitochondriales induites par la
doxorubicine
- étude du rôle différentiel d’Epac1 et d’Epac2 dans le développement de la
cardiotoxicité induite par la dox : quels inhibiteurs utilisés (ESI09 ou CE3F4)
pour prévenir les altérations induites par la doxorubicine ?
- étude du rôle d’Epac dans le développement de la cardiotoxicité induite par
les traitements combinés (par exemple, doxorubicine+ irradiation,
doxorubicine+trastuzumab)
- étude des effets secondaires de l’inhibition d’Epac sur la néphrotoxicité et
l’hépatotoxicité induite par la doxorubicine
- étude des éventuels effets secondaires de l’inhibition d’Epac sur l’activité
antitumorale

Ces perspectives de travail seront plus amplement développées dans la partie discussion.

Page
217
Discussion

Page
218
Discussion et perspectives
Des études précédentes montrent l'implication des petites protéines G Rac1 et RhoA pouvant
être activées par Epac dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. L'objectif de cette
étude a donc été de déterminer le rôle d'Epac dans la cardiotoxicité induite par la dox. Pour
cela, nous avons mis en place un modèle in vivo de cardiotoxicité chronique induite par la dox
dans lequelle nous avons caractérisé les altérations de la signalisation d'Epac. Cette étude
montre ainsi une altération de la signalisation d'Epac induite par la dox concomittante aux
altérations de l'homéostasie calcique. La doxorubicine induit notamment l'activation d'Epac
conduisant à une modulation du signalosome d'Epac. L'inhibition d'Epac et notamment
d'Epac1 permet la prévention des effets cardiotoxiques in vivo et in vitro de la dox par la
diminution des dommages à l'ADN sans interférer avec l'efficacité antitumorale de la dox.
Cette étude ouvre donc plusieurs perspectives de travail qui seront abordées dans la
discussion. Les modèles expérimentaux de la cardiotoxicité induite par la dox, les effets de la
dox sur la signalisation d'Epac ainsi que le rôle d'Epac dans la mort cellulaire induite par la
dox seront ainsi discutés.

1- Modèles d’étude in vivo de la cardiotoxicité induite par la dox

Dans la littérature, il existe de nombreux modèles murins de cardiotoxicité induite par la

doxorubicine. Ces grandes disparités proviennent essentiellement du choix des souris (fonds
génétiques et âge), du choix de la dose et des modalités d’administration de la doxorubicine.
Une liste non exhaustive des différents modèles murins de cardiotoxicité induite par la dox est
présentée dans le tableau 7 (cf. page suivante). On peut ainsi remarquer que la plupart des
études sont réalisées chez des souris exposées à des doses supérieures à 20 mg/kg en injection
intrapéritonéale (i.p). Cependant, selon la monographie de la doxorubicine éditée par Pfizer,
la dose léthale moyenne (DL50) chez la souris Swiss s’établit respectivement à 8,5, 21,1 et à
plus de 750 mg/kg selon que la doxorubicine est administrée en i.p, en i.v. ou par voie orale (135).
Ainsi, une dose importante de doxorubicine injectée en IP (dose supérieure à 8,5mg/kg) peut
conduire à une nécrose abdominale importante et peut provoquer des effets secondaires
pouvant être responsable de l’augmentation de la mortalité des animaux sans complications
cardiaques sévères. De plus, peu d’études analysent la toxicité chronique de la doxorubicine
se limitant en moyenne à 2 semaines après la fin du traitement (cf. Tableau 7).

Page
219
L’objectif de cette étude étant d’étudier le développement de la cardiotoxicité induite par la
doxorubicine, nous avons choisi un modèle de souris C57Bl6 exposées à une dose cumulée
totale de dox de 12mg/kg administrée en 3 cycles d'injection espacés de 4 jours en
intraveineuse (i.v codale). En effet, la posologie moyenne de la dox est de 40 à 75 mg/m2 par
cycle, chaque cycle étant espacé de 3 à 4 semaines. Malgré la mise en garde d’une probabilité
d’installation d’une IC de 6 à 20% à 500 mg/m2 contre 5 à 8% à 400mg/m2, il est
recommandé dans la monographie de la dox de ne pas dépasser 550 mg/m2, dose plus
rarement atteinte chez les patients. En effet, chez les patientes atteintes d’un cancer du sein, la
doxorubicine est administrée en i.v en 3 cycles à 3 semaines d’intervalle pour une dose
cumulée totale qui se situe entre 300 et 350 mg/m2. Ce modèle a donc été choisi afin d’être le
plus proche possible de ce qui est pratiqué en clinique et offrir la même biodisponibilité
(volume et cinétique) sans induire de mortalité. Ainsi, le pourcentage de mortalité chez les
souris traitées à la doxorubicine est de 4% (4 souris mortes/99 pour 4 séries différentes). Les 4
souris sont mortes à partir de la 9ème semaine après la fin du traitement. Cependant, le nombre
de souris mortes dépendait essentiellement de la série. En effet, pour les deux premières
séries, le suivi des animaux n’était pas adéquat. Ainsi, certaines souris perdaient
anormalement du poids et atteignaient les points limites sans altération de la fonction
cardiaque. Ceci était du à la perte de leurs dents causées par la doxorubicine et donc à une
incapacité à se nourrir, problème corrigé dans les séries suivantes.
Les souris traitées à la dox ont également un retard de croissance avec une diminution de leur
poids de 5% par rapport aux contrôles dès la fin des injections et de 10% à 15 semaines. Ces
souris présentent également une diminution très légère (1%) de la taille de leurs tibias à 6
semaines, rattrapée à 15 semaines. La perte de poids est également fréquente chez les patients,
la doxorubicine étant émétique (135).
La nephrotoxicité ainsi que l’hépatotoxicité induites par la dox n’ont pas été étudiées au cours
de cette étude. Cependant, une mesure de poids des organes dont les poumons, le cœur, les
reins, le foie et la rate a été réalisée après chaque prélèvement. Une augmentation significative
de la masse pulmonaire (de 30%) consécutive aux atteintes initiales du VD a ainsi été
observée à 2 semaines. Une augmentation de la masse de la rate (de 30% également)
suggérant une inflammation a également été observée à 2 semaines. Aucune modification de
la masse des reins, du foie, des poumons et de la rate n’a été observée à 6 et 15 semaines post-
traitement.

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220
 Age
Souris Poids Dox/inject° nbre inject° DCT inject° durée étude % mortalité des animaux étude cibles Références
(semaine)
poids, QRS duration Zhao et al ,
BALB/c mâle et femelle 4-6 20-25g 2,5mg/kg/2j 7 17,5mg/kg IP 14j 50% Général
LDH 2011
potentiel memb mito
production ROS Zhang et al ,
Kunming mâle 20-24g 15mg/kg 1 15mg/kg IP 5j 30%
capsase 3 2009
apoptose
Bcl-2, Bax
fibrose collagene, desmine
29% mâles
stress oxydatif 3-nitrotyrosine, catalase
Van Almen
C57Bl6 10-12 2mg/kg/s 12 24mg/kg IP 12 semaines SOD2
et al , 2011
7% femelles Akt signaling phosphorylation Akt
matrix disruption MMP-2 et 9
apoptose capsase 3
fibrose microscope, fibrotic area Bernard et
BALB/cByJ mâle 10 25-30g 15mg/kg 1 15mg/kg IP 12j 69%
gene expression phospholamban, Ryr al , 2011
SERCA2a
Zhu et al ,
DBA/2J adulte 10mg/kg/3j 2 20mg/kg IP 7j euthanasie après 7j apoptose p53, mTOR
2008
Contraction Troponin I, T et C
Survie et croissance PI3K, Akt Bian et al ,
C57Bl6 mâle 10-12 20mg/kg 1 20mg/kg IP 15j 80% dox seul
ErbB2 2012
Effets NRG-1
mTOR
apoptose Nrdp1 (E3 ligase)
autophagy LC3 I et II Zhang et al ,
C57Bl6 mâle 8-10 20mg/kg 1 20mg/kg IP 10j 83%
stress oxydatif production ROS 2011
inactivation Akt, ERK1/2, STAT3
Kliment et al ,
C57Bl6 femelle 15mg/kg 1 15mg/kg IP 15j euthanasie après 15j SOD
2009
7semaine (5 semaine
10, 2*/sem Général
de traitement)
Terrand et
B6; 129SF1 mâle 5-7 18-22g 4mg/kg 40mg/kg IP 52% p21 souris KO
2 semaines euthanasie après 2 al , 2011
IL-6 et 12, IFN
pause avant semaine
4ème inject° TNFα
10, 20 ou 10,20 ou TAFII, cyclin D1
1 aigue: 1 ou 7j euthanasie après 1 à 7 j
30mg/kg 30 mg/kg Egr-1 Saadane et
CD-1 femelle 6-7 25g IP
3 (1 al , 1999
10 mg/kg 30mg/kg chronique: 6semaines euthanasie après 1 semaine
fois/semaine)
Olson et al ,
C57B6J 20mg/kg 1 20mg/kg IP 18j 91% cardiotox général Cbr-1
2003
5 mg/kg 5 mg/kg euthanasie après 24h
10 mg/kg 10 mg/kg ou Shi et al ,
FVB 1 IP euthanasie apoptose Caspase 3
15 mg/kg 15 mg/kg time course 2012
20 mg/kg 20 mg/kg cardiotox
Redfors et
C57Bl6 mâle 6 15mg/kg 1 15mg/kg IP 1j après fin traitement euthanasie après 1j apoB
al , 2012
10 mg/kg 10mg/kg 3h pharmacocinétique troponin I
Balb/c 10 mg/kg 10mg/kg xenogreffe Lovo creatinine kinase
1
20mg/kg 20mg/kg xenogreffe MDA 231 perfusion tumeur Ali et al ,
IP
CD-1 mâle 20mg/kg 20mg/kg 4j tox aigue 2011
3 (1
CD-1 mâle et femelle 5 mg/kg 15mg/kg tox chronique
fois/semaine)
3 (1 cancer sein TGF-β inhibiteur Bandyopadh
Balb/c femelle 4 4mg/kg 12mg/kg IP/IV 21j euthanasie après 21j
fois/semaine) metastasique ay et al ,
4 (1 inhibiteur histone Tarasenko et
Balb/c femelle 8-10 5mg/kg 20mg/kg IP 25j euthanasie après 25j cancer sein
fois/semaine) déacétylase al , 2012
xenogreffe 4T1
croissance tumorale Xu et al ,
Balb/c mice mâle 2,5mg/kg/j 7 17,5mg/kg IP 28j euthanasie
chronique cardiaque 2011
dysfonction
apoptose
Feridooni et
C57Bl6 11-15 20mg/kg 1 20mg/kg IP 3 ou 7j euthanasie après 3 à 7j ROS p53
al , 2011
fibrose

Tableau 7: Modèles murin de cardiotoxicité induite par la doxorubicine

Page
221
Au niveau cardiaque, la toxicité chronique de la dox se traduit par une cardiomyopathie
dilatée aussi bien chez les patients adultes que pédiatriques (490). De manière identique, la
dox induit une cardiomyopathie de type dilatée à 15 semaines post traitement dans notre
modèle. En parallèle, une modulation temps dépendante de l’homéostasie calcique ainsi que
de la signalisation d’Epac a été observée avec une phase initiale d’altérations, une phase de
compensation n’étant pas maintenue dans le temps et menant à une seconde phase
d’altérations (cf. Tableau 8).

2 semaines 6 semaines 15 semaines

Atteintes précoces du VD
(Perte sarcomérique, myolyse légère)
Histologie
Aucune fibrose
Aucune mortalité cellulaire
Echocardiographie FE et Vol télédiastolique du VG non altéré
Transitoires diminués et ralentis
Fréquence sparks et vague calcique augmentée
Homéostasie calcique Charge du RS inchangée
Expression Serca et RyR total diminuée,
hyperphosphorylation du RyR
Signalisation d'Epac Expression Epac2 et Rac1 diminuée
Atteintes du VD
(Perte sarcomérique, myolyse légère)
Aucune fibrose
Aucune mortalité cellulaire
FE et Vol télédiastolique du VG non altéré
Transitoires augmentés
Sparks inchangés
Charge du RS augmentée
Expression du PLB total diminuée
Expression Epac1 et RhoA augmentée
Atteintes du VG et du VD
(Perte sarcomérique, myolyse légère)
Aucune fibrose
Aucune mortalité cellulaire
FE diminuée
Vol télédiastolique du VG augmenté
Transitoires diminués et ralentis
Fréquence, durée et largeur sparks augmentée
Charge du RS diminuée
Expression Serca diminuée, Expression
phosphorylation RyR site PKA augmentée
Expression Epac1, Epac2 et de RhoA diminuée

Tableau 8: Résumé des altérations induites par la doxorubicine dans notre modèle

Les paramètres altérés à 2 et 15 semaines sont identiques : diminution des transitoires

calciques, augmentation de la fréquence des sparks calciques, diminution de l’expression de
Serca et d’Epac2. Cependant à 15 semaines, les souris traitées à la dox développent d’autres
altérations : charge du RS diminuée, expression des deux isoformes d’Epac. Ceci se traduit
par une altération de la fonction cardiaque avec notamment une FE diminuée et une dilatation
du VG. Cependant, aucune différence n’a été observée sur les coupes de cœur après
marquage TUNEL à 2, 6 ou 15 semaines après traitement à la dox. Ces différentes phases
d'altérations ne sont pas donc associées à une augmentation de la mortalité cellulaire
suggérant que la CMD induite par la dox serait la conséquence d'une modulation des
signalisations cardiaques plutôt que des voies de mort cellulaire. Cependant, les études in vivo
antérieures montraient une augmentation de la mort cellulaire causée notamment par la
génération d’un stress oxydant (pour revue : (121). Néanmoins, l'induction de dommages à
l'ADN (dans les 24 heures suivant les injections) menant à l'apoptose précoce (avant 2
semaines) des cardiomyocytes puis à une compensation des signalisations cardiaques peut
également expliquer ces résultats.
Ces résultats montrent également le développement de toxicités aigües et chroniques de la
dox suggèrant ainsi l’importance d’un suivi continu et tardif des patients traités à la dox.

Page
222
A l’exception de quelques rares études in vitro (491,492), il n’y a pas d’hypertrophie des
cardiomyocytes dans la cardiomyopathie dilatée (CMD) induite par la doxorubicine ce qui est
concordant avec notre modèle. En effet, les mésures de la surface cellulaire des CRNVs et les
mesures de la capacitance des membranes des cardiomyocytes ventriculaires isolées à partir
des souris traitées ou non à la dox ne révèlent aucune hypertrophie dans ces deux modèles
(données non publiées).
En revanche, en clinique, une fibrose interstielle diffuse est fréquente dans la CMD liée à la
dox. Cette fibrose est d’autant plus marquée que la fraction d’éjection est abaissée (63). Or
dans notre modèle, la FE est abaissée légèrement. Le volume télédiastolique du VG est
également légérement augmenté ce qui suggère une cardiomyopathie dilatée modérée à 15
semaines expliquant ainsi l’absence de fibrose. Cependant, la cardiomyopathie dilatée induite
par la dox à 15 semaines est également maintenue à 20 semaines après traitement (données
non publiées). Cette CMD pourrait néanmoins s’aggraver après 20 semaines, il serait donc
intéressant d’analyser les altérations de la fonction cardiaque également à des temps beaucoup
plus tardifs (30-50 semaines après traitement).

In vivo, la dox induit donc dans notre modèle une cardiomyopathie dilatée modérée associée à
des altérations de l’homéostasie calcique ainsi que de la signalisation d’Epac. Le
développement de cette cardiotoxicité se traduit par différentes phases : une phase
d’altérations à 2 semaines, compensée à 6 semaines mais pas maintenue dans le temps et
menant à une phase de décompensation à 15 semaines.

2- La doxorubicine induit une altération globale de la signalisation

d’Epac
Le traitement à la dox in vivo induit une altération temps dépendante de la signalisation
d'Epac. Cette altération se traduit par une diminution de l'expression d'Epac2 et Rac1 à 2
semaines, une augmentation de l'expression d'Epac1 et RhoA à 6 semaines et une diminution
de l'expression d'Epac1, Epac2 et RhoA à 15 semaines. Les variations des isoformes d’Epac
suivent ainsi le profil des variations des paramètres calciques avec notamment une altération
initiale à 2 semaines, une compensation avec notamment l’expression la plus forte d’Epac 1 et
2 observée à 6 semaines et une phase de décompensation se caractérisant par une diminution
forte de l’expression des deux isoformes. Ces résultats sont également à mettre en relation
avec les différents profils d’expression des petites protéines G décrits précédemment
suggérant des rôles différentiels de ces 2 isoformes d’Epac.

Page
223
En effet, les isoformes d'Epac mises en jeu dans la phase initiale puis dans la phase de
compensation sont différentes. Elles pourraient donc avoir un rôle différent dans le
développement de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine.
Les petites protéines G mises en jeu sont également différentes selon la phase avec
notamment une diminution concomittante de l'expression d'Epac2 et de Rac1 et une
modulation identique de l'expression d'Epac1 associée à celle de RhoA à 6 semaines et à 15
semaines. Néanmoins, aucune modification de l'expression de Rap1, effecteur direct d'Epac,
n'a été établie dans notre modèle, malgré une tendance à l'augmentation de son expression
protéique à 6 et 15 semaines. Cependant, aucune expérience mesurant l'activité des petites
protéines G in vivo dans notre modèle n'a pu être effectuée, ces expériences demandant une
grande quantité de protéines déjà allouées aux western blot. Ces expériences ont donc été
réalisées in vitro dans un modèle de culture primaire de cardiomyocytes de rats nouveau-nés
exposés à différentes doses de doxorubicine pendant 24 heures. Nous avons ainsi pu observer
une diminution significative de l'expression d'Epac1 et d'Epac2 après un traitement à la dox
de 1µM pendant 24 heures. Malgré une expression protéique diminuée de 70%, l'activité
d'Epac1 est augmentée dès 15 min de traitement à la dox à 1µM. Il semblerait également que
la dox augmente l'activité d'Epac1 à des temps plus tardifs et notamment après 12 et 24 heures
de traitement. L'augmentation de l'activité d'Epac n'est pas associée à une augmentation de
l'activité de Rac1, petite protéine G activée par Epac démontrée précédemment par Morel et
al (52,463). En effet, le traitement à la doxorubicine conduit à une diminution de l'expression
et de l'activité de Rac1. De plus, l’activité de Rap1 est également diminuée. Cette diminution
est associée à une réduction de l’expression de Rap1 induite par le traitement à la dox in vitro.
Une étude sur des cellules neuronales montre que l’activation d’Epac permet le recrutement
de la protéine STEF (SIF and Tiam 1-like exchange factor) par Rap1, Rap1 pouvant
s’associer à STEF. La protéine STEF est une GEF activant Rac1 (493). On peut donc
supposer que la diminution de l’activité de Rap1 conduirait à la diminution de l’activité de
Rac1 observée après traitement à la dox. Cependant, aucune étude ne montre la présence ou le
rôle de STEF dans le cœur. De plus, une étude montre que l’inhition de Rac1 permet de
prévenir les effets cardiotoxiques de la dox (348). Cette hypothèse ne permettrait pas
d’expliquer ces contradictions. Or, une autre étude montre que la protéine kinase PAK,
effecteur de Rac1, est capable de phosphoryler PREX2 (Phosphatidylinositol-3,4,5-
trisphosphate (PIP3)-dependent Rac exchanger 2), autre GEF pouvant activer Rac1, et
diminue son activité GEF et donc l’activation de Rac1 (494).

Page
224
Ainsi, cette boucle de rétrocontrôle négatif pourrait expliquer l’inhibition de Rac1 après
traitement à la dox, d’autant plus que l’inhibiteur EHT1864, inhibiteur spécifique de Rac1,
mime les effets protecteurs de l’inhibition de PAK sur les dommages à l’ADN induits par la
dox (351). L’expression de la protéine PAK ainsi que la présence dans le cœur et la
phosphorylation de la GEF PREX2 devront ainsi être vérifiées après traitement à la dox. De
plus, les résultats portant sur les effets tardifs (24h) de la dox sur l'activité d'Epac1 ainsi que
ses effets sur l'activité et l'expression des petites protéines G activées par Epac doivent être
confirmés en multipliant les expériences.
Par ailleurs, selon les résultats in vivo, il existerait une corrélation entre la modulation de
l'expression d'Epac1 avec celle de RhoA. En effet, plusieurs études indiquent un lien direct ou
non entre Epac et RhoA. Ainsi, Epac active Rap1 qui inhiberait RhoA et participerait à
l'inflammation via la promotion de la migration des macrophages initiée par le TGF-β1 (355).
D'autres études montrent également une inhibition de RhoA via Epac1-Rap1 et notamment
dans le muscle lisse gastrique (495) et dans les cellules progénitrices du muscle lisse
coronarien (357). Cependant, une étude contradictoire montre qu'Epac active RhoA dans les
cellules musculaires lisses vasculaires (496). De plus, l'inhibition de RhoA ou de la voie
RhoA/ROCK permet la prévention des effets cardiotoxiques de la dox ainsi que l'inhibition de
la résistance à la dox des cellules cancéreuses du colon (335,337). L'activation accrue d'Epac
induite par la dox pourrait ainsi conduire à l'activation de RhoA et participerait ainsi aux
effets délétères de la dox sur le coeur. Cependant, aucune étude ne montre qu'Epac active
RhoA dans les cardiomyocytes. Il serait donc intéressant d'étudier le lien entre Epac et RhoA
dans les cardiomyocytes et leur rôle dans le développement de la cardiotoxicité induite par la
doxorubicine. En effet, les effets protecteurs de l'inhibition de RhoA passent notamment par
l'inhibition de ROCK et l'inhibition de l'activation de NFκB induite par la dox (337). Or, dans
notre modèle in vitro, la dox induit une diminution de 40% de l'activité transcriptionnelle de
NFκB. En concordance avec ces résultats, une étude montre que lorsque NFκB est inactif, le
niveau d'expression de facteurs pro-survies est diminué et facilite l'induction TNF-dépendante
de facteurs pro-apoptotiques menant à l'apoptose des ostéoclastes, cellules responsables de la
résorption du tissu osseux (497). De plus, il a été montré que l'activation d'Epac est impliquée
dans la différenciation des ostéoclastes par la translocation nucléaire de NFκB et par la
modulation de la réorganisation du cytosquelette d'actine via notamment l'activation de RhoA
(498). La possibilité d’un lien existant entre Epac et la voie RhoA/NFκB dans le contexte de
la cardiotoxicité induite par la doxorubicine reste donc à établir notamment par l'étude des
effets de la dox sur l'activité de RhoA (RhoA pull-down activation assay, Cytoskeleton).

Page
225
Malgré l’augmentation de l’activité d’Epac, l’activité des petites protéines G Rap1 et Rac1 est
diminuée. Or, une étude réalisée au sein de notre laboratoire a montré notamment dans
l’hypertrophie des cardiomyocytes que Epac conduit à l’activation de Rac (52). De plus,
plusieurs études ont montré que l’inhibition de Rac1 permet la prévention des effets
cardiotoxiques de la dox (348,349,352). Deux hypothèses peuvent ainsi être formulé :
l’inhibition de l’activité de Rac1 induite par la dox n’est pas suffisante pour permettre la
prévention de ses effets cardiotoxiques, ce serait donc un mécanisme de protection de la
cellule ou il existerait différents pools de Rac1 dans la cellule participant à différents effets et
suggère ainsi une coordination spatio-temporelle de la signalisation d’Epac. Cette
coordinationpourrait notamment provenir des AKAP, protéines d’ancrage permettant la
compartimentation de la signalisation de l’AMPc. En effet, les AKAP peuvent se lier à
différents partenaires dont la PKA, Epac1, Rap1 ou RhoA. Toutefois, la liaison à ces
partenaires implique différentes AKAPs localisées de façon différentielle. Ainsi, la mAKAP
se lie à Epac1 mais également à Rap1 au niveau de l’enveloppe nucléaire tandis que l’AKAP-
Lbc se lie à RhoA au niveau du cytosquelette (Pour revue : (499)). De plus, l’AKAP-Lbc est
également une GEF de RhoA dans les cardiomyocytes et permet ainsi son activation après
stimulation des récepteurs α1-ARs. Ce lien existant entre cette AKAP et RhoA est notamment
impliqué dans l’hypertrophie. L’AKAP-Lbc peut également recruter la PKC ainsi que son
effecteur la PKD induisant ainsi son activation. L’activation de la PKD phosphoryle
l’HDAC5 et induit son export nucléaire conduisant ainsi à la levée de la répression de facteurs
de transcription tels que MEF-2, impliqués dans l’hypertrophie cardiaque. Cependant, cette
AKAP peut également activer des voies antihypertrophiques via notamment la
phosphorylation de HSP20 (heat shock protein) dépendante de la PKA (Pour revue : (500)).
La coordination de la signalisation de l’AMPc et de la signalisation d’Epac exercée par les
AKAP pourrait ainsi être à l’origine de la modulation du signalosome d’Epac induite par la
dox. On pourrait ainsi supposer qu’il existe différents pools d’Epac, de Rap1 et donc de Rac1
(Rap pouvant activer Rac) ainsi que de RhoA dans la cellule qui seraient différentiellement
influencés par un traitement à la dox. Il serait donc indispensable d’étudier le rôle des
AKAPs dans la cardiotoxicité induite par la dox.
Cette hypothèse est également favorisée par la compartimentation et les différents rôles
cellulaires des isoformes d’Epac. En effet, Epac1 joue un rôle dans le couplage excitation-
transcription qui implique la signalisation nucléaire du calcium tandis qu’Epac2 a des effets
proarrythmogéniques par l’induction d’une fuite calcique du RS (cf. partie 5-3-1 de
l’introduction). Les stocks en calcium sont également eux-même compartimentés.

Page
226
En effet, une étude récente montre que la charge en calcium du RS et de l’appareil de golgi
fonctionne de façon indépendante l’une de l’autre. La stimulation β1-adrénergique conduit à la
libération de calcium de l’appareil de golgi. De plus, ce mécanisme est dépendant de la PKA,
d’Epac et de la C aMKII et est régulé par les PDE 3 et 4 (501) soulignant une fois de plus
le rôle de la compartimentation de l’AMPc.
La compartimentation de la réponse aux stress et plus particulièrement à la dox du
signalosome d’Epac ainsi que de la signalisation de l’AMPc devra donc être étudiée
notamment par l’analyse du rôle des AKAPs, des PDEs mais également du calcium
cytosolique et nucléaire.
Par ailleurs, le traitement à la doxorubicine induit également une augmentation de l'activité
transcriptionnelle de MEF-2 et une diminution de l'activité transcriptionnelle de NFAT
suggérant une réponse spécifique de la voie CaMKII/MEF-2 et de la voie
Calcineurine/NFAT. En effet, des travaux réalisés au sein de notre laboratoire ont montré que
Epac participe au couplage excitation-transcription par la modulation de la signalisation du
calcium nucléaire via la voie PLC/IP3R et l'activation de la CaMKII.
L'activation de la CaMKII induit ensuite l'export nucléaire des HDAC4/5 et l'activation du
facteur de transcription MEF-2 exprimé au cours du développement cardiaque et initie ainsi le
programme pro-hypertrophique (409,416). L'activation de MEF-2 par la dox (1µM) suggère
ainsi une activation de la voie CaMKII/MEF-2, l’activation de la CaMKII dans notre modèle
restant à être confirmer. Le rôle de la PKD dans l’activation de MEF-2 devra également être
caractérisé, la PKD pouvant également phosphoryler l’HDAC5 et conduire à l’activation de
MEF-2. Cependant, l'activation de cette voie n'est pas associée à l'induction du programme
pro-hypertrophique, l’induction de l’hypertrophie nécessitant l’activation concomittante de la
voie CaMKII et de la voie calcineurine (52,354). De plus, une étude montre que le traitement
in vitro à la dox active la CaMKIIδB, sous-unité nucléaire de la CaMKII prédominante dans
le coeur, qui contribue ainsi à l'altération de l'homéostasie calcique induite par la dox
(318).En outre, une étude récente sur modèle murin Epac2 KO montre qu'après une
stimulation β1-adrénergique, Epac2 induit une fuite de calcium du RS via la phosphorylation
du RyR dépendante de la CaMKII et participe aux effets pro-arythmiques de la stimulation β-
AR (422). On pourrait ainsi émettre l'hypothèse d'une stimulation d'Epac par la dox activant la
CaMKII et participant ainsi à l'altération de l'homéostasie calcique et à l'induction d'arythmies
induites par la dox. En effet, le traitement à la dox chez les patients peut conduire au
développement d’arythmies en toxicité aigüe mais également en chronique (4).

Page
227
Cependant, dans notre modèle in vivo, la dox n'induit pas d'arythmie, il sera donc difficile de
vérifier cette hypothèse dans notre modèle. Néanmoins, une étude in vivo a montré que la dox
induit une diminution de l'expression de la CaMKIIδB corrélée à une altération de la fonction
cardiaque (502). La dox conduit donc a une augmentation de l'activité de la CaMKII, d'autant
plus marquée qu'elle induit également la diminution de son expression. On retrouve les
mêmes effets de la dox sur Epac, ce qui pourrait consolider notre hypothèse.
En revanche, les études présentées précedemment ont des conclusions contradictoires quant
au potentiel thérapeutique de l'inhibition de la CaMKII dans la cardiotoxicité induite par la
dox. En effet, dans l'étude de Sag et al, l'inhibition de la CaMKII permet la prévention des
altérations de la signalisation calcique de la dox tandis que dans l'étude de Little et al, la
surexpression de la CaMKII permet d'inhiber l'apoptose induite par la dox (318,502).
Il est donc difficile de conclure sur les effets potentiels d'Epac sur la cardiotoxicité induite par
la dox via son effet sur la CaMKII.
De plus, nous avons également pu observer une diminution de 50% de l'activité
transcriptionnelle de NFAT associée à une réduction de 60% de l’activité de la calcineurine
suggérant l'inhibition de la voie calcineurine/NFAT. En outre, une étude antérieure de notre
laboratoire montre également que l'activation d'Epac induit l'hypertrophie des cardiomyocytes
via l'activation dépendante de Rac1 de la voie Calcineurine/NFAT (52).
L'activation de NFAT nécessite également l’activation de la voie de signalisation O-GlcNAc
(beta-O-linked N-acetylglucosamine). En effet, la O-GlcNAc glycosylation est une
modification post-traductionnelle réversible dépendante de la concentration en glucose, qui
implique l’addition de N-Acétyglucosamine sur les résidus sur sérine ou thréonine de
protéines cytosoliques ou nucléaires. La O-GlcNAc glycosylation régule la localisation, la
stabilité ou l’activité des protéines en fonction de l’environnement nutritionnel de la cellule
(503). La signalisation O-GlcNAc permet la translocation nucléaire de NFAT après
déphosphorylation par la calcineurine et est ainsi activée au cours de l'hypertrophie cardiaque
ce qui coïncide avec la dérégulation de l'expression des transporteurs de glucose GLUT-1 et
GLUT-4 régulés par PGC-1α (Peroxisome proliferator activator receptor γ coactivator-1α,
corégulateur transcriptionnel) (504). Ceci suggère ainsi un lien potentiel entre Epac et le
métabolisme énergétique qui conduit à l'activation de NFAT et du programme
hypertrophique. En effet, des données non publiées de notre laboratoire montrent que
l'activation d'Epac augmente les ARNm du coactivateur transcriptionel PGC-1α ainsi que du
facteur de transcription Tfam (mitochondrial transcription factor A) impliqué dans la
transcription du génome mitochondrial (505) après 9h de stimulation puis augmente l’ARNm

Page
228
de l'enzyme Cox-1 (cyclooxygenase-1) après 24h de stimulation suggérant ainsi un rôle
d'Epac dans la biogénèse et la dynamique mitochondriale. Cette hypothèse est d'autant plus
favorisée par l'implication de la glycosylation O-GlcNAc-dépendante des protéines
mitochondriales dans la dysfonction cardiaque (506) et notamment dans l'hypertrophie.
Néanmoins, la dox induit l'inhibition de la voie Calcineurine/NFAT suggérant une fois de plus
que le programme pro-hypertrophique n'est pas initié après traitement à la dox malgré
l'activation d'Epac. L'étude du rôle d'Epac dans les altérations du métabolisme énergétique
mais également de la biogénèse mitochondriale induite par la dox serait donc intéressante et
pourrait également expliquer l'inhibition de la voie calcineurine/NFAT. L'étude de la
régulation de la signalisation O-GlcNAc par Epac1 pourrait également permettre d'établir un
lien entre Epac et le métabolisme du glucose.
En conclusion, la doxorubicine induit une augmentation de l'activité d'Epac qui ne se traduit
pas par une hypertrophie. Ceci peut être expliqué par la modulation du signalosome d'Epac
induite par la dox avec notamment une réponse spécifique de la voie CaMKII/MEF-2
impliquée dans les effets pro-arythmiques de la dox et de la voie Calcineurine/NFAT qui
pourrait être expliqué par les altérations du métabolisme énergétique par la dox (cf. Figure
36).
DOX

Epac

Rac Rap

Ca 2+/Calcineurine
Calcineurine Ca 2+/CaMKII
CaMKII RhoA

Noyau NFAT MEF2 NF?B

NFκB

Remodelage cardiaque

Figure 36: Altération de la signalisation d'Epac induite par la doxorubicine

La doxorubicine induit l'activation d'Epac. L'activité des petites protéines G activées par Epac Rap et Rac est
respectivement inchangée ou diminuée après le traitement à la doxorubicine. L'activation d'Epac par la dox
induit ensuite une réponse spécifique avec une activation de la voie CaMKII/MEF-2 et une inhibition de la
Calcineurine/NFAT et conduit à un remodelage cardiaque. Les flèches vertes (en pointillés) représentent les
hypothèses à confirmer.

Page
229
3- L’inhibition d’Epac 1 permet la prévention des effets
cardiotoxiques de la doxorubicine
La doxorubicine induit l'activation d'Epac1 ce qui a pour conséquence une altération du
signalosome d'Epac. Les données concernant les effets de la dox sur la signalisation β-
adrénergique et sur la production d'AMPc après traitement à la dox et pouvant expliquer
l'activation d'Epac observée dans notre modèle sont rares.
Une ancienne étude montre ainsi une augmentation du taux d'AMPc induite par la dox et
pourrait ainsi expliquer l'augmentation de l'activité d'Epac (507).
Cependant, d'autres études montrent une inhibition de la signalisation β1-AR pouvant
conduire à une réduction du taux d'AMPc (pour revue: 299). Il a également été montré que
l'utilisation d'inhibiteur de la PDE4 permet de prévenir les effets cardiotoxiques de la dox
suggérant une augmentation de l'activité des PDE causée par la dox conduisant à une
augmentation de la dégradation de l'AMPc (508). Cette réduction du taux d'AMPc semble se
traduire par l'inhibition de la PKA qui est associée à l'abolition des effets bénéfiques de la
metformine, un antidiabétique, sur les effets cardiotoxiques de la doxorubicine (509).
Ainsi, malgré un taux réduit, l'AMPc activerait préférentiellement Epac qui serait ainsi
impliqué dans la réponse proapoptotique tandis que l'activité de la PKA impliquée dans la
réponse antiapoptotique dans ce contexte serait diminuée. Cette hypothèse a ainsi été vérifiée
in vitro par l'étude de l'effet de la modulation de l'activité d'Epac sur les dommages à l'ADN et
l'apoptose induite par la dox dans des cultures primaires de cardiomyocytes de rats nouveau-
nés exposés pendant 24 heures, à 1µM de dox. En effet, cette dose correspond à la
concentration plasmatique des patients traités aux anthracyclines (510) et à laquelle les
altérations les plus importantes du signalosome d'Epac ont été observées. Ainsi, on a pu
observer une augmentation significative de la phosphorylation de l'histone γH2AX sur la
sérine 139, marqueur de dommage à l'ADN médié par les cassures double-brin de l'ADN,
induites par la dox après pré-traitement au 8-CPT, activateur d'Epac. Cependant,
l'augmentation des dommages à l'ADN induits par la dox suite à l'activation d'Epac n'est pas
associée à une augmentation de la mortalité des cardiomyocytes induite par la dox. Ces
résultats suggèrent une réparation des dommages à l'ADN suite au traitement au 8-CPT
précédent le traitement à la dox. En effet, lorsque des cassures double-brin surviennent dans
l’ADN, le complexe MRN (Mre11/Rad50/Nbs1) est recruté au site d’ADN endommagé et
recrute à son tour la protéine ATM (Ataxia telangiectasia mutated).

Page
230
Celle-ci, présente normalement dans la cellule sous forme de dimère inactif,
s’autophosphoryle au niveau de la sérine 1981, entraînant une dédimérisation et une
activation d’ATM. Elle phosphoryle ensuite l'H2AX qui peut recruter au site d’ADN
endommagé plusieurs protéines qui sont subséquemment phosphorylées par ATM, dont
53BP1, BRCA1, Chk1 et Chk2 (511,512). Ces substrats d’ATM vont ensuite induire l’arrêt
du cycle cellulaire et l’activation des points de contrôle, deux processus qui vont permettre la
réparation de l’ADN endommagé. Si l’ADN est irréparable, des processus d’apoptose ATM-
dépendants vont se mettre en place pour induire l'apoptose de la cellule (512). Ainsi, une
étude montre qu'un traitement à la dox conduit à la phosphorylation de l'H2AX dépendante
d'ATM dans la phase initiale.
La dox stimule également l'autophosphorylation d'ATM ainsi que la phosphorylation de ses
nombreux effecteurs tels que Nsb1, Chk1 et Chk2. Ceci était associé à l'accumulation
nucléaire et la phosphorylation de p53 dépendante d'ATM dans une lignée cellulaire
lymphoblastoïde humaine (513). L'activité antitumorale de la dox se traduit ainsi par
l'induction de cassures double-brin de l'ADN non réparées conduisant à la mort de la cellule
cancéreuse. On peut ainsi supposer que les mécanismes de la cardiotoxicité induite par la dox
sont identiques.
A ce titre, le 8-CPT pourrait augmenter les dommages à l'ADN sans induire l'activation des
voies de réparation, déjà inhibées par la doxorubicine et sans augmenter la mortalité des
cardiomyocytes, déjà à son maximum par le traitement à la dox seule. Ceci suggérerait que les
effets délétères de l'activation endogène d'Epac par la dox seraient suffisants et maximaux et
expliqueraient ainsi qu'il n'y ait pas de synergie par l'activation additionelle exogène d'Epac.
Cette hypothèse est, en effet, favorisée par le fait que la surexpression d'Epac1 n'induit aucune
augmentation des dommages à l'ADN ni de la mortalité des cardiomyocytes.
Nous avons également pu remarquer une diminution des dommages à l'ADN induits par la
dox par le traitement à l'ESI09, inhibiteur des deux isoformes d'Epac. De manière
intéressante, l'inhibition spécifique d'Epac2 par ESI05 ne conduit pas à la réduction des
dommages à l'ADN suggérant ainsi que l'inhibition spécifique d'Epac1 permet la prévention
des dommages à l'ADN induits par la dox. Ces résultats ont été confirmés par l'utilisation
d'adénovirus shEpac1 qui diminue considérablement les dommages à l'ADN induits par la
dox. De plus, le shContrôle diminuant également l’expression d’Epac1, nous avons pu
observer une diminution des dommages à l’ADN dépendante de l’expression d’Epac1. En
effet, plusieurs shContrôle ont été testés pour cette étude. Cependant, tous les shContrôles
utilisés avaient un effet sur l’expression d’Epac1.

Page
231
En outre, à 10µM, aucune phosphorylation de l’H2AX n’a pu être observée dans chacune des
conditions. En effet, à des doses élevées (supérieure à 5µM), la doxorubicine s’intercale
directement au niveau de l’ADN empêchant la liaison de la TopII sur l’ADN et donc ne
permettant pas l’induction de la voie ATM/H2AX (352).
Par ailleurs, la diminution de ces dommages par l'inhibition d'Epac1 est également corrélée à
une diminution de la mortalité des cardiomyocytes induite par la dox. En effet, l'ESI09 ainsi
que le CE3F4, inhibiteur spécifique d'Epac1 offre la même cardioprotection que le
dexrazoxane, seul agent cardioprotecteur utilisé en clinique dans la prévention de la
cardiotoxicité induite par la dox uniquement dans le traitement des cancers du sein
métastatiques.
Afin de déterminer si les effets cardioprotecteurs de l'inhibition d'Epac proviennent de la
diminution des cassures double-brin induites par la dox ou de la réparation de ces dommages,
le rôle d'Epac dans la formation des complexes de clivage ADN-TopIIβ à l'origine des
cassures double-brin a été étudiée et fera l'objet de la partie 4. Il serait également intéressant
d'étudier le rôle de l'inhibition d'Epac dans la réparation ATM-dépendante des dommages à
l'ADN induit par la dox dans les cardiomyocytes via notamment l'étude de la cinétique
d'induction de la phosphorylation de l'H2AX par la dox ainsi que la phosphorylation d'ATM
et de ses substrats. Ceci permettrait notamment de déterminer si les inhibiteurs d'Epac doivent
être utilisés en prévention ou en traitement de la cardiotoxicité induite par la dox.

4- Les effets cardioprotecteurs d’Epac1 passent par la voie

Topoisomérase II β indépendamment de l’état d’activation de Rac1
L'équipe du Dr Yeh a récemment présenté une alternative au dogme présentant la génération
d’un stress oxydant menant à la mort cellulaire comme unique cause de la cardiotoxicité
induite par la dox (206). Son groupe montre notamment que l'altération de la TopIIβ serait à
l'origine des altérations cardiaques induites par la dox. L'inhibition de la TopIIβ permettrait
ainsi de prévenir les dommages à l'ADN, les altérations mitochondriales et la génération d'un
stress oxydant induits par la dox. Suite aux résultats obtenus sur la diminution des dommages
à l'ADN par l'inhibition d'Epac, nous avons ensuite étudié le rôle d'Epac dans la signalisation
de la TopIIβ et notamment au niveau de la formation des complexes de clivage ADN-TopIIβ.
Nous avons ainsi pu remarquer que l'inhibition d'Epac permet la diminution de la formation
de complexe de clivage ADN-TopIIβ mesurée par band depletion assay, technique
développée par le Dr Fritz et nouvellement mise en place dans notre laboratoire.

Page
232
Cette méthode permet la quantification relative et indirecte de la formation de ces complexes
par la mesure de la diminution de la forme libre de la TopIIβ.
En effet, les complexes ADN-TopIIβ ne peuvent pénétrer dans le gel de polyacrilamide
dénaturant et ne seront ainsi pas détectables par western blot. Ainsi, dans le cas de la
formation de complexes clivables, l'intensité de la bande de la forme libre de la TopIIβ
diminue (entre 70-90%) (351). Bien que l'efficacité de cette méthode dans l'analyse de la
formation des complexes de clivage ait été prouvée, elle mériterait également d'être confirmée
par d'autres méthodes de mesure de l'intéraction ADN-protéine et notamment par le comet
assay. De façon identique aux dommages à l'ADN, l'inhibition d'Epac1 et 2 par ESI09 permet
une diminution de la formation de ces complexes tandis que l'inhibition spécifique d'Epac2
par ESI05 ne parvient pas à les diminuer efficacement.
Ces résultats suggérent ainsi que l'inhibition spécifique d'Epac1 permet la diminution de la
formation des complexes de clivage induits par la dox. Ces résultats ont également été
confirmés par l'utilisation de shEpac1, malgré un shContrôle qui diminue également
l'expression d'Epac1.
De plus, cette étude montre également que Epac régule l'expression de la TopIIβ. En effet,
l'activation d'Epac augmente l'expression de la TopIIβ tandis que l'inhibition d'Epac par
l'ESI09 ainsi que par le CE3F4 diminue son expression. Ces résultats suggèrent que les effets
cardioprotecteurs de l'inhibition d'Epac1 proviennent de la diminution de l'expression de la
TopIIβ ce qui a pour conséquence la réduction de la formation des complexes de clivage
ADN-TopIIβ et donc des dommages à l'ADN. Cette étude montre ainsi un nouveau rôle
d’Epac notamment au niveau des dommages à l’ADN régulés par la TopII β et remet ainsi en
question la théorie du Dr Yeh.
Par ailleurs, les effets de l'inhibition d'Epac sur la signalisation TopIIβ pourraient également
passer par Rac1. En effet, Huelsenbeck et al ont montré que Rac1 est nécessaire à la
stabilisation du complexe de clivage ADN-TopIIβ induite par la dox et donc à l'induction des
dommages à l'ADN. Epac activant Rac1 dans les cardiomyocytes, nous avons ainsi étudié le
rôle de Rac1 dans les effets cardioprotecteurs de l'inhibition d'Epac sur la formation des
complexes de clivage et les dommages à l'ADN par l'utilisation de dominants positifs de Rac1
(Ad-RacG12V) et négatif (Ad-RacS17N). On a ainsi pu remarquer que l'inhibition d'Epac par
l'ESI09 ou le CE3F4 suffit à prévenir de façon optimale la formation de ces complexes ainsi
que l'induction par la dox des dommages à l'ADN malgré l'activation de Rac1. En revanche, la
réciproque n'est pas vraie.

Page
233
En effet, l'inhibition de Rac1 seule par son dominant négatif permet la même prévention des
effets délétères de la dox sur la signalisation TopII et les dommages à l'ADN. Cependant,
l'activation d'Epac par le 8-CPT diminue significativement les effets protecteurs de l'inhibition
de Rac1 sur la formation des complexes de clivage.
Les effets cardioprotecteurs d'Epac1 sembleraient ainsi indépendants de ceux de Rac1 mais
pourraient également passer partiellement via Rac1. De plus, l'inhibition d'Epac est nécessaire
et suffisante pour prévenir les dommages à l'ADN médiés par la signalisation TopII
indépendamment de l'état d'activation de Rac1 suggérant ainsi l'implication d'une autre petite
protéine G ou d’une autre GEF (cf. partie 2 de la discussion). En effet, dans notre modèle in
vitro, l'expression et l'activité de Rac est diminuée après traitement à la dox et favoriserait
ainsi l'hypothèse selon laquelle les effets d'Epac sont indépendants de ceux de Rac1. De plus,
on a observé in vivo des altérations identiques de l'expression d'Epac1 et de RhoA au cours
des phases d'altération et de compensation suggérant de possibles effets synergiques d'Epac1
et RhoA. L'inhibition de RhoA permettant la prévention de la cardiotoxicité induite par la dox
ainsi que l'inhibition de la résistance à la dox dans les cellules cancéreuses, on pourrait ainsi
émettre l'hypothèse suivante: Epac active RhoA qui participe ainsi aux effets délétères de
l'activation d'Epac par la dox. L'étude du rôle de RhoA dans la prévention des dommages à
l'ADN par l'inhibition d'Epac serait ainsi nécessaire.
Cette étude passerait par l'analyse des effets de la dox sur l'activité de RhoA dans un premier
temps puis l'analyse de la formation des complexes de clivage ainsi que des dommages à
l'ADN en modulant l'activité de RhoA et d'Epac (de façon identique à ce qui a été
précédemment montré avec Rac1). Enfin, RhoA est impliqué dans diverses fonctions
cellulaires et notamment la contraction, l'adhésion, la migration, la prolifération et l'apoptose
qui sont altérées par la dox (514). L'étude du rôle d'Epac dans la signalisation de RhoA par
l'analyse des effets de la dox sur les effecteurs de RhoA dont ROCK (Rho kinase) impliquée
notamment dans l'apoptose ou la fibrose , la kinase LIM impliquée dans la réarrangement du
cytosquelette serait également intéressante aussi bien dans le contexte de la cardiotoxicité
qu'en cancérologie (243).

Page
234
 Figure 37: Rôle d'Epac dans la mort des cardiomyocytes induits par la doxorubicine
La doxorubicine induit l'augmentation de l'activité d'Epac1 qui induit la surexpression de la TopII β et participie
ainsi à la formation des complexes de clivage ADN-TopII β à l'origine des cassures double brin de l'ADN et des
dommages à l'ADN induits par la doxorubicine. L'inhibition d'Epac1 permet ainsi de diminuer la mortalité des
cardiomyocytes. Ces effets cardioprotecteurs pourraient également passer partiellement par Rac1.

En conclusion, l'inhibition d'Epac1 permet la prévention des dommages à l'ADN et de la

mortalité des cardiomyocytes associée à ces dommages par la diminution de l'expression de la
TopII β et la réduction subséquente de la formation des complexes de clivage ADN-TopII β
(cf. Figure 35). La confirmation de ces résultats in vitro dans un modèle in vivo de souris
transgéniques Epac1 KO exposées à de la dox sera présentée dans la partie 5.

5- Prévention du développement de la cardiotoxicité induite par la

doxorubicine par invalidation d’Epac1 chez la souris
Précédemment, nous avons montré la prévention des effets délétères de la dox par l'inhibition
d'Epac. Cette prévention étant spécifique d'Epac1, nous avons ainsi ensuite vérifiés ses effets
bénéfiques chez les souris Epac1 KO exposées à une même dose de doxorubicine dans les
mêmes modalités d'administration et aux même temps d'analyse que pour les souris wild-type
(3 injection en i.v de 4 mg/kg pour une dose cumulée totale de 12mg/kg). Les paramètres ont
été analysés de manière identique aux séries précédentes.

Page
235
Un retard de croissance chez les souris Epac1 KO traitées à la dox comparé aux souris Epac1
KO salines identiques aux souris wild-type a été observé. De plus, les souris Epac1 KO
traitées à la dox ne montrent aucune altération de la fraction d'éjection ainsi que du volume
télédiastolique du VG à 15 semaines suggérant la prévention des altérations de la fonction
cardiaque et de CMD par l'invalidation d'Epac1. En revanche, à 6 semaines, le volume
télédiastolique du VG diminue mais n'est pas associé à une augmentation du ratio poids
coeur/poids du corps et ne se traduit donc pas par une hypertrophie. Aucune analyse des
transitoires calciques ainsi que de la signalisation calcique n'a été réalisée à 6 semaines du fait
du nombre insuffisant de souris Epac1 KO obtenues. Les échocardiographies réalisées à 6 et
15 semaines correspondent donc aux même souris qui ont été euthanasiées après 15 semaines
de traitement. Les altérations induites par la dox des transitoires calciques observées chez les
souris wild type sont également inhibées chez les souris Epac1 KO. Au contraire, on peut
même observer une augmentation des amplitudes des transitoires calciques (11%), une
augmentation de la charge en calcium du RS (27%) associée à une vitesse plus élevée de 25%
de la sortie du calcium du RS. Cependant l'augmentation de ces transitoires calciques est
légère et n'est pas associée à une augmentation de la contraction des cardiomyocytes observée
sur le paramètre de « cell shortening » mesuré par microscopie confocale identique. De plus,
l'expression de la SERCA2 reste inchangée dans les souris Epac1 KO traitées à la dox et ne
permet pas d'expliquer une vitesse de relaxation plus élévée suggérant que les légères
modifications de l'homéostasie calcique chez les souris Epac1 KO traitées à la dox n'ont pas
de conséquence sur la fonction cardiaque.
Au niveau moléculaire, nous avons vérifié par western blot l'invalidation spécifique d'Epac1.
Les souris Epac1 KO expriment donc bien Epac2 mais n'expriment pas Epac1. De plus, le
niveau d’expression d’Epac2 chez les souris Epac1KO et leurs litttermates est identique. En
outre, une diminution significative de l'expression de Rap1, effecteur direct d'Epac a été
observée chez les souris Epac1 KO qu’elles soient ou non traitées à la dox (diminution de
70% de l’expression de Rap1 chez les souris Epac1 KO saline, diminution de 30% chez les
souris Epac1 KO traitées à la dox).
Ainsi, tandis qu’une diminution de l'expression de RhoA et une expression inchangée de Rac1
ont été observés chez les souris wild-types, on peut remarquer totalement l'inverse chez les
souris Epac1 KO à 15 semaines post-traitement. En effet, l'expression de Rac1 diminue après
traitement à la dox tandis que l'expression de RhoA retourne au niveau basal chez les souris
Epac1 KO.

Page
236
Ces résultats peuvent suggérer que: 1/ la prévention des effets chez les souris Epac1 KO
pourrait passer par Rac1 et 2/ une modulation isoforme dépendante des petites protéines G.
En effet, Epac 2 étant toujours présent et actif pourrait activer RhoA. Ces résultats suggèrent
également que l'inhibition de la voie Epac1/Rap1 permettrait l'activation de RhoA dans les
cardiomyocytes. Cependant, ces résultats portent uniquement sur l'expression des petites
protéines G. Il serait donc intéressant d'étudier l'activité des petites protéines G Rac1 et RhoA
chez les souris Epac1 KO et également dans le contexte de la cardiotoxicité induite par la dox.
Enfin, deux souris Epac1 KO traitées à la dox sur quinze (13% de mortalité) sont mortes du à
une incapacité à se nourir (pertes des dents). Ces résultats doivent cependant être nuancés par
le fait que l'échantillon de souris Epac1 KO (n=15) est nettement réduit par rapport aux wild
types (n=99) et que la mortalité chez les souris traitées à la dox est dépendante de la série. De
plus, la mortalité est causée par une incapacité à se nourir et non pas par des complications
cardiaques sévères. L'augmentation des séries Epac1 KO traitées ou non à la dox sera réalisée
après la fin de cette thèse par Maxance Ribeiro, étudiant en thèse. La comparaison wild-
type/Epac1 KO dans l'induction des dommages à l'ADN in vivo sur des temps courts (24, 48h)
sera également étudiée.
En conclusion, les résultats in vitro montrant une cardioprotection des effets cardiotoxiques
de la doxorubicine par l'inhibition d'Epac1 ont été confirmés in vivo dans un modèle de souris
Epac1 KO. Les effets cardioprotecteurs d'Epac proviendraient de l'inhibition de la
topoisomérase II β qui a pour conséquence une diminution des dommages à l'ADN et de la
mort des cardiomyocytes.
Cependant, d'autres voies de mort cellulaire sont altérées par la dox. Il serait donc judicieux
d'étudier également le rôle d'Epac en utilisant les autres modèles de souris Epac KO
disponibles au laboratoire (Epac2 KO et double KO) dans l'induction des voies de mort
cellulaire telles que l'autophagie mais également dans la génération d'un stress oxydant,
l'induction des altérations mitochondriales et l'inhibition de la régénération cardiaque induite
par la dox ainsi que d’établir le profilage de ces différentes voies de mort cellulaire. Une étude
récente montre notamment que l’invalidation d’Epac1 chez la souris permet la prévention de
l’induction de l’autophagie ainsi que du remodelage cardiaque associé à la stimulation β-
adrénergique (455). Ces résultats sont donc en concordance avec notre hypothèse selon
laquelle l’inhibition d’Epac1 pourrait prévenir les effets de l’induction de différents stress
cellulaires dont les dommages à l’ADN, l’autophagie et ainsi la mort cellulaire.

Page
237
A ce titre, plusieurs hypothèses de travail peuvent être suggérer ce qui permettra
l'identification de nouveaux effecteurs d'Epac tels que Sirt1, la PI3K ou de nouveaux
régulateurs d'Epac tels que mir-1.

Les différentes voies à étudier seraient ainsi:

- Epac/ fuite calcique du RS ou du RE/CamKKβ/AMPK/PGC1α + Sirt-1 (515): l'étude
de cette voie permettra d'établir un lien entre Epac et Sirt-1. En effet, l'activation de Sirt-1
permet la prévention des effets cardiotoxiques de la dox via l'inhibition du stress RE (516), la
restauration de la fonction des cellules cardiaques progénitrices (290) et l'inhibition du stress
oxydant (238).
- Epac/Ras/PI3K/Akt (517,518): L'activation de la voie PI3K/Akt permet l'inhibition
du stress oxydant ainsi que de l'apoptose (519–522) mais également de l'autophagie (poster
A.Ghigo, Heart Failure Association Winter Research Meeting, 2015) induit par la dox. De
plus, la voie Epac/PI3K est également impliquée dans la synthèse de collagène (429), il serait
donc intéressant d'étudier le rôle de cette voie dans l'induction d'une fibrose induite par la dox.
La PI3K permet également l'activation d'ATM (523) et pourrait ainsi être impliquée dans la
réponse aux dommages à l'ADN induit par la dox.
- Régulation expression génique par miR (miR-1 et miR-520h)/ Epac/Rac/HDAC
(350,524,525): La dox induit la surexpression de miR-520h qui inhibe l'HDAC1 augmentant
ainsi l'intéraction ADN-doxorubicin ainsi que la cytotoxicité de la dox sur les cellules
cancéreuses gastriques (525). La surexpression de miR-1 permettrait d'inhiber la résistance
des cellules cancéreuses pulmonaires (A549) à la doxorubicine via le ciblage de l'HDAC4
(524). Enfin, l'inhibition de Rac1 permet la prévention de l'inhibition des HDAC induite par la
dox dans le coeur (350). Les miR pourraient ainsi réguler l'expression d'Epac qui active Rac1
et participeraient aux effets délétères d'Epac et de Rac1 via l'inhibition des HDAC et
l'induction de dommage à l'ADN. De plus, miR-1 est impliqué dans la signalisation calcique
(526,527) et pourrait ainsi être une cible intéressante de la voie de signalisation d’Epac
également. Des données non publiées de notre laboratoire montrent ainsi que la dox (10µM à
24h) augmente l’expression de miR-1 ce qui pourrait expliquer la diminution de l’expression
d’Epac1 si l’hypothèse est vérifiée. En effet, Epac peut également réguler l’expression des
microARN et notamment le miR-124 (528), dont l’expression est diminuée à forte dose de
dox (10µM, données non publiées).

Page
238
Enfin, l’augmentation de la masse des poumons et de la rate observée à 2 semaines après
traitement chez les souris wild-type est également inhibée chez les souris Epac1 KO. En effet,
la masse des poumons et de la rate les souris Epac1 KO traitées à la dox est comparable à
celle des souris Epac1 KO saline ainsi qu’à leurs littermates.
La doxorubicine pouvant également être néphrotoxique et hépatotoxique, il serait intéressant
d'analyser les paramètres de toxicité rénale et hépathique (en collaboration avec des
laboratoires spécialisés) chez les souris Epac1 KO afin d'étudier l'apparition éventuelle
d'effets secondaires suite à l'inhibition d'Epac1, Epac1 étant fortement exprimé dans le rein.
La diminution de l'activité antitumorale de la dox pourrait également faire partie des effets
secondaires de l'inhibition d'Epac1 et doit donc être étudiée (cf. partie 6).

6- L’inhibition d’Epac1 n’interfère pas avec l’activité antitumorale de

la doxorubicine in vitro
L’enjeu principal dans la découverte de nouvelle stratégie thérapeutique de la cardiotoxicité
induite par la dox est de prévenir les effets cardiotoxiques de la doxorubicine sans interférer
avec l'activité antitumorale de la dox. En effet, l’utilisation du dexrazoxane, seul agent utilisé
dans la prévention de la cardiotoxicité induite par la dox, est aujourd’hui limitée aux cancers
du sein métastatiques du fait de ses interférences avec l’efficacité de la dox et l’apparition de
tumeurs secondaires (cf. partie 4-2-2 de l’introduction). L'inhibition d'Epac in vitro et in vivo
permet la prévention des altérations cardiaques induites par la dox. Nous avons donc ensuite
vérifié que l'inhibition d'Epac par ESI09 n'interfère pas avec la cytotoxicité de la dox sur les
cellules cancéreuses. Pour cela, nous avons choisi deux lignées cancéreuses: une lignée de
cellules cancéreuses mammaires (MCF-7), le cancer du sein étant l'indication thérapeutique
fréquente de la doxorubicine et une lignée de cellules cancéreuses pulmonaires (A549)
permettant d'évaluer une éventuelle potentialisation des effets thérapeutiques de la dox par
l'inhibition d'Epac dans le cancer du poumon, indication thérapeutique de dox beaucoup
moins fréquente (135). Dans un premier temps, nous avons remarqué que les cardiomyocytes
sont beaucoup plus sensibles in vitro à la dox que les cellules cancéreuses. Cependant, les
CRNVs étant immatures, elles sont plus sensibles à la dox que les cardiomyocytes adultes
(121). Ces expériences doivent donc être répétées sur cardiomyocytes de rats adultes. En
effet, une même dose de dox (1µM) induit un taux de mortalité des cardiomyocytes de 40%
tandis qu'elle induit seulement 5% de mortalité de ces deux types cellulaires. Ces résultats
peuvent également être expliqués par la résistance à la dox de ces deux lignées cellulaires.

Page
239
En revanche, l'inhibition d'Epac par ESI09 ne diminue pas la cytotoxicité de la dox dans les
MCF-7 ainsi que dans les A549 et augmente même l'efficacité de la dox dans les MCF-7 à
une dose de 50µM, dose non thérapeutique de la dox. De plus, le dexrazoxane ne diminue pas
non plus l'activité antitumorale de la dox sur ces deux lignées cellulaires.
Cependant, des essais cliniques et des expérimentations in vivo ont mis en évidence une
diminution de l'activité antitumorale de la dox ainsi que l'apparition de tumeurs secondaires
suite au traitement au dexrazoxane. Les résultats in vitro sur l'influence de l'inhibition d'Epac
sur l'efficacité de la dox sur les cancers doivent donc être vérifiés in vivo dans un modèle de
souris transgéniques Epac1 KO portant une xénogreffe de cellules cancéreuses (et notamment
une lignée cellulaire de cancer du sein ou de lymphome humain) exposées à la même dose de
dox. Cette expérience peut également être effectuée chez des souris wild-type traitées en
prévention par de l'ESI09 ou du CE3F4 (en minipompe). Cependant, plusieurs études
montrent que l'inhibition d'Epac permettrait également de potentialiser la cytotoxicité des
chimiothérapies sur les cellules cancéreuses.
En effet, des données de la littérature montrent que l'inhibition d'Epac pourrait inhiber
l'oncogénèse via notamment la signalisation O-GlnNAc (529).
D'autres études en faveur de l'utilisation de l'ESI09 ou du CE3F4 montrent que l'inhibition
d'Epac1 permet d'inhiber la migration et l'invasion des cellules cancéreuses pancréatiques
(434,436). De plus, il serait également important d’étudier la modulation de l’expression
TopIIα, cible de la doxorubicine et surexprimée dans de nombreux types de cancer afin de
déterminer si l’inhibition d’Epac pourrait augmenter l’activité antitumorale de la dox.
En outre, l'effet du CE3F4 sur la cardiotoxicité induite par la dox mais également sur
l'efficacité ou la résistance de certains cancers à la dox n'a jamais été testé in vivo,
contrairement à l'ESI09. En revanche, des études ont montré que l'activation d'Epac pourrait
être bénéfique dans le traitement du cancer du poumon et de la prostate suggérant ainsi que
l'utilisation d'inhibiteurs d'Epac devrait être contre-indiquée dans ces deux types de cancers
(cf. Introduction, partie 5-5 Epac et cancer). Ceci suggère également que les modulations
d'Epac permettraient de discriminer plusieurs types de cancers. L’expression augmentée ou
diminuée d’Epac pourrait également être correlée à l’agressivité de certains cancers.
En résumé, l'inhibition d'Epac1 permet la prévention des effets cardiotoxiques de la
doxorubicine sans interférer in vitro sur son efficacité antitumorale. Les études suivantes
devront donc étudier les effets cardioprotecteurs d'Epac dans des systèmes plus complexes se
rapprochant d'autant plus de la clinique: les traitements anticancéreux combinés.

Page
240
Dans ce contexte, une étude portant sur le rôle d'Epac dans la fibrose cardiaque radio-induite a
été réalisée en collaboration avec notre équipe (cf.Annexe 2).
Cette étude montre, pour la première fois, que l'hypertrophie et l'amyloïdose induite par
l'irradiation de souris sont corrélées à l'augmentation de l'expression d'Epac1 tandis que la
fibrose radio-induite est associée à l'activation de la voie RhoA/ CTGF.
Ceci suggère qu'Epac1 contribue à l'hypertrophie et à l'amyloïdose mais pas à la fibrose
induite par l'irradiation (530). A ce titre, l'inhibition d'Epac1 pourrait réduire l'hypertrophie et
l'amyloïdose et être ainsi bénéfique dans la cardiotoxicité induite par l'irradiation. De plus,
l'irradiation peut également causer des cassures simple et double-brin de l'ADN. Une étude
montre notamment que la signalisation de l'AMPc inhibe l'activation d'ATM par l'activation
de la PP2A par la PKA et permet la diminution de l'apoptose induite par l'activation de NFκB
dépendante d'ATM au cours de l'irradiation des cellules cancéreuses pulmonaires (531).
Compte tenu des effets de l'inhibition d'Epac1 sur l'induction des cassures double-brin de
l'ADN induites par la dox montrés précédemment, on pourrait ainsi imaginer que l'inhibition
d'Epac1 pourrait également avoir des effets bénéfiques sur les dommages à l'ADN des
cardiomyocytes induits par l'irradiation.
L'étude du rôle d'Epac dans la cardiotoxicité induite par la combinaison
Doxorubicine/Irradiation mais également par la combinaison de traitements
chimiothérapeutiques cardiotoxiques telles que Doxorubicine/Trastuzumab,
Doxorubicine/Paclitaxel, Doxorubicine/5-FU est donc indispensable pour déterminer le
potentiel thérapeutique des inhibiteurs d'Epac dans la cardiotoxicité induite par les traitements
anticancéreux.

Page
241
Conclusion

Page
242
Conclusion

De nos jours, les traitements anticancéreux sont de plus en plus efficaces permettant
notamment l’amélioration de la qualité de vie et de la survie des patients. Cependant, 4 à 36
% des patients développent des complications cardiaques pouvant aller jusqu’à l’insuffisance
cardiaque et la mort. Parmi ces traitements, la doxorubicine est une des molécules les plus
efficaces utilisée en chimiothérapie dans de nombreux types de cancers. Cependant, elle
induit une toxicité cardiaque qui peut survenir rapidement ou plus tardivement, jusqu’à 40 ans
après la fin du traitement. Le dogme initial présente les mécanismes moléculaires de la
cardiotoxicité de la dox comme étant l’induction d’un stress oxydant et de dommages causés à
l’ADN menant à l'altération des voies de mort cellulaire des cardiomyocytes. Or, l’utilisation
d’antioxydants dans de nombreux essais cliniques n’a pas permis une amélioration de cette
toxicité. De nouvelles thérapies, permettant une prévention de la toxicité cardiaque induite par
la doxorubicine sans en réduire l’efficacité, sont donc nécessaires. A ce titre, nous nous
sommes intéressés à Epac un facteur d'échange directement activé par l'AMP cyclique
activant les petites protéines G Rac1 et RhoA que nous savons impliquées dans cette toxicité.
L'objectif de cette thèse a donc été d'étudier le rôle de la signalisation d'Epac dans la toxicité
cardiaque induite par la dox. In vitro, la dox induit l'altération globale de la voie de
signalisation d'Epac se traduisant par l'augmentation de l'activité d'Epac1 malgré une forte
diminution de l'expression d'Epac 1 et d'Epac 2 ainsi que par une réponse spécifique des voies
CaMKII/MEF-2 et Calcineurine/NFAT dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés. De
plus, l'inhibition spécifique d'Epac1 permet la diminution de l'expression de la Topoisomérase
II β qui conduit à la réduction de la formation des complexes de clivage, du dommage à
l'ADN et par conséquent de la mort des cardiomyocytes. In vivo, les échocardiographies
réalisées sur les souris C57Bl6 traitées à la dox (12mg/kg en iv) montrent qu’elles
développent une cardiomyopathie dilatée à partir de 15 semaines (post-traitement)
caractérisée par une altération temps-dépendante de l'homéostasie calcique. L'altération de
l'homéostasie calcique est concomittante à la modulation temps-dépendante de la signalisation
d'Epac. De plus, la prévention des effets cardiotoxiques de la doxorubicine in vitro a
également été observée in vivo par l'invalidation d'Epac1 (cf. Figure 36).

Page
243
 DOX

PREX2?
RAP1/STEF ?
Epac1
Rac1 Rap1
Ca2+ ?
PAK
AKAP-Lbc ?

TopIIβ

2+ Calcineurine Ca2+/CaMKII
RhoA
Complexe ADN-TopIIβ Ca /Calcineurine CaMKII

MEF2 NF?B
NFκB Noyau
NFAT

Dommage à l’ADN Remodelage cardiaque

Cardiotoxicité
Figure 38: Rôle d'Epac dans la cardiotoxicité induite par la doxorubicine
La doxorubicine induit l'activation d'Epac. L'activité de Rap et Rac est respectivement inchangée ou diminuée
après le traitement à la doxorubicine. L'activation d'Epac par la dox induit ensuite une réponse spécifique avec
une activation de la voie CaMKII/MEF-2 et une inhibition de la Calcineurine/NFAT et conduit à un remodelage
cardiaque. L'activation d'Epac par la dox induit également la surexpression de la TopII β et participe ainsi à la
formation des complexes de clivage ADN-TopII β à l'origine des cassures double brin de l'ADN et des
dommages à l'ADN. L'inhibition d'Epac1 permet ainsi de diminuer la mortalité des cardiomyocytes. Ces effets
cardioprotecteurs pourraient également passer partiellement par Rac1. Les flèches vertes (en pointillés)
représentent les hypothèses à confirmer.

De plus, l'inhibition d'Epac1 ne diminue pas l'activité antitumorale de deux lignées

cancéreuses différentes. Ainsi, ces résultats indiquent que l'inhibition d'Epac1 permet la
prévention de la cardiotoxicité induite par la dox sans diminuer son efficacité antitumorale.
Cependant, ces travaux amènent également à penser d'autres perspectives de travail à court
terme. Ainsi, l'étude du rôle de RhoA dans les altérations de la signalisation d'Epac1 induite
par la dox ainsi que l'étude du rôle d'Epac dans les voies de mort cellulaire induite par la dox
sont nécessaires. Ces études permettront d'appréhender les mécanismes cellulaires mis en jeux
dans la cardioprotection d'Epac contre la cardiotoxicité induite par la dox.

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244
Ces résultats seront ensuite à confirmer dans des modèles de cardiotoxicité induite par la
combinaison de traitement anticancéreux et notamment la combinaison de chimiothérapie (
doxorubicine+ trastuzumab, doxorubicine+paclitaxel) mais également la combinaison de la
chimiothérapie et de la radiothérapie. Ces études permetteront d'établir le potentiel
thérapeutique de l'inhibition d'Epac1 dans la cardiotoxicité induite par les traitements
anticancéreux. Les objectifs à long terme seront donc:
- l'étude du rôle d'Epac et de la modulation de sa signalisation dans la cardiotoxicité
induite par les traitements combinés
- l'analyse de la cardioprotection induite par l'inhibition d'Epac1 dans différents
modèles de cardiotoxicité induite par les traitements combinés
- l'étude des effets de l'inhibition d'Epac1 sur l'activité antitumorale de la doxorubicine
et des traitements combinés dans un modèle murin portant une xénogreffe de cellules
cancéreuses.

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Annexes

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Annexe 1: Revue: Complications of chemotherapy, a basic science
update

Revue :
Mazevet M, Moulin M, Llach-Martinez A, Chargari C, Deutsch E, Gomez AM,
Morel E.

Complications of chemotherapy, a basic science update.

Presse Med. 2013 Sep;42(9 Pt 2):e352-61.

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 Annexe 2: Article: Epac contributes to cardiac hypertrophy and
amyloidosis induced by radiotherapy but not fibrosis

Article:
Monceau V, Llach A, Azria D, Bridier A, Petit B, Mazevet M, Strup-Perrot C,
To TH, Calmels L, Germaini MM, Gourgou S, Fenoglietto P, Bourgier C,
Gomez AM, Escoubet B, Dörr W, Haagen J, Deutsch E, Morel E, Vozenin MC.

Epac contributes to cardiac hypertrophy and

amyloidosis induced by radiotherapy but not fibrosis.

Radiother Oncol. 2014 Apr;111(1):63-71.

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Titre : Etude de la cardiotoxicité induite par les traitements anticancéreux : Rôle d’Epac dans la
cardiotoxicité induite par la Doxorubicine
Mots clés : Doxorubicine, cardiotoxicité, Epac, dommage à l’ADN
Résumé : La doxorubicine induit un stress
oxydant, des dommages à l’ADN conduisant
aussi bien à la mort des cellules cancéreuses que
des cardiomyocytes. De nos jours, plusieurs
hypothèses non reliées à la mort cellulaire et
impliquant d’autres mécanismes ou l’altération
des signalisations cardiaques telles que la
signalisation β-adrénergique ont émergées.
Cette thèse a donc pour objectif l’étude du rôle
d’Epac, facteur d’échange directement activé
par l’AMP cyclique, lui-même produit après
stimulation β-adrénergique, dans la
cardiotoxicité induite par la doxorubicine. En
effet, la doxorubicine induit une
cardiomyopathie dilatée 15 semaines après
traitement associée à une altération de
l’homéostasie calcique. Ces altérations sont
corrélées à la modulation temps et dose-
dépendantes de la signalisation d’Epac.
Title : Role of Epac signaling in cardiotoxicity induced by doxorubicin
Keywords : Doxorubicin, cardiotoxicity, Epac signaling, DNA damage
Abstract: The mechanisms underlying
doxorubicin (Dox)-induced cardiotoxicity
involve reactive oxygen species generation,
DNA intercalation and topoisomerase II (TopII)
inhibition which trigger DNA damage,
oxidative stress, alteration of calcium
homeostasis and lead to cardiomyocyte death.
Now, evidences have emerged that Dox may
promote cardiotoxicity by alternative
mechanisms or by signaling pathways
modulation including β-adrenergic signaling
unrelated directly to cell death. This study
provides in vitro and in vivo evidence of the
guanine exchange factor directly activated by
Epac role, a guanine exchange factor directly
activated by cyclic AMP produced after β-AR
stimulation, in cardiotoxicity induced by
doxorubicin.
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301
Cette même altération globale de la
signalisation d’Epac a également été observée
in vitro après 24h de traitement à la dox. De
plus, l’inhibition spécifique d’Epac 1 a permis
la prévention des dommages à l’ADN et de
façon subséquente de la mort des
cardiomyocytes. L’invalidation du gène
d’Epac1 chez la souris a également permis la
prévention in vivo des altérations de
l’homéostasie calcique ainsi que de la fonction
cardiaque induite par la dox. Enfin, l’inhibition
d’Epac n’interfère pas avec l’efficacité
antitumorale de la doxorubicine sur différentes
lignées cancéreuses. En conclusion, nous avons
identifiés Epac comme nouvelle cible
thérapeutique de la cardiotoxicité induite par la
dox permettant sa prévention sans réduire
l’efficacité du traitement anticancéreux.
Indeed, Dox leads to the development of a
dilated cardiomyopathy (DCM) 15 weeks post
treatment in mice associated with calcium
homeostasis abnormalities. These alterations
were associated with time- and dose-
dependent alterations of Epac signaling. The
same alterations of Epac signaling were
observed in vitro after 24h of dox treatment.
Furthermore, we first showed that the specific
pharmacologic or genetic inhibition of Epac1
but not Epac2 prevents the deleterious effects
of Dox in vitro. These cardioprotection were
confirmed in vivo in transgenic Knock-out
Epac1 mice. Epac 1 inhibition did not
interfere with the attempted Dox antitumor
efficiency on tumor cell lines. Altogether,
these findings identify the cAMP-binding
protein, Epac, as a potential therapeutic target
of dox-induced cardiotoxicity.
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