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LES BIOFILMS

La plupart des espèces bactérienne ne vivent pas


individuellement en suspension mais en communautés
complexes adhérent à des surfaces

Toutes ces formes de communautés vivantes plus ou moins


organisées sont regroupées sous le vocable de « Biofilm »
QU’EST-CE QU’UN BIOFILM ?
Le biofilm correspond à un environnement physiquement structuré

Agrégats de microorganismes (bactéries, champignons, autres) fixés à


une surface, séparés par des espaces libres dépourvus de bactéries et
parcourus par des courants aqueux, « canaux », ceux-ci y assurent la
circulation de fluides et permettent à la fois l’apport de nutriments aux
bactéries et l’élimination de leurs produits de dégradation

Environnement structuré qui présente souvent une architecture


complexe, très variable d’un biofilm à l’autre selon les microorganismes
qui le composent et les conditions environnementales
La matrice extracellulaire est une caractéristique de nombreux
biofilms

 Production de la matrice extracellulaire par les bactéries du biofilm

Inclut tous les éléments du biofilm autre que les microorganismes: eau
(jusqu’à 97 %), polymères polysaccharidiques secrétés par les
microorganismes, produits de dégradation et de substances provenant du
milieu extérieur

Peut contenir d’autres composants, tels que de l’ADN, de l’ARN et des


lipides
Le biofilm est un environnement hétérogène
Le développement tridimensionnel du biofilm conduit à la création de
gradients physico-chimiques

Environnement homogène car il présente des zones à teneurs variables


en oxygène ou en nutriments, qui présentent des valeurs de pH
différentes

Les régions au centre des agrégats bactériens sont généralement


anaérobies et pauvres en nutriments, alors que celles situées près des
canaux ou de l’interface entre le biofilm et le liquide sont mieux
oxygénées et plus riches en nutriments

Hétérogénéité physico-chimique s’accompagne d’une hétérogénéité


métabolique: source de microenvironnements qui permet la coexistence
organisée d’espèces bactériennes aux propriétés métaboliques
différentes et souvent complémentaires.

Répartition biologique organisée de nombreux microorganismes dans


le biofilm où peuvent cohabiter bactéries, champignons, algues et
protozoaires
Les bactéries du biofilm possèdent des propriétés spécifiques

La notion de biofilm recouvre donc des formations biologiques assez


différentes et souvent très complexes: haute densité bactérienne,
production de matrice et croissance sur une surface

Expression différentielle des gènes, comparée à celle des bactéries


planctoniques

L’ensemble des caractéristiques structurales et physico-chimiques du


biofilm confère aux bactéries qui le composent, des propriétés spécifiques
de morphologie, de croissance, de communication entre les cellules et de
résistances aux biocides, distinctes de celles des bactéries planctoniques
Biomasse microbienne fixée sur des surfaces et qui constitue des
populations hétérogènes englobées dans une matrice extracellulaire
riche en eau, en sucres et en protéines. Présentes dans tous les
environnements et associées à des surfaces minérales, végétales
(surface des feuilles) ou animales (surfaces des muqueuses, surfaces
dentaires etc.), elles sont appelées biofilms
 Le plus souvent inoffensifs, les biofilms jouent un rôle écologique
capital et contribuent très largement au bon fonctionnement de la
plupart des écosystèmes.

Ils représentent également une importante source de nuisance en


médecine humaine ou vétérinaire, ainsi que dans l’industrie et les
environnements humains industriels, où, particulièrement tolérants à
toutes sortes de stress (dessiccation, carence en nutriments,
exposition aux acides, agents antibactériens, etc.), ils sont très
difficiles à éliminer
Rôle ubiquitaire des biofilms
Sludge / corrosion tuyauteries

Stromatolithes
B. subtilis / racine d’Arabidopsis Shark Bay (Australie)

S. aureus / cathétère

Plaque dentaire
COMMENT EST FORMÉ LE BIOFILM ?
1ère étape: “conditionnement” de la surface

Adsorption de macromolécules formant un “film de conditionnement”.


Traces de matières organiques neutralisant charges excessives et énergie
libre de surface qui préviennent l’établissement d’une proximité
entre bactéries et surface
2ème étape: mouvement bactérien vers
la surface conditionnée

Accès des bactéries à la surface conditionnée: chimiotaxie/motilité,


sédimentation, mouvement Brownien, transport convectif
Vibrio cholerae Caulobacter crescentus Vibrio fischeri

Flagelles

Monotrich
e

Escherichia coli Spirochètes Lophotriche


Salmonella

Péritrich
Flagelles TTSS e
3ème étape: adhérence à la surface
Attachement
réversible à ce stade

1 - Attachement initial par interactions


électrostatiques de van der Vaals.
2 - Perception de la surface.
3 - Adhésion spécifique.
4ème étape: ancrage à la surface
Attachement
irréversible à ce stade
= Matrice !

Modification radicale de la physiologie des


bactéries entrant en mode de vie biofilm:
Klebsiella oxytoca + glutamate sur
particules de carbone activé vs milieu
liquide:
- Taux de division accéléré (x10)
6 heures 2 jours - Consommation d’O2 augmentée
- Production de la matrice
5ème étape: détachement /planctonisation

-Contraintes physiques
-Disponibilité de nutriments (la disponibilité de glucose est
un paramètres inducteurs du détachement)
- Signaux intercellulaires (pas liés directement au QS)
AVANTAGES ET CONSÉQUENCES DU MODE DE VIE
BIOFILM
Coopérations métaboliques et échanges d’informations au
sein du biofilm

Coopération métabolique: accès facile aux nutriments,


échanges et la mise en place de symbioses entre des bactéries

Signalisation au sein du biofilm:communication


intercellulaire via un mécanisme appelé Quorum-sensing

Transfert d’information génétique au sein du biofilm:


transfert horizontal par conjugaison favorisé

Protection vis-à-vis des agressions de l’environnement:


diverses agressions extérieures comme les UV, les changements de pH et
d’osmolarité, la prédation et les agents antimicrobiens (effet barrière)
LES BIOFILMS ET L’HOMME
Infections dues aux biofilms
Infections nosocomiales :

 Capacité de se développer sur divers instruments médicaux (sondes


urinaires, cathéters veineux, tubes de ventilation artificielle, prothèses
orthopédiques etc…)

Impliquent souvent des bactéries commensales comme Staphylococcus


epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa

Contamination des systèmes de climatisation, de ventilation et de


distribution d’eau par des biofilms abritant des microorganismes pathogènes

Propagation des infections en milieux hospitaliers ou non hospitaliers


environnement agroalimentaires où les biofilms sont une source importante de
nuisance
Résistance des biofilms aux antibiotiques

Résistance extrêmement élevée aux agents antibactériens (antibiotiques et


désinfectants)

Cette résistance accrue, multifactorielle, est liée aux conditions de vie dans
le biofilm (hétérogénéité, accès aux nutriments, oxygène etc.)

Modification des propriétés physiologiques des micro-organismes et


induisent des mécanismes de résistance spécifiques qui s’ajoutent aux
mécanismes de résistance connus

 Les antibiotiques sont en effet très peu efficaces contre les biofilms et les
symptômes peuvent réapparaître une fois le traitement fini
Protection vis-à-vis du système immunitaire

 Protection vis-à-vis du système immunitaire des hôtes infectés

 La taille des biofilms est tout d’abord un frein important au processus de


phagocytose

 Les cellules phagocytaires libèrent des enzymes qui ont très peu d’effet sur
le biofilm et qui peuvent endommager les tissus

La matrice extracellulaire est également une barrière au système


immunitaire de l’hôte car elle empêche la reconnaissance des antigènes
bactériens par les anticorps
Relation entre biofilm et virulence

 Biofilm joue un rôle dans la persistance des bactéries dans un


environnement donné et non directement dans le mécanisme infectieux

 Les biofilms constituent ainsi des réservoirs d’infections: chez les personnes
atteintes de mucoviscidose, par exemple, la bactérie Pseudomonas aeruginosa
infecte les tissus pulmonaires. L’infection s’établit de manière chronique et
conduit à des endommagements mortels du tissu pulmonaire

 La persistance de l’infection serait liée à la présence de la bactérie sous forme


de biofilms
Plaque dentaire = D’un biofilm à l’autre…
biofilm

Planctonisation,circulation
systémique de bactéries
(streptocoques) issues du
biofilm de la plaque dentaire

Végétation
endocarditique
valvulaire = biofilm
Biofilm et inflammation chronique
Une fois un biofilm établi, sa fragmentation brutale peut
causer des emboles métastatiques dramatiques (embole
septique cérébrale)

Les bactéries planctoniques quittent périodiquement le biofilm,


se multiplient et se dispersent dans la circulation.
Cycle biofilmisation-planctonisation

Mode de survie idéal


pour un
microorganisme
de virulence
intermédiaire:
équilibre défense-
Biofilm mature Bactéries survie
Immuno- planctoniques (Parsek MR. 2003.
échappement Immuno- Ann.Rev.Microbiol.)
Inflammation limitée Inflammation
reconnaissance

Processus d’inflammation
chronique/récidivante
Enclume

Marteau Etrier
Oreille
moyenne
Tympan

Trompe d’ Eustache

Otite
Moyenn
Otite moyenne
e

Inflammation
et
épanchement

Biofilm (H. influenzae et S. pneumoniae)


Les biofilms représentent une source de problèmes industriels
Nombreux problèmes dans le secteurs industriels.:

 Dans l’industrie pétrolière par exemple, la colonisation des systèmes d’injection


d’eau peut entraîner une acidification du pétrole qui devient alors inutilisable

 La formation de biofilms dans les canalisations d’eau potable, en particulier par


la bactérie Legionella pneumophila, est également un problème majeur car l’ajout
de chlore ne permet pas d’éliminer les bactéries fixées

 La formation de biofilms sur les coques des navires, appelée phénomène de «


biofouling », conduit à une augmentation des forces de friction, une diminution de
la vitesse des bateaux et des surcoûts énergétiques considérables

La formation des biofilms sur les métaux peut également engendrer des
problèmes de corrosion: en effet, associés à des surfaces métalliques, les biofilms
de bactéries anaérobies sont à l’origine de réactions chimiques corrosives,
susceptibles d’endommager, d’obturer et de contaminer durablement les
systèmes de circulation de fluides

 Dans l’industrie agro-alimentaire, les biofilms constitués d’organismes


pathogènes représentent un problème sanitaire sérieux
Les biofilms positifs
Rôle écologique capital:

 Contribuent très largement au bon fonctionnement de la plupart des


écosystèmes en participant notamment au cycle du carbone, de l’eau (traitement
des eaux usées)

Les biofilms jouent aussi un rôle essentiel dans de nombreux processus :

 Contribuent à la production et à la dégradation de la matière organique, au


recyclage de l’azote, du soufre et de nombreux métaux

 La flore commensale humaine peut être considérée comme un biofilm qui


protège son hôte contre les attaques des bactéries pathogènes

 Dans l’industrie, les biofilms servent au traitement des déchets par un


mécanisme de bioremédiation, les microorganismes composant les biofilms
peuvent utiliser des matériaux polluants comme source de carbone et d’énergie

 Les biofilms sont employés pour traiter les eaux usées et les décharges, pour
dépolluer des sites contaminés et enfin, pour mobiliser les métaux lourds d’un sol
ou d’un déchet par le procédé de biolixiviation
Peut-on élargir le concept de biofilm ?
Fusobacterium nucleatum (rouge),
Streptococcus oralis (bleu),
Actinomyces naeslundii (vert)
(salive)

Biofilms complexes

Biofilms intracellulaires

? Biofilms viraux ?

Autres…?
Biofilms polymicrobiens
Bien que la plupart des travaux expérimentaux soient réalisés
avec une seule espèce microbienne, la réalité est celle de
communautés plurimicrobiennes.
Dynamique des communautés complexes évoluant comme
la résultante de coopérations (symbioses vitales) et de
compétitions (antagonismes mortels).
Plaque dentaire: plus de 500 espèces bactériennes
différentes coexistantes, la moitié incultivables.
Streptococcus gordonii
Fermentation des sucres (production de lactate)

Induction par V.a. de l’expression d’une -amylase de


S.g. (AmyB) augmentant la concentration de sucres
fermentables

Veillonella atypica
Utilise les produits de fermentation
(lactate)
Pseudomonas aeruginosa
Diminution du niveau
de production de
quinolone et de
pyocyanine
3-oxo-C12HSL

Dialogue croisé des


autoinducteurs du
QS
Farnesol
Candida albicans
Diminution du
nombre des
hyphes

Morphotype levure Morphotype filamenteux (hyphe =


(commensal) virulent)
Biofilms intracellulaires ?

Dans le compartiment intracellulaires (l’épithelium vésical), les bactéries se


divisent rapidement et forment une volumineuse poche d’endocytose
(intracellular bacterial community, IBC) dans laquelle les bactéries expriment
des fonctions retrouvées au sein des biofilms, en particulier le Quorum
Sensing. Ces bactéries expriment encore des pili de type 1 qui sont
nécessaires à la formation d’IBC. Après 4-6 heures les IBCs se disloquent et
les bactéries se dispersent.
NOTIONS
Microbiote: le microbiote correspond à l'ensemble des micro-
organismes peuplant un microbiome, c'est-à-dire un milieu de vie bien défini

Microbiome: un microbiome est constitué de l'ensemble


des microbes d'un organisme, de leurs éléments génétiques (génome), et
des interactions environnementales.

Les microbiomes sont caractérisés dans de nombreux


autres environnements, ainsi, y compris dans le sol, dans l'eau de mer et
dans l'eau douce. Il a été suggéré que les microbes ont eu une relation de
symbiose avec d'autres organismes depuis l'émergence des créatures
complexes sur Terre.
L'Homme, un microbiote
L'Homme abrite par exemple un microbiote intestinal. Il se compose des
100.000 milliards de bactéries vivant dans ses intestins.

Terre et mer, des microbiotes


Ce terme est aussi utilisé pour décrire des communautés de micro-organismes
peuplant entre autres les sols ou les océans. Les quelque 2,9×1029 êtres
unicellulaires vivant dans le plancher océanique, un autre microbiome,
forment ainsi le plus grand microbiote du monde
Notions d'interactions

 Dans une population complexe de micro-organismes, chaque sous


population de micro-organismes va s’organiser différemment selon ses
caractéristiques génétiques
 Chaque sous population tentera de s’imposer et utilisera et/ou
produira des métabolites originaux
Il va alors s’instaurer un certain équilibre. Ce dernier est instable
puisqu’il dépend des conditions intrinsèques (liées aux populations) et
extrinsèques
 Toute modification artificielle des populations ou des conditions va
modifier l’équilibre
 L’équilibre évolue également naturellement au cours du temps, les
conditions du milieu étant modifiées par les micro-organismes
Il s’instaure entres les micro-organismes des relations positives :

 Mutualisme : Les deux micro-organismes s’aident mutuellement. Le


bénéfice est réciproque et obligatoire, c'est-à-dire que même s'il y a
présence dans le milieu des éléments dont les deux micro-organismes ont
besoin, il y a tout de même coopération.

 Procoopération : La relation est de nouveau mutuellement


bénéfique mais si le milieu dispose des éléments dont les micro-
organismes ont besoin, alors ils deviennent indépendants

 Commensalisme : Relation dans laquelle le commensal tire un


avantage alors que l’autre n’est ni affecté ni aidé
Et d’autres négatives :

Prédation

Parasitisme : 1 micro-organisme utilise au dépend de son hôte les


métabolites que ce dernier produit

 Amensalisme : 1 micro-organisme est inhibé dans sa croissance par un


autre micro-organisme

 Compétition : 2 micro-organismes utilisent la même ressource, il


s’instaure alors une « lutte » pour celle-ci
Mécanismes d'interactions

Acidification :

 pH optimum de développement pour chaque micro-organisme


Acidification du milieu pendant leur développement
Micro-organismes passe dans une phase où le pH sera optimum pour
leur croissance
Comportements différents selon que le substrat, la matrice à un pouvoir
tampon élevé ou non
Ce phénomène d’acidification doit être considéré globalement puisqu’il y
a interaction avec d’autres facteurs comme la température, l’activité de
l’eau ou la concentration saline
 Résistance à l’acide acétique, lactique et chlorhydrique variable

Salmonelles résistaient mieux à l’acide chlorhydrique qu’à


l’acide acétique

 L’acide lactique occupant une place intermédiaire

 L’effet inhibiteur des acides est attribué à une forme non dissociée

 Diminution de la force proton motrice par accumulation de protons


dans la cellule: perturbations au niveau des échanges de nutriments et
d’acides aminés

Résistances variables à ces effets spécifiques selon les micro-


organismes
Antagonisme/Synergie de substrat :

 Utilisation par plusieurs micro-organismes d’un même élément: phénomènes


de compétition entres les micro-organismes

 La synergie de substrat s’illustre à la fois positivement et négativement:

Positivement, une bactérie va transformer un substrat en un autre substrat qui sera


disponible pour une autre bactérie. Par exemple, le substrat 1 n’était pas utilisable,
à l’inverse du substrat 2 (produit par une bactérie), par une bactérie dit
commensale

Négativement, la bactérie synthétise ce composé et peut elle-même l’utiliser.


Elle doit produire pour deux plutôt que seulement pour elle-même
Réaction exothermique :

 Certaines fermentations vont avoir pour effet une augmentation de la


température du milieu: augmentation de la température dans les cuves
(risque de tuer la flore la plus utile)

 Les micro-organismes ne contribuent pas tous significativement à ces


réactions exothermiques et un même micro-organisme peut à la fois
entraîner une élévation de la température quand il utilise un certain
substrat mais ne rien produire lorsqu’il utilise un autre substrat
Actions de substances inhibitrices spécifiques ou non :

 Peroxyde d’hydrogène : synthétisé par les bactéries lactiques, actions


inhibitrices ou mortelles sur les bactéries ne disposant pas de catalase ou d’autres
molécules à action antioxydante, l’accumulation dans le milieu résulte d’un
déséquilibre entres les voies de biosynthèse et de dégradation

 Diacétyle : produit par nombres de bactéries lactiques, effet inhibiteur sur de


nombreuses bactéries et moisissures, action supérieure en milieu acide, plus
élevée sur les Gram négatives

 Reutérine : C’est un composé inhibiteur produit par une bactérie lactique et


qui possède un large spectre d’action

 Bactériocine : colicines produites par E. coli en sont un exemple

Antibiotiques: compétitions par interférence, action bactéricide,


Streptomyces, Penicillium
Fonction de la flore endogène
Fonction : barrière ou de résistance à la
colonisation
Mécanisme : compétition pour sites d’adhésion et
nutriments, sécrétion de bactériocines
Génomique microbienne outils
post-génomiques

Analyse et comparaison simultanée d’ un génome complet (matériel génétique


d’un organisme) ou un grand nombre de gènes appartenant à un organisme

La génomique microbienne peut nous aider à comprendre quelle est l’action des
micro-organismes, comment ils agissent et comment ils peuvent être manipulés à
notre avantage
La génomique microbienne dans la production et la
transformation des produits alimentaires

 Identifier rapidement les micro-organismes présents dans un produit (cru)

 Mesurer directement la réponse totale des micro-organismes de contamination

Outils:

 Petites puces contenant les informations relatives à des milliers de gènes


appartenant aux micro-organismes de contamination. Ces informations sont
disposées et fixées sur un support solide (par exemple, une lame de verre) selon
un réseau de forme régulière

 Nouvelles technologies d’analyses moléculaires à grande échelle


(transcriptomique et protéomique) « post-génomique » (ou génomique
fonctionnelle, les deux termes étant équivalents) pour désigner les recherches de
biologie fonctionnelle où les produits des gènes (ARNm et protéines) sont au
coeur des analyses et non plus seulement les gènes et leurs séquences
Exemple: Campylobacter jejuni est un agent pathogène redoutable

 C. jejuni possèderait 1 700 gènes

 Génomique pour explorer l’activité de chaque gène et découvrir les


différentes protéines produites par cet organisme lorsqu’il est confronté à
diverses agressions environnementales d’adaptation d’une série de gènes
régulateurs performants qui lui permettent de modifier rapidement son
métabolisme en fonction de son environnement (cru contaminé ou dans un
intestin humain)

 Grâce à la génomique microbienne, il est facile d’analyser un échantillon de


produit alimentaire pour détecter la présence de ces gènes, qui indique une
contamination par C. jejuni

D’autres applications

L’étude des pré biotiques et des pro biotiques, la description des réponses au
stress, l’étude de l’écologie microbienne et, ce qui n’est pas négligeable, la mise
au point de procédures d’évaluation des risques
Réponse physiologique des
microorganismes aux fluctuations des
paramètres physico-chimiques de
l'environnement
Adaptations thermiques
Mise en oeuvre de mécanismes permettant la détection du stress, quelle
qu’en soit la nature (thermique, acide…)

Réponse au choc thermique " heat shock response " l’universalité de la "
réponse au choc thermique " l'induction rapide et vigoureuse de l'activité de gènes
spécifiques lors de stress (les " heat shock genes "), accompagnée par la répression
d'autres séquences géniques

Stress hypothermique (froid)

 Cold shock proteins (Csps) : protéine de faible poids moléculaire

 Synthèse accrue de protéines lors d’un stress au froid (Lactobacillus plantarum,


Lactobacillus lactis)

ROLE: Préserver la structure de l’ADN et de l’ARN, favoriser la transcription et la


traduction

AUTRE: CAP (Cold Accumulation Proteins), CIP (Cold Induced Proteins),


protéines du métabolisme général
Stress hyperthermique (chaleur)

 Synthèse d'un petit nombre de nouvelles protéines distinctes, qualifiées de "


heat shock proteins " (Hsps)

 Protéases énergie-dépendantes

 5 familles (DnaK, DnaJ, GrpE, GroES, GroEL

ROLE: chaperons moléculaires


Osmorégulation

Variations de pression osmotique du milieu environnant

Stress osmotique
Choc hypertonique Choc hypotonique

Sortie d’eau entrée d’eau

 diminution du volume H2O  augmentation du


cytoplasmique et de la volume cytoplasmique et
pression conduisant à de la pression de
une plasmolyse turgescence

H2O
Plasmolyse Turgescence

Osmoprotection
Les bactéries se défendent selon deux voies :

 Accumulation des concentrations énormes des ions (osmolytes)


dans le cytoplasme (halotolérants et halophiles)

 Accumulation des solutés compatibles par synthèse ou par assimilation de


l’environnement: Osmoprotecteurs

Osmoprotecteurs : solutés permettent aux bactéries de supporter le stress


osmotique. Ces substances peuvent être eux-mêmes solutés compatibles ou bien
des précurseurs, convertis enzymatiquement pour y être des solutés compatibles

 Charge net sous pH physiologique

 Ne perturbent pas le fonctionnement de la cellule (réplication, le métabolisme,


interaction ADN-protéine)

Comme exemple on cite : le tréhalose, la choline-O-sulfate, la carnitine,


l’éctoine, la proline, la glycine bétaïne
 E.coli et Salmonella typhimurium: les ions K+ entrent
massivement via les pompes

 E. coli: glycine bétaïne

 Bacillus subtilis: osmoprotecteurs réglés par le facteur σB.

Bactéries thermophiles: phosphotréhalose

 Bactéries marines: l’ectoïne


.
L'adaptation des microorganismes, Bactéries et
Archées en environnement extrêmes

Caractéristiques adaptatives suivant trois parties:

 Adaptation thermophile au niveau de la membrane

Adaptation thermophile au niveau du cytosol (principalement les activités


enzymatiques et la structure des protéines)

Adaptation thermophile au niveau génétique


Au niveau de la membrane
Au niveau du cytosol

 La composition chimique du cytosol

 L'activité enzymatique et la structure des protéines

 La thermostabilité des acides aminés

 La polymérisation des sous-unités

 La compartimentation cellulaire
Au niveau génétique

Les particularités des chromosomes

Les particularités du génome et de l'ADN

La stabilité thermique des ARN

Les particularités au niveau de gènes spécifiques

Les modalités de l'expression et la régulation génétique